CN105385700A

CN105385700A - 一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法和重组工程菌及其构建方法和应用

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Publication number: CN105385700A
Application number: CN201510680846.9A
Authority: CN
Inventors: 陈小龙; 王益栋; 范永仙; 陆跃乐
Original assignee: Deqing Juesheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2015-10-20
Publication date: 2016-03-09

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建、表达和应用，所述的葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列为SEQIDNo.1，其基因来源于<i>Xanthomonascampestrispv.campestris</i>。本发明利用一步法克隆试剂盒用于基因的克隆，并将目的基因连接到pET系列载体中，并导入大肠杆菌Rosetta(DE3)[FompThsdS_B(r_Bm_B)galdcm(DE3)pRARE²(Cam^R)]中。对重组大肠杆菌利用乳糖作为诱导剂进行蛋白表达优化，并对葡萄糖基转移酶催化合成α-熊果苷的酶学性质进行研究。采用本发明优化后生产α-熊果苷的产量达21-30g/L，对苯二酚转化率可达90%以上，且反应时间在2-4h之间，利用此大肠杆菌重组工程菌进行α-熊果苷的生产具有良好的工业前景。

Description

一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法和重组工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于酶的基因工程和酶的生化工程领域，涉及一种野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris ）的葡萄糖基转移酶的序列，涉及含有该酶基因的制备方法、重组工程菌和应用。

背景技术

熊果苷(Arbutin)化学名称为对-羟基苯-D-吡喃葡萄糖苷，最早发现于熊果叶中，其有两种差向异构体，即α和β型熊果苷。熊果苷最初应用于药物中，有抗菌、消炎、利尿、镇咳的作用。自上世纪80年代，研究发现熊果苷作为酪氨酸酶的竞争抑制剂，能抑制黑素形成过程中关键酶酪氨酸酶的活性，因此有美白的效果。日本资生堂公司首先将熊果苷应用于美白化妆品中，目前国内外也有多家厂商将熊果苷添加美白类化妆品中。故熊果苷有很大的市场应用前景。

通过相关研究发现，β-熊果苷在β-葡萄糖苷酶的作用下可转化为氢醌，而氢醌因具有潜在的致敏性和致癌性，除美甲和染发类化妆品外，在其他化妆品中为禁用物质。相对于β-熊果苷，α-熊果苷具有更好的生物稳定性和美白活性，由于其抑制酪氨酸酶的原理的差异，导致α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的15倍。按照目前的技术，β-熊果苷几乎都是由化学法合成，而α-熊果苷仅限于通过生物转化法合成。

随着基因工程技术的发展，通过克隆葡萄糖基转移酶基因实现其在大肠杆菌中的过量表达，这样可以降低生产周期，提高生产效率，更加有利于工业化生产。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法，本发明的第二个目的是提供所述基因的重组工程菌和其应用。本发明运用基因工程技术，将野油菜黄单胞菌野油菜致病变种中的葡萄糖基转移酶基因进行克隆，并导入大肠杆菌中进行重组表达，从而提供一种高效、绿色、安全、低成本的一步法催化对苯二酚生产α-熊果苷的方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

本发明提供了一种葡萄糖基转移酶基因，所述的葡萄糖基转移酶基因是从野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris ）中克隆而来，所述的葡萄糖基转移酶核苷酸序列为SEQ ID No.1。

本发明提供了一种葡萄糖基转移酶基因，所述的葡萄糖基转移酶核苷酸序列为SEQ ID No.1，其命名为agl，全长为1617bp，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.2，蛋白质的氨基酸数为538个氨基酸。

本发明还涉及从NCBI数据库上获得葡萄糖基转移酶基因的序列，并设计引物。由于实验采用一步法克隆试剂盒（One Step Cloning Kit）进行克隆，可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。其引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列（15-20bp）。

作为优选，按如上方法设计引物为:agl-one-step-F：5’-GAAGGAGATATACCATGTCG CAGACACCATG-3’；agl-one-step-R:5’-AGTGCGGCCGCAAGCTTCAGCCACGACCGAC-3’。

上述的葡萄糖基转移酶基因的重组工程菌。

本发明以Xcc基因组DNA为模板，通过引物退货温度优化获得一个最佳的退火温度，PCR获得葡萄糖基转移酶基因。同时本发明要对载体进行线性化处理，按照操作说明，采用双酶切线性化，因为该法线性化完全，转化背景低。上述的重组工程菌的构建方法，该重组工程菌的载体用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切线性化后，将两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶Exnase的催化下，在37℃下反应30min重组完全，完成定向克隆。

所述葡萄糖基转移酶基因重组工程菌的构建，本发明所述的重组表达载体通过本领域一种最新技术将本发明的葡萄糖基转移酶基因连接于各种表达载体上构建而成。实验室常用的载体有pMD 19-T、pUCM-T、pET20b、 pET22b、pET28a、pET32a等。本发明考虑到目的基因的表达严谨性，选择pET28a作为重组载体。

本发明涉及一种由上述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌。发明通过将上述重组表达载体转化到大肠杆菌表达宿主中，由于大肠杆菌表达外源基因具有明显的优势，例如对其进行全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架，代谢途径清晰；基因克隆表达系统成熟完善；繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定；被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。本发明优选大肠杆菌Rosetta™(DE3) [F− ompT hsdSB(rB− mB− ) gal dcm (DE3) pRARE2 (CamR)]，该感受态细胞用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。该菌株是携带氯霉素抗性质粒BL21的衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA, AGG, AGA, CUA,CCC, GGA)对应的tRNA，提高外源基因在原核系统中的表达水平。本法明将上述的重组载体pET28a-agl通过热机转化法转化至Rosetta™(DE3)中，即可获得本发明优选重组基因工程菌，即Rosetta™(DE3)/ pET28a-agl。

本发明还提供了所述的重组工程菌诱导剂葡萄糖基转移酶的方法，该方法包括以下的步骤：重组工程菌接种至含有卡那霉素（50μg/mL）和氯霉素（35μg/mL）的LB培养基中过夜培养10-12h，再以1~3%的接种量转接至同上的LB培养基中，当转接2-3h后，加入终浓度为0.1-10g/L的乳糖（优选1g/L），放到20-30℃（优选28℃）的摇床上，诱导表达8~15h，高效表达葡萄糖基转移酶。

由于发明采用pET系列载体为表达载体，其上含有乳糖操纵子，考虑到诱导成本，本发明采用乳糖作为诱导剂，对重组菌的蛋白表达进行优化。分别对乳糖的诱导时机，乳糖的诱导浓度，重组工程菌的诱导温度等进行优化，获得蛋白最大的表达量，高效表达葡萄糖基转移酶。发明所述的乳糖诱导优化的培养基为细菌培养常用培养基Luria-Bertani培养基，简称LB：配制每升培养基，在950 ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L。在15psi高压下蒸汽灭菌20min。

一种葡萄糖基转移酶催化对苯二酚生成α-熊果苷的方法，该方法包括以下的步骤：将制备的携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的湿菌体，使其破碎离心液作为催化剂，以1%-2%对苯二酚为底物，10%-40%麦芽糖为辅助底物（通过水解α-1，4糖苷键使其产生两个葡萄糖，反应过程中水解产生葡萄糖并非处于游离状态，而是与酶局限在很近的距离，彼此之间存在某种作用力互相牵制使其处于过渡状态，与对苯二酚的酚羟基发生糖基化反应），在pH 7.0的100mM磷酸钠缓冲液中，在180rpm，30℃条件下反应24h。

与现有的技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明克服了利用野油菜黄单胞菌野生菌培养时，较难获得足够的催化剂用于α-熊果苷的合成和较长的催化周期，并且菌体培养液中存在黄原胶，对于后期产物分离纯化造成阻碍。而本发明利用重组大肠杆菌催化合成α-熊果苷，可以在短时间内获得高密度的重组菌体用于催化合成α-熊果苷，并且大大的缩短的催化周期，使其生产α-熊果苷的产量达21-30g/L，对苯二酚转化率可达90%以上，且反应时间在2-4h之间，因此利用此大肠杆菌重组工程菌进行α-熊果苷的生产具有良好的工业前景。

附图说明

图1为野油菜黄单胞菌的基因组DNA电泳图，M₁和M₂分别为10000bp Marker和λ-Hind Ⅲ digest Marker， 1和2都为野油菜黄单胞菌的基因组DNA。

