CN113717964A - 非糖基化溶葡球菌素变体蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及非糖基化溶葡球菌素变体蛋白。具体地，本发明提供了非糖基化溶葡球菌素变体蛋白、核酸分子、载体和宿主细胞，以及用于在酵母表达系统中生产非糖基化溶葡球菌素变体蛋白的方法。所述蛋白在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中生产，并已被显示具有与野生型溶葡球菌素等同的活性。所述溶葡球菌素变体蛋白可作为治疗性蛋白用于治疗疾病例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)感染。
Description
本申请是国际申请日2014年7月16日、国际申请号PCT/US2014/046786于2016年2月5日进入中国国家阶段、申请号201480046809.6、发明名称“非糖基化溶葡球菌素变体蛋白”的申请的分案申请。
技术领域
本申请要求2013年8月6日提交的美国临时专利申请系列号61/862,599的优先权，所述临时申请的内容整体通过参考以其全文并入本文。
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号为1R21 AI098122的政府支持下做出的。美国政府在本发明中具有一定权利。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的细菌病原体，其引起多种可能危及生命的感染，包括皮肤病损(Pantosti,A.和M.Venditti.2009.Eur.Respir.J.34:1190-1196)、肺部感染(Defres等，2009.Eur.Respir.J.34:1470-1476)、菌血症(Wisplinghoff等，2004.Clin.Infect.Dis.39:309-317)和心内膜炎(Fowler等，2005.JAMA 293:3012-3021)。尽管医学共同体努力尝试更有效地对抗这种病原体，但在最近几十年中医院和社区获得性金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的病例仍不断增加(Hospital Infections Program.1999.Am.J.Infect.Control 27:520-532)，并且临床分离株中抗生素耐药性的发生率也稳步增长(Taubes,G.2008 Science 321:356-361)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)的出现和快速传播深深地困扰着公共卫生官员和健康护理提供者，这类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌目前占医院和某些社区背景中金黄色葡萄球菌(S.aureus)分离株的50％以上(Grundmann等，2006.Lancet 368:874-885)。此外，已知MRSA获得另外的耐药性元件，由此产生危险的多药耐药菌株。特别引人担忧的是对被广泛当作MRSA感染的“终极治疗药物”(drug of last resort)的万古霉素表现出降低的敏感性的MRSA分离株(Taubes,G.2008Science 321:356-361)。总的来说，这些数据强调了对开发通过与常规抗细菌化学疗法不同的机理起作用的新的抗葡萄球菌药剂的迫切需求(Lowy,F.D.2007.Nat.Med.13:1418-1420)。
溶葡球菌素(LST)是一种锌依赖性的甘氨酰甘氨酸内肽酶，其最初被编码在金黄色葡萄球菌(S.aureus)的一种环境竞争者——模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的pACK1质粒上(Gargis等，2010.Plasmid 64:104-109)。LST酶选择性并高效地降解金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞壁的肽聚糖组分中的五甘氨酸交联物，最终引起细菌裂解和死亡。LST发现于1960年代(Schindler,C.A.和V.T.Schuhardt.1964.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 51:104-109)，并且从那时起已经历了不同研究组和组织的各种不同程度的临床前开发和甚至小规模的临床试验(Harrison等，1975.Infect.Immun.11:309-312；Zygmunt,W.A.和P.A.Tavormina.1972.Prog.Drug Res.16:309-333；Walsh等，2003.Antimicrob.AgentsChemother.47:554-558；Stark等，1974.New Engl.J.Med.291:239-240；Martin,R.R.和A.White.1968.J.Lab.Clin.Med.71:791-797)。关于LST作为治疗药剂的早期兴趣由于常规药物例如甲氧西林的容易获得而消失，但由于广泛传播的抗生素耐药性和抗微生物剂开发管道的变窄，对LST生物医学应用的热情被重新点燃(Szweda等，2012.Appl.Microbiol.Biotechnol.96:1157-1174)。
LST临床应用的一个障碍是根除某些感染所需的高剂量。在患有多药耐药葡萄球菌肺炎、多发性脓肿和蜂窝组织炎的无反应性白血病患者中，LST似乎表现出良好效能(Walsh等，2003.Antimicrob.Agents Chemother.47:554-558)，但是这种效果需要酶的500mg全身性推注。在另一项研究中，凝固酶阳性金黄色葡萄球菌(S.aureus)的鼻部携带者显示出在鼻内LST治疗后，所述病原体被有效清除，但这种效果也需要大量酶(每天三次用5mg/ml LST溶液进行鼻冲洗，共一周)(Martin,R.R.和A.White.1968.J.Lab.Clin.Med.71:791-797)。在鼻腔带菌清理的其他人类研究中，在类似的高剂量水平下获得了类似的结果(Quickel等，1971.Appl.Microbiol.22:446-450；Harris等，1967.Antimicrob.AgentsChemother.7:110-112)。在与导管相关的金黄色葡萄球菌(S.aureus)生物膜的鼠类模型中，在4天的治疗方案期间进行全身性LST给药以清除已建立的生物膜以及单次预防性给药，防止了随后生物膜在留置导管上的形成(Kokai-Kun等，2009.J.Antimicrob.Chemother.64:94-100)。然而，将有效剂量外推到人类患者，将需要在4天内给药超过16克酶。因此，尽管LST在动物模型和甚至人类研究中具有被证实的一致的效能，但将有效剂量推广到大范围临床应用，将需要特别高效的生产平台。
为达到这个目的，已在广泛的各种微生物表达宿主中生产LST。例如，溶葡球菌素基因已在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞中表达(Zhdaova等，2001.Zh.Mikrobiol.Epidemiol.Immunobiol.4:3-6)。商品化LST的一个来源是天然生物体模拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的高细胞密度培养物，但来自于这个系统的工业规模生产得率作为专有信息未被公开。可选地，来自于细菌宿主大肠杆菌(Escherichia coli)的表达得率已知在10至20mg/L的范围内(Szweda等，2001.Protein Expr.Purif.22:467-471；Szweda等，2005.J.Biotechnol.117:203-213；Sharma等，2006.Protein Expr.Purif.45:206-215)，并且这种重组平台也是商业来源材料的重要贡献者。已使用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NICE系统进行用于临床试验的大规模LST生产(Mierau等，2005.Microb.Cell Fact.4:15；Mierau等，2005.Microb.Cell Fact.4:16)。在大体积高细胞密度发酵中实现了100mg/L的表达水平，但是最终的纯化得率仅为40mg/L(Mierau等，2005.Microb.Cell Fact.4:15)。随后对这种系统的过程优化将生物反应器表达水平提高到300mg/L(Mierau等，2005.Microb.Cell Fact.4:16)，但仍存在相当大的进一步改进空间。最后，应该注意到，LST也已在哺乳动物细胞中表达(Williamson等，1994.Appl.Environ.Microbiol.60:771-776)，但没有尝试对得率进行最大化或甚至定量。
