JP4496000B2 - 宿主微生物 - Google Patents
宿主微生物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4496000B2 JP4496000B2 JP2004113468A JP2004113468A JP4496000B2 JP 4496000 B2 JP4496000 B2 JP 4496000B2 JP 2004113468 A JP2004113468 A JP 2004113468A JP 2004113468 A JP2004113468 A JP 2004113468A JP 4496000 B2 JP4496000 B2 JP 4496000B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- bacillus subtilis
- deleted
- region
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
また、本発明の組換え微生物は、当該宿主微生物を親微生物として構築されるものである。
表2に示した、5’末端側にそれぞれ、ApaI、XhoI、PstI、BamHI、各制限酵素認識配列を含む10 bpを付加したspo0A-260F、SPO-1-RX、SPO-2-F、SPO-2-RBの各プライマーセットを用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、spo0A遺伝子の上流を含む5’末端側の699 bp断片(A)、及び3’末端側の348 bp断片(B)をそれぞれ調製した。得られた断片(A)はApaIおよびXhoI、(B)はPstIおよびBamHI処理した。一方、プラスミドpDG1727(Gene, 167, 335, (1995) )のBamHIおよびXhoI制限酵素切断点よりスペクチノマイシン耐性遺伝子領域を切り出した(C)。次に、3断片を(A)(C)(B)の順になる様に、pBluescript II SK(+)(Stratagene)に(A)はApaIおよびXhoI、(C)はXhoIおよびPstI、(B)はPstIおよびBamHI制限酵素切断点にそれぞれ挿入した。この結果得られた組換えプラスミドDNAを制限酵素ScaIで処理して直鎖状DNAにし、形質転換用の供与体DNAとした(図2参照)。このDNA断片を用いてコンピテント法による枯草菌168株の形質転換を行い、スペクチノマイシン(100μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってspo0A遺伝子が欠失してスペクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。
一方、実施例1と同様にして表2に示した、5’末端側にそれぞれ、SalI、XbaI、各制限酵素認識配列を含む10 bpを付加したcwlB+1F、cwlB+920R、またBglII制限酵素認識配列を含むcwlB+1488R、cwlB+1098Fの各プライマーセットを用いて、枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、cwlB遺伝子の5’末端側の920 bp断片(A)、及び3’末端側の391 bp断片(B)をそれぞれ調製した。得られた断片(A)はSalIおよびXbaI、(B)はBglII処理した。カナマイシン耐性遺伝子(C)を持つプラスミドpDG782 (Gene, 167, 335, (1995) )に(A)はSalIおよびXbaI、(B)はBglII、各制限酵素切断点に挿入した。このプラスミドDNAを制限酵素ScaIで処理し、直鎖状DNAにし、形質転換用の供与体DNAとした。実施例1で作成したspo0A遺伝子が削除された枯草菌株を宿主とし、形質転換を行い、スペクチノマイシン(100μg/mL)およびカナマイシン(5μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってcwlB遺伝子が欠失してカナマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の結果、ゲノム上のspo0A遺伝子とcwlB遺伝子が欠失し、それぞれ、スペクチノマイシン耐性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子に置換した菌株を分離した。
実施例1で作成したspo0A遺伝子が削除された枯草菌株を宿主とし、sigD遺伝子が削除された枯草菌株(Gene, 329, 125, (2004))の染色体DNAを用いて形質転換を行い、スペクチノマイシン(100μg/mL)およびクロラムフェニコール(5μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってゲノム上のspo0A遺伝子とsigD遺伝子が欠失しそれぞれスペクチノマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることを確認した。更に、実施例2で作成したspo0A遺伝子およびcwlB遺伝子が削除された枯草菌株を宿主としsigD遺伝子が削除された枯草菌株(Gene, 329, 125, (2004))の染色体DNAを用いて形質転換を行い、スペクチノマイシン(100μg/mL)、カナマイシン(10μg/mL)およびクロラムフェニコール(5μg/mL)を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、PCRによってゲノム上のspo0A遺伝子、cwlB遺伝子およびsigD遺伝子が欠失し、それぞれスペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されていることを確認した。
実施例2及び3にて得られたspo0A遺伝子とcwlB遺伝子又はsigD遺伝子のいずれか、又はspo0A遺伝子、cwlB遺伝子とsigD遺伝子が削除された菌株、及び対照として枯草菌168株、並びに実施例1にて得られたspo0A遺伝子が削除された菌株を5 mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.6 mLを30 mLの2×L−マルトース培地(2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7/5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、培養液の濁度(OD600nm)を測定した後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清を電気泳動等によって解析した。この結果、spoOA遺伝子が削除された菌株では溶菌により培養3日目の培養液濁度が大幅に低下(図3)し、また細胞壁溶解によって極めて多くのタンパク質バンドが検出され、更にザイモグラム解析(J. Bacteriol., 174, 464, (1992), J. Bacteriol., 175, 6260, (1993))に於いて、多くの細胞壁溶解酵素活性が認められた(図4)。これに対して、spo0A遺伝子に加えてcwlB遺伝子又はsigD遺伝子、或いはcwlB遺伝子とsigD遺伝子が削除された菌株では培養3日目の濁度の現象が殆どなく、またタンパク質バンド及び細胞壁溶解酵素活性が大幅に減少することが明らかになった。
実施例2にて得られたspo0A遺伝子とcwlB遺伝子が削除された菌株、及び対照として枯草菌168株、並びに実施例1にて得られたspo0A遺伝子が削除された菌株、それぞれに、バチルス エスピー(Bacillussp.)KSM-S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子(特開2000-210081号公報)断片(3.1 kb)がシャトルベクターpHY300PLKのBamHI制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドpHY-S237を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を5 mLのLB培地で一夜30℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.6 mLを30 mLの2×L−マルトース培地(2% トリプトン、1% 酵母エキス、1% NaCl、7.5% マルトース、7.5 ppm硫酸マンガン4-5水和物、15 ppmテトラサイクリン)に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、培養液の濁度(OD600nm)を測定した後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、図3に示した様に、spo0A遺伝子が削除された菌株では対照の168株(野生型)の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められたが、培養の後半で激しい細胞壁溶解に伴う培地濁度低下が認められた。これに対して、spo0A遺伝子とcwlB遺伝子が削除された菌株では高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められたが、細胞壁溶解による濁度低下はspo0A遺伝子が削除された株に比べて大幅に抑えられた。一方、各培養液から遠心分離(10,000 rpm、5分、3℃)によって得られた培養上清液を電気泳動等によって解析したところ、spoOA遺伝子が削除された菌株では細胞壁溶解によって極めて多くのタンパク質バンドが検出され、上清液にも濁りを生じた(図5)が、これに対してspo0A遺伝子とcwlB遺伝子が削除された菌株では澄明な上清液が得られ、且つ、タンパク質バンドが大幅に減少することが明らかになった(図5)。