图2为agl基因梯度PCR电泳图，M为2000bp Marker，1是以50℃为退火温度进行PCR,2是以51.6℃为退火温度进行PCR，3是以54.1℃为退火温度进行PCR，4是以57.1℃为退火温度进行PCR，5是以61.2℃为退火温度进行PCR，6是以54.5℃为退火温度进行PCR，7是以66.7℃为退火温度进行PCR，8是以68℃为退火温度进行PCR。

图3 线性化的载体和葡萄糖基转移酶基因的电泳图，M₁和M₂分别为10000bp Marker和2000bp Marker，1为线性化的载体，2为葡萄糖基转移酶基因。

图4为重组转化子质粒电泳图，M为10000bp Marker,1为pET28a质粒，pRARE2为Rosetta™(DE3)菌株自带的质粒，2-7都为挑取的重组转化子质粒。

图5为以重组转化子为模板的质粒PCR, M为2000bp Marker,1是以pET28a为模板的PCR,2-7都为挑取的重组转化子质粒为模板的质粒PCR。

图6为构建的重组大肠杆菌的蛋白电泳图，M为150 kDa Marker，1为Rosetta™(DE3)空白对照,2为Rosetta™(DE3)/ pET28a-agl葡萄糖基转移酶的蛋白电泳图。

图7为构建的质粒谱图。

图8为底物浓度对催化反应的影响。

图9为温度对葡萄糖基转移酶酶活的影响。

图10为pH对葡萄糖基转移酶酶活。

图11为金属离子对糖基转移酶酶活的影响。

图12为糖基转移酶酶活的反应进程。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实例中所用的NYGB培养基：野油菜黄单胞菌的液体培养基，每升含蛋白胨5.0 g,酵母提取粉3 g, 甘油20 g, pH 7.0。

NYGA培养基：野油菜黄单胞菌菌种活化，每升含蛋白胨5.0 g,酵母提取粉3 g, 甘油20 g, 琼脂条20 g，pH 7.0。

LB培养基：大肠杆菌液体培养，每升含有胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0。

LB固体培养基：大肠杆菌活化和纯化，每升含有胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂条20 g，pH 7.0。

实施例1野油菜黄单胞菌野油菜致病变种基因组DNA的制备

将野油菜黄单胞菌于NYGA培养基上划线活化，在28℃培养36h，挑取一个单菌落于NYGB培养基中，在30℃、180rpm条件下震荡培养24h；用2mL离心管取1.5-3mL菌液，10000rpm离心2min，弃上清，用去离子水洗涤菌体2-3次；将收获的菌体用600μL细胞裂解液（40mM Tris-乙酸缓冲液 pH 7.8，20mM乙酸钠，1mM EDTA，1% SDS）用移液器充分的吹打，并放于冰水静置5min；然后在冰上操作加入200μL 5mol/L NaCl来回颠倒8-10次，有白色沉淀形成；为去除杂蛋白和细胞碎片，在4℃下12000rpm离心10min；离心后取上清加入等体积的氯仿，缓慢来回颠倒50次，待形成一个乳白色的溶液，于12000rpm离心5min；再将上清转移到一个干净EP管中，加入2倍体积的无水乙醇，轻轻的混匀，并放于冰水静置30min；静置完后，于12000rpm离心5min，沉淀用70%乙醇洗涤2-3次，然后在安全柜中用风机吹2-3min，最后加入50μL TE缓冲液溶解基因组DNA，取2μL溶液用来跑琼脂糖电泳验证，如图1在电泳孔附近有一个较大分子量的条带，剩下的放于-20℃冰箱备用。

实施例2目的基因的克隆

根据从NCBI数据库上获得葡萄糖基转移酶基因的序列和一步法克隆试剂盒（One Step Cloning Kit）引物设计总的原则，按如上方法设计引物为:

agl-one-step-F：5’-GAAGGAGATATACCATGTCGCAGACACCATG-3’；

agl-one-step-R：5’-AGTGCGGCCGCAAGCTTCAGCCACGACCGAC-3’。

以野油菜黄单胞菌基因组DNA为模板，agl-one-step-F/ agl-one-step-R为引物PCR扩增agl基因，由于设计的引物的退火温度差异较大，故本发明先做了一个退火温度优化，PCR体系为：

ddH₂O	5.1μL
		2×PCR Buffer for KOD FX	10μL
2Mm dNTPs	2μL
		10pmol/μL agl-one-step-F	1μL
10pmol/μL agl-one-step-R	1μL
		野油菜黄单胞菌基因组DNA	0.5μL
KOD FX	0.4μL
			20μL

