CN114540385B - 一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法，主要提供了一种溶葡萄球菌酶编码基因Opt‑Lys的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；大肠杆菌重组菌产溶葡萄球菌酶的方法，包括如下步骤将大肠杆菌重组菌接至含有氨苄青霉素以及终浓度为48‑51mM甘氨酸的LB培养基中，培养到OD600nm至0.25‑0.35后，添加终浓度为0.8‑1.1g/L的乳糖，并在36‑37℃、180‑200rpm培养35‑37h，固体分离，取上清即是溶葡萄球菌酶发酵液。在本发明中，仅通过对溶葡萄球菌酶编码基因的密码子优化，即可实现了其在大肠杆菌中的分泌表达。

Description

一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的革兰氏阳性菌，广泛存在于空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中。它是一种人兽共患病原菌，可导致人和动物的多种疾病，包括伪膜性肠炎、败血症和脓毒症等，严重威胁人类和动物的生命安全。抗生素最早用来治疗金黄色葡萄球菌引起的感染，但是容易导致耐药性的出现。金黄色葡萄球菌细胞壁中含有大量Gly五肽交联桥，而溶葡萄球菌酶(lysostaphin,Lys)可以专一性地作用于此结构，从而裂解细胞壁，对金黄色葡萄球菌具有很好的溶菌杀菌效果。成熟溶葡萄球菌酶是一种分子质量约为27.0kDa的Zn2+依赖蛋白酶。此外，溶葡萄球菌酶的溶菌活性不受金黄色葡萄球菌生长周期的影响，而且不会产生耐药性。所以溶葡萄球菌酶在预防和治疗葡萄球菌感染，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)与耐多药金黄色葡萄球菌(MDRSA)感染的一种很有前景的治疗剂，在生物技术应用方面也具有巨大潜力。
尽管溶葡萄球菌酶有非常大的应用潜力，但由于其生产的高成本，目前仍没有广泛应用于医学或兽医实践或食品工业。过去的研究中，已有几种溶葡萄球菌酶异源过表达系统，包括毕赤酵母、大肠杆菌和乳酸乳球菌。虽然这些研究人员试图提高溶葡萄球菌素的产量，但结果仍不令人满意。在毕赤酵母表达系统中，蛋白表达过程中会发生糖基化，导致酶活性降低。而且毕赤酵母存在发酵周期长、培养成本昂贵、诱导剂甲醇存在危险性等缺点。大肠杆菌具有遗传背景清楚、遗传操作简单、生长繁殖快、目标基因表达水平高，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，其表达外源基因产物的水平也远高于其它原核基因表达系统，所以大肠杆菌成为目前应用最广泛的蛋白质表达宿主。研究人员也利用大肠杆菌作为宿主，进行了不同的尝试。但结果表明溶葡萄球菌酶均为胞内表达，且产量也不高。乳酸乳球菌中Nisin控制的基因表达系统NICE表达溶葡萄球菌酶时，虽然该系统的下游纯化过程简单，但是最终产量仅约100mg/L，未能实现高效生产。
中国专利文献CN1900290A(申请号：200510028038.0)公开了一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法。该专利文献中是将适合在大肠杆菌中分泌表达的编码信号肽的序列克隆于部分或全部成熟溶葡萄球菌酶的基因序列前，实现溶葡萄球菌酶在大肠杆菌中的外分泌表达。
中国专利文献CN111748544A(申请号：202010665840.5)公开了一种高效表达溶葡萄球菌酶的方法，该专利文献采用毕赤酵母表达系统进行溶葡萄球菌酶的分泌表达，根据毕赤酵母密码子偏好性对溶葡萄球菌酶的成熟进行密码子优化，在基因序列末端添加终止密码子TAA，并在优化序列前需要添加适宜毕赤酵母的分泌序列。
中国文献《溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究》，表述了根据溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段，构建溶葡萄球菌酶基因表达载体，并在优化序列前需要添加适宜乳酸克鲁维酵母的分泌序列。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供了一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法。
本发明的发明人依照大肠杆菌密码子偏好性对模拟葡萄球菌来源的溶葡萄球菌酶进行了密码子优化，而且不添加起分泌表达作用的信号肽编码序列，构建了溶葡萄球菌酶重组表达菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys，发现溶葡萄球菌酶能够被分泌至胞外。
本发明的技术方案如下：
一种溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
一种重组载体，包含上述溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys的核苷酸序列，如SEQ IDNO.1所示。
一种重组菌，包含上述溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys的核苷酸序列，如SEQ IDNO.1所示。
根据本发明优选的，所述重组菌为大肠杆菌重组菌。
一种大肠杆菌重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)PCR扩增溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys，PCR引物为Opt-Lys-F与Opt-Lys-R，扩增产物纯化后，获得包含pET22b载体同源臂以及基因Opt-Lys的扩增片段；将该片段连接到经NdeI与XhoI双酶切处理后的pET22b(+)载体片段，构建重组质粒，命名为pET22b(+)-Opt-Lys；
