CN114774390B - 来源于深海细菌的α-葡萄糖苷酶QsGH13的三维结构及其晶体制备和应用 - Google Patents

来源于深海细菌的α-葡萄糖苷酶QsGH13的三维结构及其晶体制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了来源于深海细菌的α‑葡萄糖苷酶QsGH13的三维结构及其晶体制备和应用。申请人通过结晶条件的筛选，获得了α‑葡萄糖苷酶QsGH13的晶体并通过X射线衍射的方法获得了其结构坐标，解析得到了其三维结构。一个晶体学不对称单位中有两个蛋白分子，该结构由20个β链和19个α螺旋组成，其中这些β链又形成5个β折叠片层。该晶体三维结构的解析将在食品、卫生等产业对人工筛选及改造酶的底物与酶活方面具有一定的应用前景，可在酒精发酵、糖类水解、化学合成等领域中推广应用。

Description

来源于深海细菌的α-葡萄糖苷酶QsGH13的三维结构及其晶体 制备和应用
技术领域
本发明涉及来源于深海细菌的α-葡萄糖苷酶QsGH13的三维结构及其晶体制备和应用。属于生物技术领域。
背景技术
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase EC:3.2.1.20)种类繁多，广泛分布在所有的生命体内，它能将多糖的非还原末端的α-1,4-糖苷键切开，并水解底物生成α-D-葡萄糖(水解作用)，或将游离的葡萄糖残基与低聚糖中的α-1,4-糖苷键结合生成α-1,6-糖苷键(转糖苷作用)，从而得到非发酵型的低聚糖。由于不同生命体生存的环境不同，导致不同来源的α-葡萄糖苷酶理化特征，生理功能各不相同。
海洋来源的糖苷酶通常具有与海洋环境相关的优良性质，例如温度稳定性、耐盐性、耐碱性、耐低温等等，因此，从海洋微生物中筛选出独具特性的α-葡萄糖苷酶就成了开发新型工业酶制剂的一个重要方向。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于深海细菌Qipengyuania seohaensis sp.SW-135的α-葡萄糖苷酶QsGH13的三维结构及其晶体制备方法和应用。
1、来源于深海细菌Qipengyuania seohaensis sp.SW-135的α-葡萄糖苷酶QsGH13的三维结构，分辨率为其参数为：
晶体结构空间群：P 21 21 21；
晶胞参数：α＝γ＝β＝90°；
I/σ(I)：14.36；
Rwork/Rfree：0.2112/0.2678；
分辨率范围50.00-2.20；
数据完整性(％)：99.40。
具体而言，深海细菌Qipengyuania seohaensis sp.SW-135的α-葡萄糖苷酶QsGH13的晶体三维结构中，一个晶体学不对称单位有两个蛋白分子，被称为A链与B链。每个分子由20个β链和19个α螺旋组成。具体组成如下：β折叠1，即含Ala11-Ile16的氨基酸区段，α螺旋1，即含Asp31-Gly46氨基酸区段，β折叠2，即含Asp48-Ser53的氨基酸区段，β折叠3，即含Phe55-Lys57的氨基酸区段，β折叠4，即含Asp69-Asp74的氨基酸区段，α螺旋2，即含Pro75-Gly78的氨基酸区段，α螺旋3，即含Thr79-Leu93的氨基酸区段，β折叠5，即含Lys96-Gln101的氨基酸区段，α螺旋4，即含His110-Arg117的氨基酸区段，β折叠6，即含Val129-Ala131的氨基酸区段，β折叠7，即含Ala151-Asp155的氨基酸区段，β折叠8，即含Gln160-His164的氨基酸区段，α螺旋5，即含Asn177-Glu193的氨基酸区段，β折叠9，即含Asp197-Asp202的氨基酸区段，α螺旋6，即含Ala203-Ala207的氨基酸区段，α螺旋7，即含Arg228-Phe232的氨基酸区段，α螺旋8，即含Asp243-Asp256的氨基酸区段，β折叠10，即含Phe262-Val267的氨基酸区段，α螺旋9，即含Asp271-Phe279的氨基酸区段，β折叠11，即含Asn287-Tyr290的氨基酸区段，α螺旋10，即含Thr301-Glu311的氨基酸区段，β折叠12，即含Trp320-Trp323的氨基酸区段，α螺旋11