几项专利和专利申请描述了在各种微生物表达系统中生产LST。例如，美国专利No.4,931,390和EP0299978公开了在大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和球形芽孢杆菌(B.sphaericus)中表达克隆的LST基因。PCT/US2002/040924和WO 2003/082184公开了在大肠杆菌(E.coli)、乳酸乳球菌(L.lactis)和球形芽孢杆菌(B.sphaericus)细胞中生产均质形式的重组LST蛋白。美国专利No.6,897,041、WO 2001/029201、EP1224271和KR1020020064886都公开了在大肠杆菌(E.coli)中表达重组LST的方法。美国专利申请No.2002/0006406公开了可以携带单一突变并且可以重组表达的LST的类似物和变体。所述变体在球形芽孢杆菌(B.sphaericus)中生产，并且所述变体在野生型LST的218位置处具有单一突变。美国专利申请No.2005/0118159公开了具有增强的溶葡萄球菌活性的截短的LST分子。所述生产在大肠杆菌(E.coli)、乳酸乳球菌(L.lactis)或球形芽孢杆菌(B.sphaericus)中进行。美国专利申请No.2008/0095756公开了LST变体和使用方法。所述变体被描述为是“去免疫化”分子，意味着已从所述LST序列中去除T-细胞表位和结构域。美国专利申请No.2009/0186380公开了在大肠杆菌中表达LST的方法以及一系列突变体LST分子。最后，美国专利No.8,241,901、WO2007/009351和KR102008018960公开了在大肠杆菌中以高水平表达LST的方法。在这些专利和专利申请中公开的方法均未涉及酵母中的LST表达。
LST代表了用于治疗葡萄球菌感染、尤其是MRSA菌株的感染的有希望的治疗药剂。然而，正如上面讨论的，用于所述酶的常规表达系统受到各种限制，并且对于高效且成本效益高的生产方法仍存在需求，以便于临床推广和非医学应用的开发。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近年中已被证明是高度成功的异源表达宿主的酵母生物体(Cregg等，2009.Methods Enzymol.463:169-189)。与常规使用的原核系统不同，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)具有专用的高容量蛋白分泌途径，这极大简化了上游和下游蛋白质纯化两者(Gasser等，2013.Future Microbiol.8:191-208)。此外，作为酵母生物体，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)不产生内毒素，消除了在生物医学应用之前对费力且低效的内毒素去除步骤的需求(Vogl等，2013.Curr.Opin.Biotechnol.Doi:pii:S0958-1669(13)00038-4.10.1016/j.copbio.2013.02.024)。尽管巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)被广泛用于重组蛋白的高水平表达，但对于在这种工业相关宿主中生产LST来说存在两个主要障碍：缺少从野生型溶葡球菌素基因的表达，以及野生型蛋白序列的异常糖基化。
发明内容
本发明涉及一种用于在酵母表达系统中生产非糖基化溶葡球菌素(LST)变体蛋白的方法。所述生产方法包括将LST变体核酸分子导入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中，以产生表达LST的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)生物体，将所述巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)生物体在生物反应器培养系统中培养，以及从所述生物反应器培养系统分离所述非糖基化LST蛋白或蛋白变体。在优选实施方式中，所述LST核酸分子包括SEQ ID NO：3的合成的野生型LST核酸分子、SEQ ID NO：5的合成的LST变体核酸分子(也称为LST(S126P))或SEQ ID NO：7的合成的LST变体核酸分子(也称为LST(T126A))。下述生产方法也是优选的，即，在所述生产方法中，生物反应器包含低盐Bifidius选择培养基(BSM)，并在整个培养期间维持在20℃下。在使用本发明方法的生产的基础上，本发明还包括SEQ ID NO：8的非糖基化LST变体蛋白、SEQ ID NO：4的非糖基化LST变体蛋白(也称为LST(S126P)蛋白)和SEQ ID NO：6的LST变体蛋白(也称为LST(T127A)蛋白)。另外，本发明提供了编码所述LST变体蛋白的重组核酸分子，以及载体例如表达载体和带有这些载体的重组宿主细胞。
已显示，本发明的非糖基化LST变体蛋白具有与野生型LST蛋白相近水平的防止细菌生长的活性，并因此可以被提供在药物组合物中，用于抑制细菌生长的方法中。本发明的生产变体LST蛋白的方法，提供了避免产生内毒素的成本效益高的高效方法。结果，本发明还包括治疗性蛋白以及这些蛋白在预防或治疗细菌感染中的应用。
附图说明
图1A-1B描绘了野生型LST基因中主要有害序列的作图。图1A是所检查的嵌合WT-SYN基因的示意图。在图1B中，显示了一组嵌合基因的LST表达水平，正如通过SDS-PAGE蛋白质条带的定量密度测量法所测量的。
图2描绘了检查去糖基化对LST活性的影响的实验结果。已发现，非常规的序列子突变提高非糖基化LST的性能。在培养上清液的2倍连续稀释液上进行使用金黄色葡萄球菌(S.aureus)SA113的MIC测定。示出了每个酶的每种稀释液的OD650读数。注意，三种活性最高的酶在512倍至1024倍稀释水平之间达到MIC-50。误差条表示标准偏差。
图3描绘了分析非糖基化LST变体的活性的实验结果。示出的结果来自于检查LST变体的抗细菌效能的实验，正如通过最低抑制浓度(MIC)测定法所测量的。评估纯化的酶的连续稀释液对金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株SA113的生长抑制。示出的结果是生长24小时后的OD650读数。
具体实施方式
本发明涉及从酵母表达系统巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效、高水平生产LST的方法。现在已发现，LST在酵母系统中的低水平表达可归因于转录提前终止，这通过去除这些富含A/T的基因区段以产生更平衡的核苷酸分布来克服。对于野生型LST的异常糖基化问题来说，已显示在两个共有序列段Asn-Xaa-Ser或Asn-Xaa-Thr之一处的异常N-连接的糖基化严重损害野生型LST(SEQ ID NO：1)的活性。尽管位于中央的Asn-Ser-Thr(NST)序列子中N-连接的天冬酰胺(N125)的突变消除了糖基化，但它也造成催化性能降低90％。相反，所述序列子的第二和第三氨基酸处的置换允许分泌具有完全野生型LST活性的均匀地非糖基化的LST变体(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6)。使用本发明的方法，可以在小规模生物反应器中以约500mg/L的量生产LST变体，并且可以使用简单的两步纯化方法以高纯度回收该材料的50％。本发明的表达系统产生大量表现出野生型催化活性的LST酶，并且没有污染的内毒素。
