CN113637619A - 一株须糖多孢菌ΔClu13-MmsA及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

一株须糖多孢菌ΔClu13‑MmsA及其构建方法与应用，该须糖多孢菌ΔClu13‑MmsA（Saccharopolyspora pogonaΔClu13‑MmsA），保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021825。本发明须糖多孢菌Δ Clu13‑MmsA的构建方法操作简便，用其发酵生产丁烯基多杀菌素，丁烯基多杀菌素产量比须糖多孢菌原始菌提高10.1倍，同时也远远高于S.pogona‑MmsA菌株。

Description

一株须糖多孢菌ΔClu13-MmsA及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一株须糖多孢菌菌株及其构建方法与应用，尤其涉及一株高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA及其构建方法与应用。

背景技术

农作物虫害是我国现代农业可持续发展的主要障碍之一。传统化学农药能抵御害虫的侵袭，但是其易残留，会对环境造成污染和破坏，同时产生食品安全问题。生物农药因其选择性强、无毒无害、不易产生抗性等优点，逐渐被得以重视。随着人们的生态环境和食品安全意识的提高，对环境和农作物安全的绿色生物农药需求也不断增长。

丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyn)，是由须糖多孢菌(Saccharopolysporapogona)经好氧发酵产生的，是触杀及摄食毒素的新型微生物源杀虫剂，具有比多杀菌素更为广泛的杀虫谱，对水果类害虫的控制更为明显，是当今世界上最具发展前景的新型生物农药之一。虽然，丁烯基多杀菌素杀虫效果显著，但野生型菌株丁烯基多杀菌素产量低、质量不稳定、发酵周期长，严重制约了丁烯基多杀菌素的生产和应用。因此，如何提高丁烯基多杀菌素产量以及缩短发酵周期成为科学攻关研究的热点课题。

2018年，Li等人首次通过基因工程技术完成对须糖多孢菌聚核苷酸磷酸激酶基因(pnp)研究，并获得高产突变株，使得利用基因工程技术对须糖多孢菌基因组进行定向遗传修饰成为了提高丁烯基多杀菌素产量的有效方法(参见“Li L,Rang J,He H,et al.Impacton strain growth and butenyl-spinosyn biosynthesis by overexpression ofpolynucleotide phosphorylase gene in Saccharopolyspora pogona.Appl MicrobiolBiotechnol.2018Sep；102(18):8011-8021”)。随后，为了构建高产丁烯基多杀菌素工程菌株，科研人员进行了广泛的研究，包括双组份系统SenX3-RegX3(参见“Rang J,He H,ChenJ,et al.SenX3-RegX3,an Important Two-Component System,Regulates Strain Growthand Butenyl-spinosyn Biosynthesis in Saccharopolyspora pogona.iScience.2020；23(8):101398”)，TetR家族调控因子(参见“He H,Yuan S,Hu J,et al.Effect of theTetR family transcriptional regulator Sp1418 on the global metabolic networkof Saccharopolyspora pogona.Microb Cell Fact.2020；19(1):27”)，GDP-岩藻糖合成酶(参见“彭胜男,何昊城,苑爽芹等.fcl基因对须糖多孢菌丁烯基多杀菌素生物合成及生长发育的影响.生物工程学报,2019,35(09):1662-1675”)以及其它聚酮化合物基因簇(参见“Rang J,Li Y,Cao L,et al.Deletion of a hybrid NRPS-T1PKS biosynthetic genecluster via Latour gene knockout system in Saccharopolyspora pogona and itseffect on butenyl-spinosyn biosynthesis and growth development.MicrobBiotechnol.2020；published online”)，但仍未取得显著的突破，现有须糖多孢菌工程菌株的丁烯基多杀菌素的产量仍旧不够令人满意。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌工程菌株。

本发明进一步要解决的技术问题是，提供一株高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌工程菌株的构建方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一株须糖多孢菌ΔClu13-MmsA(Saccharopolyspora pogonaΔClu13-MmsA)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021825。

进一步，所述须糖多孢菌ΔClu13-MmsA，是在敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌中，插入强启动子过表达丙二酸半醛脱氢酶基因mmsA获得的。