PCR引物序列如下：
Opt-Lys-F：5’-TAAGAAGGAGATATACATATGGCTGCAACCCACGAACATTC-3’SEQ ID NO.2；
Opt-Lys-R：5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTTGATCGTACCCC-3’SEQ ID NO.3；
(2)将重组质粒pET22b(+)-Opt-Lys转化至大肠杆菌BL21(DE3)，挑选阳性克隆获得大肠杆菌重组菌，命名为BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys。
根据本发明优选的，步骤(1)中使用同源重组法将扩增片段连接至pET22b(+)载体片段，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至含有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB平板，36-37℃培养12-16h，挑取转化子于含有氨苄青霉素的LB培养基，于36-37℃、180-200rpm培养12-16h，然后提取质粒，使用引物Opt-Lys-F与Opt-Lys-R进行质粒PCR验证后，得到重组质粒，命名为pET22b(+)-Opt-Lys。
根据本发明优选的，步骤(1)中，PCR扩增条件：2×Taq Master Mix 25μL，10μM的上下游引物各2μL，DNA模板1μL，add ddH2O至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
根据本发明优选的，步骤(2)中将重组质粒pET22b(+)-Opt-Lys通过热激法至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布至含有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB平板，36-37℃培养12-16h，挑取菌落获得大肠杆菌重组菌，命名为BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-lys。
上述大肠杆菌重组菌在产溶葡萄球菌酶中的应用。
根据本发明优选的，上述大肠杆菌重组菌产溶葡萄球菌酶的方法，包括如下步骤：
将大肠杆菌重组菌接至含有氨苄青霉素以及终浓度为48-51mM甘氨酸的LB培养基中，培养到OD600nm至0.25-0.35后，添加终浓度为0.8-1.1g/L的乳糖，并在36-37℃、180-200rpm培养35-37h，固体分离，取上清即是溶葡萄球菌酶发酵液。
根据本发明优选的，所述方法，包括如下步骤：
将大肠杆菌重组菌培养于含有氨苄青霉素的LB培养基，37℃200rpm培养12h获得种子液，将种子液以体积分数2％的比例转接至含有氨苄青霉素以及50mM甘氨酸的LB培养基中，培养到OD600nm至0.3后，添加终浓度为1g/L的乳糖，并在37℃下诱导培养36h，固体分离，取上清即是溶葡萄球菌酶发酵液。
根据本发明优选的，所述方法中，氨苄青霉素在培养基中的终浓度为100μg/mL。
有益技术效果
现有技术中溶葡萄球菌酶的表达系统，表达的溶葡萄球菌酶通常位于胞内，也有使用信号肽在大肠杆菌和毕赤酵母中实现溶葡萄球菌酶分泌表达的报道，在本发明中，仅通过对溶葡萄球菌酶编码基因的密码子优化，即可实现了其在大肠杆菌中的分泌表达，分泌量高且胞外蛋白较单一。
附图说明
图1为BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys与BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys的SDS-PAGE分析图；
图中，M:marker；W:全细胞蛋白样品；I:胞内蛋白样品；E:胞外蛋白样品。
图2为大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys最适培养基优化的酶活测定结果图。
图3为大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys乳糖浓度优化的酶活测定结果图。
图4为大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys诱导时机优化的酶活测定结果图。
图5为大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys甘氨酸浓度优化的酶活测定结果图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步说明，但本发明内容的保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
实施例1
大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys的构建方法，包括如下步骤：
(1)针对溶葡萄球菌酶的基因序列，如SEQ ID NO.4所示，进行大肠杆菌密码子偏好性序列优化，由南京派森诺基因公司进行合成优化后的基因序列Opt-Lys，如SEQ IDNO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。优化后的序列使用引物Opt-Lys-F与Opt-Lys-R进行扩增，获得扩增产物。
PCR引物序列如下：
Opt-Lys-F：5’-TAAGAAGGAGATATACATATGGCTGCAACCCACGAACATTC-3’SEQ ID NO.2；
Opt-Lys-R：5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTTGATCGTACCCC-3’SEQ ID NO.3。
PCR扩增条件：2×Taq Master Mix 25μL，10μM的上下游引物各2μL，DNA模板1μL，add ddH2O至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
