CN114752580A

CN114752580A - 一种转糖基活性提高的α-糖苷酶突变体、编码基因及应用

Info

Publication number: CN114752580A
Application number: CN202210579317.XA
Authority: CN
Inventors: 朱林江; 陈路易; 陈小龙; 陆跃乐; 陈翰驰; 周家伟; 马志
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-05-25
Filing date: 2022-05-25
Publication date: 2022-07-15

Abstract

本发明涉及一种转糖基活性提高的α‑葡萄糖苷酶突变体及其编码基因，以及其在酶法制备香兰素‑α‑葡萄糖苷或乙基香兰素‑α‑葡萄糖苷中的应用，所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α‑葡萄糖苷酶第145位和/或第272位氨基酸突变而得。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种α‑葡萄糖苷酶突变体，显著提高了α‑葡萄糖苷酶的转糖基活性，克服了现有α‑葡萄糖苷酶转糖基活性低以及大量水解转糖基产物的问题，更适合工业应用。

Description

一种转糖基活性提高的α-糖苷酶突变体、编码基因及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种转糖基活性提高的α-糖苷酶突变体及其编码基因，以及其在酶法制备香兰素-α-葡萄糖苷或乙基香兰素-α-葡萄糖苷中的应用。

(二)背景技术

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)，又称α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的α-D-葡萄糖苷键，同时释放出α-D-葡萄糖和相应的配基。α-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物中，这类酶既能水解简单的α-葡萄糖苷，又能作用于含α-葡萄糖苷键的大分子，如多糖、糖蛋白和糖脂。此外，某些α-葡萄糖苷酶不仅具有水解功能，在体外合适的反应条件下还具有转α-葡萄糖苷的活性，合成葡萄糖苷化合物，应用于食品和医药行业。

高催化效率的α-葡萄糖苷酶工程菌株的获得主要通过诱变、筛选和酶分子改良获得。诱变分为自然突变和人工诱变，自然突变成功的几率非常小，人工诱变的工作量较大且有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质难以控制；而筛选的盲目性较大，不容易获得目的菌株；酶分子改良目的性强，针对酶分子具体结构分析进行改造，从而达到提高催化效率和转糖苷比率的目的，已成为最常用的技术手段。

(三)发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种转糖基活性提高的α-葡萄糖苷酶突变体及其编码基因，以及其在酶法制备香兰素-α-葡萄糖苷或乙基香兰素-α-葡萄糖苷中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种转糖基活性提高的α-葡萄糖苷酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡萄糖苷酶第145位和/或第272位氨基酸突变而得。

优选的，所述突变为下列之一：(1)第145位亮氨酸突变为异亮氨酸(SEQ IDNO.2)，(2)第272位丝氨酸突变为苏氨酸(SEQ ID NO.3)，(3)第145位亮氨酸突变为异亮氨酸，且第272位丝氨酸突变为苏氨酸(SEQ ID NO.4)。

与原始α-葡萄糖苷酶相比，本发明突变体更适合工业应用，在食品、医药、化妆品等领域具有更广泛的应用前景，从而扩大了α-葡萄糖苷酶在食品、医药、化妆品等领域提供了应用潜力。

所述突变体制备方法如下：

①采用PCR的方法定点突变含野生型α-葡萄糖苷酶基因的重组质粒，以获得高转糖基活性α-葡萄糖苷酶基因的重组质粒序列载体线性片段；

②将高转糖基活性的α-葡萄糖苷酶突变体序列载体线性片段用同源重组酶进行同源重组，以获得α-葡萄糖苷酶突变体表达载体；

③将突变体表达载体转化至E.coil BL21(DE3)，诱导表达，获得突变株。

本发明还涉及所述α-葡萄糖苷酶突变体的编码基因。

具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.5～7之一所示。

本发明还涉及含有所述编码基因的重组表达载体。这些重组载体可以用本领域常规方法将本发明的α-葡萄糖苷酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，例如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。

本发明还涉及含有所述编码基因的工程菌。作为一种重组表达载体的应用，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得基因工程菌。宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，主要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的α-葡萄糖苷酶突变体基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