进一步，所述强启动子为P_kasO，其序列如SEQ ID No.5所示。

进一步，所述丙二酸半醛脱氢酶基因mmsA来自基因组上编号为orf3916的须糖多孢菌基因组，其序列如SEQ ID No.1所示。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一株须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的构建方法，包括下列步骤：

(1)提取须糖多孢菌NRRL 30141基因组，确定mmsA基因前非编码区，在mmsA基因前非编码区上下游分别扩增同源臂，分别得上游同源臂和下游同源臂；

(2)提取pKCcas9dO质粒和pUC57-Amp-P_kasO质粒，用pKCcas9dO质粒为模板，以sgRNA-F_mmsA/sgRNA-R_mmsA为引物对扩增sgRNA序列，用pUC57-Amp-P_kasO质粒作为模板，以P_kasO-F_mmsA/P_kasO-R_mmsA作为引物对扩增强启动子P_kasO；

(3)将扩增后的sgRNA、上游同源臂、扩增后的强启动子P_kasO和下游同源臂依次相连，然后与质粒pKCcas9进行同源重组，得重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA；

(4)将步骤(3)所得的重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA接合转移至敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌中，筛选后即得高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA。

进一步，步骤(1)中，所述上游同源臂的序列如SEQ ID No.2所示。

进一步，步骤(1)中，所述下游同源臂的序列如SEQ ID No.3所示。

进一步，步骤(1)中，上下游扩增使用的引物对分别为UHA-F_mmsA/UHA-R_mmsA和DHA-F_mmsA/DHA-R_mmsA；UHA-F_mmsA的序列为TTTGAGAGCACAAACACCACTCAAGC，UHA-R_mmsA的序列为GTGAACACCGTTATCTGGGCACTTTCG，DHA-F_mmsA的序列为GGGAGTTACTGAAGCGGCTCCTCACTAG，DHA-R_mmsA的序列为CGACGGCCAGTGCCAAACCGAGATGCCGATTGTG。

进一步，步骤(2)中，所述sgRNA-FmmsA的序列为GTCCTAGGTATAATAGACCGCCGGCCCGCCGGATGGTTTTAGAGCTAGAAA；所述sgRNA-R_mmsA的序列为GTTTGTGCTCTCAAAAAAAGCACCGACTCGG；所述P_kasO-F_mmsA的序列为GATAACGGTGTTCACATTCGAACGGTCT；所述P_kasO-R_mmsA的序列为GCTTCAGTAACTCCCCCAGTCCTGCACG。

进一步，步骤(2)中，所述sgRNA的序列如SEQ ID No.4所示；所述强启动子P_kasO的序列如SEQ ID No.5所示。

进一步，步骤(4)中，所述接合转移为，先将步骤(3)所得的重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-PkasO-DHA电转入供体菌E.coli S17(ATCC47055(中国微生物菌种保藏中心)，经阿泊拉霉素筛选转化子，提取质粒进行酶切鉴定，得阳性转化子；将所述含有重组质粒的阳性转化子E.coil S17作为供体菌，以敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌(该菌种同样保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019070)作为受体菌进行接合转移。

进一步，步骤(4)中，接合转移构建工程菌株后，将所得工程菌株进行PCR鉴定、蛋白质印迹分析和生理特性分析，研究mmsA基因在须糖多孢菌中的作用。

本发明须糖多孢菌ΔClu13-MmsA应用于合成丁烯基多杀菌素，丁烯基多杀菌素产量比须糖多孢菌原始菌提高10.1倍，同时也远远高于S.pogona-MmsA菌株。

本发明原理：首先，丙二酸半醛脱氢酶MmsA是参与氨基酸代谢的酶，其能参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解，最终生成丙酰-CoA，是丁烯基多杀菌素生物合成所必需的前体物质；然后，研究发现，mmsA基因的表达量不仅能提高对丁烯基多杀菌素生物合成中具有正向调节作用，而且发现敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌工程菌，能提高丁烯基多杀菌素的产量；最后，本发明通过在敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌工程菌对mmsA进行过表达，进一步提高了须糖多孢菌丁烯基多杀菌素的生物合成效率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明在构建重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA的基础上，利用接合转移的方法将外源重组质粒转入敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌中，获得高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA,通过PCR鉴定和蛋白质印迹结果分析，表明mmsA基因的翻译水平显著提高，过表达工程菌构建成功；