，即含Ala333-Cys338的氨基酸区段，α螺旋12，即含Thr339-Leu357的氨基酸区段，β折叠13，即含Asn360-Tyr365的氨基酸区段，α螺旋13，即含Gly366-Gly370的氨基酸区段，α螺旋14，即含Asp383-Trp390的氨基酸区段，α螺旋15，即含Arg396-Arg400的氨基酸区段，α螺旋16，即含Asn426-Ser430的氨基酸区段，α螺旋17，即含Val431-Asp437的氨基酸区段，α螺旋18，即含Ser440-Asn455的氨基酸区段，α螺旋19，即含Pro456-His460的氨基酸区段，β折叠14，即含His462-Asp469的氨基酸区段，β折叠15，即含Asp471-Ala479的氨基酸区段，β折叠16，即含Gln482-Leu490的氨基酸区段，β折叠17，即含Val495-Cys497的氨基酸区段，β折叠18，即含Arg503-Ile508的氨基酸区段，β折叠19，即含Thr514-Leu516的氨基酸区段，β折叠20，即含Ala520-Glu525的氨基酸区段。
所述三维结构的第202位天冬氨酸(Asp202)、第266位谷氨酸(Glu266)与第329位天冬氨酸(Asp329)构成催化活性中心。
2、具有前述三维结构的α-葡萄糖苷酶QsGH13晶体，所述α-葡萄糖苷酶QsGH13含528个氨基酸，分子量为59.3kDa。该晶体的三维结构具有图1、2中列出的原子坐标(x,y,z)±(1.0,1.0,1.0)确定的三维结构。
3、上述α-葡萄糖苷酶QsGH13晶体的制备方法，具体步骤如下：先将预先制备好的高纯度QsGH13蛋白浓缩至5～30mg/ml，接着使用结晶试剂盒作为晶体生长的初筛条件，采用悬滴气相扩散法进行结晶，得到衍射分辨率高的晶体；晶体培养在4～25℃进行，结晶液滴中蛋白溶液与结晶试剂体积比为3：1～1：3，结晶缓冲液的组成为：0.01～0.2M Tris-HCl(pH 7.0～10.0)，0.1～0.3M NaCl，质量浓度5～30％的分子量为1000～10000的PEG。
优选的，所述α-葡萄糖苷酶QsGH13的蛋白纯度在90％以上，进一步优选为95％以上，更进一步优选为98％以上。
优选的，所述QsGH13蛋白浓缩至10～20mg/ml，更进一步优选为浓缩至10mg/ml。
优选的，所述结晶试剂盒为商业购买而得，比如Hampton Research公司的结晶试剂盒Crystal Screen(CAT NO:HR2-110)；Crystal Screen 2(CAT NO:HR2-112)Index(CA TNO:HR2-144),SaltRx1/SaltRx2(CAT NO:HR2-107/109),PEG/Ion Screen(CAT N O:HR2-126)等。
优选的，蛋白溶液与结晶试剂的体积比为1：1。
优选的，结晶溶液的组成为：0.05～0.1M Tris-HCl(pH 8.0-8.5)，0.1～0.2MNaCl，质量浓度10～25％的分子量为1000～10000的PEG。
进一步优选的，结晶溶液的组成为：0.1M Tris-HCl(pH 8.5)，0.2M NaCl，质量浓度20％PEG3350。
4、上述α-葡萄糖苷酶QsGH13三维结构在药物筛选、食品加工、化工合成中的应用。
本发明的有益效果：
本发明利用结晶的方法得到了α-葡萄糖苷酶QsGH13的晶体并解析了其三维结构，对结构的分析与理解对α-葡萄糖苷酶QsGH13在临床检测，疾病的预防与治疗，生命体的代谢机理研究，以及酒精发酵，糖类水解，化学合成等化工领域应用广泛。
本发明的α-葡萄糖苷酶QsGH13含528个氨基酸，分子量为59.3kDa，在表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)plus中具有高度可溶性表达。申请人通过X射线衍射的方法获得了其三维结构，分辨率达到一个晶体学不对称单位中有两个蛋白分子，该结构由20个β链和19个α螺旋组成，其中这些β链又形成5个β折叠片层。该结构中第202位天冬氨酸残基(Asp202)，第266位谷氨酸残基(Glu266)与第329位天冬氨酸残基(Asp329)构成催化活性中心。