进行实验以在酵母中表达LST基因。所探索的第一种酵母系统是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，在其中对野生型LST基因(SEQ ID NO：2)进行克隆和表达。然而，尽管存在在培养上清液中可以检测到裂解活性这一事实，但表达得率不佳。用于实验的下一个系统是巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)。由于内毒素的缺少和高的固有的重组蛋白表达和分泌能力，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)作为用于治疗性蛋白质的成本效益高的生产平台得到普遍应用。因此，在尝试从酵母生物体获得更高表达得率的努力中，将野生型LST基因(SEQ ID NO：2)克隆到巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)表达载体pPIC9中，并转化到巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)菌株GS115中。这种构建物删除了野生型LST本源的前原(pre-pro)序列，并将该酶融合到来自于巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的α交配因子分泌信号。然而，在诱导GS115宿主后，通过摇瓶培养上清液的SDS-PAGE分析未能检测到LST酶(SEQID NO：1)。对于其他基因报道了类似的结果，其中已发现表达水平低至不可检测(Sinclair,G.和F.Y.Choi.2002.Protein Expr.Purif.26:96-105)。已知蛋白质从巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的分泌是涉及转录、翻译、蛋白质折叠和通过分泌途径向培养基转运的多步过程。对于给定蛋白质靶来说，这些步骤中的任一步都可能是限速的(Delic等，2013.FEMS Microbiol.Rev.doi:10.1111/1574-6976.12020；Love等，2012.PLoS One7:e37915)。因此，尽管巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)用于生物治疗剂生产具有优势，但获得高水平表达是困难的。
最初认为，在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中缺少LST的任何可检测的表达是与酵母宿主相比细菌基因中的不同密码子偏好(表1)的结果，但是对野生型LST基因的更仔细的检查也揭示出三个表现出明显高的A+T含量的DNA区段(野生型LST基因(SEQ ID NO：2)的34AATAATTACAAAAAA48(SEQ ID NO：9)、107ATTTTTTTATGAATATT123(SEQ ID NO：10)和252TAAATATAATGTTAAA267(SEQ ID NO：11))。因此，也可能的是，野生型基因的一个或多个内部区段起到转录提前终止信号的作用(Scorer等，1993.Gene 136:111-119；Schuren,F.H.和J.G.Wessels.1998.Curr.Genet.33:151-156)。
表1
CAI，密码子适应指数；CBI，密码子偏好指数；Fop，最适密码子的频率。
为了同时解决这些潜在问题，合成了编码野生型LST酶的人工基因——合成的LST或SYN LST(SEQ ID NO：3)，以满足两个总体目标：(1)替换巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的优选的密码子用法，以及(2)平衡具有不成比例的A+T含量的区段的A+T/C+G分布。在SYN基因中，大多数密码子被巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的最优选的密码子代替。然而，为了破坏长段A/T碱基，在需要时插入巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的使用频率第二高的Thr和Val密码子。具体来说，偶尔将ACC(14.5％使用率)代替ACT(22.4％使用率)用于Thr，并将GTC(14.9％)代替GTT(26.9％)用于Val。野生型和SYN基因的特征的差异列于表1中。与野生型基因相反，从巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)表达SYN基因在培养上清液中产生显著量的酶(在摇瓶培养物中～80mg/L)。
为了鉴定造成表达不良的野生型LST基因的具体区域，构建了一组嵌合的WT-SYN基因。通过一系列研究追踪对表达受损贡献最大的序列，在所述研究中，将组成性野生型基因序列系统地一分为二，并将每一半用相应的SYN序列替换。对来自于两个得到的构建物的表达进行面对面比较，并将得率较低的嵌合体送入下一轮野生型序列劈分和替换中。图1A示出了嵌合构建物和野生型LST基因中的主要有害序列的图。尽管野生型LST表达的完全失败不能被追溯到基因的任何单一区域，但已发现有害序列不是均匀分布的(图1B)。重要的是，表达得率不良的最重要的决定簇被局限到位于野生型基因(SEQ ID NO：2)中228至276位核苷酸的49个碱基对的区段(Chi8)。
随后进行实验以检查LST表达受损的机制。野生型和SYN基因的228至276位碱基对的详细序列比较揭示出，关键差异位于富含A+T的区域(252至267位核苷酸)内，并不是与任何代表性高度不足的密码子偏好相关(表2)。
表2
252至267位核苷酸带有下划线。
为了证实该富含A+T区域的调控作用，将野生型的富含A+T的区段(252至267位核苷酸)拼接在SYN LST基因中，产生构建物SYN+AT。这个基因本质上是嵌合基因Chi8的目标更狭隘的子系。此外，通过用相应的SYN序列替换，将同样的富含A+T的区段从野生型LST基因中缺失，由此产生基因WT-ΔAT，其是基因SYN+AT的颠倒。参见表2。培养上清液的SDS-PAGE分析揭示，WT-ΔAT中富含A+T的区域的缺失引起LST表达提高，尽管水平比使用SYNLST时观察到的低。相反，在SYN+AT基因中引入富含A+T的区域，与SYN LST相比不引起表达降低。
为了确定富含A+T的区域是否通过起到转录提前终止子的作用影响表达，使用RT-PCR进行实验以检测对应于全长野生型和SYN LST基因或其更短的5’-片段的mRNA。该分析表明，发现表达水平与mRNA的相对丰度相关性良好。具体来说，对于WT LST基因来说没有检测到LST特异性mRNA，对于SYN LST基因来说检测到高水平mRNA，对于WT-ΔAT基因来说检测到低水平mRNA。
为了评估巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)用于LST中试规模生产的潜力，将表达SYNLST的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)在2升(L)生物反应器中进行培养。在低温(20℃)下的诱导防止LST的降解，并且使用低盐Bifidius选择培养基(BSM)提高聚乙二醇(PEG)沉淀的效率。来自于生物反应器培养的表达水平为～500mg/L，并且通过PEG沉淀和阳离子交换层析可以以高纯度回收约50％的该材料。然而，来自于摇瓶和生物反应器培养物两者的LST在SDS-PAGE中作为双线迁移。这两种物质作为单峰从阳离子交换层析共洗脱，并且减少装载在FPLC柱上的酶量不提高层析分辨率。较高分子量的材料据认为由异常糖基化产生，并且事实上在PNGase F处理后更上方的条带从SDS-PAGE中消失。与以前的观察结果(即，来自于哺乳动物细胞的糖基化LST没有活性(Kerr等，2001.Nat.Biotechnol.19:66-70))相一致，在浊度测量分析中含有较高比例的糖基化LST的FPLC级分的活性较低。因此，需要产生非糖基化变体以充分获得巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)表达宿主的优势。
因此，进行了实验以构建非糖基化LST变体，然后分析它们的活性。LST含有两个共有的N-连接的糖基化序列子，一个在125位处(125Asn-Ser-Thr127)，另一个在232位处(232Asn-Lys-Thr234)。当将后者232位用N232Q点突变破坏时，变体蛋白在SDS-PAGE中继续作为双线迁移。这个结果表明，N125是巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中异常糖基化的位点。最近的演示为这一结论提供了另外的证据，即在哺乳动物细胞中N125位是糖基化的位点(Huang等，2013.Anim.Biotechnol.24:129-147)。
最初通过在125位引入保守的N->Q点突变这一策略来破坏N125糖基化序列子。所述突变成功地废止了LST的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)糖基化，并得到了与野生型蛋白可比的表达水平。然而，令人吃惊的是，培养上清液的MIC-50分析显示脱糖基化的N125Q变体表现出与巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)生产的本源酶相比低10倍的活性(图2)。
