CN111849851A - 一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111849851A
CN111849851A CN202010804318.0A CN202010804318A CN111849851A CN 111849851 A CN111849851 A CN 111849851A CN 202010804318 A CN202010804318 A CN 202010804318A CN 111849851 A CN111849851 A CN 111849851A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
acpp
pseudomonas aeruginosa
pyocin
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010804318.0A
Other languages
English (en)
Inventor
王海洪
张文彬
马金成
曹丹
宋雨露
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202010804318.0A priority Critical patent/CN111849851A/zh
Publication of CN111849851A publication Critical patent/CN111849851A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/21—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/78—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Pseudomonas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程领域。本发明通过基因同源重组技术，将铜绿假单胞菌酰基载体蛋白编码基因Pa acpP用大肠杆菌酰基载体蛋白编码基因Ec acpP替换，使得突变菌株产生绿脓菌素的能力提升为野生型菌株的4～5倍。为构建及选育生产绿脓菌素或其相关次生代谢产物，如吩嗪‑1‑羧酸的基因工程菌和大规模生产绿脓菌素及其相关次生代谢产物提供了工程菌种。

Description

一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
绿脓菌素(Pyocyanin,PYO)是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的一种具有氧化还原能力的吩嗪类毒力因子，可溶解于氯仿、甲醇以及水中。绿脓菌素存在氧化态和还原态两种形式，氧化态在碱性时呈蓝色，在酸性时呈红色；还原态无色，但在酸性条件下为氧化还原的中间阶段，呈绿色。其不同离子形式之间的转换可干扰细胞内氧化还原反应，影响胞内生物大分子的功能。
绝大多数野生分离的铜绿假单胞菌菌株均可产生绿脓菌素，但产量较低。作为一种毒力因子，绿脓菌素可以与细胞膜呼吸链相互作用，导致细菌无法进行代谢转运，并且会加速细菌耗氧，产生H2O2并转移电子流，最终使得细胞死亡。有研究表明，绿脓菌素可抑制金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和肺炎克雷伯菌等致病菌的生长；对烟曲霉、白色念珠菌和酵母菌等真菌也有拮抗效果。而绿脓菌素的前体——吩嗪-1-羧酸，更是作为一种农用杀菌剂被加以推广。因此，绿脓菌素作为一种潜在新型的抗生素，具有工业开发的价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用。该菌株脂肪酸合成途径中酰基载体蛋白(acyl-carrier protein，ACP)编码基因Pa acpP被大肠杆菌Ec acpP基因替换，将该菌株命名为PA-A1，PA-A1与初始菌株PAO1相比，在绿脓菌素产量上有明显的提高，并可用于构建及选育生产绿脓菌素或其相关次生代谢产物，如吩嗪-1-羧酸的基因工程菌。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一株高产绿脓菌素的铜绿假单胞菌工程菌，所述工程菌是铜绿假单胞菌酰基载体蛋白编码基因Pa acpP的突变菌株，命名为PA-A1；其中，所述酰基载体蛋白编码基因Pa acpP被替换为大肠杆菌酰基载体蛋白基因Ec acpP。
本发明还提供一种高产绿脓菌素的铜绿假单胞菌的构建方法，铜绿假单胞菌酰基载体蛋白编码基因被替换为大肠杆菌酰基载体蛋白编码基因。
进一步地，所述构建方法步骤包括构建大肠杆菌Ec acpP基因的重质粒，进一步获得敲除质粒，利用敲除质粒转化铜绿假单胞菌，利用PCR鉴定获得的PA-A1菌株；Pa acpP基因序列为SEQ ID No.1所示序列或与SEQ ID No.1所示序列具有90％以上同源性的DNA序列或编码SEQ ID No.2所示蛋白质的序列。
优选的，所述的构建方法具体包括以下步骤：