α-葡萄糖苷酶QsGH13具有良好的耐盐、耐碱的性质，其特异性底物为对硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷。该晶体三维结构的解析将在食品、卫生等产业对人工筛选及改造酶的底物与酶活方面具有一定的应用前景，可在酒精发酵、糖类水解、化学合成等领域中推广应用。
附图说明
图1为α-葡萄糖苷酶QsGH13的三维结构卡通示意图。
图2为α-葡萄糖苷酶QsGH13的拓扑结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
α-葡萄糖苷酶QsGH13的蛋白晶体制备
将来源于深海细菌Qipengyuania seohaensis sp.SW-135的α-葡萄糖苷酶QsGH13的蛋白进行表达纯化，获得适合结晶的高纯度的蛋白，浓缩至浓度为30mg/ml，使用商业结晶试剂盒(来自Hampton Research公司的结晶试剂盒Crystal Screen，Crystal Screen 2,In dex,SaltRx1/SaltRx2,PEG/Ion Screen等)作为晶体生长的初筛条件，采用悬滴气相扩散法进行结晶。本发明在多个不同的结晶试剂条件下获得了初始晶体。通过后期的优化调整，结晶液滴中蛋白溶液与结晶试剂体积比为1:1，结晶条件为0.1M Tris-HCl(pH 8.5),0.2M NaCl,20％PEG 3350。晶体培养在4℃进行，制备得到具有足够衍射能力的蛋白晶体。
实施例2
α-葡萄糖苷酶QsGH13的蛋白晶体的数据收集及结构解析
本发明将制备的蛋白晶体以质量浓度25％的PEG 3350作为防冻剂处理后，冻存于液氮中。晶体X射线衍射的数据收集在上海光源(SSRF)生物大分子晶体学光束线站(五线六站BL17U)进行，收集到一套分辨率为的X射线衍射数据。数据处理使用Xds gui，结构解析以α-葡萄糖苷转移酶xgtA(PDB ID:6AAV)为模型，采用分子置换法，利用Refmac程序并辅以Coot软件做进一步修正，最终解析得到α-葡萄糖苷酶QsGH13蛋白的三维结构(图1、图2)。本领域的普通技术人员可知，于其中所述晶体三维结构中的原子具有序列表中所列的至少40％的原子坐标，或者3D蛋白的晶体三维结构中至少40％氨基酸的主链碳骨架的原子结构坐标与图1中的坐标的平均根方差小于或等于/>的原子坐标，均可被认为与3D蛋白具有雷同结构。
具体而言，所述的α-葡萄糖苷酶QsGH13的晶体三维结构，一个晶体学不对称单位有两个蛋白分子，被称为A链与B链。每个分子由20个β链和19个α螺旋组成。以A链为例，具体组成如下：β折叠1，即含Ala11-Ile16的氨基酸区段，α螺旋1，即含Asp31-Gly46氨基酸区段，β折叠2，即含Asp48-Ser53的氨基酸区段，β折叠3，即含Phe55-Lys57的氨基酸区段，β折叠4，即含Asp69-Asp74的氨基酸区段，α螺旋2，即含Pro75-Gly78的氨基酸区段，α螺旋3，即含Thr79-Leu93的氨基酸区段，β折叠5，即含Lys96-Gln101的氨基酸区段，α螺旋4，即含His110-Arg117的氨基酸区段，β折叠6，即含Val129-Ala131的氨基酸区段，β折叠7，即含Ala151-Asp155的氨基酸区段，β折叠8，即含Gln160-His164的氨基酸区段，α螺旋5，即含Asn177-Glu193的氨基酸区段，β折叠9，即含Asp197-Asp202的氨基酸区段，α螺旋6，即含Ala203-Ala207的氨基酸区段，α螺旋7，即含Arg228-Phe232的氨基酸区段，α螺旋8，即含Asp243-Asp256的氨基酸区段，β折叠10，即含Phe262-Val267的氨基酸区段，α螺旋9，即含Asp271-Phe279的氨基酸区段，β折叠11，即含Asn287-Tyr290的氨基酸区段，α螺旋10，即含Thr301-Glu311的氨基酸区段，β折叠12，即含Trp320-Trp323的氨基酸区段，α螺旋11，即含Ala333-Cys338的氨基酸区段，α螺旋12，即含Thr339-Leu357的氨基酸区段，β折叠13，即含Asn360-Tyr365的氨基酸区段，α螺旋13，即含Gly366-Gly370的氨基酸区段，α螺旋14，即含Asp383-Trp390的氨基酸区段，α螺旋15，