PCR程序：94℃,2min；(98℃，10s；50/68℃，30s；68℃，2min) x30；68℃，10min；4℃,∞。PCR扩增产物的琼脂糖电泳如图2所示，退火温度从50℃到68℃，目的条带开始的时候比较弥散，到68℃时目的条带比较清晰和明亮，综上所述，选择以68℃为退火温度，并按照TOYOBO试剂的说明书上指导，PCR程序按二步循环法进行克隆。PCR体系同上。PCR程序：94℃,2min；(98℃，10s；68℃，2min) x30；68℃，10min；4℃,∞。以上PCR扩增产物采用PCR CLEAN试剂盒清洗（购自Axygen）。

载体线性化，取-20℃甘油保存的pET28a菌种100μL加入到装有50ml新鲜无菌的LB培养基中（50μg/ml的卡那霉素），37℃培养过夜。利用生工SanPrep柱式质粒提取试剂盒，提取pET28a质粒。将制备的pET28a质粒用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切线性化后，用PCR CLEAN试剂盒清洗（购自Axygen）。如图3所示1泳道是线性化的载体大概在5500bp左右，2泳道是PCR扩增产物大概在1600bp左右。

实施例3一步克隆法构建重组质粒

将用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切线性化后的pET28a质粒，使得插入片段PCR扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列（15-20bp），在重组酶Exnase的催化下，使得插入片段PCR扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端同源互补，仅需要在37℃下反应30min即可重组完全，即可进行转化，完成定向克隆，重组质粒具体如图7所示。本发明于冰水中配置如下反应体系：

ddH₂O	Up to 20μL
		5×CE Ⅱ Buffer	4μL
线性化载体	4μL
		插入片段PCR扩增产物	2μL
Exnase Ⅱ	2μL

体系配置完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡。并置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。之后，反应产物直接进行转化。

取20μL冷却反应液，加入到200μL Rosetta™(DE3)感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰水浴中放置30min。42℃热激60s，冰水孵育3min。加入800 μL LB培养基，37℃孵育30min使其抗性复苏。9000rpm离心2min，将菌体浓缩至100μL，均匀涂布在含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。

重组子的鉴定，直接在长有重组子的平板上，直接挑取6个单菌落含有35μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基里，在37℃培养过夜。利用生工SanPrep柱式质粒提取试剂盒，提取质粒，并进行琼脂糖电泳。如图4所示，泳道1为pET28a质粒，pRARE2为Rosetta™(DE3)菌株自带的质粒，泳道2-7都为挑取的重组转化子质粒，相比较得出从上到下第二条带为pET28a-agl重组质粒，上到下第一条带为pET28a-agl质粒的不同螺旋结构，初步说明重组构建成功。

为了进一步验证，将上述质粒，以agl-one-step-F/ agl-one-step-R为引物进行质粒PCR,并进行琼脂糖电泳。如图5所示，泳道1是以pET28a为模板的PCR,泳道2-7都为挑取的重组转化子质粒为模板的质粒PCR，在图上泳道2-7上在1600bp位置都有一条明亮的条带。进一步说明重组质粒构建成功，并送样品进行测序，验证序列正确。

实施例4葡萄糖基转移酶的表达

将实施例3验证成功的含有质粒的重组大肠杆菌Rosetta™(DE3)/ pET28a-agl，分别挑取两个重组子挑到装有50ml新鲜无菌的LB培养基中（50μg/ml的卡那霉素、和35μg/ml的氯霉素），37℃过夜培养10h。再以2%的接种量转接到装有50ml新鲜无菌的LB培养基中（50μg/ml的卡那霉素、和35μg/ml的氯霉素），在重组菌转接120min，向摇瓶中加入终浓度0.5mM的IPTG，然后28℃继续诱导10h，培养结束后，取100μL的菌液放于4℃冰箱中，用于跑SDS-PAGE电泳，剩余的于4℃、 8000rpm 离心10min收获菌体，接着菌体用50mM的pH 7.2 磷酸盐缓冲液洗涤3次，将菌体放置在4℃冰箱保存。如图6所示，在50-70kDa中间存在一个明显过量表达的蛋白，证实了葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中表达了。