(1)构建携带大肠杆菌Ec acpP基因的重组质粒：根据Pa acpP序列、其上下游DNA序列以及大肠杆菌Ec acpP序列设计引物P1-P8；以铜绿假单胞菌PAO1总DNA为模板，分别以P1/P2，P3/P4引物扩增得到Pa acpP基因的上下游各500bp片段，再以大肠杆菌MG1655菌株总DNA作为模板，以P5/P6引物扩增获得Ec acpP基因，利用重叠延伸PCR方法，以P1/P6为引物将Pa acpP的上游和下游片段与大肠杆菌Ec acpP基因拼接起来，将重叠延伸后的DNA片段用限制性核酸内切酶HindIII和BamHI消化后，连接至以相同内切酶消化过的pK18mobsacB，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR筛选，获得阳性克隆；
(2)获得敲除质粒：利用试剂盒提取上述阳性克隆中的Ec acpP基因重组质粒，并测定其DNA序列；使用限制性核酸内切酶BamHI线性化Ec acpP基因重组质粒，纯化备用；再提取p34S-Gm质粒，用BamHI消化后获得庆大霉素抗药性基因(GmR)，将线性化Ec acpP基因重组质粒与GmR基因连接获得敲除质粒pPA-A1；
(3)铜绿假单胞菌突变菌株的构建与鉴定：将测序无误后的pPA-A1转化至大肠杆菌S17-1菌株。通过接合作用，质粒pPA-A1转移进入铜绿假单胞菌细胞中，并发生同源重组；将接合产物涂布于含有庆大霉素(100μg/mL)的培养基上，得到的单菌落为一次重组子；经菌落PCR鉴定之后，选取一个重组子在LB液体培养基中培养过夜，之后将菌液按1％～2％的转接量转接至含有10％蔗糖的LB液体培养基中，继续培养4h；将培养物稀释涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基上；用无菌牙签挑取长出来的单菌落，对应转接到含有庆大霉素和不含抗生素的LB平板上；由于发生二次重组后，庆大霉素抗性基因随载体从基因组上解离，故上述培养物会产生无抗性的突变菌株和野生型菌株；用菌落PCR技术以P7/P8为引物对不能在抗性板上生长的菌落进行筛选，根据PCR产物的大小初步获得突变菌株PA-A1；对突变菌株中相关的突变序列进行DNA序列测定，进一步确定突变菌株正确。
本发明还提供一种用于构建高产绿脓菌素的重组铜绿假单胞菌工程菌的重组酶表达质粒，所述质粒是以自杀质粒pK18mobsacB为基础构建的敲除质粒pPA-A1，包括连接有Pa acpP基因的上游和下游片段的大肠杆菌Ec acpP基因和GmR基因。
本发明还提供所述的铜绿假单胞菌工程菌在制备绿脓菌素中的应用。
优选的，利用绿脓菌素生产培养基培养所述的铜绿假单胞菌工程菌制备绿脓菌素。
优选的，所述的绿脓菌素生产培养基为GA培养基、PDP培养基、FD培养基、PPM培养基中的一种或多种。
优选的，所述绿脓菌素生产培养基为FD培养基。
本发明还提供所述的产绿脓菌素基因重组工程菌在构建及选育生产绿脓菌素其相关的基因工程菌中的应用。
优选的，所述的绿脓菌素次生代谢产物是吩嗪-1-羧酸。
本发明具有以下技术效果：
本发明是在研究铜绿假单胞菌脂肪酸合成途径中观察到的现象，该基因所编码蛋白的主要功能在于作为游离脂肪酸的运输载体，运载脂肪酸与脂肪酸合成途径中的各个功能酶结合，催化脂肪酸链的缩合、还原、脱水、再还原反应。铜绿假单胞菌Pa acpP被大肠杆菌Ec acpP基因替换后，对绿脓菌素产量提高的分子机制目前尚无法解释，但该突变株的绿脓菌素产量为普通菌株的4～5倍，可用于绿脓菌素生产发酵，也可作为构建高产绿脓菌素基因工程菌株的初始菌株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为绿脓菌素分子式。
图2为Pa acpP基因敲除盒片段构建示意图。
图3为Pa acpP::Ec acpP敲除原理示意图。
图4为Pa acpP基因突变株PA-A1(ΔPa acpP::Ec acpP)的PCR验证，图中1为以野生型菌株为模板，用引物P7/P8扩增出的DNA片段，2～4为以突变株为模板，用相同引物扩增出的DNA片段，M表示Marker。
图5为液体培养基直接观测法检测野生菌株PAO1和PA-A1突变株绿脓菌素产量的结果，图中左侧为野生菌株PAO1，右侧为PA-A1突变株。
图6为分光光度法测定野生菌株PAO1和PA-A1突变株绿脓菌素产量的结果。
图7为铜绿假单胞菌野生型PAO1和PA-A1突变株在各培养基中的生长曲线及绿脓菌素生产曲线,图中a代表野生型PAO1的生长曲线，b代表PA-A1突变株的生长曲线，c代表野生型PAO1在各培养基中的绿脓菌素浓度，d代表PA-A1突变株在各培养基中的绿脓菌素浓度。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，本发明中的数值均为6个重复样品的平均值。对于本发明中的数值范围，应理解为公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
