CN113817757B - 一种生产樱桃苷的重组酵母工程菌株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生产樱桃苷的重组酵母工程菌株及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明通过表达葡萄糖基转移酶UGT73C6的重组酿酒酵母，获得了能够合成樱桃苷的重组酿酒酵母菌，并进一步强化了内源UDP‑葡萄糖生物合成途径，提高了UDP‑葡萄糖的供应量，构建并强化了异源蔗糖磷酸化酶途径和莽草酸途径，提高了樱桃苷的产量，使发酵120h的酿酒酵母樱桃苷产量达136.7mg/L，为后续的黄酮类化合物生物合成奠定了基础。

Description

一种生产樱桃苷的重组酵母工程菌株及应用
技术领域
本发明涉及一种生产樱桃苷的重组酵母工程菌株及应用，属于基因工程及生物工程技术领域。
背景技术
樱桃苷是一种糖基化黄酮类化合物，是柑橘类植物的重要成分，对人类健康具有重要的有益作用。樱桃苷具有抗病毒、抗炎、降血糖、降胆固醇等多种生物活性，在糖尿病治疗中具有巨大的应用潜力。樱桃苷是存在于葡萄柚中，可以从果皮和种子等废弃物中提取出来。其水解产物柚皮素在药物、化妆品和食品工业领域具有巨大的应用潜力。
目前工业上生产黄酮类化合物的主要方法是植物提取，但高附加值黄酮类化合物樱桃苷在植物组织中积累水平很低，利用传统提取工艺分离纯化费时、昂贵、浪费自然资源，过程中使用大量有机溶剂对环境造成威胁。此外，植物的生长受到季节、环境(如土壤成分、营养)和生长周期等因素的影响。采用化学合成可能提供了一种替代方法，但受所需产品复杂化学结构的限制，难以工业化生产。因此，针对天然产物提取和化学合成樱桃苷在产品稳定性、产品质量安全和价格优势等方面的局限，近年快速发展起来的代谢工程与合成生物学可为黄酮类化合物的合成提供思路。
发明内容
本发明通过敲除酿酒酵母自身的葡萄糖苷水解酶(EXG1和SPR1)，并在表达了来源于拟南芥的葡萄糖基转移酶基因UGT73C6，实现了樱桃苷的合成。随后，通过强化内源UDP-葡萄糖生物合成途径基因PGM1、UGP1、URA6和YNK1的表达，增加了UDP-葡萄糖的供应。再通过引入来源于大肠杆菌的异源蔗糖磷酸化酶途径基因galU和过量表达莽草酸途径基因ARO1、ARO2、ARO3和来源于大肠杆菌的aroL，进一步提高了樱桃苷的产量，得到了高产樱桃苷的酿酒酵母菌株。
本发明提供了编码葡萄糖基转移酶的基因UGT73C6，其含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一株可合成樱桃苷的酿酒酵母工程菌，以含有柚皮素合成途径的酿酒酵母为出发菌株，表达了来源于Arabidopsis thaliana的葡萄糖基转移酶基因UGT73C6。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母还进行了如下至少一种改进：
(1)敲除了酿酒酵母内源糖苷水解酶基因EXG1和/或SPR1；
(2)过量表达酿酒酵母内源基因PGM1、UGP1、URA6和YNK1强化内源UDP-葡萄糖生物合成途径；
(3)引入了异源蔗糖磷酸化酶途径基因galU；
(4)过量表达莽草酸途径基因ARO1、ARO2、ARO3和aroL。
在一种实施方式中，所述基因UGT73C6的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述基因UGT73C6整合在位点EXG1处。
在一种实施方式中，利用启动子PCCW12起始UGT73C6基因表达。
在一种实施方式中，所述葡萄糖生物合成途径基因PGM1序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述基因PGM1整合在GAL10位点处。
在一种实施方式中，用启动子PTDH3起始PGM1基因的表达。
在一种实施方式中，所述葡萄糖生物合成途径基因UGP1序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述基因UGP1整合在SPR1位点处。
在一种实施方式中，用启动子PPGK1起始UGP1基因的表达。
在一种实施方式中，所述葡萄糖生物合成途径基因URA6序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，用启动子PFBA1起始URA6基因的表达。
在一种实施方式中，所述葡萄糖生物合成途径基因YNK1序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，用启动子PENO2起始YNK1基因的表达。
在一种实施方式中，所述基因URA6和基因YNK1整合在308a位点处。
在一种实施方式中，所述基因galU的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一种实施方式中，所述基因galU整合在1014a位点处。
在一种实施方式中，用启动子PTDH3起始galU基因的表达。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌还过量表达了酿酒酵母内源莽草酸途径基因ARO1、ARO2、ARO3和来源于大肠杆菌的aroL，基因ARO1、ARO2、ARO3和aroL的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
在一种实施方式中，用启动子PTDH3起始ARO1基因的表达，用启动子PENO2起始ARO2基因的表达，用启动子PTEF1起始ARO3基因的表达，用启动子PFBA1起始aroL基因的表达。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母E32，已公开于论文《Effects ofmetabolic pathway gene copy numbers on the biosynthesis of(2S)-naringenin inSaccharomyces cerevisiae》中，申请人承诺自申请日起20年向公众发放。
本发明还提供了所述酿酒酵母工程菌在生产樱桃苷中的应用。
在一种实施方式中，将所述酿酒酵母工程菌接种于YPD培养基中，于30℃发酵72～96h，或72～120h。
本发明还要求保护所述酿酒酵母工程菌在食品、医药、化工领域生产含樱桃苷的产品方面的应用。
在一种实施方式中，所述应用是用于制备含樱桃苷的疫苗或药物，或制备含樱桃苷的化妆品。
有益效果：本发明以酿酒酵母工程菌E32为宿主，通过表达葡萄糖基转移酶UGT73C6的重组酿酒酵母，获得了能够合成樱桃苷的重组酿酒酵母菌，并进一步强化了内源UDP-葡萄糖生物合成途径，提高了UDP-葡萄糖的供应量，构建并强化了异源蔗糖磷酸化酶途径和莽草酸途径，提高了樱桃苷的产量，使发酵120h的酿酒酵母樱桃苷产量达136.7mg/L，为后续的黄酮类化合物生物合成奠定了基础。
附图说明
图1为酿酒酵母中异源合成樱桃苷的代谢示意图；其中，PEP为磷酸烯醇丙酮酸盐，E4P为4-磷酸赤藓糖，DAHP为3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸，EPSP为5-O-(1-carboxyvinyl)-3-phosphoshikimate，CHA为分支酸，PPA为预苯酸，G6P为6-磷酸葡萄糖，G1P为1-磷酸葡萄糖，UDP-G为UDP葡萄糖。
图2为工程菌株经YPD培养后的樱桃苷色谱图。
图3为樱桃苷的质谱柱状图。
图4为工程菌株经YPD培养后的樱桃苷产量图。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。
YNB培养基：Yeast Nutrition Base 67.4g/L，葡萄糖20g/L。营养缺陷型培养基需要添加相应的氨基酸，具体添加量为：尿嘧啶5g/L，色氨酸10g/L，亮氨酸10g/L，组氨酸10g/L。
YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L。
(二)酿酒酵母的感受态制备：酿酒酵母感受态制备使用Frozen-EZ YeastTransformation II化转试剂盒，30℃，与10mL YPD培养基培养酿酒酵母菌至中数量级(OD600＝0.8-1.0)。以下步骤室温进行。
1、3500rpm离心细胞5min，吸掉上清液；
2、加入10mL EZ1溶液清洗沉淀，重新离心沉淀细胞，吸掉上清液；
3、加入1mL EZ2溶液重悬沉淀细胞。
(三)酿酒酵母的转化：
1、去50μL感受态细胞与0.2-1μg DNA(体积少于5μl)混合；加入500μL EZ3溶液，完全混合；
2、30℃孵育45min，孵育过程中用手指轻弹或低俗涡旋2-3次让其混匀；
3、从转化混合液中取50-150μL到适当营养缺陷型平板上。
4、30℃平板孵育3天长出转化子。
(四)樱桃苷HPLC测定：使用岛津高效液相色谱进行测定。HPLC条件：色谱柱：InertSustain C18 250mm×4.6mm column(particle size 5μm)；流动相A，含有1‰三氟乙酸的超纯水；流动相B，含有1‰三氟乙酸的乙腈；流动相比例条件，0-10min，10-40％B，10-30min，40-80％B，30-35min，80-80％B，35-37min，80-10％B，37-40min，10-10％B；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测器波长：290nm。
(五)菌株信息如表1所示。
表1本发明中涉及的菌株
(六)实施例涉及的启动子/终止子如表2所示。
表2实施例中涉及的启动子/终止子
实施例1含糖基转移酶的重组酿酒酵母菌株的构建
选择酿酒酵母E32的EXG1位点作为葡萄糖基转移酶UGT73C6(核苷酸序列如SEQ IDNO.1)的整合位点，并敲除酿酒酵母内源基因SPR1。具体步骤为：
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成如SEQ ID NO.1所示的UGT73C6基因，用表3中的引物PCCW12-F/PCCW12-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增启动子PCCW12，用引物TADH1-F/TADH1-R扩增终止子TADH1，用引物EXG1-armup-F/EXG1-armup-R和EXG1-armdown-F/EXG1-armdown-R分别扩增出EXG1位点的上游同源臂575bp序列和下游同源臂472bp序列。利用OE-PCR组装上述片段。PCR产物通过乙醇沉淀法回收。约1μg的整合片段与约500ng的sgRNA利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ Yeast Transformation II转化至酿酒酵母工程菌株E32，涂布于筛选固体培养基上，30℃培养3天，直至出现菌落，挑取正确的克隆命名为酿酒酵母E32T1。
所有引物及基因序列均列在表3中。
表3引物序列
将获得的工程菌株E32T1在YPD培养基中，于30℃，220rpm条件下发酵120h，采用液相色谱检测产物的含量，结果显示，酿酒酵母工程菌E32T1发酵液中含有樱桃苷(如图2)。酿酒酵母工程菌E32T1发酵液中樱桃苷和柚皮素产量分别为31.7mg/L和136.6mg/L。而胞内有24.6mg/L柚皮素积累，但未检测到樱桃苷。
实施例2内源UDP-葡萄糖生物合成途径的优化
为促进UDP-葡萄糖的供给，过量表达酿酒酵母内源基因PGM1(核苷酸序列如SEQID NO.2)，将基因PGM1整合到GAL10位点，具体步骤为：
用引物PGM1-F/PGM1-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增出基因PGM1，用表3中的引物PTDH3-F/PTDH3-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增启动子PTDH3，用引物TTYS1-F/TTYS1-R扩增终止子TTYS1，用引物GAL-armup-F/GAL-armup-R和GAL-armdown-F/GAL-armdown-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上分别扩增出GAL10位点的上游同源臂820bp序列和下游同源臂723bp序列。用引物UGP1-F/UGP1-R从酿酒酵母基因组上扩增出基因UGP1(核苷酸序列如SEQ ID NO.3)，用引物PPGK1-F/PPGK1-R从酿酒酵母基因组上扩增启动子PPGK1，用引物TCYC1-F/TCYC1-R从酿酒酵母基因组上扩增终止子TCYC1，用引物SPR1-armup-F/SPR1-armup-R和SPR1-armdown-F/SPR1-armdown-R从酿酒酵母基因组上分别扩增出SPR1位点的上游同源臂720bp序列和下游同源臂442bp序列。用引物URA6-F/URA6-R从酿酒酵母基因组上扩增出基因URA6(核苷酸序列如SEQ ID NO.4)，用引物PFBA1-F/PFBA1-R从酿酒酵母基因组上扩增启动子PFBA1，用引物TFBA1-F/TFBA1-R从酿酒酵母基因组上扩增终止子TFBA1，用引物YNK1-F/YNK1-R从酿酒酵母基因组上扩增出基因YNK1，用引物PENO2-F/PENO2-R从酿酒酵母基因组上扩增启动子PENO2，用引物TCYC1-F/TCYC1-R从酿酒酵母基因组上扩增终止子TCYC1，用引物308a-armup-F/308a-armup-R和308a-armdown-F/308a-armdown-R分别扩增出308a位点的上游同源臂767bp序列和下游同源臂775bp序列。利用OE-PCR组装上述片段。PCR产物通过乙醇沉淀法回收。约1μg的整合片段与约500ng的sgRNA利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ Yeast Transformation II转化至酿酒酵母工程菌株E32T1，涂布于筛选固体培养基上，30℃培养3天，直至出现菌落，挑取正确的克隆命名为酿酒酵母E32T13。
挑取酿酒酵母E32T13单菌落转接入于5mL的含有亮氨酸和尿嘧啶的YNB培养基中，24h后按OD600＝0.2接种量转接于25mL YPD培养基中，培养120h(约OD600＝26)后取500μL发酵液，加入500μL甲醇，将重悬液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。结果表明，重组工程菌E32T13的樱桃苷产量为93.6mg/L，中间产物柚皮素产量为101.6m/L。
实施例3表达异源蔗糖磷酸化酶galU强化UDP-葡萄糖的供应
以大肠杆菌Top10基因组为模板用引物galU-F/galU-R扩增蔗糖磷酸化酶基因galU(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示)，用引物PTDH3-galU-F/PTDH3-galU-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增启动子PTDH3，用引物TGPM1-F/TGPM1-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增终止子TGPM1，用引物1014a-armup-F/1014a-armup-R和1014a-armdown-F/1014a-armdown-R分别从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增出1014a位点的上游同源臂469bp序列和下游同源臂419bp序列。利用OE-PCR组装上述片段。PCR产物通过乙醇沉淀法回收。约1μg的整合片段与约500ng的sgRNA利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ YeastTransformation II转化至酿酒酵母工程菌株E32T1，涂布于筛选固体培养基上，30℃培养3天，直至出现菌落，挑取验证正确的克隆命名为酿酒酵母E32T14。
挑取单菌落转接入于5mL的对应的含有亮氨酸和尿嘧啶的YNB培养基中24h后按OD600＝0.2接种量转接于25mL YPD培养基中，培养120h(约OD600＝26)后取500μL发酵液，加入500μL甲醇，将重悬液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。结果表明，重组工程菌E32T14的樱桃苷产量为109.2mg/L，中间产物柚皮素产量为111.2m/L。。
表4引物序列
实施例4莽草酸途径的强化
为促进前体物柚皮素的供给，过量表达酿酒酵母内源基因ARO1、ARO2、ARO3和大肠杆菌的aroL(核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示)，具体步骤为：用引物ARO1-F/ARO1-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增出基因ARO1，用引物PTDH3-ARO1-F/PTDH3-ARO1-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增启动子PTDH3，用引物TCYC1-ARO1-F/TCYC1-ARO1-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增终止子TTDH3，用引物ARO2-F/ARO2-R从酿酒酵母基因组上扩增出基因ARO2，用引物PENO2-ARO2-F/PENO2-ARO2-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增启动子PENO2，用引物TADH1-F/TADH1-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增终止子TADH1，用引物ARO3-F/ARO3-R从酿酒酵母基因组上扩增出基因ARO3，用引物PTEF1-F/PTEF1-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增启动子PTEF1，TTPS1-F/TTPS1-R用引物从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增终止子TTPS1，用引物aroL-F/aroL-R从大肠杆菌Top10基因组上扩增aroL，用引物PFBA1-aroL-F/PFBA1-aroL-R扩增从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上启动子PFBA1，用引物TFBA1-F/TFBA1-R从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增终止子TFBA1，用引物911b-armup-F/911b-armup-R和911b-armdown-F/911b-armdown-R分别从酿酒酵母CEN.PK2-1D基因组上扩增出911b位点的上游同源臂546bp序列和下游同源臂590bp序列。。利用OE-PCR组装上述片段。PCR产物通过乙醇沉淀法回收。约1μg的整合片段与约500ng的sgRNA利用酵母转化试剂盒Frozen-EZ YeastTransformation II转化至酿酒酵母工程菌株E32T1，涂布于筛选固体培养基上，30℃培养3天，直至出现菌落，挑取验证正确的克隆命名为酿酒酵母E32T14。挑取酿酒酵母E32T14单菌落转接入于5mL的含有亮氨酸和尿嘧啶的YNB培养基中，24h后按OD600＝0.2接种量转接于25mL YPD培养基中，培养120h(约OD600＝26)后取500μL发酵液，加入500μL甲醇，将重悬液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析。分析结果表明，重组工程菌E32T19的樱桃苷产量为136.7mg/L。
表5引物序列
对比例1
具体实施方式同实施例1，区别在于，将启动子Pccw12替换为PENO2，结果显示，在相同条件下发酵120h的樱桃苷产量为16.5mg/L。
对比例2
具体实施方式同实施例2，区别在于，在E32T1的基础上，仅表达PGM2、UGP1或URA6基因，结果显示，在相同条件下发酵120h的樱桃苷产量分别为40.07mg/L、56.6mg/L、60.5mg/L。
表6酿酒酵母表达不同基因的樱桃苷产量
表达的基因 樱桃苷产量(mg/L)
PGM2 40.07
UGP1 56.6
URA6 60.5
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种生产樱桃苷的重组酵母工程菌株及应用
<130> BAA211295A
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcctttg agaaaaataa tgaaccattt ccacttcact tcgttctttt cccattcatg 60
gcccaaggtc acatgatccc aatggttgac atcgctaggc ttcttgctca gaggggagtc 120
cttatcacca ttgttactac cccacacaac gccgctagat tcaaaaacgt ccttaataga 180
gccatcgagt ctggtcttcc aatcaatttg gtccaagtca agttcccata tcaagaagcc 240
ggattgcaag aaggacaaga aaacatggac ttgttgacca ccatggagca aatcaccagc 300
ttttttaaag ctgttaacct tcttaaagag ccagtccaaa acttgattga agaaatgagt 360
cctaggcctt cttgcttgat ctctgacatg tgcttgagtt atacctctga aattgctaag 420
aaattcaaaa ttcctaaaat ccttttccac ggtatgggat gtttctgcct tctttgcgtc 480
aacgtcctta ggaagaatag agaaattctt gataacttga agtctgataa agaatacttt 540
attgttccat atttcccaga tagagtcgag tttactagac cacaagttcc agttgaaacc 600
tacgtcccag ctggttggaa ggaaattttg gaggatatgg tcgaagccga caagaccagt 660
tatggagtta ttgttaattc ttttcaagaa cttgaaccag cttacgctaa ggatttcaag 720
gaggctagaa gtggtaaggc ttggaccatc ggtccagtta gtctttgcaa caaagtcggt 780
gtcgataagg ctgagagggg aaacaagagt gacatcgacc aagatgagtg cttggaatgg 840
cttgacagta aggaacccgg tagtgtcctt tacgtctgcc ttggttctat ctgtaacttg 900
cctcttagtc agttgttgga gttgggtctt ggtcttgagg agagtcagag accttttatc 960
tgggtcatta gaggttggga gaagtataag gagttggtcg agtggttcag tgagagtgga 1020
ttcgaggata gaatccaaga taggggtctt cttatcaagg gttggtctcc acagatgttg 1080
atcttgtctc acccttctgt tggaggtttc cttacccatt gcggttggaa ctctaccctt 1140
gagggaatta ccgccggact tcctatgctt acttggccat tgttcgctga ccagttctgt 1200
aacgagaagt tggtcgtcca aattttgaag gtcggagtca gtgccgaggt caaggaggtc 1260
atgaagtggg gagaggagga gaagattggt gtccttgttg ataaggaagg tgtcaagaaa 1320
gccgtcgagg agttgatggg agaaagtgat gacgccaagg agagaaggag aagagccaag 1380
gagttgggtg agtctgctca taaggccgtt gaggaaggtg gatcttctca ctctaacatt 1440
actttcttgt tgcaagatat catgcaattg gcccaatcta acaattaa 1488
<210> 2
<211> 1713
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
atgtcacttc taatagattc tgtaccaaca gttgcttata aggaccaaaa accgggtact 60
tcaggtttac gtaagaagac caaggttttc atggatgagc ctcattatac tgagaacttc 120
attcaagcaa caatgcaatc tatccctaat ggctcagagg gaaccacttt agttgttgga 180
ggagatggtc gtttctacaa cgatgttatc atgaacaaga ttgccgcagt aggtgctgca 240
aacggtgtca gaaagttagt cattggtcaa ggcggtttac tttcaacacc agctgcttct 300
catataatta gaacatacga ggaaaagtgt accggtggtg gtatcatatt aactgcctca 360
cacaacccag gcggtccaga gaatgattta ggtatcaagt ataatttacc taatggtggg 420
ccagctccag agagtgtcac taacgctatc tgggaagcgt ctaaaaaatt aactcactat 480
aaaattataa agaacttccc caagttgaat ttgaacaagc ttggtaaaaa ccaaaaatat 540
ggcccattgt tagtggacat aattgatcct gccaaagcat acgttcaatt tctgaaggaa 600
atttttgatt ttgacttaat taaaagcttc ttagcgaaac agcgcaaaga caaagggtgg 660
aagttgttgt ttgactcctt aaatggtatt acaggaccat atggtaaggc tatatttgtt 720
gatgaatttg gtttaccggc agaggaagtt cttcaaaatt ggcacccttt acctgatttc 780
ggcggtttac atcccgatcc gaatctaacc tatgcacgaa ctcttgttga cagggttgac 840
cgcgaaaaaa ttgcctttgg agcagcctcc gatggtgatg gtgataggaa tatgatttac 900
ggttatggcc ctgctttcgt ttcgccaggt gattctgttg ccattattgc cgaatatgca 960
cccgaaattc catacttcgc caaacaaggt atttatggct tggcacgttc atttcctaca 1020
tcctcagcca ttgatcgtgt tgcagcaaaa aagggattaa gatgttacga agttccaacc 1080
ggctggaaat tcttctgtgc cttatttgat gctaaaaagc tatcaatctg tggtgaagaa 1140
tccttcggta caggttccaa tcatatcaga gaaaaggacg gtctatgggc cattattgct 1200
tggttaaata tcttggctat ctaccatagg cgtaaccctg aaaaggaagc ttcgatcaaa 1260
actattcagg acgaattttg gaacgagtat ggccgtactt tcttcacaag atacgattac 1320
gaacatatcg aatgcgagca ggccgaaaaa gttgtagctc ttttgagtga atttgtatca 1380
aggccaaacg tttgtggctc ccacttccca gctgatgagt ctttaaccgt tatcgattgt 1440
ggtgattttt cgtatagaga tctagatggc tccatctctg aaaatcaagg ccttttcgta 1500
aagttttcga atgggactaa atttgttttg aggttatccg gcacaggcag ttctggtgca 1560
acaataagat tatacgtaga aaagtatact gataaaaagg agaactatgg ccaaacagct 1620
gacgtcttct tgaaacccgt catcaactcc attgtaaaat tcttaagatt taaagaaatt 1680
ttaggaacag acgaaccaac agtccgcaca tag 1713
<210> 3
<211> 1500
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 3
atgtccacta agaagcacac caaaacacat tccacttatg cattcgagag caacacaaac 60
agcgttgctg cctcacaaat gagaaacgcc ttaaacaagt tggcggactc tagtaaactt 120
gacgatgctg ctcgcgctaa gtttgagaac gaactggatt cgtttttcac gcttttcagg 180
agatatttgg tagagaagtc ttctagaacc accttggaat gggacaagat caagtctccc 240
aacccggatg aagtggttaa gtatgaaatt atttctcagc agcccgagaa tgtctcaaac 300
ctttccaaat tggctgtttt gaagttgaac ggtgggctgg gtacctccat gggctgcgtt 360
ggccctaaat ctgttattga agtgagagag ggaaacacct ttttggattt gtctgttcgt 420
caaattgaat acttgaacag acagtacgat agcgacgtgc cattgttatt gatgaattct 480
ttcaacactg acaaggatac ggaacacttg attaagaagt attccgctaa cagaatcaga 540
atcagatctt tcaatcaatc caggttccca agagtctaca aggattcttt attgcctgtc 600
cccaccgaat acgattctcc actggatgct tggtatccac caggtcacgg tgatttgttt 660
gaatctttac acgtatctgg tgaactggat gccttaattg cccaaggaag agaaatatta 720
tttgtttcta acggtgacaa cttgggtgct accgtcgact taaaaatttt aaaccacatg 780
atcgagactg gtgccgaata tataatggaa ttgactgata agaccagagc cgatgttaaa 840
ggtggtactt tgatttctta cgatggtcaa gtccgtttat tggaagtcgc ccaagttcca 900
aaagaacaca ttgacgaatt caaaaatatc agaaagttta ccaacttcaa cacgaataac 960
ttatggatca atctgaaagc agtaaagagg ttgatcgaat cgagcaattt ggagatggaa 1020
atcattccaa accaaaaaac tataacaaga gacggtcatg aaattaatgt cttacaatta 1080
gaaaccgctt gtggtgctgc tatcaggcat tttgatggtg ctcacggtgt tgtcgttcca 1140
agatcaagat tcttgcctgt caagacctgt tccgatttgt tgctggttaa atcagatcta 1200
ttccgtctgg aacacggttc tttgaagtta gacccatccc gttttggtcc aaacccatta 1260
atcaagttgg gctcgcattt caaaaaggtt tctggtttta acgcaagaat ccctcacatc 1320
ccaaaaatcg tcgagctaga tcatttgacc atcactggta acgtcttttt aggtaaagat 1380
gtcactttga ggggtactgt catcatcgtt tgctccgacg gtcataaaat cgatattcca 1440
aacggctcca tattggaaaa tgttgtcgtt actggtaatt tgcaaatctt ggaacattga 1500
<210> 4
<211> 615
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 4
atgacagctg ccactacatc acagccagct ttctcgcctg accaagtttc cgtgatcttc 60
gttctaggag gacccggtgc aggcaagggt actcagtgtg aaaaactagt taaggactat 120
tcatttgtcc atttgtcagc cggagacctt ctacgtgctg agcagggcag agcaggttcc 180
caatatgggg aattgatcaa gaactgcatc aaagagggcc agattgtccc tcaagagatt 240
actttggcgc ttttacgcaa cgctatttcc gataacgtca aggcgaacaa gcataagttc 300
ttaattgacg gatttcctag gaagatggat caagccattt cctttgaaag agacatcgtt 360
gaaagcaaat tcatcctgtt ctttgactgc cctgaagata tcatgttaga gagactattg 420
gagcgtggca agaccagtgg tagaagcgat gacaacattg agtccattaa gaagagattt 480
aacactttca aggagactag tatgcccgtc atcgagtact ttgaaaccaa atcgaaagtc 540
gtccgtgttc gttgcgacag atccgtcgaa gatgtgtaca aagacgtcca agacgctatc 600
cgtgatagct tatag 615
<210> 5
<211> 462
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 5
atgtctagtc aaacagaaag aacttttatt gcggtaaaac cagatggtgt ccagaggggc 60
ttagtatctc aaattctatc tcgttttgaa aaaaaaggtt acaaactagt tgctattaaa 120
ttagttaaag cggatgataa attactagag caacattacg cagagcatgt tggtaaacca 180
tttttcccaa agatggtatc ctttatgaag tctggtccca ttttggccac ggtctgggag 240
ggaaaagatg tggttagaca aggaagaact attcttggtg ctactaatcc tttgggcagt 300
gcaccaggta ccattagagg tgatttcggt attgacctag gcagaaacgt ctgtcacggc 360
agtgattctg ttgatagcgc tgaacgtgaa atcaatttgt ggtttaagaa ggaagagtta 420
gttgattggg aatctaatca agctaagtgg atttatgaat ga 462
<210> 6
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggctgcca ttaatacgaa agtcaaaaaa gccgttatcc ccgttgcggg attaggaacc 60
aggatgttgc cggcgacgaa agccatcccg aaagagatgc tgccacttgt cgataagcca 120
ttaattcaat acgtcgtgaa tgaatgtatt gcggctggca ttactgaaat tgtgctggtt 180
acacactcat ctaaaaactc tattgaaaac cactttgata ccagttttga actggaagca 240
atgctggaaa aacgtgtaaa acgtcaactg cttgatgaag tgcagtctat ttgtccaccg 300
cacgtgacta ttatgcaagt tcgtcagggt ctggcgaaag gcctgggaca cgcggtattg 360
tgtgctcacc cggtagtggg tgatgaaccg gtagctgtta ttttgcctga tgttattctg 420
gatgaatatg aatccgattt gtcacaggat aacctggcag agatgatccg ccgctttgat 480
gaaacgggtc atagccagat catggttgaa ccggttgctg atgtgaccgc atatggcgtt 540
gtggattgca aaggcgttga attagcgccg ggtgaaagcg taccgatggt tggtgtggta 600
gaaaaaccga aagcggatgt tgcgccgtct aatctcgcta ttgtgggtcg ttacgtactt 660
agcgcggata tttggccgtt gctggcaaaa acccctccgg gagctggtga tgaaattcag 720
ctcaccgacg caattgatat gctgatcgaa aaagaaacgg tggaagccta tcatatgaaa 780
gggaagagcc atgactgcgg taataaatta ggttacatgc aggccttcgt tgaatacggt 840
attcgtcata acacccttgg cacggaattt aaagcctggc ttgaagaaga gatgggcatt 900
aagaagtaa 909
<210> 7
<211> 4767
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggtgcagt tagccaaagt cccaattcta ggaaatgata ttatccacgt tgggtataac 60
attcatgacc atttggttga aaccataatt aaacattgtc cttcttcgac atacgttatt 120
tgcaatgata cgaacttgag taaagttcca tactaccagc aattagtcct ggaattcaag 180
gcttctttgc cagaaggctc tcgtttactt acttatgttg ttaaaccagg tgagacaagt 240
aaaagtagag aaaccaaagc gcagctagaa gattatcttt tagtggaagg atgtactcgt 300
gatacggtta tggtagcgat cggtggtggt gttattggtg acatgattgg gttcgttgca 360
tctacattta tgagaggtgt tcgtgttgtc caagtaccaa catccttatt ggcaatggtc 420
gattcctcca ttggtggtaa aactgctatt gacactcctc taggtaaaaa ctttattggt 480
gcattttggc aaccaaaatt tgtccttgta gatattaaat ggctagaaac gttagccaag 540
agagagttta tcaatgggat ggcagaagtt atcaagactg cttgtatttg gaacgctgac 600
gaatttacta gattagaatc aaacgcttcg ttgttcttaa atgttgttaa tggggcaaaa 660
aatgtcaagg ttaccaatca attgacaaac gagattgacg agatatcgaa tacagatatt 720
gaagctatgt tggatcatac atataagtta gttcttgaga gtattaaggt caaagcggaa 780
gttgtctctt cggatgaacg tgaatccagt ctaagaaacc ttttgaactt cggacattct 840
attggtcatg cttatgaagc tatactaacc ccacaagcat tacatggtga atgtgtgtcc 900
attggtatgg ttaaagaggc ggaattatcc cgttatttcg gtattctctc ccctacccaa 960
gttgcacgtc tatccaagat tttggttgcc tacgggttgc ctgtttcgcc tgatgagaaa 1020
tggtttaaag agctaacctt acataagaaa acaccattgg atatcttatt gaagaaaatg 1080
agtattgaca agaaaaacga gggttccaaa aagaaggtgg tcattttaga aagtattggt 1140
aagtgctatg gtgactccgc tcaatttgtt agcgatgaag acctgagatt tattctaaca 1200
gatgaaaccc tcgtttaccc cttcaaggac atccctgctg atcaacagaa agttgttatc 1260
ccccctggtt ctaagtccat ctccaatcgt gctttaattc ttgctgccct cggtgaaggt 1320
caatgtaaaa tcaagaactt attacattct gatgatacta aacatatgtt aaccgctgtt 1380
catgaattga aaggtgctac gatatcatgg gaagataatg gtgagacggt agtggtggaa 1440
ggacatggtg gttccacatt gtcagcttgt gctgacccct tatatctagg taatgcaggt 1500
actgcatcta gatttttgac ttccttggct gccttggtca attctacttc aagccaaaag 1560
tatatcgttt taactggtaa cgcaagaatg caacaaagac caattgctcc tttggtcgat 1620
tctttgcgtg ctaatggtac taaaattgag tacttgaata atgaaggttc cctgccaatc 1680
aaagtttata ctgattcggt attcaaaggt ggtagaattg aattagctgc tacagtttct 1740
tctcagtacg tatcctctat cttgatgtgt gccccatacg ctgaagaacc tgtaactttg 1800
gctcttgttg gtggtaagcc aatctctaaa ttgtacgtcg atatgacaat aaaaatgatg 1860
gaaaaattcg gtatcaatgt tgaaacttct actacagaac cttacactta ttatattcca 1920
aagggacatt atattaaccc atcagaatac gtcattgaaa gtgatgcctc aagtgctaca 1980
tacccattgg ccttcgccgc aatgactggt actaccgtaa cggttccaaa cattggtttt 2040
gagtcgttac aaggtgatgc cagatttgca agagatgtct tgaaacctat gggttgtaaa 2100
ataactcaaa cggcaacttc aactactgtt tcgggtcctc ctgtaggtac tttaaagcca 2160
ttaaaacatg ttgatatgga gccaatgact gatgcgttct taactgcatg tgttgttgcc 2220
gctatttcgc acgacagtga tccaaattct gcaaatacaa ccaccattga aggtattgca 2280
aaccagcgtg tcaaagagtg taacagaatt ttggccatgg ctacagagct cgccaaattt 2340
ggcgtcaaaa ctacagaatt accagatggt attcaagtcc atggtttaaa ctcgataaaa 2400
gatttgaagg ttccttccga ctcttctgga cctgtcggtg tatgcacata tgatgatcat 2460
cgtgtggcca tgagtttctc gcttcttgca ggaatggtaa attctcaaaa tgaacgtgac 2520
gaagttgcta atcctgtaag aatacttgaa agacattgta ctggtaaaac ctggcctggc 2580
tggtgggatg tgttacattc cgaactaggt gccaaattag atggtgcaga acctttagag 2640
tgcacatcca aaaagaactc aaagaaaagc gttgtcatta ttggcatgag agcagctggc 2700
aaaactacta taagtaaatg gtgcgcatcc gctctgggtt acaaattagt tgacctagac 2760
gagctgtttg agcaacagca taacaatcaa agtgttaaac aatttgttgt ggagaacggt 2820
tgggagaagt tccgtgagga agaaacaaga attttcaagg aagttattca aaattacggc 2880
gatgatggat atgttttctc aacaggtggc ggtattgttg aaagcgctga gtctagaaaa 2940
gccttaaaag attttgcctc atcaggtgga tacgttttac acttacatag ggatattgag 3000
gagacaattg tctttttaca aagtgatcct tcaagacctg cctatgtgga agaaattcgt 3060
gaagtttgga acagaaggga ggggtggtat aaagaatgct caaatttctc tttctttgct 3120
cctcattgct ccgcagaagc tgagttccaa gctctaagaa gatcgtttag taagtacatt 3180
gcaaccatta caggtgtcag agaaatagaa attccaagcg gaagatctgc ctttgtgtgt 3240
ttaacctttg atgacttaac tgaacaaact gagaatttga ctccaatctg ttatggttgt 3300
gaggctgtag aggtcagagt agaccatttg gctaattact ctgctgattt cgtgagtaaa 3360
cagttatcta tattgcgtaa agccactgac agtattccta tcatttttac tgtgcgaacc 3420
atgaagcaag gtggcaactt tcctgatgaa gagttcaaaa ccttgagaga gctatacgat 3480
attgccttga agaatggtgt tgaattcctt gacttagaac taactttacc tactgatatc 3540
caatatgagg ttattaacaa aaggggcaac accaagatca ttggttccca tcatgacttc 3600
caaggattat actcctggga cgacgctgaa tgggaaaaca gattcaatca agcgttaact 3660
cttgatgtgg atgttgtaaa atttgtgggt acggctgtta atttcgaaga taatttgaga 3720
ctggaacact ttagggatac acacaagaat aagcctttaa ttgcagttaa tatgacttct 3780
aaaggtagca tttctcgtgt tttgaataat gttttaacac ctgtgacatc agatttattg 3840
cctaactccg ctgcccctgg ccaattgaca gtagcacaaa ttaacaagat gtatacatct 3900
atgggaggta tcgagcctaa ggaactgttt gttgttggaa agccaattgg ccactctaga 3960
tcgccaattt tacataacac tggctatgaa attttaggtt tacctcacaa gttcgataaa 4020
tttgaaactg aatccgcaca attggtgaaa gaaaaacttt tggacggaaa caagaacttt 4080
ggcggtgctg cagtcacaat tcctctgaaa ttagatataa tgcagtacat ggatgaattg 4140
actgatgctg ctaaagttat tggtgctgta aacacagtta taccattggg taacaagaag 4200
tttaagggtg ataataccga ctggttaggt atccgtaatg ccttaattaa caatggcgtt 4260
cccgaatatg ttggtcatac cgctggtttg gttatcggtg caggtggcac ttctagagcc 4320
gccctttacg ccttgcacag tttaggttgc aaaaagatct tcataatcaa caggacaact 4380
tcgaaattga agccattaat agagtcactt ccatctgaat tcaacattat tggaatagag 4440
tccactaaat ctatagaaga gattaaggaa cacgttggcg ttgctgtcag ctgtgtacca 4500
gccgacaaac cattagatga cgaactttta agtaagctgg agagattcct tgtgaaaggt 4560
gcccatgctg cttttgtacc aaccttattg gaagccgcat acaaaccaag cgttactccc 4620
gttatgacaa tttcacaaga caaatatcaa tggcacgttg tccctggatc acaaatgtta 4680
gtacaccaag gtgtagctca gtttgaaaag tggacaggat tcaagggccc tttcaaggcc 4740
atttttgatg ccgttacgaa agagtag 4767
<210> 8
<211> 1131
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atgtcaacgt ttgggaaact gttccgcgtc accacatatg gtgaatcgca ttgtaagtct 60
gtcggttgca ttgtcgacgg tgttcctcca ggaatgtcat taaccgaagc tgacattcag 120
ccacaattga ccagaagaag accgggtcaa tctaagctat cgacccctag agacgaaaag 180
gatagagtgg aaatccagtc cggtaccgag ttcggcaaga ctctaggtac acccatcgcc 240
atgatgatca aaaacgagga ccaaagacct cacgactact ccgacatgga caagttccct 300
agaccttccc atgcggactt cacgtactcg gaaaagtacg gtatcaaggc ctcctctggt 360
ggtggcagag cttctgctag agaaacgatt ggccgtgtcg cttcaggtgc cattgctgag 420
aagttcttag ctcagaactc taatgtcgag atcgtagcct ttgtgacaca aatcggggaa 480
atcaagatga acagagactc tttcgatcct gaatttcagc atctgttgaa caccatcacc 540
agggaaaaag tggactcaat gggtcctatc agatgtccag acgcctccgt tgctggtttg 600
atggtcaagg aaatcgaaaa gtacagaggc aacaaggact ctatcggtgg tgtcgtcact 660
tgtgtcgtga gaaacttgcc taccggtctc ggtgagccat gctttgacaa gttggaagcc 720
atgttggctc atgctatgtt gtccattcca gcatccaagg gtttcgaaat tggctcaggt 780
tttcagggtg tctctgttcc agggtccaag cacaatgacc cattttactt tgaaaaagaa 840
acaaacagat taagaacaaa gaccaacaat tcaggtggtg tacaaggtgg tatctctaat 900
ggtgagaaca tctatttctc tgtcccattc aagtcagtgg ccactatctc tcaagaacaa 960
aaaaccgcca cttacgatgg tgaagaaggt atcttagccg ctaagggtag acatgaccct 1020
gctgtcactc caagagctat tcctattgtg gaagccatga ccgctctggt gttggctgac 1080
gcgcttttga tccaaaaggc aagagatttc tccagatccg tggttcatta a 1131
<210> 9
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgttcatta aaaacgatca cgccggtgac aggaaacgct tggaagactg gagaatcaaa 60
ggttatgatc cattaacccc tccagatctg cttcaacatg aatttccaat ttcagccaaa 120
ggtgaggaaa acattatcaa ggcaagagac tccgtctgtg atattttgaa tggtaaagat 180
gatcgtttag ttatcgtgat cgggccatgt tccctacatg accccaaagc cgcttacgat 240
tacgctgaca gattggctaa aatttcagaa aagttgtcaa aagacttatt gattattatg 300
agagcgtatt tagaaaaacc aaggactact gttggctgga aagggttgat taacgaccct 360
gatatgaata actcttttca aatcaataaa ggtctacgga tttcgagaga aatgttcata 420
aaactggttg aaaaattacc cattgctggt gagatgttgg ataccatttc tccgcagttt 480
ttgagtgatt gtttctcctt gggtgccatc ggcgccagaa ctactgaatc ccaactgcac 540
agagaattag catccggtct atctttccct attggattta agaacggtac tgatggtggt 600
ttgcaagtcg ccatcgacgc tatgagagcc gctgcacatg aacattactt cctttctgtc 660
acaaagccag gtgtcactgc tatcgtgggc actgaaggta acaaggatac cttcctgatc 720
ttgagaggtg gtaagaacgg tactaacttt gacaaagaaa gtgttcaaaa tactaagaaa 780
cagttagaaa aggccggttt gactgatgat tcccagaaaa gaattatgat cgattgttcc 840
cacggcaaca gtaataaaga tttcaagaac caaccaaagg ttgccaaatg tatttatgac 900
cagctgacgg agggtgagaa tagtctctgt ggtgttatga ttgagtccaa cataaatgaa 960
ggtagacaag atattcccaa agaaggtggc agagagggat tgaagtatgg ttgttctgtt 1020
acggatgctt gtattggctg ggagtccacc gaacaggtat tggagctatt ggcagaaggt 1080
gttagaaaca gaagaaaggc cttgaaaaaa tag 1113
<210> 10
<211> 525
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgacacaac ctctttttct gatcgggcct cggggctgtg gtaaaacaac ggtcggaatg 60
gcccttgccg attcgcttaa ccgtcggttt gtcgataccg atcagtggtt gcaatcacag 120
ctcaatatga cggtcgcgga gatcgtcgaa agggaagagt gggcgggatt tcgcgccaga 180
gaaacggcgg cgctggaagc ggtaactgcg ccatccaccg ttatcgctac aggcggcggc 240
attattctga cggaatttaa tcgtcacttc atgcaaaata acgggatcgt ggtttatttg 300
tgtgcgccag tatcagtcct ggttaaccga ctgcaagctg caccggaaga agatttacgg 360
ccaaccttaa cgggaaaacc gctgagcgaa gaagttcagg aagtgctgga agaacgcgat 420
gcgctatatc gcgaagttgc gcatattatc atcgacgcaa caaacgaacc cagccaggtg 480
atttctgaaa ttcgcagcgc cctggcacag acgatcaatt gttga 525

Claims (5)

1.一株可合成樱桃苷的酿酒酵母，其特征在于，以含有柚皮素合成途径的酿酒酵母E32为出发菌株，表达了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的来源于Arabidopsis thaliana的葡萄糖基转移酶基因UGT73C6，其替换酿酒酵母基因组上的EXG1基因，还进行了如下改进：
（1）敲除了酿酒酵母内源糖苷水解酶基因SPR1；
（2）过量表达酿酒酵母内源基因PGM1、UGP1、URA6和YNK1；
（3）引入了异源蔗糖磷酸化酶途径基因galU；
（4）过量表达莽草酸途径基因ARO1、ARO2、ARO3和aroL；其中，基因PGM1、UGP1、URA6和YNK1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，基因galU的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，基因ARO1、ARO2、ARO3和aroL的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，利用启动子PCCW12起始UGT73C6基因表达。
3.根据权利要求1或2所述的酿酒酵母，其特征在于，用启动子PTDH3起始PGM1基因的表达；用启动子PPGK1起始UGP1基因的表达；用启动子PFBA1起始URA6基因的表达；用启动子PENO2起始YNK1基因的表达；用启动子PTDH3起始galU基因的表达。
4.一种生产樱桃苷的方法，其特征在于，应用权利要求1~3任一所述的酿酒酵母发酵，收集发酵液中的樱桃苷；所述发酵是将所述酿酒酵母接种于YPD培养基中，于25~30℃发酵至少72 h。
5.权利要求1~3任一所述的酿酒酵母或权利要求4所述方法在生产樱桃苷或含樱桃苷的产品中的应用。
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