CN109628420B - 一种葡萄糖基转移酶及其生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的应用 - Google Patents

一种葡萄糖基转移酶及其生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种葡萄糖基转移酶及其生产香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷的应用，所述葡萄糖基转移酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述的应用以含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液为菌剂，以麦芽糖和香兰素为底物，在pH值6.0～8.5、20‑40℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷。本发明的菌剂生物催化生产香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷，反应12小时，可得到大于10％的香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷溶液，且底物转化率大于60％，香兰素‑α‑D‑葡萄糖苷的产物浓度高，转化率高。

Description

一种葡萄糖基转移酶及其生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种葡萄糖基转移酶及其生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的应用。
(二)背景技术
香草兰是最重要的食品香料之一，广泛应用于高档食品、饮料和化妆品产业，其主要香味成分为香兰素。具有强烈而又独特的香荚兰豆香气，天然存在于香荚兰豆荚，以及丁香油、橡苔油、秘鲁香脂、吐鲁香脂和安息香脂中。香兰素一般由成熟豆荚中的香兰素葡萄糖苷经过漫长的发酵过程转化而来。香兰素在空气中逐渐被氧化，遇光分解，理化性质不稳定。且其熔点只有80℃左右，在烟草燃烧过程中的高温下会提前分解，使香味过早释放。而其糖苷作为香料前体物质分子量较大，理化性质稳定，沸点较高，香气较淡，但经过高温加热或燃烧裂解能释放出具有甜奶香及烘烤香味道，可以供烟用香精使用。并且糖苷在燃烧同时裂解也产生了醛类、酮类、呋喃类、有机酸和酚类等致香成分，这些产物改善和提高了卷烟品质。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种葡萄糖基转移酶及其生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种源自野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestrispv.campestris)的葡萄糖基转移酶，所述葡萄糖基转移酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，所述酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestrispv.campestris)为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestrispv.campestris)CGMCC No.13990，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.13990，保藏日期为2017年4月7日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，已在专利申请CN107446844A中公开。
本发明还提供一种葡萄糖基转移酶在生产香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用，所述的应用以含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液为菌剂，以麦芽糖和香兰素为底物，在pH值6.0-8.5、20-40℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得香兰素-α-D-葡萄糖苷。所述麦芽糖质量加入量以发酵液体积计为200-500g/L(优选400g/L)，所述香兰素质量加入量以发酵液体积计为5-50g/L(优选15g/L)，所述发酵液中湿菌体含量为5-30g/L(优选10g/L)。
进一步，本发明所述菌剂按如下方法制备：将含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌接种到含卡那霉素50μg/L发酵培养基中，30-37℃培养4-6h(优选35℃、5h)；再加入终浓度为5.6-7.0mM(优选7.0mM)的α-乳糖，22-25℃继续发酵12-18h(优选24℃，12h)，取发酵液，即得到生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂；所述发酵培养基组成：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、54mM甘油、2.8mM葡萄糖、25mM Na2HPO4、25mM KH2PO4、50mM NH4Cl、5mM Na2SO4、2mM MgSO4，溶剂为去离子水，pH7.0。
进一步，所述工程菌在发酵前先进行种子活化培养，再将种子液以体积浓度1-5％的接种量接种至发酵培养基，所述种子活化培养为：将含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌IFE-agl)接种在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基组成：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO4 3.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O0.49g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。
进一步，本发明所述含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌按如下方法构建：将源自野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990的葡萄糖基转移酶编码基因agl克隆至质粒pET28a，构建重组表达质粒pET28a-agl，导入E.coli RosettaTM(DE3)感受态细胞，筛选获得含重组质粒pET28a-agl的阳性克隆子E.coli RosettaTM(DE3)(pET28a-agl)，记为大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-agl。