考虑到使用N125Q突变时出人意料的结果，构建、表达并分析了4个另外的非糖基化突变体(表3)。这些突变体中的两个包括125位处的可选替换(N125D和N125S)，一个包括126位处的替换(S126P)，最后一个包括127位处的替换(T127A)。与使用N125Q的原始结果类似，4个新突变的酶一致地是非糖基化的，并以与野生型蛋白可比的水平表达。有趣的是，可选的N125D和N125S突变导致抗细菌活性甚至更大的降低(分别为17倍和42倍)(图2)。相反，SEQ ID NO：4的LST(S126P)变体和SEQ ID NO：6的LST(T127A)变体具有与野生型蛋白等同的杀细菌活性(图2)。
表3
因此，选择这两个变体用于进一步研究。遵照与用于野生型LST的相同的生产方法，将LST(S126P)和LST(T127A)变体在2L生物反应器中表达并纯化至均质。对于非糖基化变体(SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6)和野生型LST(SEQ ID NO：1)两者来说，表达水平和最终纯化得率非常相近。将非糖基化LST变体蛋白的活性和热稳定性与作为参比的商业化来源的LST进行比较。在裂解动力学的浊度测量分析中，LST(S126P)、LST(T127A)和商品化LST的TOD50(实现金黄色葡萄球菌细胞悬液的浊度减少50％的时间)分别为5、7和17分钟。同样地，在抗细菌最低抑制浓度(MIC)测定中，LST(S126P)和LST(T127A)与商品化酶相比表现出高2倍的效能(对于LST(S126P)和LST(T127A)来说MIC-0为4ng/ml，对于商品化酶来说为8ng/ml)(图3)。对于结构稳定性来说，LST(S126P)显示出57℃的单一表观Tm，LST(T127A)显示出59℃的单一Tm。这与商业化来源的野生型LST相反，后者表现出两次显著的转变，一次在47℃，另一次在60℃。LST变体蛋白与野生型LST蛋白之间的这些活性和稳定性差异可能归因于工程化的点突变、酵母与细菌表达平台的差异、相应的纯化方法的差异或这些要素的某些组合。无论如何，当合在一起考虑时，这些结果清楚地证实从巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)生产的SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的非糖基化LST蛋白变体性能优于细菌起源的商业化来源的LST。
本文描述的实验结果证实，最初在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)培养上清液中缺少检测到的LST可追溯到转录瓶颈，其通过使用编码本源LST蛋白序列的密码子操作过的合成基因得以改善。通过进行系统性的“分而治之”方法，将野生型和合成的基因重组，并且将主要转录提前终止信号局限于野生型LST基因的228-276位核苷酸。重要的是，使用相应的合成序列替换野生型序列的甚至更小的16碱基对的富含A+T的区域(构建物WT+AT)，得到对应于合成基因的水平的25％的中度表达水平。因此，这个短的富含A+T的区段是主要内部LST转录终止子的关键元件。然而，值得注意的是，在这两个基因之间交换这个短的富含A+T的区域，既不恢复完整合成基因的完全表达水平(在WT-ΔAT的情形中)，也不以任何可察觉的程度降低合成基因的表达水平(在SYN+AT的情形中)。因此，似乎所述16碱基对的富含A+T的序列的更广范围的上下文序列是重要的，并且同样地，在野生型LST基因内似乎包埋有其他次要的转录提前终止信号。总的来说，本文中展示的结果支持巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)缺乏从野生型LST基因的表达的相对精细的机制。
基因序列突变已成为在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中提高异源蛋白表达水平的广泛有效的措施(Nakamura等，2013.Biotechnol.Appl.Biochem:doi:10.1002/bab.1079；Hu等，2013.PLoS One 8:e58393；Yang等，2013.PLoS One 8:e53939；Tu等，2013.Appl.Microbiol.Biotechnol.97:2867-2875；Chung等，2012.BMC Syst.Biol.6:134)，但是隐藏在这一策略背后的机制很少被研究。本文中展示的模型对于将密码子用法用于巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中的高水平基因表达具有重要意义。根据所述模型，转录提前终止可能由某些本源基因内的严重核苷酸偏好的短区段产生，并且这些区域的靶向破坏可能是用于基因突变的高效且成本效益高的策略。正如这里示出的，仅仅6个核苷酸的替换足以激活原本无能的野生型LST基因的合理表达。本文中的结果表明，富含A+T的区域应该被当作诱变的首要靶点。
异常糖基化是从巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)高水平生产功能性蛋白时常常遇到的障碍，并且已显示对于抗细菌酶LST来说，情况正是如此。在大多数情况下，糖基化序列子的破坏通过用谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸或丙氨酸替换N-连接的天冬酰胺残基来实现(Zhao等，2009.FEMS Yeast Res.9:591-599；Muller-Steffner等，2010.ProteinExpr.Purif.70:151-157；Vinzon等，2010.Protein Expr.Purif.73:23-30；Peraino等，2012.Protein Expr.Purif.82:270-278)。在本文描述的实验中，在N-连接的N125残基处的所有突变都引起酶活性的显著(10倍以上)降低。鉴于125位残基被认为是功能性M23肽酶结构域与SH3样细胞壁结合结构域(UniProt登记号P10547)之间的连接物中的残基这一事实，N125突变体的严重受损的活性是令人吃惊的。因此，第一次显示了在糖基化序列子中突变位置的选择可以影响非糖基化蛋白变体的功能性。这一认识可以极大提高LST在转基因动物中的使用，更广义来说，其他功能上敏感的蛋白可能从用于N-连接的序列子破坏的拓宽的突变选择中获益。
因此，本发明是一种用于在酵母宿主巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中高效、高水平生产LST的系统。通过核酸序列修饰、蛋白质糖基化修饰和生物过程修饰的组合，在实验室规模的生物反应器中获得了高表达水平(即，500mg/L)和高的最终纯化得率(即，250mg/L)。这些高得率和分泌的无内毒素酶的纯化的容易性是在开发LST作为用于治疗哺乳动物(包括人类)中的细菌感染的治疗药剂方面的重要进步。
因此，本发明提供了重组核酸、蛋白、载体和宿主细胞以及它们在高效生产具有与野生型LST等同的活性的LST蛋白的新方法中的应用。因此，本发明是一种用于在酵母表达系统中生产非糖基化LST变体蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：a)将LST变体核酸分子导入到酵母生物体中(例如通过带有LST变体核酸分子的载体的转化或电穿孔)以产生表达LST的生物体，其中所述LST变体是对野生型LST核酸进行突变以产生富含A/T的区段减少的核酸的结果；b)将所述酵母生物体在生物反应器培养系统中培养；和c)从所述生物反应器培养系统分离所述非糖基化LST蛋白。在优选的实施方式中，所述酵母生物体是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。在其他优选实施方式中，所述LST变体核酸分子包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7。在其他优选实施方式中，将所述表达LST的生物体在所述生物反应器中在低盐BSM培养基中在20℃下进行培养。
在本发明中使用的载体可用于扩增LST变体核酸分子和/或表达LST变体蛋白。就此而言，本发明的载体可以包括克隆载体例如通常在大肠杆菌中用于LST变体核酸分子在大肠杆菌中的增殖和维持的pBLUESCRIPT、pUC19或pBR322，以及表达载体例如用于在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达LST变体蛋白的pPIC载体，或用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达LST变体蛋白的pYES2或pTEF1。