在以下实施例中所用到的材料中，野生菌株PAO1、大肠杆菌S17-1、自杀质粒pK18mobsacB、p34S-Gm为美国伊利诺伊大学香槟分校John E.Cronan教授惠赠，另，野生菌株PAO1可在北京北纳创联生物技术研究院购买，大肠杆菌S17-1可在北京乐博生物科技有限公司购买，自杀质粒pK18mobsacB可购于湖南丰晖生物科技有限公司、p34S-Gm可购于国家典型培养物保藏中心(NTCC)，上述材料均与本发明所述材料具有相同效果。质粒pPA-A1为本发明构建，限制性内切酶、连接酶等试剂购自宝日医生物技术(北京)有限公司，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司广州分公司合成。
本发明涉及的部分序列如下所示：
SEQ ID NO.1:
ATGAGCACCATCGAAGAACGCGTTAAGAAGATCGTCGCTGAACAACTCGGCGTGAAGGAAGAAGAAGTCACCAACAGCGCTTCCTTCGTCGAAGACCTGGGCGCCGACTCCCTTGACACCGTCGAGCTGGTGATGGCTCTGGAAGAGGAATTCGAGACCGAAATCCCTGACGAGAAAGCTGAAAAGATCACCACCGTTCAGGAAGCCATCGACTACATCGTTGCTCACCAGCAATAA。
SEQ ID NO.2:
Met SerThr Ile GluGluArg Val Lys Lys Ile Val Ala GluGlnLeuGly Val LysGluGluGlu Val ThrAsnSer Ala SerPhe Val Glu Asp LeuGly Ala Asp SerLeu Asp ThrVal GluLeu Val Met Ala LeuGluGluGluPheGluThrGlu Ile Pro Asp Glu Lys Ala GluLys IleThrThr Val GlnGlu Ala Ile Asp Tyr Ile Val Ala HisGlnGln。
实施例1
PA-A1(ΔPa acpP::Ec acpP)基因敲除突变株的构建
根据PA2966基因及上下游序列，设计引物(划线部分为酶切位点):
P1(SEQ ID NO.3):ATAATCAAGCTTTGCGCATGAAAGACGACGAG
P2(SEQ ID NO.4):TAGTGCTCATACCTTGTTTTCACTCCTATGG
P3(SEQ ID NO.5):AAAACAAGGTATGAGCACTATCGAAGAACG
P4(SEQ ID NO.6):TCTCGAATTCTTACGCCTGGTGGCCGTCGATG
P5(SEQ ID NO.7):ACCAGGCGTAAGAATTCGAGACCGAAATCCC
P6(SEQ ID NO.8):CGCCGAGGATCCAACCCATGGATACGCCGATAC
P7(SEQ ID NO.9):TGGTCATCGGCACCGCGACCAGCGCGTC
P8(SEQ ID NO.10):CGGCCTCGCCATAGGCGATGTTGCGAGC
为得到PA-A1(ΔPa acpP::Ec acpP)突变株，本发明首先构建了acpP敲除载体。首先以铜绿假单胞菌PAO1总DNA作为模板，分别以P1/P2，P3/P4引物扩增获得到Pa acpP基因的上下游各约500bp片段(50μL扩增体系：总DNA 1μL，引物各1μL，dNTP 2μL，10×DNA聚合酶缓冲液5μL，DNA聚合酶pfu 1μL，双蒸水补至50μL。扩增条件：95℃预变性10min，95℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min。程序循环数：30个循环)，再以大肠杆菌MG1655菌株总DNA作为模板，以P5/P6引物扩增获得Ec acpP基因(50μL扩增体系：总DNA 1μL，引物各1μL，dNTP 2μL，10×DNA聚合酶缓冲液5μL，DNA聚合酶pfu 1μL，双蒸水补至50μL。扩增条件：95℃预变性10min，95℃变性50s，56℃退火30s，72℃延伸1.0min。程序循环数：30个循环)。本发明在引物设计时，预先在P2、P3,P4、P5引物末端设计了短重叠延伸连接头，利用重叠延伸PCR方法，以P1/P6为引物可将Pa acpP基因的上游和下游片段与大肠杆菌Ec acpP基因拼接起来(50μl扩增体系：P1P2片段、P3P4和P5P6片段各1μL，P5、P6引物各1μL，dNTP 2μL，10×DNA聚合酶缓冲液5μL，DNA聚合酶pfu 1μL，双蒸水补至50μL。扩增条件：95℃预变性10min，95℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸3min。程序循环数：30个循环)；将重叠延伸后的P1P6敲除盒片段用限制性核酸内切酶HindIII和BamHI消化后(酶切条件为：片段或质粒60μL，10×酶切Buffer 10μL，BamHI 2μL，HindIII 2μL，双蒸水补至100μL，37℃反应4h)，连接至以相同内切酶消化过的pK18mobsacB(连接条件为：酶切后片段10μL，酶切后载体5μL，10×连接酶Buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，双蒸水补至20μL,16℃连接12h)，菌落PCR筛选(20μL扩增体系：阳性重组子菌液1μL，M13上下游引物引物各0.5μL，dNTP0.5μL，10×DNA聚合酶缓冲液2μL，DNA聚合酶Taq0.5μL，双蒸水补至20μL。扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性40min，56℃退火30s，72℃延伸2min。程序循环数：30个循环)。