实施例5重组葡萄糖基转移酶工程菌催化α-熊果苷合成

将携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的100mg/mL湿菌体作为催化剂，以1%对苯二酚为底物，40%麦芽糖为辅助底物，在pH 7.0的100mM磷酸钠缓冲液中,在180rpm，30℃条件下反应24h，用0.01mol/L HCL稀释反应液10倍，然后用HPLC检测其酶活性。

采用液相色谱检测的条件为：C_l8柱色谱柱，250x4.6 mm；柱温：25℃；流动相： CH₃OH：H₂O：C₂HF₃O₂=90：10：0.1；流速：0.8mL·min^-1；检测器：紫外检测器；检测波长：287nm；进样量：10μL。

结果显示，该工程菌的α-熊果苷的产量达21.3g/L，对苯二酚转化率可达90%以上, 对苯二酚选择性也达90%以上。

实施例6重组基因工程菌乳糖诱导pET载体表达重组蛋白

取-20℃保存的菌种100μL加入到装有50ml新鲜无菌的LB培养基中（50μg/ml的卡那霉素、和35μg/ml的氯霉素），37℃过夜培养10h。再以2%的接种量转接到装有50ml新鲜无菌的LB培养基中（50μg/ml的卡那霉素、和35μg/ml的氯霉素），在重组菌转接120min，向摇瓶中加入250 μL20%的乳糖溶液，至终浓度为0.5g/L，然后28℃继续诱导10h，培养结束后，于4℃、 8000rpm 离心10min收获菌体，接着菌体用50mM的pH 7.2 磷酸盐缓冲液洗涤3次，将菌体放置在4℃冰箱保存。

将获得的湿菌体进行超声破碎：以50mg/ml的菌体浓度悬浮于50mM 磷酸盐平衡缓冲液中(pH 7.2，20 g/L NaCl)，在冰水混合物中，以30%功率，工作2秒，间隔6秒，总时长90min，中间跟换几次冰水混合物。待菌液澄清后，于4℃、15000rpm离心10min，取上清于4℃保存，并跑蛋白电泳验证。

实施例7重组基因工程菌酶学性质研究

1底物浓度对催化反应的影响

将携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的50mg/mL湿菌体，使其破碎离心液作为催化剂，以0.5%-5%对苯二酚为底物，40%麦芽糖为辅助底物，在pH 7.0的100mM磷酸钠缓冲液中,在180rpm，30℃条件下反应24h，用0.01mol/L HCL稀释反应液10倍，然后用HPLC检测其酶活性。结果如图8所示，最佳的底物浓度在1%-1.5%之间，当底物浓度大于1.5%时，底物对于酶活具有明显的抑制。

2温度对葡萄糖基转移酶酶活的影响

将携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的50mg/mL湿菌体，使其破碎离心液作为催化剂，以1.1%对苯二酚为底物，40%麦芽糖为辅助底物，在pH 7.0的100mM磷酸钠缓冲液中,分别在16、20、25、30、35、40、50℃温度下反应180min，反应结束时用0.01M 盐酸溶液稀释10倍来终止反应，并用HPLC检测。结果如图9所示，在16-30℃，酶活缓慢增加，在30-35℃酶活达到最高，当温度大于40℃时酶活显著降低。说明该酶对高温比较敏感，故选择催化温度是宁可温度第一点也不要选择高温。

3 pH对葡萄糖基转移酶酶活

通过配置100mM的醋酸钠缓冲液（pH为4.0、4.5、5、5.5），100mM的磷酸钠缓冲液（pH为6.0、6.5、7、7.5、8.0）。将携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的50mg/mL湿菌体，使其破碎离心液作为催化剂，以1.1%对苯二酚为底物，40%麦芽糖为辅助底物，在不同缓冲体系中，于30℃下反应180min，反应结束时用0.01M 盐酸溶液稀释10倍来终止反应，并用HPLC检测。结果如图10所示，该酶在4.0-5.0之间酶活比较低，由于该酶的等电点在4.5附近，而如图10所示其最佳的反应pH在6.5-7.0之间，说明该酶比较适合在弱酸和中性的缓冲体系下反应，并且该酶不耐酸碱，同时碱性环境下底物比较容易氧化，故应选择一个弱酸和中性的缓冲体系用于催化反应。