(2)研究表明，将重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA接合转移至须糖多孢菌中所得的工程菌株(以下简称“S.pogona-MmsA”)，与须糖多孢菌原始菌相比，S.pogona-MmsA中丁烯基多杀菌素的产量提高了0.84倍，生长稳定期较长(比原始菌延长了近2天)；

(3)本发明将该重组质粒接合转移至敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌中，即获得了mmsA基因过表达的本发明之高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA，通过PCR鉴定结果表明，外源质粒已成功导入敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌中；HPLC检测结果表明，本发明之高产丁烯基多杀菌素的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的丁烯基多杀菌素产量比须糖多孢菌原始菌提高了10.1倍，同时也远远高于S.pogona-MmsA菌株。

微生物保藏情况说明

本发明须糖多孢菌ΔClu13-MmsA(Saccharopolyspora pogonaΔClu13-MmsA)，于2021年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学)，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021825。

附图说明

图1是本发明中重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA及工程菌的构建流程图。

图2是本发明工程菌株S.pogona-MmsA的PCR鉴定图；其中1-3泳道为工程菌S.pogona-MmsAPCR验证结果，4泳道为须糖多孢菌原始菌对照。

图3是本发明中mmsA基因的Western blot分析图，其中1泳道为镍柱纯化后剩余的蛋白，2泳道为镍柱纯化的蛋白，3泳道为透析后的蛋白。

图4是本发明工程菌株S.pogona-MmsA生长曲线测定图。

图5是本发明工程菌株S.pogona-MmsA丁烯基多杀菌素产量分析图。

图6是本发明中丁烯基多杀菌素的质谱鉴定图。

图7是本发明须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的PCR鉴定图；其中1泳道为原始菌对照，2-6泳道为转化子验证结果，3、4、6泳道表明工程菌构建成功。

图8是本发明须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的丁烯基多杀菌素产量分析图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

(一)培养基配方和培养条件

(1)S.pogona种子活化培养基CSM(Complete synthetic medium)：TrypticSoyBroth 4.5g/L，Glucose 0.9g/L，Yeast extract 0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.22g/L；接种单克隆或2％菌种保藏液加入装有20mLCSM的150mL摇瓶中，30℃，220r/min培养48h；

(2)S.pogona合成发酵培养基SFM(Synthetic fermentation medium)：Glucose20.0g/L，Yeast extract 4.0g/L；接种2％的菌种活化液加入装有50mL SFM的300mL摇瓶中，30℃，220r/min培养10d；

(3)接合转移采用R6培养基：蔗糖200g/L，糊精10g/L，酪蛋白氨基酸1g/L，BHI(脑心浸出液肉汤培养基)13g/L；使用之前在培养基中分别加入已过滤除菌的MOPS 0.01M，L-谷氨酸0.065M和CaCl₂·2H₂O 0.048M；

(4)E.coli DH5α液体培养基LB(lysogeny broth)：Tryptone 1g/L，Yeastextract 0.5g/L和NaCl 1g/L；

(5)在上述(1)～(4)液体中加入15-20g/L的琼脂粉，配制成LB固体培养基。

(二)重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA构建

以S.pogona基因组为模板，设计两对引物UHA-F_mmsA/UHA-R_mmsA和DHA-F_mmsA/DHA-R_mmsA扩增mmsA前非编码区的上下游同源臂；同时引物对sgRNA-F_mmsA/sgRNA-R_mmsA和P_kasO-F_mmsA/P_kasO-R_mmsA分别用于扩增sgRNA和P_ksaO，扩增后的片段用于与质粒pKCcas9进行连接，上述引物序列见表1。PCR扩增的PCR反应体系如下：