进一步，本发明所述转化反应是在发酵罐中进行连续补料反应：将发酵液加入发酵罐中，加入质量终浓度0.05％消泡剂，在pH值6.0-8.5、20-40℃条件下进行转化反应；在反应开始30min后，每隔20min补料香兰素，每次加入量为总添加质量的0.3-0.7％；反应完全后，将反应液分离纯化，获得香兰素-α-D-葡萄糖苷。
与现有化学法合成香兰素糖苷的技术相比，本发明有益效果主要体现在：
(1)酶法催化一步绿色合成，即本发明构建的生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的活性成分为大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-agl，大肠杆菌IFE-agl能够在胞内高效合成葡萄糖基转移酶，以麦芽糖为底物，高效催化香兰素的糖基化反应；(2)高效的香兰素糖基活性，即本发明的菌剂生物催化生产香兰素-α-D-葡萄糖苷，反应12小时，可得到大于10％的香兰素-α-D-葡萄糖苷溶液，且底物转化率大于60％，香兰素-α-D-葡萄糖苷的产物浓度高，转化率高。
(四)附图说明
图1香兰素-α-D-葡萄糖苷的结构示意图。
图2为pET28a-agl载体的结构示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。
LB培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
NYGB培养基(野油菜黄单胞菌的液体培养基)：蛋白胨5.0g/L，酵母提取粉3g/L，甘油20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
NYGA培养基(野油菜黄单胞菌菌种活化培养基)：蛋白胨5.0g/L，酵母提取粉3g/L，甘油20g/L，琼脂条20g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
种子培养基：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaHPO4·12H2O 8.9g/L、KH2PO43.4g/L、NH4Cl 2.67g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O 0.49g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。
发酵培养基：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、54mM甘油、2.8mM葡萄糖、25mMNa2HPO4、25mM KH2PO4、50mM NH4Cl、5mM Na2SO4、2mM MgSO4，溶剂为去离子水，pH7.0。
实施例1、制备生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂
1、野油菜黄单胞菌基因组DNA的提取
将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestrispv.campestris)CGMCC No.13990(已在专利申请CN107446844A中公开)于NYGA培养基上划线活化，在28℃培养36h，挑取一个单菌落于NYGB培养基中，在30℃、180rpm条件下震荡培养24h；用2mL离心管取1.5-3mL菌液，10000rpm离心2min，弃上清，用去离子水洗涤菌体2-3次；将收获的菌体用600μL细胞裂解液(40mM Tris-乙酸缓冲液pH 7.8，20mM乙酸钠，1mM EDTA，1％SDS)用移液器充分的吹打，并放于冰水静置5min；然后在冰上操作加入200μL 5mol/L NaCl来回颠倒8-10次，有白色沉淀形成；为去除杂蛋白和细胞碎片，在4℃下12000rpm离心10min；离心后取上清加入等体积的氯仿，缓慢来回颠倒50次，待形成一个乳白色的溶液，于12000rpm离心5min；再将上清转移到一个干净EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，轻轻的混匀，并放于冰水静置30min；静置完后，于12000rpm离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2-3次，然后在安全柜中用风机吹2-3min，最后加入50μL TE缓冲液溶解野油菜黄单胞菌基因组DNA，放于-20℃冰箱备用。
2、构建高效表达野油菜黄单胞菌葡萄糖基转移酶的大肠杆菌
以步骤1提取的野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990基因组DNA为模板，用以下引物进行PCR扩增：
agl-one-step-F：5’-ATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGTCGCAGACACCATG-3’；
agl-one-step-R：5’-GCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCAGCCACGACCGAC-3’。
采用南京诺维赞生物科技有限公司高保真DNA聚合酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，得到葡萄糖基转移酶基因片段agl，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
采用南京诺维赞生物科技有限公司一步法克隆试剂盒(One Step Cloning Kit)进行重组表达质粒pET28a-agl的构建。将用EcoRI和HindIII双酶切线性化后的pET28a质粒，使得插入片段PCR扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15-20bp)，在重组酶Exnase的催化下，使得插入片段PCR扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端同源互补，仅需要在37℃下反应30min即可重组完全，即可进行转化。
取20μL冷却的重组连接反应液，加入到200μL的E.coli RosettaTM(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激60s，冰水孵育3min。加入800μLLB培养基，37℃孵育45min使其抗性复苏。9000rpm离心2min，将菌体浓缩至100μL，均匀涂布在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
阳性克隆转化子的鉴定。直接在长有重组子的平板上挑取6个单菌落接种至含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基里，在37℃培养过夜。利用生工生物工程(上海)有限公司的SanPrep柱式质粒提取试剂盒，提取质粒，并酶切验证和测序验证，最终得到阳性克隆子含有的重组表达载体命名为pET28a-agl(图2)。
含重组质粒pET28a-agl的阳性克隆子E.coli RosettaTM(DE3)(pET28a-agl)命名为大肠杆菌(Escherichia coli)IFE-agl，即得到高效表达野油菜黄单胞菌葡萄糖基转移酶的大肠杆菌。