(2)将扩增产物使用产物纯化试剂盒(Vazyme,Nanjing,China)纯化后，获得包含pET22b载体同源臂以及基因Opt-Lys的扩增片段。将扩增片段使用同源重组法连接至经NdeI与XhoI双酶切处理后的pET22b(+)载体片段，连接产物使用热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂布至含有100μg/mL Amp的LB平板，37℃培养12h。挑取转化子于含有100μg/mLAmp的LB培养基，37℃摇床200rpm培养12h，使用质粒提取试剂盒(Tiangen,Beijing,China)提取质粒后使用引物Opt-Lys-F与Opt-Lys-R进行质粒PCR验证后，得到重组质粒，命名为pET22b(+)-Opt-Lys。
(3)将重组质粒pET22b(+)-Opt-Lys通过热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布至含有100μg/mL Amp的LB平板，37℃培养12h，挑取菌落获得大肠杆菌重组菌，命名为BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys。
对比例1
大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys的构建方法，包括如下步骤：
(1)使用引物Lys-F与Lys-R扩增模拟葡萄球菌来源的溶葡萄球菌酶基因中的成熟溶葡萄球菌酶基因序列(Lys)，如SEQ ID NO.4所示，所编码的氨基酸序列，如SEQ ID NO.5所示，获得扩增产物。
PCR引物序列如下：
Lys-F：5’-TAAGAAGGAGATATACATATGGCTGCAACACATGAACAT-3’SEQ ID NO.6；
Lys-R：5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTTTATAGTTCCCC-3’SEQ ID NO.7。
PCR扩增条件：2×Taq Master Mix 25μL，10μM的上下游引物各2μL，DNA模板1μL,add ddH2O至50μL；
PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
(2)将扩增产物使用产物纯化试剂盒(Vazyme,Nanjing,China)纯化后，获得包含pET22b载体同源臂及溶葡萄球菌酶基因Lys的扩增片段。将扩增片段使用同源重组法连接至经NdeI与XhoI双酶切处理后的pET22b(+)载体片段，连接产物使用热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂布至含有100μg/mL Amp的LB平板，37℃培养12h。挑取转化子于含有Amp的LB培养基，37℃摇床200rpm培养12h，使用质粒提取试剂盒(Tiangen,Beijing,China)提取质粒后使用引物Lys-F与Lys-R进行质粒PCR验证后，得到重组质粒，命名为pET22b(+)-Lys。
(3)将重组质粒pET22b(+)-Lys通过热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布至含有100μg/mL Amp的LB平板，37℃培养12h，挑取菌落获得BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys。
实施例2
实施例1制备的重组菌发酵制备溶葡萄球菌酶，具体包括如下步骤：
将重组菌株培养于含有100μg/mL Amp的LB培养基，37℃摇床200rpm培养12h获得种子液。将种子液以体积分数2％的比例转接至含有100μg/mL Amp的LB培养基中，培养到OD600nm至0.5～0.6后，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，终浓度为0.5mM，并在37℃下诱导培养200rpm、36h，获得菌液。
取所得菌液在12000rpm离心5min后，取上清既是溶葡萄球菌酶发酵液。
对比例2
对比例1制备的重组菌发酵制备溶葡萄球菌酶，具体方法与实施例2相同。
对比例3
大肠杆菌BL21(DE3)发酵，具体方法与实施例2相同。
实验例1
取实施例2、对比例2、对比例3中获得的菌液，在12000rpm离心5min后，取上清经过0.22μm滤膜过滤，滤液为胞外蛋白样品。收集离心后的菌体，等体积重悬至磷酸钠缓冲液(100mM，pH7.0)中，使用超声波细胞破碎仪(Tianling,Jiangsu,China)超声破碎，细胞破碎液为全细胞蛋白样品。将细胞破碎液12000rpm离心5min后，取上清为胞内蛋白样品。通过SDS-PAGE分析上述制得的全细胞、胞内与胞外蛋白样品，如图1所示。
以对比例3获得菌液，制得的全细胞蛋白样品、胞内蛋白样品与胞外蛋白样品作为对照组；与对照组相比，对比例1制备的重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys胞内蛋白谱在27kDa左右多出一条带，表明溶葡萄球菌酶成功在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，但是蛋白的表达量比较低，也没有检测到分泌到胞外的溶葡萄球菌酶，即胞外无分泌表达，见图1。实施例1制备的重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys，检测结果显示，胞内溶葡萄球菌酶的表达量得到了提高，此外，还发现其在胞外有明显的分泌表达，见图1。
发明人首次发现将溶葡萄球菌酶编码序列根据大肠杆菌密码子的偏好性进行了优化，进行密码子优化后的溶葡萄球菌酶基因Opt-Lys在大肠杆菌BL21(DE3)的表达量得到了提高，此外，还发现其在胞外有明显的分泌表达，而未优化溶葡萄球菌酶基因Lys在大肠杆菌BL21(DE3)的胞外无分泌。并且在经过大肠杆菌密码子的偏好性进行优化后，溶葡萄球菌酶基因Opt-Lys胞内含量与胞外分泌量均显著提高。