PCR反应体系：2×GC buffer 10μL，正向引物1.0μL，反向引物1.0μL，dNTP 1.6μL，模板1.0μL，ddH₂O 5.2μL，Primer Star DNA聚合酶0.2μL。PCR反应程序：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃60s(sgRNA和P_ksaO为30s)，30个循环；72℃延伸10min。

将上述PCR产物进行回收、纯化，对质粒pKCcas9dO进行spe I和Hind III双酶切，并利用同源重组酶构建重组质粒；然后将重组质粒热转入E.coli DH5α感受态细胞中，并在LB抗性平板(阿泊拉霉素)上进行转化子筛选和验证，获得重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA(参见图1)。

(三)在须糖多孢菌中过表达mmsA

为了确定mmsA基因在须糖多孢菌中的作用，将构建的重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA电转入供体菌E.coli S17，经阿泊拉霉素筛选转化子，提取质粒进行酶切鉴定，获得阳性转化子E.coil S17(pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA)，以E.coli S17作为供体菌，以本实验室的须糖多孢菌原始菌作为受体菌进行接合转移。将长出的单克隆在CSM固体培养基上纯化2次，然后挑取转化子转接至50mL CSM培养基(含阿泊拉霉素)中，30℃、220r/min培养3～5d。取1mL阳性克隆子的菌液，提取基因组DNA，以野生型菌株基因组为对照，以P_kasO-F_mmsA/DHA-R_mmsA为引物，PCR扩增目的片段。将鉴定到的阳性接合子，命名为S.pogona-MmsA，-80℃保藏。扩增目的片段PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。PCR反应体系：2×GC buffer 10μL，P_kasO-F_mmsA 1.0μL，DHA-R_mmsA1.0μL，dNTP 1.6μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 5.2μL，Primer Star DNA聚合酶0.2μL(参见图2)。

(四)蛋白质印迹检测

为了在翻译水平上验证工程菌株S.pogona-MmsA中mmsA基因表达量是否提高，采用蛋白质印迹方法对该菌株进行了检测分析。首先，扩增mmsA基因，将其整合到表达载体pCold-TF中，所述的mmsA基因序列如SEQ ID No.5所示。将表达质粒整合到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，通过15℃，180r/min培养20h，取菌液超声后离心取上清，通过镍柱纯化MmsA蛋白，加入佐剂研磨混匀，分别在第0天，第14天，第28天免疫小鼠，采血并与37℃沉淀后取血清，获得一抗。

提取在CSM培养基培养两天的须糖多孢菌原始菌和工程菌S.pogona-MmsA蛋白，通过SDS-PAGE电泳后，将蛋白转至PVDF膜，一抗孵育后，用带荧光的二抗孵育，最后利用荧光强度检测蛋白表达水平。如图3所示，工程菌株S.pogona-MmsA与原始菌株相比，工程菌株S.pogona-MmsA中MmsA蛋白的表达水平上调高于原始菌。由此可见，mmsA基因能够在须糖多孢菌中过表达。

(五)mmsA基因过表达对菌株S.pogona的生长发育及丁烯基多杀菌素合成的影响

(1)对菌株生长曲线的影响

分别将活化好的工程菌株S.pogona-MmsA和原始菌株等量转入合成发酵培养基中，每24h取样进行菌体OD₆₀₀值测定(测定值在0.2～08之间，以保证测定结果的准确性，否则对样品进行稀释)，取样周期为10d。如图4所示，工程菌株S.pogona-MmsA与原始菌株相比，生长曲线有显著变化，表现为稳定期提前且延长，但是其最大OD₆₀₀值小于原始菌株。

(2)对丁烯基多杀菌素生物合成的影响

分别将活化好的工程菌株S.pogona-MmsA和原始菌株等量转入合成发酵培养基中，取培养至第8天的发酵液进行丁烯基多杀菌素产量检测。具体操作步骤为，取500μL培养至第8天的发酵液于1.5mL的Ep管中，并加入等体积的乙酸乙酯进行混匀，60℃浸提1h；12000r/min离心10min，取上清液(含有丁烯基多杀菌素)；冻干后加入50μL甲醇，使用Agilent 1290超高效液相色谱系统测定上清液中丁烯基多杀菌素含量。HPLC1290仪器参数设置为：色谱柱型号(ZORBAX SB-C18)，柱温：室温，流动相：A相为10％乙腈，B相为90％乙腈，流速：1.0mL/min，上样体积：20μL，检测波长：250nm。通过仪器自带的分析软件计算丁烯基多杀菌素峰面积(参见图5)，并使用LC-MS/MS对该峰进行质谱鉴定，以确定其是否为丁烯基多杀菌素(参见图6)。