即含Arg396-Arg400的氨基酸区段，α螺旋16，即含Asn426-Ser430的氨基酸区段，α螺旋17，即含Val431-Asp437的氨基酸区段，α螺旋18，即含Ser440-Asn455的氨基酸区段，α螺旋19，即含Pro456-His460的氨基酸区段，β折叠14，即含His462-Asp469的氨基酸区段，β折叠15，即含Asp471-Ala479的氨基酸区段，β折叠16，即含Gln482-Leu490的氨基酸区段，β折叠17，即含Val495-Cys497的氨基酸区段，β折叠18，即含Arg503-Ile508的氨基酸区段，β折叠19，即含Thr514-Leu516的氨基酸区段，β折叠20，即含Ala520-Glu525的氨基酸区段。
晶体结构空间群：P 21 21 21；
晶胞参数：α＝γ＝β＝90°；
I/σ(I)：14.36；
Rwork/Rfree：0.2112/0.2678；
分辨率范围50.00-2.20；
数据完整性(％)：99.40。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
序列表
<110> 中南大学
<120> 来源于深海细菌的α-葡萄糖苷酶QsGH13的三维结构及其晶体制备和应用
<130> 2021
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 528
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Ser Gly Lys Leu Pro Trp Trp Lys Gly Ala Val Ile Tyr Gln Ile
1 5 10 15
Tyr Pro Arg Ser Phe Met Asp Ser Asn Gly Asp Gly Ile Gly Asp Leu
20 25 30
Pro Gly Ile Ala Gln Arg Leu Pro His Ile Ala Glu Leu Gly Ala Asp
35 40 45
Ala Ile Trp Ile Ser Pro Phe Phe Lys Ser Pro Met Lys Asp Phe Gly
50 55 60
Tyr Asp Val Ser Asp Tyr Cys Asp Val Asp Pro Ile Phe Gly Thr Leu
65 70 75 80
Glu Asp Phe Asp Ala Val Ile Ala Arg Ser His Glu Leu Gly Leu Lys
85 90 95
Val Leu Ile Asp Gln Val Tyr Ser His Thr Ser Asp Asp His Glu Trp
100 105 110
Phe Ala Glu Ser Arg Ser Asn Arg Asp Asn Pro Lys Ala Glu Trp Tyr
115 120 125
Val Trp Ala Asp Ala Lys Pro Asp Gly Ser Pro Pro Ser Asn Trp Gln
130 135 140
Ser Val Phe Gly Gly Pro Ala Trp Thr Trp Asp Ala Arg Arg Gly Gln
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu His Asn Phe Leu Ser Ser Gln Pro Gln Leu Asn Leu His
165 170 175
Asn Arg Glu Ala Gln Gln Ala Val Leu Asp Val Met Arg Phe Trp Leu
180 185 190
Glu Arg Gly Val Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Leu Asn Phe Ala Met
195 200 205
His Asp Pro Gln Leu Arg Asp Asn Pro Pro Ala Pro Pro Thr Asp Lys
210 215 220
Gln Arg Thr Arg Pro Phe Asp Phe Gln Leu Lys Thr Tyr Asn Gln Ser