适用于LST变体核酸分子的增殖和维持的重组宿主包括任何常规的大肠杆菌菌株，包括例如DH10B、HB101、JM109、DH5α或XL1-BLUE。
适用于表达LST变体蛋白的重组宿主包括例如野生型巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)或巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)菌株NRRL-Y 11430(Northern RegionalResearch Laboratories,Peoria,IL)的衍生株例如GS115(his4)、KM71(his4 arg4 aox1Δ::ARG4)或MC100-3(his4 arg4 aox1Δ::SARG4 aox2Δ::Phis4)，以及酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株例如DYS-5或DYS-6。
本发明还设想了可用作治疗剂以预防或治疗疾病例如细菌感染的分离的LST变体蛋白，其中所述细菌感染是金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染或MRSA感染。
在本发明的情形中，“LST变体核酸分子”是一种核酸分子，其中序列已被突变以产生与野生型核酸分子相比具有减少的富含A/T的区段的核酸分子。具体来说，鉴于野生型LST核酸分子具有63％的A/T含量和37％的G/C含量，变体LST核酸分子编码LST并具有48％至60％范围内的A/T含量和40％至52％范围内的G/C含量。在某些实施方式中，变体LST核酸分子具有低于60％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％或48％的A/T含量。本发明的LST变体核酸分子的实例包括但不限于由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7提供的序列。
此外，在本发明的上下文中，“LST变体蛋白”是由具有减少的富含A/T的区段的LST核酸分子编码的LST蛋白。在某些实施方式中，LST变体蛋白是从模拟葡萄球菌(Staphylococcus simulans)分离的LST蛋白的变体。LST变体蛋白的实例包括但不限于在SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8下提供的蛋白。在某些实施方式中，LST变体蛋白未被糖基化。根据这个实施方式，LST变体蛋白被定义为在野生型LST蛋白(SEQ ID NO：1)的126(Ser126)或127(Thr127)位的一个或两个位置处具有氨基酸替换的LST蛋白。适合的替换的实例包括但不限于例如用谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸或丙氨酸替换Ser126和/或Thr127，由此阻断LST蛋白的糖基化。这些LST变体蛋白的实例包括但不限于在SEQ ID NO：4和SEQID NO：6下提供的蛋白。在特定实施方式中，本发明的LST变体蛋白具有单一表观熔解温度或热变性温度(Tm)，其优选在50℃至59℃的范围内。相反，正如本文中证实的，野生型LST具有两次不同的转变，一次在47℃，另一次在60℃。
在本发明的情形中，“具有减少的富含A/T的区段的核酸分子”是已被突变成将具有转录提前终止信号的区域用不含所述转录提前终止信号的可替选密码子代替的核酸分子。这些具有减少的富含A/T的区段的核酸分子的实例包括但不限于SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：7。然而，也设想了其它具有减少的富含A/T的区段的核酸分子。例如，按照本发明的教导，可以提高以下一个或多个核酸分子在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中的表达：α-半乳糖苷酶A，α-1,6葡聚糖-6-葡聚糖水解酶，青霉素G酰胺酶，抗凝血酶，鸡胱抑素，α-乳清蛋白，角质酶，植酸酶，纤维二糖水解酶，单链Fv，癌胚抗原，明胶酶B，漆酶，半乳糖氧化酶，神经氨酸酶，α1-抗胰蛋白酶等。参见例如Li等，2007.Appl.Biochem.Biotechnol.142:105-124。
正如也已提到的，本发明的LST变体蛋白可作为治疗剂用于疾病的预防或治疗，所述疾病包括由金黄色葡萄球菌(S.aureus)或MRSA引起的细菌感染。因此，本发明还提供了含有所述LST变体蛋白的药物组合物，以及通过使细菌与有效量的LST变体蛋白接触来抑制细菌生长的方法。在一个实施方式中，所述方法包括使用具有SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示的序列的LST变体蛋白。在优选实施方式中，所述细菌是金黄色葡萄球菌(S.aureus)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(S.aureus)细菌。本领域技术人员了解如何在蛋白治疗剂在当前医学中的常见应用的基础上开发这些蛋白治疗剂。
当用于预防或治疗细菌感染时，所述LST变体蛋白应以有效抑制细菌生长或定植的量给药到需要治疗的对象。细菌生长或定植的抑制水平可以在50％至100％的范围内。在本发明的情形中，患者或对象可以是任何哺乳动物，包括人、伴侣动物(例如狗或猫)、家畜(例如奶牛、绵羊、猪或马)、实验室动物(例如兔)或动物园动物(例如(猴)。在特定实施方式中，所述对象是人。
对于治疗应用来说，可以将所述LST变体蛋白以适合的剂量与可药用载体配制在一起。这样的药物组合物可以通过多种方法来制备，并含有本领域中公知的载体。这些方法和成分的公认的概略是《雷明顿：药物学科学与实践》(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro主编，第20版，Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000。可药用载体、组合物或介质例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料，参与将所述主题药剂从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的另一部分。每种载体在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上必须是可接受的。
可以用作可药用载体的材料的实例包括糖例如乳糖、葡萄糖和蔗糖，淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉，纤维素及其衍生物例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯，粉状黄芪胶，麦芽，明胶，滑石，赋形剂例如可可脂和栓剂用蜡，油例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油，二醇例如丙二醇，多元醇例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇，酯例如油酸乙酯和月桂酸乙酯，琼脂，缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝，海藻酸，无热原水，等渗盐水，林格氏(Ringer's)溶液，乙醇，pH缓冲溶液，聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐，以及在药物制剂中使用的其它无毒相容物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和增香剂、防腐剂和抗氧化剂，也可以存在于所述组合物中。
本发明的组合物可以按照标准的医学惯例肠胃外(例如通过静脉内、腹膜内、皮下或肌内注射)、局部、经口、鼻内、阴道内或直肠给药。
LST变体蛋白的所选剂量水平取决于各种不同因素，包括给药途径，给药时间，治疗持续时间，组合使用的其它药物、化合物和/或材料，待治疗患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和先期医学史，以及医学领域中公知的其它因素。
还设想了所述LST变体蛋白可以单独使用或与常用于在患者中治疗细菌感染的其它药剂组合使用。这些药剂包括但不限于任何已知且销售的抗生素。本领域技术人员将根据他们使用这些药剂的临床经验来选择组合使用的药剂，按照药品在销售时的标签使用被批准用于人类的剂量。