本发明还涉及所述α-葡萄糖苷酶突变体在酶法制备香兰素-α-葡萄糖苷或乙基香兰素-α-葡萄糖苷中的应用。利用该α-葡萄糖苷酶突变体菌株以麦芽糖为糖基供体，以乙基香兰素为糖基受体，一步转糖基反应合成单一乙基香兰素糖苷。

具体的，所述应用为：以香兰素或乙基香兰素为糖基受体，以麦芽糖为糖基供体，加入所述α-葡萄糖苷酶突变体或其重组表达载体，在30～50℃、pH 5～7条件下进行一步转糖基反应，得到含有香兰素-α-葡萄糖苷或乙基香兰素-α-葡萄糖苷的催化液。

优选的，所述一步转糖基反应在45℃、pH 6.5条件下进行。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种α-葡萄糖苷酶突变体，显著提高了α-葡萄糖苷酶的转糖基活性，克服了现有α-葡萄糖苷酶转糖基活性低以及大量水解转糖基产物的问题，更适合工业应用。

(四)附图说明

图1为催化乙基香兰素转糖基反应时α-葡萄糖苷酶突变体与野生型的最适pH。

图2为催化乙基香兰素转糖基反应时α-葡萄糖酶突变体与野生型的最适温度。

图3为Agl与Agl-L145I/S272T催化乙基香兰素转糖基反应时，乙基香兰素与乙基香兰素-α-葡萄糖苷含量随时间的变化。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：表达宿主E.coli BL21(DE3)，源自Xanthomonas campestrispv.campestris 8004的α-葡萄糖苷酶野生型表达质粒载体pET28a为浙江工业大学生物工程研究所保存。

2、酶类及其它生化试剂：高保真酶与连接酶购自Vazyme公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。

(2)LB固体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂糖20g/L。

(3)发酵培养基：酵母粉12g/L，蛋白胨15g/L，甘油10g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 8.9g/L，KH₂PO₄ 3.4g/L，NH₄Cl 2.67g/L，Na₂SO₄ 0.71g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，pH6.9。

实施例1：突变酶基因表达载体的构建

本发明以Xanthomonas campestris pv.campestris 8004的α-葡萄糖苷酶Agl的重组载体为母本，采用PCR的方法，利用表1的定点突变引物对α-葡萄糖苷酶Agl的重组载体进行突变，获得的线性突变片段用同源重组酶连接成环状载体，其基因序列如SEQ IDNO.5/SEQ ID NO.6/SEQ IDNO.7所示。

表1：α-葡萄糖苷酶突变体L145I和S272T PCR特异性引物

实施例2：突变酶在大肠杆菌中的表达和纯化

将正确重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株Agl-L145I，Agl-S272T，Agl-L145I/S272T。从LB固体平板中挑取单菌落接种至50mL含50mg/mL kana的LB液体培养基中，37℃培养12h，然后按2％的接种量，将活化后的菌体接种至50mL含50mg/mL kana的发酵培养基中培养3h，往其中添加IPTG，使IPTG终浓度为0.5Mm从而诱导表达，进行诱导培养10h，诱导表达结束后，4℃、5000r/min离心5min收集菌体，使用pH 7.0的PBS溶液重悬后并采用柱层析纯化，通过SDS-PAGE蛋白电泳分析发现，纯化后的重组酶的大小约为60kDa，与理论值相符，说明蛋白表达成功。

实施例3：重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体和野生型的性质测定

1、重组高转糖基α-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适pH测定方法如下：

将实施例2纯化的重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体和在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。反应体系中含有的糖基供体为340g/L的麦芽糖，糖基受体为3.96g/L的乙基香兰素，以及20U提纯的重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体，不同的pH环境由不同种类的50mM缓冲液营造，醋酸钠为pH 4.0～5.5，PBS缓冲液为pH 6.0～8.0，BSP缓冲液为pH 8.0～9.0，反应体系在40℃下乙基香兰素的转糖基活力测定。结果(图1)表明，重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适反应pH一致(pH 6.5)，符合不改变最适pH值提高催化效率的目的。

2、重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适温度测定方法如下：

重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适温度的测定为在50mMPBS缓冲液(pH 6.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图2)表明，重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体的最适温度与野生型保持一致(45℃)。

3、重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体和野生型的转糖苷动力学参数测定方法如下:

测定反应的一级反应时间。确定测定K_m及V_max的反应时间为5min。用不同浓度的乙基香兰素为糖基受体，400g/L的麦芽糖为糖基供体，在PBS缓冲液(pH6.5)缓冲液体系中，45℃下测定酶活性，计算出其在45℃下的K_m值。突变体及野生酶动力学参数如表2所示：

表2：突变体及野生型对乙基香兰素转糖苷催化反应动力学参数

结果显示，高转糖基活性α-葡萄糖苷酶双突变体L145I/S272T最适pH为6.5，与野生型的一致，但是K_m值由27.12mM降低为6.17mM，即亲和力比野生型提高4.39倍；K_cat/K_m值由0.38mM^-1·s^-1提高至4.69mM^-1·s^-1，即转糖基催化效率提高12.3倍。

4、重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体和野生型转糖基生成乙基香兰素-α-葡萄糖苷测定方法如下：

重组高转糖基活性α-葡萄糖苷酶突变体和野生型，在它们共同最适温度(45℃)以及最适pH缓冲液体系(6.5,50mM PBS缓冲液)下进行酶促转糖基生成乙基香兰素-α-葡萄糖苷的反应。每一份反应体系为980μL的50mM PBS(pH 6.5)缓冲液，其中含有麦芽糖340g/L和糖基受体乙基香兰素3.96g/L，该空白体系在45℃下孵育10min，然后加入20μL纯化的Agl或Agl-L145I/S272T。将混合好的反应体系在45℃下振荡(1000rpm)反应0-600min，通过将100μL反应液添加到900μL 0.1M HCl中来终止反应。通过HPLC分析不同时间点乙基香兰素-α-葡萄糖苷生成情况来比较Agl与Agl-L145I/S272T合成乙基香兰素-α-葡萄糖苷的能力。

结果显示(图3)，在反应开始后的1h内，乙基香兰素-α-葡萄糖苷产量迅速增加，直到其在Agl与Agl-L145I/S272T催化的反应中都达到最大值；随后，随着反应时间的延长，可以观察到乙基香兰素-α-葡萄糖苷的水解，而Agl-L145I/S272T反应体系内水解的乙基香兰素-α-葡萄糖苷的量明显比Agl反应体系低。Agl的乙基香兰素-α-葡萄糖苷产量在30min时达到最大值(41.1％，3.25g/L)，而Agl-L145I/S272T在50min时达到最大值(52.8％，4.17g/L)。Agl-L145I/S272T的最大转化率相比Agl提高了11.7％。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种转糖基活性提高的α-糖苷酶突变体、编码基因及应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 538

<212> PRT

<213> Xanthomonas campestris

<400> 1

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1 5 10 15

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Gly Ile Ile Ala Lys Leu Asp Tyr Ile Ala Gly Leu Gly Val Asp Ala

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50 55 60

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<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