3、制备生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂
将大肠杆菌IFE-agl接种在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液。
将新鲜培养的种子液以体积浓度3％的接种量接种到含卡那霉素50μg/L发酵培养基中，35℃培养5h；加入终浓度为7.0mM的α-乳糖，控制发酵温度24℃，继续发酵12h，取发酵液，即得到生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂。
实施例2菌剂在生产香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用
一、菌剂的活性检测
取实施例1培养好的菌剂10mL，5000×g离心收集细胞，将0.3g细胞重新悬浮于10mL的pH7.0的50mM磷酸缓冲液中；加入终浓度7.6g/L的香兰素和终浓度400g/L的麦芽糖，在30℃、150rpm条件下水浴摇床催化30min。反应液用于HPLC分析。
液相色谱检测条件。样品前处理：100μL反应液，加入到900μL的0.01mol/L稀盐酸中；12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：Cl8柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：CH3OH(甲醇)：H2O＝35:65(体积比)；流速：1.0mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：272nm；进样量：10μL。底物香兰素的出峰时间一般为10min，产物香兰素-α-D-葡萄糖苷的出峰时间为4min。
经过30min转化反应，取转化液用于HPLC分析，测得形成的产物香兰素-α-D-葡萄糖苷浓度为10mmol/L，转化率为20％。
二、2L发酵罐中的菌剂制备及其在1L反应体系中连续补料转化的应用
1、菌种活化：大肠杆菌IFE-agl接种在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液。
2、2L发酵罐中的菌剂制备：将新鲜培养的种子液按照体积浓度5％的接种量，接种到1.5L含50μg/ml卡那霉素和质量浓度0.05％消泡剂的发酵培养基中，35℃培养5h；加入终浓度为7.0mM的α-乳糖，控制发酵温度24℃，继续发酵18h，得到用于生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的大肠杆菌IFE-agl发酵液，其湿菌体含量为30g/L。
3、1L发酵液中的连续补料转化：取步骤2制备的1L大肠杆菌IFE-agl发酵液，用2mol/L NaOH调节pH7.0。加入200g麦芽糖和5g香兰素，放在20℃水浴锅上，安装全自动机械搅拌器，100rpm下进行催化反应。反应开始30min后，每隔20min，添加1.0-2.0g香兰素。在2h的转化时间内，连续累计投入香兰素底物10g，香兰素-α-D-葡萄糖苷的生产量为7.8g/L，香兰素的转化率为35％。
4、1L发酵液中的连续补料转化：取步骤2制备的1L大肠杆菌IFE-agl发酵液，用2mol/L NaOH调节pH7.0。加入200g麦芽糖和5g香兰素，放在40℃水浴锅上，安装全自动机械搅拌器，100rpm下进行催化反应。反应开始30min后，每隔20min，添加1.0-2.0g香兰素。在4h的转化时间内，连续累计投入香兰素底物15g，香兰素-α-D-葡萄糖苷的生产量为20g/L，香兰素的转化率为60％。
5、1L发酵液中的连续补料转化：取步骤2制备的1L大肠杆菌IFE-agl发酵液，用2mol/L NaOH调节pH7.0。加入400g麦芽糖和5g香兰素，放在40℃水浴锅上，安装全自动机械搅拌器，100rpm下进行催化反应。反应开始20min后，每隔15-20min，添加1.0-2.0g香兰素。在4h的转化时间内，连续累计投入香兰素底物20g。香兰素-α-D-葡萄糖苷的生产量为34g/L，香兰素的转化率为75％。
香兰素-α-D-葡萄糖苷产物浓度检测。样品前处理：取100μL反应液，加入到900μL的0.01mol/L稀盐酸中；12000×g离心5min，用0.22μm滤膜过滤，将滤液加入液相样品瓶中；色谱柱：Cl8柱，250×4.6mm；柱温：25℃；流动相：CH3OH(甲醇)：H2O＝35:65(体积比)；流速：1.0mL·min-1；检测器：紫外检测器；检测波长：272nm；进样量：10μL。底物香兰素的出峰时间为10min，产物香兰素-α-D-葡萄糖苷的出峰时间为4min。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种葡萄糖基转移酶及其生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1617
<212> DNA
<213> 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestrispv.campestris)
<400> 1
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<210> 2
<211> 538
<212> PRT
<213> 野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestrispv.campestris)
<400> 2
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1 5 10 15
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85 90 95
Met Ile Asp Gln Val Leu Ser His Thr Ser Ile Ala His Val Trp Phe
100 105 110
Gln Glu Ser Arg Gln Asp Arg Ser Asn Pro Lys Ala Asp Trp Tyr Val
115 120 125
Trp Ala Asp Pro Arg Glu Asp Gly Thr Pro Pro Asn Asn Trp Leu Ser
130 135 140
Leu Phe Gly Gly Val Ala Trp Gln Trp Glu Pro Arg Arg Glu Gln Tyr
145 150 155 160
Tyr Leu His Asn Phe Leu Val Asp Gln Pro Asp Leu Asn Phe His Asn
165 170 175
Ala Glu Val Gln Gln Ala Thr Leu Asp Asn Val Arg Phe Trp Leu Asp
180 185 190
Arg Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Ile Asn Phe Cys Phe His
195 200 205
Asp Ala Gln Leu Arg Asp Asn Pro Ala Lys Pro Ala Asp Lys Arg Val
210 215 220