225 230 235 240
His Ala Asp Ile Pro Ala Phe Ile Glu Arg Ile Arg Ala Leu Thr Asp
245 250 255
Glu Phe Asp Gly Ile Phe Thr Val Ala Glu Val Gly Gly Asp Asp Ala
260 265 270
Val Arg Glu Met Lys Ala Phe Thr Glu Gly Glu Thr His Leu Asn Ser
275 280 285
Ala Tyr Gly Phe Asn Phe Leu Tyr Ala Glu Ala Leu Thr Pro Gln Leu
290 295 300
Val Cys Ser Ala Leu Ala Glu Trp Pro Glu Glu Pro Asp Leu Gly Trp
305 310 315 320
Pro Ser Trp Ala Phe Glu Asn His Asp Ala Pro Arg Ala Leu Ser Arg
325 330 335
Trp Cys Thr Pro Glu Asp Arg Gln Ala Phe Ala Arg Leu Lys Thr Leu
340 345 350
Leu Leu Met Ser Leu Arg Gly Asn Ala Ile Leu Tyr Tyr Gly Glu Glu
355 360 365
Leu Gly Leu Thr Gln Val Asp Ile Pro Phe Asp Gln Leu His Asp Pro
370 375 380
Glu Ala Ile Ala Asn Trp Pro Leu Thr Leu Ser Arg Asp Gly Ala Arg
385 390 395 400
Thr Pro Met Pro Trp Asp Asp Ser Glu Cys Ala Gly Phe Gly Ser Thr
405 410 415
Ala Pro Trp Leu Pro Val Gly Asp Asp Asn Arg Pro Arg Ser Val Ala
420 425 430
Ala Gln Leu Gly Asp Ala Asn Ser Leu Leu Lys Phe Thr Arg Gln Ala
435 440 445
Ile Ala Leu Arg Lys Ala Asn Pro Ala Leu His His Gly His Val Val
450 455 460
Glu Cys Asn His Asp Gly Asp Leu Leu Glu Leu Val Arg Glu Ala Gly
465 470 475 480
Gly Gln Arg Leu Arg Cys Arg Phe Asn Leu Gly Ser Lys Pro Val Glu
485 490 495
Cys Asp Asp Cys Glu Gly Arg Thr Leu Leu Ala Ile Asn Gly Ala Glu
500 505 510
Pro Thr Ala Leu Pro Pro Phe Ala Ala Ile Ile Leu Glu Thr Asp Thr
515 520 525

Claims (9)

1.来源于深海细菌Qipengyuania seohaensis sp.SW-135的α-葡萄糖苷酶QsGH13晶体，其特征在于，其参数为：
晶体结构空间群：P 21 21 21 ；
晶胞参数：a=58.816 Å，b=129.920 Å，c=161.307 Å，α=γ=β=90°；
I/σ (I)：14.36 ；
Rwork/ Rfree：0.2112 /0.2678；
分辨率范围（Å）：50.00-2.20 ；
数据完整性（%）：99.40 ；