筛选获得阳性重组子并测序无误后，提取重组质粒(质粒抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B110091-0100，操作说明见附件)，限制性核酸内切酶BamHI消化后纯化备用；再提取p34S-Gm质粒，以BamHI消化后获得GmR基因(以上实验操作，质粒抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B110091-0100，按操作说明进行实验；酶切条件为：片段或质粒60μL，10×酶切Buffer 10μL，BamHI2μL，HindIII 2μL，双蒸水补至100μL，37℃反应4h；胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B110092-0100，按操作说明进行实验)；将线性化pK18mobsacB重组质粒与GmR基因连接获得敲除质粒pPA-A1，具体过程如图2所示。
将测序无误后的pPA-A1转化至大肠杆菌S17-1菌株，通过接合实验，质粒能转移进入铜绿假单胞菌细胞，并发生同源重组。一次重组时整个质粒整合到铜绿假单胞菌基因组中，因为带有GmR抗性基因，将接合产物涂布于含有Gm(100μg/mL)的培养基上，培养得到的单菌落为一次重组子。经过菌落PCR鉴定之后，选取一个重组子在无抗性的LB液体培养基培养过夜，将菌液按1％～2％的转接量转接至含有10％蔗糖的无抗性LB液体培养基中，培养4h。再将培养物稀释涂布于含有10％蔗糖的无抗性LB固体培养基上。用无菌牙签挑取长出来的单菌落依次点到有Gm抗生素和无抗生素的平板上，由于发生二次重组后Gm抗性基因随载体从基因组上解离(重组原理如图3所示)，产生没有抗性的突变株和野生型菌株，所以不能在抗性板上生长的菌落为发生二次重组的重组子，即为PA-A1菌株。最后，以P7/P8为引物用PCR的方法对获得的PA-A1菌株进行鉴定(结果如图4)。
实施例2
PA2966基因替换突变株PA-A1绿脓菌素含量检测
绿脓菌素抽提及检测参照以下方法：
1.将铜绿假单胞菌接种至加入5mL LB液体培养基的15mL离心管中，37℃震荡培养过夜。
2.将5mL种子液转移到100mL绿脓菌素生产培养基中，三角瓶容量为250mL，放入37℃震荡培养箱培养，转速200rpm。
3.每隔4h取5mL菌体，4000rpm离心10min，收集上清。
4.加入3mL氯仿，充分萃取，取下层有机相。
5.向下层有机相中加入1mL 0.2M HCl，剧烈震荡1min。
6.取200μL上层水相，检测OD520nm值。
7.绿脓菌素浓度(μg/mL)＝OD520nm值×17.072。
(参考Essar,D.W.,Eberly,L.,Hadero,A.,and Crawford,I.P.(1990).Identification and characterization of genes for a second anthranilatesynthase in Pseudomonas aeruginosa:interchangeability of the two anthranilatesynthases and evolutionary implications.J.Bacteriol.172,884–900.doi:10.1128/jb.172.2.884-900.1990)
(1)培养基上清分析
将突变株PA-A1和野生型PAO1分别接种到5ml液体LB培养基中，37℃培养24h后，4000rpm离心10min，移取培养基上清至干净玻璃试管内，置于白色背景处观察培养基颜色。结果显示，突变株PA-A1培养基上清明显呈深绿色，而野生菌株PAO1培养基上清颜色为浅绿色，如图5所示。
(2)分光光度法定量测定
将突变株PA-A1和野生型PAO1分别接种到100ml液体LB培养基中，37℃培养，每隔4h取5ml菌液，4000rpm离心10min，移取培养基上清至干净玻璃试管内；加入3mL氯仿，充分萃取，取下层有机相；向下层有机相中加入1mL 0.2M HCl，剧烈震荡1min；取200μL上层水相，离心后，检测OD520nm吸收值。绿脓菌素浓度按公式X(μg/mL)＝OD520nm值×17.072计算。结果如图6所示，24h～40h内培养上清中，突变株PA-A1的绿脓菌素产生量约为野生菌的4倍，证明突变株PA-A1的绿脓菌素合成量较野生型有大量提高。
实施例3
摇瓶发酵法测定PA-A1突变株在不同生产培养基下绿脓菌素产量
微生物的生长及其代谢物质的产生均受到营养条件、培养条件等多方面的影响。本研究通过查阅文献，收集多种绿脓菌素生产培养基，包括GA培养基、PDP培养基、FD培养基、PPM培养基，并分别培养野生型PAO1和PA-A1突变株，检测绿脓菌素浓度，筛选出最适合PA-A1突变株生产绿脓菌素的培养基。结果如图7所示。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 237