Gly Arg Gly Phe Ser Ala Asp Asn Pro Tyr Ala Tyr Gln Tyr His Tyr
225 230 235 240
Phe Asn Asn Thr Gln Pro Glu Asn Leu Pro Phe Leu Glu Arg Leu Arg
245 250 255
Gly Leu Leu Asp Ser Tyr Pro Gly Ala Val Ser Leu Gly Glu Ile Ser
260 265 270
Ser Glu Asp Ser Leu Ala Thr Thr Ala Glu Tyr Thr Ala Lys Gly Arg
275 280 285
Leu His Met Gly Tyr Ser Phe Glu Leu Leu Val Gln Asp Tyr Ser Ala
290 295 300
Ala Tyr Ile Arg Asp Thr Val Ser Arg Leu Glu Ala Thr Met Leu Glu
305 310 315 320
Gly Trp Pro Cys Trp Ala Ile Ser Asn His Asp Val Val Arg Ala Val
325 330 335
Thr Arg Trp Gly Gly Ala His Ala Thr Pro Ala Phe Ala Arg Met Val
340 345 350
Val Ala Leu Leu Cys Ser Leu Arg Gly Ser Ile Cys Leu Tyr Gln Gly
355 360 365
Glu Glu Leu Gly Leu Ser Glu Ala Glu Val Ala Phe Glu Asp Leu Gln
370 375 380
Asp Pro Tyr Gly Ile Thr Phe Trp Pro Thr Phe Lys Gly Arg Asp Gly
385 390 395 400
Cys Arg Thr Pro Met Pro Trp Thr Asp Ala Pro Ser Ala Gly Phe Thr
405 410 415
Ser Gly Lys Pro Trp Leu Pro Leu Ala Ala Ser His Arg Ala Ala Ala
420 425 430
Val Ser Val Gln Gln Asp Asp Ala His Ser Val Leu Ser Ala Val Arg
435 440 445
Asp Phe Leu Ala Trp Arg Lys Glu Met Pro Ala Leu Arg Glu Gly Ser
450 455 460
Ile Ala Phe Tyr Asp Thr Ala Glu Pro Val Leu Met Phe Arg Arg Glu
465 470 475 480
His Leu Gly Gln Val Met Leu Leu Ala Phe Asn Leu Ser Ala Asp Pro
485 490 495
Ala Asp Leu Ala Leu Pro Ala Gly Glu Trp Glu Gln Ile Asp Val Pro
500 505 510
Gly Val Glu Leu Gly Ala Met Glu Gly Gly His Leu Arg Leu Ala Gly
515 520 525
His Gly Val Val Ala Ala Val Gly Arg Gly
530 535

Claims (8)

1.一种源自野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestrispv.campestris）的葡萄糖基转移酶在生产香兰素-α-D-葡萄糖苷中的应用，其特征在于所述葡萄糖基转移酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述葡萄糖基转移酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述野油菜黄单胞菌为野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestrispv.campestris）CGMCC No. 13990。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用以含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液为菌剂，以麦芽糖和香兰素为底物，在pH值6.0~8.5、20-40℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得香兰素-α-D-葡萄糖苷。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述麦芽糖质量加入量以发酵液体积计为200-500g/L，所述香兰素加入的质量浓度以发酵液体积计为5-50g/L，所述发酵液中湿菌体含量为5-30 g/L。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述菌剂按如下方法制备：将含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌接种到含卡那霉素 50 μg/L发酵培养基中，30-37℃培养4-6 h；再加入终浓度为5.6-7.0mM的α-乳糖，22-25oC继续发酵12-18 h，取发酵液，即得到生产香兰素-α-D-葡萄糖苷的菌剂；所述发酵培养基组成：10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母粉、54mM 甘油、2.8 mM葡萄糖、25 mM Na2HPO4、25 mM KH2PO4、50 mM NH4Cl、5 mM Na2SO4、2 mM MgSO4，溶剂为去离子水，pH7.0。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述工程菌在发酵前先进行种子活化培养，再将种子液以体积浓度1-5%的接种量接种至发酵培养基，所述种子活化培养为：将含葡萄糖基转移酶编码基因的工程菌接种在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的种子培养基中，37℃培养至对数生长中期，获得种子液；所述种子培养基组成：酵母粉 5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaHPO4·12H2O 8.9 g/L、KH2PO4 3.4g/L、NH4Cl 2.67 g/L、Na2SO4 0.71g/L、MgSO4·7H2O 0.49 g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述转化反应是在发酵罐中进行连续补料反应：将发酵液加入发酵罐中，加入质量终浓度0.05%消泡剂，在pH值6.0-8.5、20-40℃条件下进行转化反应；在反应开始30min后，每隔20min补料香兰素；反应完全后，将反应液分离纯化，获得香兰素-α-D-葡萄糖苷。
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