HPLC1290检测结果表明，在13min左右存在峰面积明显变化的色谱峰且最大吸收波长为250nm，质谱鉴定结果进一步证实该色谱峰为丁烯基多杀菌素。经软件分析后，工程菌株S.pogona-MmsA在13min的平均峰面积为404.9±75.6，而原始菌株在此外的平均峰面积为220.4±20.8，最终工程菌株S.pogona-MmsA中丁烯基多杀菌素产量相比原始菌株提高了0.84倍。

(六)本发明须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的构建

将上述(三)中带有重组质粒的E.coil S17(pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA)作为供体菌，以敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌作为受体菌进行接合转移。将长出的单克隆在CSM固体培养基上纯化2次，然后挑取转化子转接至50mL CSM培养基(含阿泊拉霉素)中，30℃、220r/min培养3～5d。取1mL阳性克隆子的菌液，提取基因组DNA，以野生型菌株基因组为对照，以P_kasO-F_mmsA/DHA-R_mmsA为引物，PCR扩增目的片段。将鉴定到的阳性接合子，命名为须糖多孢菌ΔClu13-MmsA，-80℃保藏。扩增目的片段PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。PCR反应体系：2×GC buffer 10μL，P_kasO-F_mmsA1.0μL，DHA-R_mmsA 1.0μL，dNTP 1.6μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 5.2μL，Primer Star DNA聚合酶0.2μL(参见图7)。

(七)本发明须糖多孢菌ΔClu13-MmsA中丁烯基多杀菌素产量的变化

分别将活化好的等量须糖多孢菌ΔClu13-MmsA和原始菌株转入合成发酵培养基中，取培养至第8天的发酵液进行丁烯基多杀菌素产量检测。具体操作步骤为，取500μL培养至第8天的发酵液于1.5mL的Ep管中，并加入等体积的乙酸乙酯进行混匀，60℃浸提1h；12000r/min离心10min，取上清液(含有丁烯基多杀菌素)；冻干后加入50μL甲醇，使用Agilent 1290超高效液相色谱系统测定上清液中丁烯基多杀菌素含量。HPLC1290仪器参数设置为：色谱柱型号(ZORBAX SB-C18)，柱温：室温，流动相：A相为10％乙腈，B相为90％乙腈，流速：1.0mL/min，上样体积：20μL，检测波长：250nm。通过仪器自带的分析软件计算丁烯基多杀菌素峰面积，并使用LC-MS/MS对该峰进行质谱鉴定，以确定其是否为丁烯基多杀菌素。

HPLC1290检测结果如图8所示，经软件分析后，本发明须糖多孢菌ΔClu13-MmsA与原始菌株相比，在13min的平均峰面积为2435.8±581.2(原始菌株的平均峰面积为220.4±20.8)，丁烯基多杀菌素产量相比原始菌株提高了10.1倍。

表1本发明所用菌株、质粒和引物的相关描述

注：同源重组区为粗体，重叠序列为下划线。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一株须糖多孢菌ΔClu13-MmsA及其构建方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 639