<212> DNA
<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 1
atgagcacca tcgaagaacg cgttaagaag atcgtcgctg aacaactcgg cgtgaaggaa 60
gaagaagtca ccaacagcgc ttccttcgtc gaagacctgg gcgccgactc ccttgacacc 120
gtcgagctgg tgatggctct ggaagaggaa ttcgagaccg aaatccctga cgagaaagct 180
gaaaagatca ccaccgttca ggaagccatc gactacatcg ttgctcacca gcaataa 237
<210> 2
<211> 78
<212> PRT
<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400> 2
Met Ser Thr Ile Glu Glu Arg Val Lys Lys Ile Val Ala Glu Gln Leu
1 5 10 15
Gly Val Lys Glu Glu Glu Val Thr Asn Ser Ala Ser Phe Val Glu Asp
20 25 30
Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met Ala Leu Glu
35 40 45
Glu Glu Phe Glu Thr Glu Ile Pro Asp Glu Lys Ala Glu Lys Ile Thr
50 55 60
Thr Val Gln Glu Ala Ile Asp Tyr Ile Val Ala His Gln Gln
65 70 75
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataatcaagc tttgcgcatg aaagacgacg ag 32
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagtgctcat accttgtttt cactcctatg g 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaacaaggt atgagcacta tcgaagaacg 30
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctcgaattc ttacgcctgg tggccgtcga tg 32
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accaggcgta agaattcgag accgaaatcc c 31
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgccgaggat ccaacccatg gatacgccga tac 33
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggtcatcgg caccgcgacc agcgcgtc 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggcctcgcc ataggcgatg ttgcgagc 28

Claims (10)

1.一种高产绿脓菌素的铜绿假单胞菌工程菌，其特征在于，所述工程菌是铜绿假单胞菌酰基载体蛋白编码基因Pa acpP的突变菌株，命名为PA-A1；其中，所述酰基载体蛋白编码基因Pa acpP被替换为大肠杆菌酰基载体蛋白基因Ec acpP。
2.一种如权利要求1所述的高产绿脓菌素的铜绿假单胞菌的构建方法，其特征在于，铜绿假单胞菌酰基载体蛋白编码基因被替换为大肠杆菌酰基载体蛋白编码基因。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)构建携带大肠杆菌Ec acpP基因的重组质粒：根据Pa acpP序列、其上下游DNA序列以及大肠杆菌Ec acpP序列设计引物P1-P8；以铜绿假单胞菌PAO1总DNA为模板，分别以P1/P2，P3/P4引物扩增得到Pa acpP基因的上下游各500bp片段，再以大肠杆菌MG1655菌株总DNA作为模板，以P5/P6引物扩增获得Ec acpP基因，利用重叠延伸PCR方法，以P1/P6为引物将Pa acpP的上游和下游片段与大肠杆菌Ec acpP基因拼接起来，将重叠延伸后的DNA片段用限制性核酸内切酶HindIII和BamHI消化后，连接至以相同内切酶消化过的pK18mobsacB，转化大肠杆菌DH5α，菌落PCR筛选，获得阳性克隆；
(2)获得敲除质粒：利用试剂盒提取上述阳性克隆中的Ec acpP基因重组质粒，并测定其DNA序列；使用限制性核酸内切酶BamHI线性化Ec acpP基因重组质粒，纯化备用；再提取p34S-Gm质粒，用BamHI消化后获得庆大霉素抗药性基因(GmR)，将线性化Ec acpP基因重组质粒与GmR基因连接获得敲除质粒pPA-A1；