实验例2
(一)重组菌发酵培养基的选择
培养基种类如下：
LB培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和5g/L NaCl，余量水；
TB培养基：11.8g/L胰蛋白胨、23.6g/L酵母提取物、9.4g/L K2HPO4、2.2g/LKH2PO4、4ml/L甘油，余量水；
SB培养基：32.0g/L胰蛋白胨、20.0g/L酵母提取物、5.0g/L NaCl，余量水；
2×YT培养基：16.0g/L胰蛋白胨、10.0g/L酵母提取物、5.0g/L NaCl，余量水；
SOB培养基：20.0g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、0.5g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.0g/LMgCl2、1.2g/L MgSO4，余量水。
酶活测定方法：采用分光光度法测定溶葡萄球菌酶的溶菌活性。将金黄色葡萄球菌菌株在LB中培养过夜，收集菌体后使用PBS洗涤1次。然后在PBS中重悬细胞，稀释OD600nm至1.0。加入待测样品，在37℃水浴10min，测定金黄色葡萄球菌菌悬液浊度。以OD600nm的差值来表征溶葡萄球菌酶的活力，每组实验中OD600nm降低最多的定义为100％。
分别将大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-lys、重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys以体积分数2％的比例转接至含有100μg/mL Amp的上述5种培养基中，37℃摇床200rpm培养，培养到OD600nm至0.5～0.6后，添加IPTG，终浓度为0.5mM，并在37℃下诱导培养200rpm、36h，获得菌液。将菌液在12000rpm离心5min后取上清经过0.22μm滤膜过滤后，测定酶活。
结果显示，重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys胞外仍未检测到溶葡萄球菌酶。而大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-lys在LB与SB培养基中胞外溶葡萄球菌酶分泌量明显高于其余培养基，见图2。但是由于LB培养基的组成较SB培养基更低廉，考虑到生产成本，所以后续采用LB培养基作为基础发酵培养基。
(二)以乳糖替代IPTG作为诱导剂
培养大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys、重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys，LB培养基作为发酵培养基，发酵条件同步骤(一)，以乳糖替代IPTG作为诱导剂，乳糖终浓度分别为0.05、0.1、0.25、0.5、1、2、5、10g/L，并在37℃下诱导培养200rpm、36h，获得菌液。将菌液在12000rpm离心5min后取上清经过0.22μm滤膜过滤后，测定酶活。
结果显示，重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys胞外仍未检测到溶葡萄球菌酶。而大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys随着乳糖浓度的升高，溶葡萄球菌酶的胞外产量也逐渐提高，在乳糖终浓度达到1g/L时，胞外产量达到最高。但是再继续增加乳糖浓度时，重组溶葡萄球菌酶的胞外产量也随之降低。而且与IPTG(0.5mM)诱导结果相比，乳糖(1g/L)的诱导后溶葡萄球菌酶的产量要高，见图3。
(三)诱导时机
培养大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys、重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys，LB培养基作为发酵培养基，发酵条件同步骤(一)，以乳糖替代IPTG作为诱导剂，在不同的OD600nm(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9)，添加终浓度为1g/L的乳糖，并在37℃下诱导培养200rpm、36h，获得菌液。将菌液在12000rpm离心5min后取上清经过0.22μm滤膜过滤后，测定酶活。
结果显示，重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys胞外仍未检测到溶葡萄球菌酶。而大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys在OD600nm达到0.3时，诱导后所得到的溶葡萄球菌酶胞外产量最高，再增加OD600nm，则产量会随之降低，见图4。
(四)添加甘氨酸
培养大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-lys、重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys，添加不同浓度甘氨酸(0、25、50、75、100、125、150、175、200mM)的LB培养基作为发酵培养基，发酵条件同步骤(一)，培养到OD600nm至0.3，以乳糖替代IPTG作为诱导剂，乳糖添加的终浓度分别为1g/L，并在37℃下诱导培养200rpm、36h，获得菌液。将菌液在12000rpm离心5min后取上清经过0.22μm滤膜过滤后，测定酶活。
结果显示，重组菌BL21(DE3)/pET22b(+)-Lys胞外仍未检测到溶葡萄球菌酶。而大肠杆菌重组菌株BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-lys在适当添加甘氨酸，终浓度为50mM条件下可以显著提高溶葡萄球菌酶的胞外分泌，但继续甘氨酸则会降低胞外溶葡萄球菌酶的产量，见图5。