Claims (6)
- spo0A遺伝子又は当該遺伝子と塩基配列において90%以上の同一性を有し胞子形成開始の主制御因子をコードする遺伝子が削除又は不活性化され、且つ、cwlB遺伝子、cwlB遺伝子と塩基配列において90%以上の同一性を有し主要細胞壁溶解酵素をコードする遺伝子、sigD遺伝子、及びsigD遺伝子と塩基配列において90%以上の同一性を有しRNAポリメラーゼシグマD因子をコードする遺伝子の中から選ばれる1以上の遺伝子が削除又は不活性化された枯草菌。
- 請求項1記載の枯草菌に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え枯草菌。
- 異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、又は分泌用シグナル領域を結合した請求項2記載の組換え枯草菌。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域に由来するものである請求項3記載の組換え枯草菌。
- 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域が、配列番号1で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと90%以上の同一性を有する塩基配列からなり且つ転写開始制御領域、翻訳開始制御領域又は分泌シグナル領域としての機能を有するDNA断片である請求項3記載の組換え枯草菌。
- 請求項2〜5のいずれか1項記載の組換え枯草菌を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004113468A JP4496000B2 (ja) | 2004-04-07 | 2004-04-07 | 宿主微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004113468A JP4496000B2 (ja) | 2004-04-07 | 2004-04-07 | 宿主微生物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005295830A JP2005295830A (ja) | 2005-10-27 |
JP4496000B2 true JP4496000B2 (ja) | 2010-07-07 |
Family
ID=35328128
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004113468A Expired - Fee Related JP4496000B2 (ja) | 2004-04-07 | 2004-04-07 | 宿主微生物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4496000B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5226958B2 (ja) * | 2007-02-22 | 2013-07-03 | 花王株式会社 | 組換え微生物 |
JP2009055858A (ja) * | 2007-08-31 | 2009-03-19 | Kao Corp | 細菌の溶菌抑制方法及び溶菌が抑制された細菌 |
JP5164481B2 (ja) * | 2007-08-31 | 2013-03-21 | 花王株式会社 | タンパク質生産方法 |
JP2010136689A (ja) * | 2008-12-12 | 2010-06-24 | Kao Corp | 組換え微生物 |
JP5753419B2 (ja) * | 2011-03-24 | 2015-07-22 | 花王株式会社 | 遺伝子欠損株及びそれを用いたタンパク質の製造方法 |
CN108949785B (zh) * | 2018-08-06 | 2020-03-06 | 齐鲁工业大学 | 芽孢形成相关基因spo0A在产酶中的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005137308A (ja) * | 2003-11-07 | 2005-06-02 | Kao Corp | 組換え微生物 |
-
2004
- 2004-04-07 JP JP2004113468A patent/JP4496000B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005137308A (ja) * | 2003-11-07 | 2005-06-02 | Kao Corp | 組換え微生物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2005295830A (ja) | 2005-10-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4485341B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP2006296268A (ja) | 組換え微生物 | |
JP4336184B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4336082B2 (ja) | 宿主微生物 | |
JP2005137308A (ja) | 組換え微生物 | |
JP5294666B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4915728B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4388272B2 (ja) | 宿主微生物 | |
JP4839144B2 (ja) | 宿主微生物 | |
JP4496000B2 (ja) | 宿主微生物 | |
JP4832153B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4509743B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP6059416B2 (ja) | 溶菌が抑制された微生物、当該微生物の製造方法、当該微生物を用いたタンパク質等の製造方法、及び微生物の溶菌抑制方法 | |
JP2010213577A (ja) | タンパク質又はポリペプチドの生産方法 | |
JP2006345860A (ja) | 組換えバチルス属細菌 | |
JP4820101B2 (ja) | 変異バチルス属細菌 | |
EP1680502B1 (en) | Recombinant microorganism | |
JP4643999B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4676848B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4676847B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4861659B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP4463871B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP2009034067A (ja) | 組換え微生物 | |
JP4842750B2 (ja) | 組換え微生物 | |
JP2005278644A (ja) | 改変プロモーター |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070319 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070405 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100126 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100308 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100406 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100412 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130416 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130416 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140416 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |