CN113025541A - 合成水杨苷的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种合适水杨苷的工程菌，包括宿主和重组质粒载体，该重组质粒载体上连接有表达编码葡萄糖基转移酶的基因。所述重组质粒载体上还连接有与编码葡萄糖基转移酶的基因共表达的编码羧酸还原酶和磷酰转移酶的基因。所述重组质粒载体上还连接有过表达编码莽草酸激酶、丙酮酸激酶、转酮酶、3‑脱氧‑7‑磷酸庚酸合酶、异分支酸丙酮酸裂解酶和异构分支酸合酶的基因；所述宿主还敲除编码pykA和pykF的基因，以实现水杨苷的增产。本发明还提供一种上述合成水杨苷的工程菌的构建方法和应用。利用上述合成水杨苷的工程菌，以葡萄糖和/或甘油等碳源来生产水杨苷，实现了水杨苷的高效生物合成。

Description

合成水杨苷的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种合成水杨苷的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
水杨苷，英文名称：salicin，英文别名：salicoside，CAS号：138-52-3，分子量286.28，分子式C13H18O7，结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
水杨苷是一种水杨醇糖苷，于1828年首次从柳树中分离得到。有研究发现在柳树皮提取物（WBE）中的水杨苷具有抗炎和镇痛作用，因为它逐渐转运到肠道下部，通过肠道细菌水解成水杨醇，吸收后转化为水杨酸。并且它产生解热作用而不会引起胃损伤。因此，对于在接受强效镇痛药如NASAIDs时出现胃部病变的患者，用水杨苷治疗可能是有用的。还有研究发现水杨苷有抗肿瘤和抗血管生成活性，为血管肿瘤的有效治疗提供了新的方向。
天然来源的水杨苷主要是从杨柳科植物中提取得到，例如，中国申请号为CN2015109566550、名称为“一种从白柳皮中提取水杨苷的方法”的发明专利中公开了一种从白柳皮中提取水杨苷的方法，将原料白柳皮采用弱酸-乙醇溶液渗滤提取，可以提高水杨苷在醇液里的溶解度，该方法虽然可以提高水杨苷的提取率，但水杨苷在杨柳科植物中的含量少，提取率仍较低。而且目前，罕有关于利用生物技术生产水杨苷的报道。
发明内容
有鉴于此，确有必要提供一种合成水杨苷的工程菌及其构建方法和应用，以解决上述问题。
本发明的一个目的是从大量生物或微生物体内能够合成水杨苷的酶中筛选出在体外依然具有催化效率的酶来实现水杨苷的异源合成。为此，本发明选择了来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的相关基因，通过酶的表达，构建合成水杨苷的工程菌，实现了从水杨醇生物合成水杨苷。
本发明的第二个目的是选择来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的相关基因，通过这些酶在宿主中的高效表达，构建合成水杨苷的工程菌，从而实现了以水杨酸为原料，生物合成水杨苷。
本发明的第三个目的是选择来源于细菌、真菌或蛋白质工程改造的异分支酸丙酮酸裂解酶（PchB）、异构分支酸合酶（entC）、羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的相关基因，通过这些酶在宿主中的高效表达，构建合成水杨苷的工程菌，从而实现了利用简单碳源从头生物合成水杨苷。
本发明的第四个目的在于通过抑制竞争途径，模块优化等一系列代谢调控方式来提高从简单碳源为源头生物合成水杨苷的产量。实验结果表明，在正常条件下，水杨苷从简单的碳源利用代谢工程改造菌中能达到100.7±10 mg/L的产量，而在经过优化后，水杨苷利用葡萄糖，甘油这些简单碳源的代谢工程菌能达到4.0±0.03 g/L 的最终产量。
为了实现上述目的，本发明提供一种合成水杨苷的工程菌，包括宿主和重组质粒载体，该重组质粒载体上连接有表达编码葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因。
其中，所述葡萄糖基转移酶（OSSGT1）来源于细菌或真菌，以可以来源于蛋白质工程改造的细菌或真菌。优选地，所述葡萄糖基转移酶（OSSGT1）来源于秋田小町水稻、红景天、拟南芥或蛇根木。所述宿主为细菌、酵母或真菌。所述细菌或真菌为原始的或改造过的。优选地，所述宿主为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母或黑曲霉。更优选地，所述宿主为大肠杆菌菌株BW25113、trans5α、BL21（DE3）、JCL16。所述重组质粒载体包括表达编码葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因以及连接该基因的表达质粒，且该表达质粒可以为pZE12-luc、pCS27或pSA74。所述合成水杨苷的工程菌的构建方法包括：采用现有方法，将编码葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因连接至表达质粒上，获得重组质粒载体；将所述重组质粒载体转化到所述宿主中，得到合成水杨苷的工程菌。
本发明还提供一种合成水杨苷的工程菌的应用，包括：按照体积比1%～5%的接种量，将上述合成水杨苷的工程菌接种到培养基中，并向所述培养基中加入300 mg/L~500mg/L水杨醇，在28℃～40℃进行发酵处理，制得水杨苷。
其中，所述培养基中的碳源为简单碳源，如，葡萄糖、麦芽糖、甘油等。优选地，所述培养基包括：20～30 g/L碳源，3～7 g/L酵母粉，4～8 g/L NaH2PO4，0.2～2 g/L NaCl，2.5～3 g/L KH2PO4，1～5 g/L NH4Cl，1～5 g/L MOPS， 240～250 mg/L MgSO4，14～15.5 mg/LCaCl2；其中，优选地，所述碳源为葡萄糖、甘油或两者的组合。
本发明提供的上述合成水杨苷工程菌中包括编码葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因，该工程菌以水杨醇为原料，在所述培养基进行发酵培养，在该工程菌发酵培养过程中，由于葡萄糖基转移酶作用的底物结构与水杨醇的结构相似，所以其中的水杨醇在葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的作用下转化为水杨苷，从而实现以水杨醇为原料生物合成水杨苷。
本发明还提供一种合成水杨苷的工程菌，包括宿主和重组质粒载体，该重组质粒载体上连接有共表达的编码羧酸还原酶（car）和磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因。优选地，所述羧酸还原酶（car）来源于海洋分枝杆菌，所述磷酰转移酶（sfp）来源于枯草芽孢杆菌。
其中，所述重组质粒载体主要由表达质粒和共同连接在该表达质粒上的编码羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因组成。所述合成水杨苷的工程菌的构建方法包括：采用现有方法，将编码羧酸还原酶（car）和磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因连接至表达质粒上，获得重组质粒载体；将所述重组质粒载体转化到所述宿主中，得到合成水杨苷的工程菌。
本发明还提供一种上述合成水杨苷的工程菌的应用，包括：按照体积比1%～5%的接种量，将上述合成水杨苷的工程菌接种到培养基中，并向所述培养基中加入100 mg/L～600mg/L水杨酸，在28℃～40℃进行发酵处理，制得水杨苷。
本发明提供的上述合成水杨苷工程菌中包括编码羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因，该工程菌以水杨酸为原料，在所述培养基进行发酵培养，在该工程菌发酵培养过程中，其中的水杨酸先在羧酸还原酶（car）和磷酰转移酶（sfp）的作用下转化为水杨醇，然后水杨醇在葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的作用下转化为水杨苷，从而实现以水杨酸为原料生物合成水杨苷。
本发明又提供一种合成水杨苷的工程菌，包括宿主和重组质粒载体，该重组质粒载体上连接有共表达编码异分支酸丙酮酸裂解酶（pchB）、异构分支酸合酶（entC）、羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因。
基于上述合成水杨苷的工程菌，所述重组质粒载体上还连接有过表达编码莽草酸激酶(AroL)、丙酮酸激酶(ppsA)、转酮酶（tktA）和3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶（aroGfbr）的基因。
基于上述合成水杨苷的工程菌，所述宿主同时敲除了编码pykA和pykF的基因。
本发明有提供一种上述合成水杨苷的工程菌的构建方法，包括：
重组表达质粒 将编码异分支酸丙酮酸裂解酶（pchB）、异构分支酸合酶（entC）、羧酸还原酶（car）和磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因连接至表达质粒上，获得重组质粒载体；
构建工程菌 将所述重组质粒载体转化到所述宿主中，得到合成水杨苷的工程菌。
其中，所述表达质粒可以为pZE12-luc、pCS27或pSA74。所述重组表达质粒的步骤采用现有的方法，先对编码异分支酸丙酮酸裂解酶（pchB）、异构分支酸合酶（entC）、羧酸还原酶（car）和磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因进行PCR扩增处理，再共同连接至所述表达质粒上，从而获得所述重组质粒载体。
基于上述合成水杨苷的工程菌的构建方法，所述重组表达质粒的步骤还进一步包括：采用中拷贝所述表达质粒共表达编码莽草酸激酶(AroL)、丙酮酸激酶(ppsA)、转酮酶（tktA）和3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶（aroGfbr）的基因。
其中，所述构建工程菌的步骤还包括：在将所述重组质粒载体转化到所述宿主中之前，先采用Red重组法敲除所述宿主内编码pykA和pykF的基因。
本发明还提供一种上述合成水杨苷的工程菌的应用，包括：按照体积比1%～5%的接种量，将上述合成水杨苷的工程菌接种到培养基中，在28℃～40℃进行发酵处理，制得水杨苷。其中，优选的，所述培养基包括：20～30 g/L碳源，3～7 g/L酵母粉，4～8 g/LNaH2PO4，0.2～2 g/L NaCl，2.5～3 g/L KH2PO4，1～5 g/L NH4Cl，1～5 g/L MOPS， 240～250 mg/L MgSO4，14～15.5 mg/LCaCl2；且所述碳源为葡萄糖、麦芽糖、甘油或其任意的组合。优选地，所述碳源为葡萄糖和甘油的组合。
本发明提供的上述合成水杨苷工程菌中包括编码异分支酸丙酮酸裂解酶（pchB）、异构分支酸合酶（entC）、羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因，该工程菌以葡萄糖和/或甘油等简单碳源为源头，在所述培养基中进行发酵培养，不需要向所述培养基中额外添加其它原料，如水杨醇、水杨酸等就可以合成水杨苷。具体合成路径如图1所示，所述合成水杨苷的工程菌在以葡萄糖和/或甘油等为碳源的发酵培养过程中，其中的葡萄糖和/或甘油等简单碳源经过糖酵解并在异构分支酸合酶（entC）和异分支酸丙酮酸裂解酶（pchB）的作用下，转化为水杨酸，水杨酸在羧酸还原酶（car）和磷酰转移酶（sfp）的作用下转化为水杨醇，水杨醇在葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的作用下转化为水杨苷，从而利用生物工程技术实现由葡萄糖和/或甘油等简单碳源从头合成水杨苷，水杨苷的产量可达到100.7±10 mg/L。
进一步，如图1所示，本发明提供的上述合成水杨苷的工程菌通过过表达编码丙酮酸激酶(ppsA)的基因增加磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的产量，过表达编码转酮酶（tktA）的基因增加赤藓糖-4-磷酸（E4P）的产量，过表达3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶（aroGfbr）增加磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）合成3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）的量，过表达编码莽草酸激酶(AroL)的基因可以增加反应底物分支酸（Chorismate）的量，反应底物分支酸的增加进而有利于提高水杨苷的产量。
进一步，如图1所示，本发明提供的上述合成水杨苷的工程菌中敲除了竞争反应物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的pykA和pykF基因，通过抑制竞争途径的方法进一步提高上述工程菌合成水杨苷的产量，最终可使水杨苷产量达到4±0.03 g/L。
因此，通过筛选出在体外具有活性的酶，获得本发明提供的上述合成水杨苷的工程菌；以该工程菌为基础，设计出如图1所示的水杨苷的生物合成途径，并且利用分子生物学以及代谢调控来优化合成路径，从而实现水杨苷的高效生物合成。
附图说明
图1是本发明提供的生物合成水杨苷的路径图，其中，该图中的“虚线箭头”代表多步反应，“实线箭头”代表一步反应。
图2是本发明实施例3提供的工程菌BW生产水杨苷的发酵结果图。
图3是实施例3提供的工程菌BW发酵产物及水杨苷标品的HPLC检测结果图。
图4是本发明实施例6提供的工程菌BW1生产水杨苷的发酵结果图。
图5是利用实施例6提供的工程菌BW1的发酵产物及水杨苷标品的HPLC检测结果图。
图6是本发明实施例7提供的工程菌BW2生产水杨苷的发酵结果图。
图7是利用实施例7提供的工程菌BW2的发酵产物及水杨苷标品的HPLC检测结果图。
图8是本发明实施例8提供的工程菌BW3生产水杨苷的发酵结果图。
图9是本发明实施例9进一步采用模块优化方式提供的工程菌BW4生产水杨苷的发酵结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本发明中，对表达质粒的种类没有特殊要求，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至在载体中，之后不再赘述。本发明中涉及的各种酶均来源于常用的物质。
以下实施实例中，大肠杆菌菌株BW25113，trans5α和BL21（DE3）均为常用大肠杆菌菌株，均可市售获得，其中trans5α用于载体构建，BL21（DE3）用于蛋白表达，BW25113则作为发酵用菌株。
实施例1 重组质粒pZE- OSSGT1
本实施例提供的重组质粒pZE - OSSGT1主要是将编码葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基团连接至大肠杆菌表达载体pZE12-luc获得。
本实施例提供的上述重组质粒的构建方法具体包括以下步骤。筛选来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的编码葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基因。通过将编码葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的目的基因进行PCR扩增获得目的片段后，接着用合适的酶对目的片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行回收，之后插入到表达质粒pZE12-luc上，获得pZE -OSSGT1重组质粒（见表1）。具体地本实施例中，所述葡萄糖基转移酶（OSSGT1）来源于秋田小町水稻。
实施例2 合成水杨苷的工程菌：重组大肠杆菌BW——含有pZE - OSSGT1重组质粒的大肠杆菌菌株
本发明提供的合成水杨苷的工程菌对用于构建表达质粒的宿主菌株种类没有特殊要求，本发明实施例采用了BW25113菌株作为构建质粒的初始宿主。
首先挑取新鲜的BW25113菌落接种到4 mL LB培养基中，37℃培养8～12 h后，取1mL接种到100 mL LB培养基中，37℃培养至OD600长到0.6时，在4℃的温度下6000 rpm离心10min收集菌体，用10 mL 10%预冷的甘油洗涤，6000 rpm离心10 min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入适量10%甘油重悬细胞，制得感受态细胞。取90 μL感受态加入2 μL重组质粒pZE - OSSGT1，冰上放置两分钟，电转后加入600 μL LB培养基，洗出电转后细胞，37℃复苏1 h，涂布到氨苄抗性平板,于37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上长出菌落后，挑菌于含有氨苄抗性的4 mL LB培养基中37℃培养8～10 h，即可获得生产α-熊果苷的工程菌：含有重组质粒pZE - OSSGT1的大肠杆菌菌株，用重组大肠杆菌BW表示。
实施例3 重组大肠杆菌BW的应用：联合水杨醇通过发酵培养生产水杨苷
重组大肠杆菌BW在生产水杨苷中的应用包括：在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌BW工程单菌落接种到4 mL含有相应抗生素的 LB试管中，37℃培养12 h后，转入含有相应抗生素的50 mL M9培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1%，发酵温度37℃，转速220rpm；其中，所述M9培养基包括：2.5 g/L葡萄糖、20 g/L甘油、5 g/L酵母粉、6 g/L Na2HPO4、0.5 g/L NaCl、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、2g/L MOPS、246.5 mg/L MgSO4·7H2O和14.7 mg/LCaCl2·2H2O，并根据实际情况加入相应抗生素。发酵初始加入终浓度为0.5 mM的诱导剂IPTG，分别在发酵3 h、6 h、9 h、12 h、24 h添加500 mg/L水杨醇，取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图2所示。从图2中可以看出：采用本实施例提供的方法可获得4g/L的水杨苷。
采用HPLC分析方法对目标产物水杨苷进行检测，检测条件如下：
色谱柱：分离柱：Diamonsil C18，ID 5μm，250 × 4.6 mm；
流动相：A为甲醇，B为1‰三氟乙酸水溶液，柱温35℃，流速0.8 mL/min检测波长为270nm。梯度洗脱程序如下表所示：
Figure 618878DEST_PATH_IMAGE002
取本实施例获得的发酵液样品1 mL，过滤膜，取过膜后液体用于HPLC分析，分析结果如图3中的图3B所示。采用上述方法取含有水杨苷标品水溶液进行HPLC分析，分析结果如图3中的图3A所示，图3A为标准图。从图3A中可以看出：水杨苷的特征峰保留时间为7.785 min左右；从图3B中可以看出在7.621 min左右也有一个特征峰，由此可以判断图3B中保留时间为7.621 min的特征峰为水杨苷，因此，利用本实施例提供的工程菌联合水杨醇可以制备出水杨苷。
实施例4 重组质粒pZE- car - sfp - OSSGT1
本实施例提供的重组质粒pZE- car - sfp - OSSGT1主要是将编码羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的基团连接至大肠杆菌表达载体pZE12-luc获得。
本实施例提供的上述重组质粒的构建方法具体包括以下步骤。筛选来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的编码羧酸还原酶（car）、磷酰转移酶（sfp）和葡萄糖基转移酶（OSSGT1）的目的基因进行PCR扩增获得目的片段后，接着用合适的酶对目的片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行回收，之后插入到表达质粒pZE12-luc上，获得pZE-car - sfp- OSSGT1重组质粒（见表1）。其中，本实施例中，所述羧酸还原酶（car）来源于海洋分枝杆菌，所述磷酰转移酶（sfp）来源于枯草芽孢杆菌。
实施例5 合成水杨苷的工程菌：重组大肠杆菌BW1——含有pZE- car - sfp -OSSGT1重组质粒的大肠杆菌菌株
本实施例提供的重组大肠杆菌BW1为含有pZE- car - sfp - OSSGT1重组质粒的大肠杆菌菌株，该重组大肠杆菌BW1采用实施例2提供的电转化法将重组质粒pZE- car - sfp -OSSGT1转化到BW25113菌上获得。
实施例6 重组大肠杆菌BW1的应用：联合水杨醇通过发酵培养生产水杨苷
重组大肠杆菌BW1在生产水杨苷中的应用包括：在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌BW工程单菌落接种到4 mL含有相应抗生素的 LB试管中，37℃培养12 h后，转入含有相应抗生素的50 mL M9培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1%，发酵温度37℃，转速220 rpm；其中，所述M9培养基包括：2.5 g/L葡萄糖、20 g/L甘油、5 g/L酵母粉、6 g/LNa2HPO4、0.5 g/L NaCl、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、2g/L MOPS、246.5 mg/L MgSO4·7H2O和14.7 mg/L CaCl2·2H2O，并根据实际情况加入相应抗生素。发酵初始加入终浓度为0.5 mM的诱导剂IPTG，分别在发酵3 h、6 h、9 h、12 h、24 h添加250mg/L水杨酸，取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图4所示。从图4中可以看出：采用本实施例提供的方法可获得3.05 g/L的水杨苷。
采用与实施例3中相同的HPLC分析方法对本实施例中获得的目标产物水杨苷进行检测，检测结果如图5中的图5B所示。采用上述方法取含有水杨苷标品水溶液进行HPLC分析，分析结果如图5中的图5A所示，图5A为标准图。从图5A中可以看出：水杨苷的特征峰保留时间为7.714 min左右；从图5B中可以看出在7.699 min左右也有一个特征峰，由此可以判断图5B中保留时间为7.699 min的特征峰为水杨苷，因此，利用本实施例提供的工程菌联合水杨酸可以制备出水杨苷。
实施例7 合成水杨苷的工程菌-重组大肠杆菌BW2及其构建方法和应用
重组大肠杆菌BW2及其构建方法：本实施例提供的重组大肠杆菌BW2（见表1）为含有pZE- car - sfp - OSSGT1和pCS -EP重组质粒的大肠杆菌菌株，该重组大肠杆菌BW2采用实施例2提供的电转化法将重组质粒pZE- car - sfp - OSSGT1和pCS -EP转化到BW25113菌上获得。其中，所述重组质粒pZE- car - sfp - OSSGT1采用实施例4提供的方法获得。所述重组质粒pCS –EP采用与实施例4相同的方法将编码异分支酸丙酮酸裂解酶（pchB）和异构分支酸合酶（entC）的基因进行PCR扩增、酶切处理后连接在表达质粒pCS27上，获得pCS -EP重组质粒（见表1）。具体地本实施例中，异分支酸丙酮酸裂解酶（pchB）来自萤光假单胞菌，异构分支酸合酶（entC）来源于大肠杆菌。
重组大肠杆菌BW2的应用：通过发酵培养从头生产水杨苷
重组大肠杆菌BW2在生产水杨苷中的应用包括：在平板上挑取新鲜重组大肠杆菌BW2单菌落接种到4 mL含有相应抗生素的 LB试管中，37℃培养12 h后，转入含有相应抗生素的50mL M9培养基的摇瓶中进行发酵培养，按体积比接种量为1%，发酵温度30℃或37 ℃，转速220 rpm；其中，本实施例中，所述M9培养基包括：2 g/L MOPS，2.5 g/L葡萄糖、20 g/L甘油，5 g/L酵母粉，6 g/L NaHPO4，0.5 g/L NaCl，3 g/L KH2PO4，2 g/L NH4Cl，246.5 mg/LMgSO4，14.7 mg/L CaCl2，并根据实际情况加入相应抗生素。发酵初始加入终浓度为0.5 mM的诱导剂IPTG，发酵24 h，48 h和60h取出部分发酵液用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图6所示。从图6中可以看出：采用本实施例提供的方法可获得100.7±10 mg/L的水杨苷。
采用与实施例3中相同的HPLC分析方法对本实施例中获得的目标产物水杨苷进行检测，检测结果如图7中的图7B所示。采用上述方法取含有水杨苷标品水溶液进行HPLC分析，分析结果如图7中的图7A所示，图7A为标准图。从图7A中可以看出：水杨苷的特征峰保留时间为7.785 min左右；从图7B中可以看出在7.859 min左右也有一个特征峰，由此可以判断图7B中保留时间为7.859 min的特征峰为水杨苷，因此，利用本实施例提供的工程菌可以实现以简单碳源为源头制备出水杨苷。
实施例8 合成水杨苷的工程菌-重组大肠杆菌BW3及其构建方法和应用
本实施例中重组大肠杆菌BW3（见表1）含有实施例4提供的重组质粒pZE- car - sfp -OSSGT1和重组质粒pCS-APTA-EP。其中，重组质粒pCS-APTA-EP主要是采用与实施例4同样的方法将编码莽草酸激酶(AroL)、丙酮酸激酶(ppsA)、转酮酶（tktA）和3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶（aroGfbr）插入到重组质粒pCS-EP上，获得所述重组质粒pCS-APTA-EP。
本实施例采用实施例2提供的化学转化法将重组质粒pZE-car-sfp- OSSGT1和pCS-APTA-EP均转入大肠杆菌BW25113上，获得目的重组大肠杆菌BW3。
重组大肠杆菌BW3的应用：参照实施例7，将所述重组大肠杆菌BW2在所述M9培养基中，在发酵每隔12 h取样1 mL用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图8所示。从图8中可以看出：采用本实施例提供的方法可获得1.5±0.2 g/L的水杨苷。
实施例9 合成水杨苷的工程菌-重组大肠杆菌BW4及其构建方法和应用
重组大肠杆菌BW4通过抑制竞争途径获得，具体地，在经过系统的筛选后决定敲除来源于细菌，真菌或蛋白质工程改造的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）合成路径中会与PEP生产途径进行反应物竞争的pykA和pykF。本发明提供采用Red重组法制备pykA和pykF敲除菌株，即先从宿主菌BW25113中敲除pykA，再在此基础上敲除pykF基因，获得重组大肠杆菌BW4。