所述α-葡萄糖苷酶QsGH13的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的晶体，其特征在于，深海细菌Qipengyuania seohaensissp.SW-135的α-葡萄糖苷酶QsGH13的晶体三维结构中，一个晶体学不对称单位有两个蛋白分子，被称为A链与B链。每个分子由20个β链和19个α螺旋组成。具体组成如下：折叠1，即含Ala11-Ile16的氨基酸区段，α螺旋1，即含Asp31-Gly46氨基酸区段，β折叠2，即含Asp48-Ser53的氨基酸区段，β折叠3，即含Phe55-Lys57的氨基酸区段，β折叠4，即含Asp69-Asp74的氨基酸区段，α螺旋2，即含 Pro75-Gly78的氨基酸区段，α螺旋3，即含Thr79-Leu93的氨基酸区段，β折叠5，即含Lys96-Gln101的氨基酸区段，α螺旋4，即含His110-Arg117的氨基酸区段，β折叠6，即含Val129-Ala131的氨基酸区段，β折叠7，即含Ala151-Asp155的氨基酸区段，β折叠8，即含Gln160-His164的氨基酸区段，α螺旋5，即含Asn177-Glu193的氨基酸区段，β折叠9，即含Asp197-Asp202的氨基酸区段，α螺旋6，即含Ala203-Ala207的氨基酸区段，α螺旋7，即含Arg228-Phe232的氨基酸区段，α螺旋8，即含Asp243-Asp256的氨基酸区段，β折叠10，即含Phe262-Val267的氨基酸区段，α螺旋9，即含Asp271-Phe279的氨基酸区段，β折叠11，即含Asn287-Tyr290的氨基酸区段，α螺旋10，即含Thr301-Glu311的氨基酸区段，β折叠12，即含Trp320-Trp323的氨基酸区段，α螺旋11，即含Ala333-Cys338的氨基酸区段，α螺旋12，即含Thr339-Leu357的氨基酸区段，β折叠13，即含Asn360-Tyr365的氨基酸区段，α螺旋13，即含Gly366-Gly370的氨基酸区段，α螺旋14，即含Asp383-Trp390的氨基酸区段，α螺旋15，即含Arg396-Arg400的氨基酸区段，α螺旋16，即含Asn426-Ser430的氨基酸区段，α螺旋17，即含Val431-Asp437的氨基酸区段，α螺旋18，即含Ser440-Asn455的氨基酸区段，α螺旋19，即含Pro456-His460的氨基酸区段，β折叠14，即含His462-Asp469的氨基酸区段，β折叠15，即含Asp471-Ala479的氨基酸区段，β折叠16，即含Gln482-Leu490的氨基酸区段，β折叠17，即含Val495-Cys497的氨基酸区段，β折叠18，即含Arg503-Ile508的氨基酸区段，β折叠19，即含Thr514-Leu516的氨基酸区段，β折叠20，即含Ala520-Glu525的氨基酸区段。
3.根据权利要求1所述的晶体，其特征在于，所述三维结构的第202位天冬氨酸、第266位谷氨酸与第329位天冬氨酸构成催化活性中心。
4.权利要求1～3中任一项所述晶体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：先将预先制备好的高纯度QsGH13蛋白浓缩至5～30mg/ml，接着使用结晶试剂盒作为晶体生长的初筛条件，采用悬滴气相扩散法进行结晶，得到衍射分辨率高的晶体；晶体培养在4～25℃进行，结晶液滴中蛋白溶液与结晶试剂体积比为3：1～1：3，结晶试剂的组成为：0.01～0.2 MTris-HCl，0.1～0.3 M NaCl，质量浓度5～30%的分子量为1000～10000的PEG。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶QsGH13的蛋白纯度在90%以上。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述QsGH13蛋白浓缩至10～20mg/ml。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，蛋白溶液与结晶试剂的体积比为1：1。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，结晶试剂的组成为：0.05～0.1MTris-HCl，0.1～0.2M NaCl，质量浓度10～25% 的分子量为1000～10000的PEG。
9.权利要求1～3中任一项所述晶体在药物筛选、食品加工、化工合成中的应用。
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