4 金属离子对糖基转移酶酶活的影响

称取相应可溶性金属离子盐配制1mM Ba²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、K⁺金属离子储液，将携带有葡萄糖基转移酶的重组工程菌经培养离心获得的50mg/mL湿菌体，使其破碎离心液作为催化剂，以1.1%对苯二酚为底物，40%麦芽糖为辅助底物，在pH 7.0的100mM磷酸钠缓冲液中，使其在30℃反应180min，反应结束时用0.01M盐酸溶液稀释10倍来终止反应，并用HPLC检测。结果如图11所示，其中Mn²⁺可使酶活损失10%左右，而Cu²⁺可使酶活损失几乎100%，而K⁺可使酶活增加20%左右，故可以使用K⁺缩短反应时间，用Cu²⁺来终止反应。

5糖基转移酶酶活的反应进程

在最佳条件下，并提高K⁺终浓度到100Mm,在0min、30min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min、270min时取样，并用HPLC检测。如图12所述，反应在进行到180-210min时基本已经达到最大，而且根据反应的性质，该反应是可逆反应，反应时间久了，很可能反应会朝着逆反应方向进行，故生产中我们应及时终止反应。

序列表

<110>

<120>一种葡萄糖基转移酶基因及其制备方法、重组工程菌和应用

<160>4

<210>1

<211>1617

<212>DNA

<213>野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris）

<400>1

1 atgtcgcaga caccatggtg gcgcggggcc gtcatctatc agatttatcc gcgtagtttt

61 ctggattcca atggggatgg cgtaggcgat ctgccgggca tcattgccaa gctcgactac

121 atcgccgggc tgggcgtgga tgcgatctgg atttcgccgt ttttcaagtc gccgatggcc

181 gatttcggct atgacatcgc agactatcgc gcggtggacc cgttgttcgg gtcgttggcc

241 gatttcgatc gcctgctcga aaaggcacat ggccttgggt tgaaggtgat gatcgatcag

301 gtactgagcc atacctcgat cgcgcatgtg tggtttcagg agagccgaca ggaccggagc

361 aacccgaagg ctgattggta cgtgtgggcc gatccgcgcg aggatggaac gccgccgaac

421 aactggctgt cgttgtttgg tggggtcgca tggcagtggg agccgcggcg tgagcagtac

481 tacctgcaca actttctggt ggaccagccc gatctcaatt tccataacgc cgaggtgcag

541 caggccacgc tcgataacgt gcgcttttgg ctcgatcgcg gcgtggatgg gttccgcctg

601 gatgcgatca atttttgctt tcacgacgca caactgcgcg ataacccggc caagccggca

661 gacaagcggg tggggcgtgg ctttagcgcg gacaatccgt acgcctacca gtaccactac

721 ttcaacaaca cgcagccgga aaatttgccg tttctggagc ggctgcgcgg tctgttggac

781 agctacccgg gtgcggtgag cctgggcgag atttcgtcgg aagattcgct ggcgaccacc

841 gccgaataca ccgccaaggg ccgcttacat atgggctaca gcttcgagct gctggtgcag

901 gattacagcg ctgcctacat ccgcgacacc gtaagccggc tcgaggccac catgttggag

961 ggctggccat gctgggccat ttccaatcac gacgtagtgc gcgcggtaac gcgctggggt

1021 ggggcgcatg cgacgccggc gttcgcgcgg atggtggtgg cgctgctgtg ttcgttgcgt

1081 ggctcgattt gcttgtatca gggcgaagag ctcgggctca gtgaggcaga ggtggcgttc

1141 gaggacctgc aggatccgta tgggattacc ttctggccga ccttcaaggg ccgggatggc

1201 tgccgtacgc cgatgccgtg gaccgacgcg ccatctgccg gattcaccag cggcaagcct

1261 tggctgccgt tagctgcgtc gcatcgtgcc gctgctgtga gcgtgcaaca agacgatgcg

1321 cattccgtgt tgagtgcagt acgggatttt ctagcttggc gcaaggagat gccggcgctg

1381 cgtgagggat ccatcgcttt ctacgatacg gccgaaccgg tgctgatgtt ccggcgcgag