(3)铜绿假单胞菌突变菌株的构建与鉴定：将测序无误后的pPA-A1转化至大肠杆菌S17-1菌株；通过接合作用，质粒pPA-A1转移进入铜绿假单胞菌细胞中，并发生同源重组；将接合产物涂布于含有庆大霉素(100μg/mL)的培养基上，得到的单菌落为一次重组子；经菌落PCR鉴定之后，选取一个重组子在LB液体培养基中培养过夜，之后将菌液按1％～2％的转接量转接至含有10％蔗糖的LB液体培养基中，继续培养4h。将培养物稀释涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基上；用无菌牙签挑取长出来的单菌落，对应转接到含有庆大霉素和不含抗生素的LB平板上；由于发生二次重组后，庆大霉素抗性基因随载体从基因组上解离，故上述培养物会产生无抗性的突变菌株和野生型菌株；用菌落PCR技术以P7/P8为引物对不能在抗性板上生长的菌落进行筛选，根据PCR产物的大小初步获得突变菌株PA-A1；对突变菌株中相关的突变序列进行DNA序列测定，进一步确定突变菌株正确。
4.一种用于构建高产绿脓菌素的重组铜绿假单胞菌工程菌的重组酶表达质粒，其特征在于，所述质粒是以自杀质粒pK18mobsacB为基础构建的敲除质粒pPA-A1，包括连接有PaacpP基因的上游和下游片段的大肠杆菌Ec acpP基因和GmR基因。
5.一种权利要求1所述的铜绿假单胞菌工程菌在制备绿脓菌素中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，利用绿脓菌素生产培养基培养权利要求1所述的铜绿假单胞菌工程菌制备绿脓菌素。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述绿脓菌素生产培养基为GA培养基、PDP培养基、FD培养基、PPM培养基中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的制备绿脓菌素的方法，其特征在于，所述绿脓菌素生产培养基为FD培养基。
9.权利要求1所述的产绿脓菌素基因重组工程菌在构建及选育生产绿脓菌素或其相关的次生代谢产物的基因工程菌中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的绿脓菌素次生代谢产物是吩嗪-1-羧酸。
CN202010804318.0A 2020-08-12 2020-08-12 一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用 Pending CN111849851A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010804318.0A CN111849851A (zh) 2020-08-12 2020-08-12 一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010804318.0A CN111849851A (zh) 2020-08-12 2020-08-12 一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111849851A true CN111849851A (zh) 2020-10-30

Family

ID=72972107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010804318.0A Pending CN111849851A (zh) 2020-08-12 2020-08-12 一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111849851A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115011534A (zh) * 2022-03-23 2022-09-06 山东农业大学 一种茎瘤固氮根瘤菌ors571的突变株、构建方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007009094A2 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Avi Biopharma, Inc. Antisense antibacterial method and compound
CN102939374A (zh) * 2010-04-22 2013-02-20 西江大学校产学协力团 利用脂肪酸生物合成途径的脂肪酸含量改善用异种大肠杆菌及制备方法
CN103080297A (zh) * 2010-04-22 2013-05-01 西江大学校产学协力团 用于改善脂肪酸含量而开发的铜绿假单孢菌菌株及制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007009094A2 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Avi Biopharma, Inc. Antisense antibacterial method and compound