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<212> PRT

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305 310 315 320

Gly Trp Pro Cys Trp Ala Ile Ser Asn His Asp Val Val Arg Ala Val

325 330 335

Thr Arg Trp Gly Gly Ala His Ala Thr Pro Ala Phe Ala Arg Met Val

340 345 350

Val Ala Leu Leu Cys Ser Leu Arg Gly Ser Ile Cys Leu Tyr Gln Gly

355 360 365

Glu Glu Leu Gly Leu Ser Glu Ala Glu Val Ala Phe Glu Asp Leu Gln

370 375 380

Asp Pro Tyr Gly Ile Thr Phe Trp Pro Thr Phe Lys Gly Arg Asp Gly

385 390 395 400

Cys Arg Thr Pro Met Pro Trp Thr Asp Ala Pro Ser Ala Gly Phe Thr

405 410 415

Ser Gly Lys Pro Trp Leu Pro Leu Ala Ala Ser His Arg Ala Ala Ala

420 425 430

Val Ser Val Gln Gln Asp Asp Ala His Ser Val Leu Ser Ala Val Arg

435 440 445

Asp Phe Leu Ala Trp Arg Lys Glu Met Pro Ala Leu Arg Glu Gly Ser

450 455 460

Ile Ala Phe Tyr Asp Thr Ala Glu Pro Val Leu Met Phe Arg Arg Glu

465 470 475 480

His Ala Gly Gln Val Val Leu Leu Ala Phe Asn Leu Ser Ala Asp Pro

485 490 495

Ala Asp Leu Ala Leu Pro Ala Gly Glu Trp Glu Gln Val Asp Val Pro

500 505 510

Gly Val Glu Leu Gly Ala Met Asp Gly Gly His Leu Arg Leu Ala Gly

515 520 525

His Ala Val Val Ala Ala Val Gly Arg Gly

530 535

<210> 5

<211> 1617

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

atgtcgcaga caccatggtg gcgcggggcc gtcatttatc agatttatcc gcgtagtttt 60

ctggattcca atggcgatgg cgtaggcgat ctgccgggca tcattgccaa gctcgactac 120

atcgccgggc tgggagtaga tgcgatctgg atttcgcctt ttttcaagtc gccgatggcc 180

gatttcggct atgacatcgc agactatcgc gcggtggacc cgttgttcgg gtcgttggtc 240

gatttcgatc gcttgctcga aaaggcacat ggccttgggt tgaaagtgat gatcgatcag 300

gtactgagcc attcctcgat cgcgcatgtg tggtttcagg agagccgaca ggaccggagc 360

aacccgaagg ctgattggta cgtgtgggcc gatccgcgcg aggatggaac gccgccgaac 420

aactggctgt cgatctttgg tggggtcgca tggcagtggg agccgcggcg tgagcagtac 480

tacctgcaca actttctggt ggaccagccc gatctcaatt tccacaacgc cgaggtgcag 540

caggcaacgc tcgataacgt gcggttctgg ctcgatcgcg gtgtggatgg gttccgtctg 600

gatgcgatca acttctgctt tcacgacgcg caactgcgcg ataacccggc caagccggca 660

gacaagcggg tggggcgcgg cttcagcgcg gacaatcctt acgcctacca gtatcattac 720

ttcaacaaca cgcagccgga aaatctagcg ttcctcgagc gcctgcgcgg gctgctggat 780

ctttatccga atgcagtgag ccttggcgag atctcgtcgg aagattcgct ggccaccacc 840

gccgaataca ccgcccaggg ccgcttgcat atgggctaca gcttcgagct gctggtgcag 900

gattacagcg ctgcctacat ccgcgacacc gtaagccggc tcgaggccac catgttggag 960

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ggatcgatct gcctatatca gggcgaagag ctcgggctca gtgaggcaga ggtggcgttc 1140

gaggacctgc aggatccgta tggaataact ttctggccga ccttcaaggg ccgggatggc 1200

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tggctgccgt tagctgcgtc gcatcgtgcc gctgctgtga gcgtgcaaca ggatgatgcg 1320

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cgtgagggat ccatcgcttt ctacgacacg gccgaaccgg tgctgatgtt ccgccgcgaa 1440

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aactggctgt cgttgtttgg tggggtcgca tggcagtggg agccgcggcg tgagcagtac 480

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ttgcctgcag gcgagtggga gcaggtcgat gtacctggtg tcgagcttgg ggcgatggat 1560

ggcggacacc taaggctggc cgggcatgcg gtcgttgctg ctgtcggtcg tggctga 1617

Claims

1.一种转糖基活性提高的α-葡萄糖苷酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡萄糖苷酶第145位和/或第272位氨基酸突变而得。

2.如权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于所述突变为下列之一：(1)第145位亮氨酸突变为异亮氨酸，(2)第272位丝氨酸突变为苏氨酸，(3)第145位亮氨酸突变为异亮氨酸，且第272位丝氨酸突变为苏氨酸。

3.权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体的编码基因。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.5～7之一所示。

5.含有权利要求3所述编码基因的重组表达载体。

6.含有权利要求3所述编码基因的工程菌。

7.权利要求1所述α-葡萄糖苷酶突变体在酶法制备香兰素-α-葡萄糖苷或乙基香兰素-α-葡萄糖苷中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为：以香兰素或乙基香兰素为糖基受体，以麦芽糖为糖基供体，加入所述α-葡萄糖苷酶突变体或其重组表达载体，在30～50℃、pH 5～7条件下进行一步转糖基反应，得到含有香兰素-α-葡萄糖苷或乙基香兰素-α-葡萄糖苷的催化液。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述一步转糖基反应在45℃、pH 6.5条件下进行。