具有本领域普通技术的医生，可以在类似化合物的给药或实验确定的基础上容易地确定并开出所需的药物组合物的有效量。在本发明的情形中，“有效量”或“有效剂量”被定义为将细菌生长或定植抑制至少50％的LST变体蛋白的量或剂量。例如，医生可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始药剂的剂量，并逐渐提高所述剂量直至实现所需效果。这被认为是在专业人员的技术范围之内，并且人们可以浏览关于特定药剂或类似药剂的现有文献以确定最佳给药剂量。
已在体外进行筛选并显示出具有抑制细菌例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)生长的活性的LST变体蛋白的效能，可以使用模型例如由Patel等(2004.Antimicrob.AgentsChemother.48:4754-4761)描述的模型来进一步检查。简单来说，将Swiss小鼠(每个剂量组6只小鼠，4周龄)用0.5ml细菌悬液腹膜内(i.p.)接种，使得每只小鼠接受2x108至3x108CFU的分离株。然后以在体外显示为有效并且已知在动物中安全的剂量给予待测试的药剂或待测试的药剂的组合。待测试验的剂量通常由本领域技术人员在体外药理测定结果的基础上，使用临床判断来选择。例如，剂量可以是等同于在体外抑制细菌生长的ED10、ED25、ED50和/或ED75的剂量。药剂可以在小鼠用分离株i.p.接种后1和4小时时给药。待测试的药剂可以皮下、静脉内或经口给药。还使用介质对照组。观察所有小鼠的存活率直至7天。试验药物的效能被测量为与对照动物(未治疗)相比和与给药阳性对照药剂(例如已知对治疗金黄色葡萄球菌(S.aureus)有效的抗生素)的动物组中的存活率相比，存活率的提高。
设想了本领域技术人员将根据待开发的产品类型来选择最适合的体内模型系统。某些体内模型更适合于口服或静脉内注射，而其它模型对于皮肤涂敷方法更加理想。医学文献提供了关于大量各种这些模型的优点和用途的详细公开。
提供了下面的非限制性实施例以进一步说明本发明。
实施例1：试剂
所使用的引物包括来自于IDT Technologies(Coralville,IA)的经过标准脱盐的引物。用于分子克隆的酶和REMOVE-ITTM PNGase F购自New England Biolabs(Ipswich,MA)。在大肠杆菌中生产的LST购自Sigma(St.Louis,MO)。
实施例2：质粒和菌株
巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)表达载体pPIC9和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)菌株GS115购自Invitrogen(Grand Island,NY)。金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株SA113来自于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas,VA)。
实施例3：溶葡球菌素编码基因
使用引物WT-F和WT-R(表4)从模拟葡萄球菌(S.simulans)扩增野生型(WT)LST基因。合成的(SYN)LST基因由Shanghai Xuguan Biotechnology Development Company(Shanghai,China)合成并使用引物Syn-F和Syn-R(表4)扩增。嵌合的和非糖基化的LST突变体基因使用表4中列出的引物通过拼接重叠延伸PCR进行扩增。
表4
实施例4：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达
将LST编码基因用XhoI和EcoRI消化，连接到同样消化的pPIC9中，并通过电穿孔转化到大肠杆菌DH5α[F–Φ80lacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rK–,mK+)phoA supE44λ–thi-1gyrA96 relA1]中。这将LST与α交配因子分泌信号肽同框融合。带有具有插入片段的表达载体的克隆通过PCR进行选择并通过DNA序列分析验证。将带有LST基因的pPIC9表达载体用SacI消化，然后电穿孔到巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)菌株GS115中。巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)转化子在MD培养基(1.34％YNB，4×10-5％生物素，2％右旋糖，1％琼脂)中筛选，并在BMGY/BMMY培养基中(BMGY培养基：1.0％酵母提取物，2.0％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1.0％甘油，100mM pH 6.0磷酸盐缓冲液；BMMY培养基：1.0％酵母提取物，2.0％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甘油，100mM pH 6.0磷酸盐缓冲液)培养。表达LST的菌株通过培养上清液的SDS-PAGE分析来鉴定。
实施例5：RT-PCR
LST mRNA(5’-片段或全长)使用表4中列出的引物，通过RT-PCR来检测。将醇氧化酶1(AOX1)的片段用作对照。
实施例6：生物反应器培养
对于LST的中试规模生产来说，将巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)如前所述在2L生物反应器中培养(Zhao等，2008.Appl.Microbiol.Biotechnol.81:235-241)。简单来说，使用3阶段培养过程。首先，将巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)在低盐BSM培养基(85％磷酸20ml/L，硫酸钙0.2g/L，硫酸钾5g/L，硫酸镁-7H2O 4g/L，氢氧化钾1g/L，甘油30g/L)中培养。在甘油被耗尽后，进行甘油分批补料阶段以提高细胞密度。最后，在20℃下通过甲醇来诱导溶葡球菌素的表达。
实施例7：溶葡球菌素纯化
将LST通过25％PEG沉淀从培养上清液沉淀，重悬浮在20mM NaHPO4 pH 7.5缓冲液中，并结合到已用同样缓冲液平衡的HIPREP S SEPHAROSE Fast Flow柱。通过0至250mMNaCl梯度将LST从柱上洗脱。
实施例8：MIC测定
LST的MIC通过微孔板方法来测定(Kusuma,C.M.和J.F.Kokai-Kun.2005.Antimicrob.Agents Chemother.49:3256-3263)。使用96孔聚苯乙烯板将溶葡球菌素在TSB培养基中连续稀释。将每个孔用～106CFU/ml的金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株SA113接种，得到每个孔100μl的总体积。然后将微孔板在37℃温育24小时。MIC-0和MIC-50分别被定义为生长的完全或50％抑制，正如通过在微孔板读板器中在650nm处测量光散射所确定的。
培养上清液中的杀菌活性通过生长的50％抑制MIC-50来确定。纯化的LST的杀菌活性通过生长的完全抑制MIC-0来确定。MIC-0和MIC-50两者通过在微孔板读板器中在650nm处测量光散射来确定。测定进行一式两份。
实施例9：浊度测定
将金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌株SA113在TSB培养基中培养过夜，通过离心沉淀细胞，并用PBS(2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，8.9mM Na2HPO4，136.9mM NaCl，pH 7.4)洗涤一次。然后将细胞重悬浮在足够体积的PBS中，以在650nm处产生0.8的吸光度读数。将细菌悬液(100μl)等分在96孔平底聚苯乙烯板(NUNC 269620)的重复样孔中，并通过向细菌悬液添加5μg/ml LST来启动裂解反应。通过在650nm处每分钟测量光密度总共30分钟来追踪细菌裂解的动力学，并将各个不同LST构建物的活性定义为达到初始细菌悬液的半起始吸光度的时间(TOD50)。
实施例10：热稳定性测定
LST构建物的热稳定性通过如前所述的差示扫描荧光测定法(Niesen等，2007.Nat.Protoc.2:2212-2221)，使用来自于Applied Biosystems的ABI 7500快速实时PCR系统来进行。将蛋白和SYPRO橙在PBS中稀释，并从25至94℃对荧光进行定量。