<212> DNA

<213> 须糖多孢菌(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

gtggccgggg tccacctcgt tgatctcgtg gaacaccgcg cggccgacct tgttcacctc 60

gccggcgcgg tgctcgacct caggctcggg caccacgccg ccgtcccgaa ctggggaagg 120

gcagatattc caaccttgcg caattctccc ggtcctcaag attcgcatgc tccgactccg 180

acctcgacct cgccgccgac tccatggtca acgccgggtt cggctccacg ggagcgatgc 240

atggcgatct ccgccgtcgt cgccgtgggc tcggtcgccg acgacctcgt ggcccgtatc 300

gccgaccggg cggccggctc cgcaccggtg acggcacccg cggcaccgac atggggccct 360

ggtgaccaag gcgcacagcg acaaggtgaa ggccaacgtt ggaatttcca gaacgaggta 420

gaggtcggca tggtcggcat caacgtgccg atcccggtgc cggtcgccta cgacagcttc 480

gacgacaccc acgcacacgg caccgaagcc gtgcacttcc tcacccgtgg caaggtcgtc 540

acgacccgct ggccggaccc gagccacggc ggcgtcaacc tcggcttccc agaacgtccg 600

agaaaggcgg gcagacatga ctctcaccgg agaccgtga 639

<210> 2

<211> 1155

<212> DNA

<213> 须糖多孢菌(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

agcacaaaca ccactcaagc acggactagc ggggaaactc cggctagctt cgtggggtga 60

ccgctgatca tgaatgcgtt gaacatccag ctcccgcagt gctgccctgc cggttccgga 120

ctggtcacca gggcaggacg gatgagcagc ccagagaacc acgggtcgta cttttcacgg 180

cggcgttccg gggctggcgg tgggcgagct gctgctgccg gcggcggaac tcgggctttc 240

cgtccgctac acctccccga acgcggccca cgaccccacc agggtgtacg tcacgaccga 300

cgagggcgtc gcagccgcct tcgccagccg ttacctggtg gcaggggacc ggccggtccc 360

cggcgacctc tacgaggtgc agtcggtcgg atcgaccgag gaagacccgg actaccaggg 420

ccactccccg ggcatgttcc tgagttgccg gcgggcccgg atcgtccggc gggtcgcctc 480

ggggctcgcg ctgagctagg tcgagcagcg gcgccgggaa cgccggtaca cggtgtggga 540

gaggccggat gatccgatct gggacgagaa cggcgtgctg aacccgtcgc ggcagatgcg 600

cagccacggg gtgacccggg aatggacgtt catgctgcgg ccttggctgt gggacaccga 660

gatcagcggc cgcgaaacgc ttcgcgccgc tcggttggca gccagcgggc aggaaccctg 720

gggctcagtg ctcgacgtcg tccccgcgct ggatcgggac tgccagatcc gggtcgcgcc 780

aacgtcctcc gcggccgacc gttcgtacca gtgcacgacg tgctggacgt tgatgcccgc 840

ctggaaccac gctgccgtgc accaactcgg cgagcacgcc gtggatctgc tgatccagac 900

ccatggctgg gaccggccgg acgtcaggcc cttcgtactg ggaaaactgg ttgaagccgc 960

acaggaacgg aacccgaatc gctggcattg gctgcccgac gagttggggt gatccgctga 1020

ccgccggccc gccggatgcg ggcaggttta ctagcggtgc gggttgagtg cgcgctgaag 1080

ctcgaggaaa cgggcgggga gggtggcggc ggtgaacgcg ccgtcggtga cacctcgaaa 1140

gtgcccagat aacgg 1155

<210> 3

<211> 984

<212> DNA

<213> 须糖多孢菌(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

actgaagcgg ctcctcacta ggtgcagacg taggcctcgc ccacgaatgg tgtgctgttc 60

gaactgctgc caccagggcg gatagaccaa gcgatatccc agttgacacg ccgcatatat 120

acggtcacgg gcaggttgtt gacgtaagag ttgacgtgct cattgagccc aaaagcgttg 180

agaccccaac aaccggctcc ggttctctcg gtcacgaagt gcatgtcggt gaatccggtg 240

ttgtagtaca gacacagacc gttggatctg caggcctcaa cggcagaggc ctgcggtgcg 300

gccacggcac cggtggtcgc cagtgtcacc gcggcagcga cggcgacccc gtttcgcgct 360

gcccgtcggg tgaatctcat tggcatttcc ctctcgtccg attggtgccc gggccgttcc 420