1441 catttgggtc aggtcatgct gttggcgttc aatctgtccg ccgatcctgc cgacctggcc

1501 ttgcctgccg gcgagtggga gcagatcgat gtacctggtg tcgagcttgg ggcgatggag

1561 ggcggacacc tacggctggc cgggcatggg gtcgttgctg ctgtcggtcg tggctga

<210>2

<211>538

<212>氨基酸序列

<400>2

1 MSQTPWWRGA VIYQIYPRSF LDSNGDGVGD LPGIIAKLDY IAGLGVDAIW ISPFFKSPMA 61 DFGYDIADYR AVDPLFGSLV DFDRLLEKAH GLGLKVMIDQ VLSHSSIAHV WFQESRQDRS 121 NPKADWYVWA DPREDGTPPN NWLSLFGGVA WQWEPRREQY YLHNFLVDQP DLNFHNAEVQ 181 QATLDNVRFW LDRGVDGFRL DAINFCFHDA QLRDNPAKPA DKRVGRGFSA DNPYAYQYHY 241 FNNTQPENLA FLERLRGLLD LYPNAVSLGE ISSEDSLATT AEYTAQGRLH MGYSFELLVQ 301 DYSAAYIRDT VSRLEATMLE GWPCWAISNH DVVRAVTRWG GAHATPAFAR MVVALLCSLR 361 GSICLYQGEE LGLSEAEVAF EDLQDPYGIT FWPTFKGRDG CRTPMPWTDA PSAGFTSGKP 421 WLPLAASHRA AAVSVQQDDA HSVLSAVRDF LAWRKEMPAL REGSIAFYDT AEPVLMFRRE 481 HAGQVVLLAF NLSADPADLA LPAGEWEQVD VPGVELGAMD GGHLRLAGHA VVAAVGRG

<210>3

<211>31

<212>引物

<213>人工合成

<400>3

GAAGGAGATA TACCATGTCG CAGACACCAT G 31

<210>4

<211>31

<212>引物

<213>人工合成

<400>4

AGTGCGGCCG CAAGCTTCAG CCACGACCGA C 31

Claims

1.一种来源于野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris）的一种葡萄糖基转移酶基因，所述的葡萄糖基转移酶基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于该蛋白质的的氨基酸序列为SEQ ID No.2。

3.权利要求1所述基因的制备方法，其特征在于该方法采用一步法克隆试剂盒（One Step Cloning Kit）进行克隆，将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点；其引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的引物为：

agl-one-step-F：5’-GAAGGAGATATACCATGTCG CAGACACCATG-3’；agl-one-step-R:5’-AGTGCGGCCGCAAGCTTCAGCCACGACCGAC-3’。

5.权利要求1所述基因的重组工程菌。

6.根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于重组载体为pET28a。

7.根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于工程菌宿主选用大肠杆菌Rosetta™(DE3) [F− ompT hsdSB(rB− mB− ) gal dcm (DE3) pRARE2 (CamR)]。

8.权利要求5所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于该重组工程菌的载体用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切线性化后，将两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶Exnase的催化下，在37℃下反应30min重组完全，完成定向克隆。

9.权利要求5所述的重组工程菌诱导剂葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：重组工程菌接种至含有卡那霉素和氯霉素的LB培养基中过夜培养10-12h，再以1~3%的接种量转接至同上的LB培养基中，当转接2-3h后，加入终浓度为0.1-10g/L的乳糖，放到20-30℃的摇床上，诱导表达8~15h，高效表达葡萄糖基转移酶。

10.一种葡萄糖基转移酶催化对苯二酚生成α-熊果苷的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：将权利要求5所述的重组工程菌经培养离心获得的湿菌体，使其破碎离心液作为催化剂，以1%-2%对苯二酚为底物，10%-40%麦芽糖为辅助底物，在pH 7.0的100mM磷酸钠缓冲液中，在180rpm，30℃条件下反应24h。