序列表
<110> 达特茅斯学院理事会
<120> 非糖基化溶葡球菌素变体蛋白
<130> SPI213609-61
<150> US 61/862,599
<151> 2013-08-06
<160> 52
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> 模拟葡萄球菌（Staphylococcus simulans）
<400> 1
Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His
20 25 30
Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile Gly Thr Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser Asn Tyr Gly Gly Gly
50 55 60
Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val His Arg Gln Trp Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala
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Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Pro
100 105 110
His Leu His Phe Gln Arg Met Val Asn Ser Phe Ser Asn Ser Thr Ala
115 120 125
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130 135 140
Gly Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr Gly Trp Lys Thr Asn Lys Tyr
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Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly
180 185 190
Val Leu Lys Ala Gly Gln Thr Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln
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Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val
225 230 235 240
Leu Trp Gly Thr Ile Lys
245
<210> 2
<211> 741
<212> DNA
<213> 模拟葡萄球菌（Staphylococcus simulans）
<400> 2
gctgcaacac atgaacattc agcacaatgg ttgaataatt acaaaaaagg atatggttac 60
ggtccttatc cattaggtat aaatggcggt atgcactacg gagttgattt ttttatgaat 120
attggaacac cagtaaaagc tatttcaagc ggaaaaatag ttgaagctgg ttggagtaat 180
tacggaggag gtaatcaaat aggtcttatt gaaaatgatg gagtgcatag acaatggtat 240
atgcatctaa gtaaatataa tgttaaagta ggagattatg tcaaagctgg tcaaataatc 300
ggttggtctg gaagcactgg ttattctaca gcaccacatt tacacttcca aagaatggtt 360
aattcatttt caaattcaac tgcccaagat ccaatgcctt tcttaaagag cgcaggatat 420
ggaaaagcag gtggtacagt aactccaacg cccaatacag gttggaaaac aaacaaatat 480
ggcacactat ataaatcaga gtcagctagc ttcacaccta atacagatat aataacaaga 540
acgactggtc catttagaag catgccgcag tcaggagtct taaaagcagg tcaaacaatt 600
cattatgatg aagtgatgaa acaagacggt catgtttggg taggttatac aggtaacagt 660
ggccaacgta tttacttgcc tgtaagaaca tggaataaat ctactaatac tttaggtgtt 720
ctttggggaa ctataaagtg a 741
<210> 3
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
gctgctaccc acgagcactc cgctcaatgg ttgaacaact acaagaaggg ttacggttac 60
ggtccatacc cattgggtat caacggtggt atgcactacg gtgttgactt cttcatgaac 120
atcggtaccc cagtcaaggc tatctcctcc ggtaagatcg tcgaggctgg ttggtccaac 180
tacggtggtg gtaaccaaat cggtttgatc gagaacgacg gtgtccacag acaatggtac 240
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aactccttct ccaactccac cgctcaagac ccaatgccat tcttgaagtc cgctggttac 420
ggtaaggctg gtggtaccgt caccccaacc ccaaacaccg gttggaagac caacaagtac 480
ggtaccttgt acaagtccga gtccgcttcc ttcaccccaa acaccgacat catcaccaga 540
accaccggtc cattcagatc catgccacaa tccggtgtct tgaaggctgg tcaaaccatc 600
cactacgacg aggtcatgaa gcaagacggt cacgtctggg tcggttacac cggtaactcc 660
ggtcaaagaa tctacttgcc agtcagaacc tggaacaagt ccaccaacac cttgggtgtc 720
ttgtggggta ccatcaagta a 741
<210> 4
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His
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Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile Gly Thr Pro Val Lys Ala Ile
35 40 45
Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser Asn Tyr Gly Gly Gly
50 55 60
Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val His Arg Gln Trp Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala
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Gly Gln Ile Ile Gly Trp Ser Gly Ser Thr Gly Tyr Ser Thr Ala Pro
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Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser Ala Gly Tyr Gly Lys Ala Gly