CN102939374A (zh) * 2010-04-22 2013-02-20 西江大学校产学协力团 利用脂肪酸生物合成途径的脂肪酸含量改善用异种大肠杆菌及制备方法
CN103080297A (zh) * 2010-04-22 2013-05-01 西江大学校产学协力团 用于改善脂肪酸含量而开发的铜绿假单孢菌菌株及制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIN-CHENG MA ET AL.: "Only acyl carrier protein 1 (AcpP1) functions in Pseudomonas aeruginosa fatty acid synthesis", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 *
王嘉惠 等: "绿脓菌素的研究进展", 《中国毒理学会兽医毒理学委员会与中国畜牧兽医学会兽医食品卫生学分会联合学术研讨会暨中国毒理学会兽医毒理学委员会第５次全国会员代表大会》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115011534A (zh) * 2022-03-23 2022-09-06 山东农业大学 一种茎瘤固氮根瘤菌ors571的突变株、构建方法及应用
CN115011534B (zh) * 2022-03-23 2023-11-03 山东农业大学 一种茎瘤固氮根瘤菌ors571的突变株、构建方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022262384A1 (zh) 一种提高刺糖多孢菌多杀菌素产量的方法
CN109536525A (zh) 一种杜氏盐藻叶绿体同源重组空载体及其应用
CN113831395B (zh) 一种重组抗菌肽TrSub、制备方法及其应用
CN108220219B (zh) 一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用
CN110029069B (zh) 一株浅黄霉素基因簇敲除的须糖多孢菌工程菌株及其应用
CN104818287B (zh) 棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1作为抗棉花黄萎病菌靶标基因的应用
CN101418276A (zh) 一种宿主细胞及其用于重组蛋白高效分泌表达的方法
CN111849851A (zh) 一种高产绿脓菌素工程菌及其构建方法和应用
CN114196556A (zh) 一种高毒力蝗绿僵菌菌株及其构建方法
CN113637619A (zh) 一株须糖多孢菌ΔClu13-MmsA及其构建方法与应用
Binh et al. Establishment of a new and efficient Agrobacterium-mediated transformation system in the nematicidal fungus Purpureocillium lilacinum
CN110713964B (zh) 一株cspA基因加倍的须糖多孢菌工程菌株及其应用
Chacón-Vargas et al. Comparison of two Aspergillus oryzae genomes from different clades reveals independent evolution of alpha-amylase duplication, variation in secondary metabolism genes, and differences in primary metabolism
CN113881615B (zh) 一株高产Xcn1的嗜线虫致病杆菌及其应用
CN113583931B (zh) 魏氏柠檬酸杆菌ansB基因敲除突变株及其应用
CN115948265A (zh) 一种马克斯克鲁维单倍体酵母及其构建方法与应用
CN109266676A (zh) 一种电击转化暹罗芽孢杆菌的方法
CN110713963B (zh) 基因缺失型中间气单胞菌
CN109593701B (zh) 一种耐酸重组乳酸菌及其构建方法
US20120015404A1 (en) Gene cluster for thuringiensin synthesis
KR101604187B1 (ko) 신규한 스타터 균주 및 이를 이용한 사워도우
CN112608853A (zh) 一株不产桔霉素的重组红曲菌及其构建方法
CN112094795A (zh) 一种生产1-羟基吩嗪的绿针假单胞菌qohphz-8及应用
CN110951760A (zh) 一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用
CN116426448B (zh) 可视化运动发酵单胞菌、构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20201030

RJ01 Rejection of invention patent application after publication