ggtccccgta cacactgccc ggatcggaga cgtcgttgtc tcagagcgag cacattcacc 480

cggatagagg catgcgcgtc gcccgcaccg gcgcttgcct tgtcccaatt cggaaaacga 540

ttgtctcgtg aacacctgcc accatcgtgt cgcgaatccg cgcgaccgtg gtcgacccgg 600

gccgcacgct caccctgatg gtctgcggtc ggggcatggc cggctggggc tacatcgacc 660

cggccgacgg gtcgttcacg gccgccaccc cccggcacgg tcctctcggc ctcgccgcga 720

tcggtgagca cctgcaacgc gttgccgacc gcgcccgacg agcggcccaa ctttttggct 780

atgtcgcgtg gcgtgaattc cgttcccgtg tgatcggtga gccattcggc gacaatccgc 840

cgcagctcgc cactgcgcaa ccggacaccc cccgcagtac ccgagggcac cggagcgggt 900

gcgggggttc ctggcgaacc ggcgggcggt gtcatgtgca attccccttc ccaggcggtg 960

ggccacacaa tcggcatctc ggtt 984

<210> 4

<211> 87

<212> DNA

<213> pKcas9dO(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

tctcaaaaaa agcaccgact cggtgccact ttttcaagtt gataacggac tagccttatt 60

ttaacttgct atttctagct ctaaaac 87

<210> 6

<211> 97

<212> DNA

<213> pUC57-Amp-PkasO(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

tgttcacatt cgaacggtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt aaagtcgtgg 60

ccaggagaat acgacagcgt gcaggactgg gggagtt 97

Claims (10)

1.一株须糖多孢菌ΔClu13-MmsA，其特征在于，所述须糖多孢菌ΔClu13-MmsA(Saccharopolyspora pogonaΔClu13-MmsA)，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2021825。

2.根据权利要求1所述的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA，其特征在于，所述须糖多孢菌ΔClu13-MmsA是在敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌中，插入强启动子过表达丙二酸半醛脱氢酶基因mmsA获得的。

3.根据权利要求2所述的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA，其特征在于，所述强启动子为P_kasO，其序列如SEQ ID No.5所示。

4.根据权利要求2或3所述的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA，其特征在于，所述丙二酸半醛脱氢酶基因mmsA来自基因组上编号为orf3916的须糖多孢菌基因组，其序列如SEQ ID No.1所示。

5.一种如权利要求1～4之一所述的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)提取须糖多孢菌NRRL 30141基因组，确定mmsA基因前非编码区，在mmsA基因前非编码区上下游分别扩增同源臂，分别得上游同源臂和下游同源臂；

(2)提取pKCcas9dO质粒和pUC57-Amp-P_kasO质粒，用pKCcas9dO质粒为模板，以sgRNA-F_mmsA/sgRNA-R_mmsA为引物对扩增sgRNA序列，用pUC57-Amp-P_kasO质粒作为模板，以P_kasO-F_mmsA/P_kasO-R_mmsA作为引物对扩增强启动子P_kasO；

(3)将扩增后的sgRNA、上游同源臂、扩增后的强启动子P_kasO和下游同源臂依次相连，然后与质粒pKCcas9进行同源重组，得重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-PkasO-DHA；

(4)将步骤(3)所得的重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA接合转移至敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌中，筛选后即得须糖多孢菌ΔClu13-MmsA。

6.根据权利要求5所述的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述上游同源臂的序列如SEQ ID No.2所示。

7.根据权利要求5或6所述的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述下游同源臂的序列如SEQ ID No.3所示。

8.根据权利要求5～7之一所述的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述sgRNA的序列如SEQ ID No.4所示。

9.根据权利要求5～8之一所述的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述接合转移为，先将步骤(3)所得的重组质粒pKCcas9dO-sgRNA-UHA-P_kasO-DHA电转入供体菌E.coli S17，经阿泊拉霉素筛选转化子，提取质粒进行酶切鉴定，得阳性转化子E.coil S17；将所述阳性转化子E.coli S17作为供体菌，以敲除浅黄霉素基因簇的须糖多孢菌作为受体菌进行接合转移。

10.一种如权利要求1所述的须糖多孢菌ΔClu13-MmsA在合成丁烯基多杀菌素中的应用。

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