综上所述，本发明发现将溶葡萄球菌酶编码基因的密码子依据大肠杆菌偏好性进行优化后，在大肠杆菌中即可实现分泌表达，这一有益技术效果是本领技术人员依据现有技术的记载无法预料到的。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种利用大肠杆菌产溶葡萄球菌酶的方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gctgcaaccc acgaacattc ggcgcagtgg ctgaataact ataaaaaagg ttacggctac 60
ggtccgtatc cgctgggtat caacggtggg atgcactacg gcgttgattt tttcatgaat 120
attggtacgc cggtgaaagc gattagcagc ggtaaaatcg tggaggcagg ctggtctaac 180
tacggcggtg gtaatcagat cggcctgatc gaaaacgatg gtgtgcatcg tcagtggtac 240
atgcacttgt cgaaatacaa cgttaaagtc ggtgattatg tgaaagctgg tcaaattatc 300
ggctggagcg gtagcaccgg ttacagcacc gccccgcatt tgcactttca gcgcatggtt 360
aattccttca gcaacagcac ggcccaggac ccgatgccgt tcctgaaaag cgcaggctac 420
ggcaaagcgg gcggcacggt taccccgacc ccgaataccg gttggaaaac caataaatat 480
ggcacgctgt acaagagcga atccgcgagc ttcaccccga acactgacat catcacccgt 540
accactggtc cgtttcgcag catgccgcaa agcggtgtac tgaaagcggg tcaaaccatt 600
cattatgacg aggtgatgaa gcaagacggc cacgtgtggg tcggttatac cggtaacagc 660
ggccaacgta tttatctgcc ggttagaacc tggaataagt caaccaatac cctcggcgtc 720
ctgtggggta cgatcaag 738
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taagaaggag atatacatat ggctgcaacc cacgaacatt c 41
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtggtggtgg tggtgctcga gcttgatcgt acccc 35
<210> 4
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gctgcaacac atgaacattc agcacaatgg ttgaataatt acaaaaaagg atatggttac 60
ggtccttatc cattaggtat aaatggcggt atgcactacg gagttgattt ttttatgaat 120
attggaacac cagtaaaagc tatttcaagc ggaaaaatag ttgaagctgg ttggagtaat 180
tacggaggag gtaatcaaat aggtcttatt gaaaatgatg gagtgcatag acaatggtat 240
atgcatctaa gtaaatataa tgttaaagta ggagattatg tcaaagctgg tcaaataatc 300
ggttggtctg gaagcactgg ttattctaca gcaccacatt tacacttcca aagaatggtt 360
aattcatttt caaattcaac tgcccaagat ccaatgcctt tcttaaagag cgcaggatat 420
ggaaaagcag gtggtacagt aactccaacg ccgaatacag gttggaaaac aaacaaatat 480
ggcacactat ataaatcaga gtcagctagc ttcacaccta atacagatat aataacaaga 540
acgactggtc catttagaag catgccgcag tcaggagtct taaaagcagg tcaaacaatt 600
cattatgatg aagtgatgaa acaagacggt catgtttggg taggttatac aggtaacagt 660
ggccaacgta tttacttgcc tgtaagaaca tggaataaat ctactaatac tttaggtgtt 720
ctttggggaa ctataaag 738
<210> 5
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His
20 25 30
Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile Gly Thr Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser Asn Tyr Gly Gly Gly
50 55 60
Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val His Arg Gln Trp Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala
85 90 95
Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Pro
100 105 110
His Leu His Phe Gln Arg Met Val Asn Ser Phe Ser Asn Ser Thr Ala
115 120 125
Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Gly
130 135 140
Gly Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr Gly Trp Lys Thr Asn Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp
165 170 175
Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly
180 185 190
Val Leu Lys Ala Gly Gln Thr Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln
195 200 205
Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Thr Gly Asn Ser Gly Gln Arg Ile
210 215 220
Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val
225 230 235 240
Leu Trp Gly Thr Ile Lys
245
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taagaaggag atatacatat ggctgcaaca catgaacat 39
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtggtggtgg tggtggtgct cgagctttat agttcccc 38

Claims (9)

1.一种溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组载体，包含权利要求1所述溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
3.一种重组菌，包含权利要求1所述溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；所述重组菌为大肠杆菌重组菌。
4.一种大肠杆菌重组菌的构建方法，包括如下步骤：
（1）PCR扩增权利要求1所述溶葡萄球菌酶编码基因Opt-Lys，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，PCR引物为Opt-Lys-F，如SEQ ID NO.2所示与Opt-Lys-R，如SEQ ID NO.3所示；
扩增产物纯化后，获得包含pET22b载体同源臂以及基因Opt-Lys的扩增片段；将该片段连接到经NdeI与XhoI双酶切处理后的pET22b(+)载体片段，构建重组质粒，命名为pET22b(+)-Opt-Lys；
（2）将重组质粒pET22b(+)-Opt-Lys转化至大肠杆菌BL21(DE3)，挑选阳性克隆获得大肠杆菌重组菌，命名为BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-Lys。
5.如权利要求4所述构建方法，其特征在于， 步骤（1）中使用同源重组法将扩增片段连接至pET22b(+)载体片段，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布至含有氨苄青霉素(Amp)抗性的LB平板，36-37℃培养12-16h，挑取转化子于含有氨苄青霉素的LB培养基，于36-37℃、180-200 rpm培养12-16h，然后提取质粒，使用引物Opt-Lys-F与Opt-Lys-R进行质粒PCR验证后，得到重组质粒，命名为pET22b(+)-Opt-Lys。
6.如权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤（1）中，PCR扩增条件：2×Taq MasterMix 25 μL，10μM的上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL，add ddH2O至50μL；
PCR反应条件：95 ℃预变性 5 min；95℃变性 30 s，50℃ 退火30 s，72℃延伸 45 s，30个循环，72 ℃ 延伸10 min，4℃保存。
7.如权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤（2）中将重组质粒pET22b(+)-Opt-Lys通过热激法至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布至含有氨苄青霉素抗性的LB平板，36-37℃培养12-16h，挑取菌落获得大肠杆菌重组菌，命名为BL21(DE3)/pET22b(+)-Opt-lys。
8.权利要求4-7任一项所述方法构建的大肠杆菌重组菌在产溶葡萄球菌酶中的应用。
9.权利要求4-7任一项所述方法构建的大肠杆菌重组菌产溶葡萄球菌酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求4-7任一项所述方法构建的大肠杆菌重组菌接种含有氨苄青霉素以及终浓度为48-51 mM甘氨酸的LB培养基中，培养到OD600nm至0.25-0.35后，添加终浓度为0.8-1.1g/L的乳糖，并在36-37 ℃、 180-200 rpm培养35-37 h，固体分离，取上清即是溶葡萄球菌酶发酵液。
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