具体地，首先挑取新鲜的BW25113菌落接种到4 mL LB培养基中，37℃培养8-12h后，取1 mL接种到100 mL LB培养基中，37℃培养至OD600长到0.6，4℃，6000 rpm离心10min收集菌体，用10 mL 10%预冷的甘油洗涤，6000 rpm离心10 min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入适量10%甘油重悬细胞，制得感受态细胞。取90 μL感受态加入2 μL pKD46质粒，冰上放置两分钟，电转后加入600 μL LB培养基，洗出电转后细胞，30 ℃复苏1 h，涂布到氨苄抗性平板。之后以pKD4质粒为模板，PCR扩增得到带有同源臂的敲除片段，回收进行纯化。挑取单菌落接入氨苄抗性试管8-12 h后，转接100 mL LB摇瓶培30℃培养；OD600长到0.2后，添加终浓度为100 mM的阿拉伯糖诱导；待摇瓶OD600D长到0.6时，开始制备电转感受态细胞，取90 μL感受态加入5 μL带同源臂的PCR片段，电转后，37℃复苏90 min，涂布于卡那抗性平板，过夜培养，待细胞长到足够大小，挑取单菌落于加入卡那抗性的试管中，37℃培养8-12h,后进行菌落PCR验证，确保kan片段替换掉目的基因。最后，向上一步正确的菌转入pcp20，涂布于氨苄和氯霉素混合的抗性平板中，30℃过夜培养，待细胞长到足够大小，挑取单菌落于加入氨苄和氯霉素混合的抗性的试管中30℃培养8-12h，后转接到无抗性的LB试管中，42℃培养24 h左右进行消除卡那抗性，再划线到无抗性平板，挑取单菌落接种到无抗性LB试管中，再分别转接到无抗性，氨苄抗性，卡那抗性和氨苄和氯霉素混合的抗性试管中，用以验证pKD46，pCP20是否丢失，卡那抗性是否消除。确定在以上两种抗性中均不生长后，保存于冻存管，并进一步菌落PCR验证。此过程得到菌株BWΔpykA，该菌株中敲除了pykA基因。
采用与上述同样的Red同源重组法，以菌株BWΔpykA为出发菌株，继续敲除pykF基因，得到大肠杆菌菌株BWΔpykAΔpykF。之后将实施例4构建好的重组质粒pZE-car-sfp-OSSGT1和实施例8构建好的重组质粒pCS-APTA-EP转入大肠杆菌菌株BWΔpykAΔpykF，记为BW3，在发酵每隔12 h取样1mL用以测定菌体生长状况及目标产物产量，结果如图9所示。从图9中可以看出：采用本实施例提供的工程菌可获得4.0±0.03 g/L的水杨苷。
表1 本发明各实施例中使用的质粒和菌株列表
Figure DEST_PATH_IMAGE003
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一种合成水杨苷的工程菌，其特征在于：包括宿主和重组质粒载体，该重组质粒载体上连接有表达编码葡萄糖基转移酶的基因。
2. 一种合成水杨苷的工程菌的应用，包括：按照体积比1%～5%的接种量，将权利要求1所述的合成水杨苷的工程菌接种到培养基中，并向所述培养基中加入300 mg/L~500 mg/L水杨醇，在28℃～40℃进行发酵处理，制得水杨苷。
3.一种合成水杨苷的工程菌，其特征在于：包括宿主和重组质粒载体，该重组质粒载体上连接有共表达的编码羧酸还原酶、磷酰转移酶和葡萄糖基转移酶的基因。
4. 一种合成水杨苷的工程菌的应用，包括：按照体积比1%～5%的接种量，将权利要求3所述的合成水杨苷的工程菌接种到培养基中，并向所述培养基中加入100 mg/L～600 mg/L水杨酸，在28℃～40℃进行发酵处理，制得水杨苷。
5.一种合成水杨苷的工程菌，其特征在于：包括宿主和重组质粒载体，该重组质粒载体上连接有共表达的编码异分支酸丙酮酸裂解酶、异构分支酸合酶、羧酸还原酶、磷酰转移酶和葡萄糖基转移酶的基因。
6.根据权利要求5所述的合成水杨苷的工程菌，其特征在于：所述重组质粒载体还连接有过表达编码莽草酸激酶、丙酮酸激酶、转酮酶和3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶的基因。
7.根据权利要求5或6所述的合成水杨苷的工程菌，其特征在于：所述宿主同时敲除了编码pykA和pykF的基因。
8.一种合成水杨苷的工程菌的构建方法，包括步骤：
重组表达质粒 将编码异分支酸丙酮酸裂解酶、异构分支酸合酶、羧酸还原酶、磷酰转移酶和葡萄糖基转移酶的基因连接至表达质粒上，获得重组质粒载体；
构建工程菌 将所述重组质粒载体转化到所述宿主中，得到合成水杨苷的工程菌。
9.根据权利要求8所述的合成水杨苷的工程菌的构建方法，其特征在于：所述重组表达质粒的步骤还进一步包括采用中拷贝所述表达质粒共表达编码莽草酸激酶、丙酮酸激酶、转酮酶和3-脱氧-7-磷酸庚酸合酶的基因。
10.一种合成水杨苷的工程菌的应用，包括：按照体积比1%～5%的接种量，将权利要求5～7任一项所述的合成水杨苷的工程菌接种到培养基中，在28℃～40℃进行发酵处理，制得水杨苷。
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