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Gly Thr Val Thr Pro Thr Pro Asn Thr Gly Trp Lys Thr Asn Lys Tyr
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Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp
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Ile Ile Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly
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195 200 205
Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr Thr Gly Asn Ser Gly Gln Arg Ile
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Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val
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Leu Trp Gly Thr Ile Lys
245
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<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
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gctgctaccc acgagcactc cgctcaatgg ttgaacaact acaagaaggg ttacggttac 60
ggtccatacc cattgggtat caacggtggt atgcactacg gtgttgactt cttcatgaac 120
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ttgtggggta ccatcaagta a 741
<210> 6
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
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Ala Ala Thr His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys
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Gly Tyr Gly Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His
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Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met Asn Ile Gly Thr Pro Val Lys Ala Ile
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Gly Thr Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe Thr Pro Asn Thr Asp
165 170 175
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Val Leu Lys Ala Gly Gln Thr Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln
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Tyr Leu Pro Val Arg Thr Trp Asn Lys Ser Thr Asn Thr Leu Gly Val
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<213> 模拟葡萄球菌（Staphylococcus simulans）
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<223> 合成寡核苷酸
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ttgagcggtg gaggaggaga aggagtt 27
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<211> 27
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<210> 45
<211> 27
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<220>
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<211> 25
<212> DNA
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<220>
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<400> 47
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<211> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ctttatagtt ccccaaagaa cacc 24
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attgccggaa gattggcaaa cttg 24
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
aaaacgattt gctttctagc acgg 24
2
Claims (8)
1.一种用于在酵母表达系统中生产非糖基化溶葡球菌素(LST)蛋白的方法，所述方法包括：a)将LST变体核酸分子导入到酵母生物体中以产生表达LST的生物体，其中所述LST变体核酸分子已被突变以产生富含A/T的区段减少的核酸分子；b)在生物反应器培养系统中培养所述酵母生物体；以及c)从所述生物反应器培养系统分离非糖基化LST变体蛋白，其中所述LST变体核酸分子包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7。
2.一种用于抑制细菌生长的方法，所述方法包括使细菌与有效量的LST变体蛋白接触，以抑制所述细菌的生长，其中所述LST变体蛋白包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6。
3.一种分离的非糖基化溶葡球菌素变体蛋白，其中所述蛋白包含SEQ ID NO：4或SEQID NO：6。
4.一种药物组合物，其包含与可药用载体混合的权利要求3的非糖基化溶葡球菌素变体蛋白。
5.一种重组核酸分子，其编码包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的溶葡球菌素变体蛋白，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7。
6.一种载体，其包含权利要求5的重组核酸分子，其中所述载体是表达载体。
7.一种重组宿主细胞，其包含权利要求6的载体，其中所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
8.一种编码溶葡球菌素变体蛋白的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子具有A/T含量在48％至60％范围内的编码区，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQID NO：7。
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