CN107446844A - 一种野油菜黄单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种野油菜黄单胞菌及其应用,本发明菌株具备高活性糖基转移酶活性,能够同时对多种小分子化合物包括对苯二酚、L‑薄荷醇、丁香酚和异丁香酚进行有效糖基化。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种野油菜黄单胞菌及其应用。
(二)背景技术
天然活性小分子化合物具有重要的生理功能包括抗真菌、抗细菌、抗肿瘤、抗氧化等,在医药、食品、保健品以及化妆品行业具有重要的应用价值。这些小分子活性化合物包括维生素、抗生素、黄酮类物质、生物碱、固醇类化合物以及一些香味物质等等。这些物质往往是一类水溶性差或稳定性差的化合物,在实际应用中存在很大的局限性。在不影响生理功能的前题下,对这些小分子物质进行必要的修饰,增加其水溶性、稳定性和生理活性,是目前生物化工领域创新性研究的重要方面。
为了增加脂溶性小分子化合物的水溶性和稳定性,糖基化是一个重要手段,而且糖基化能够显著增加一些活性物质的生理活性。最典型的是黄酮类化合物,其往往以糖基化的形式存在植物中,即黄酮糖苷类化合物,通过糖基化修饰,可以改变黄酮的水溶性、稳定性等,产生更多新的生物活性。抗坏血酸是一个典型的不稳定的维生素物质,通过糖基化后,显著增加其稳定性,延长其作用时间和存储时间,拓展应用范围如化妆品领域和组织细胞培养领域。对苯二酚是色素沉着治疗中应用最为广泛的治疗药物,其对皮肤细胞具有一定的美白功能,但同时产物刺激感和急性炎症的副作用,通过糖基化后,能够维持其美白功能的同时,消除副作用产生,即糖基化生产熊果苷。L-薄荷醇给人们带来清凉清新的感觉,但是极易挥发,在食品应用中存在较大的局限性,通过糖基化,可显著提高其稳定性。所以,糖基化修饰活性小分子化合物具有非常广泛的应用价值。
小分子化合物的糖基化方式主要分为两种,即化学法和生物法。化学法糖基化,往往需要多个步骤的反应,包括合适的糖基供体、添加小分子物质的保护基团、糖基化反应、去保护基团等,容易形成生物活性低的β-糖苷键或产生消旋体化合物,也会产生大量的三废物质等。生物法糖基化存在明显的优势,首先小分子化合物往往是天然产物,应用于医药、食品、化妆品等领域,生物法修饰,容易被人们接受;再者,许多生物法糖基化,产生高活性的α-糖苷键产物和光学纯物质;此外,生物法相对简单,选择合适的酶,可通过一步酶法催化实现区域选择性的糖基化修饰。所以,采用生物催化法,选择合适的微生物或者糖基转移酶,对活性小分子化合物进行糖基化修饰,具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种野油菜黄单胞菌及其在糖基化反应中的应用,具备高活性糖基转移酶活性,可用于生物催化转化高效生产α-熊果苷、L-薄荷醇-α-糖苷以及丁香酚-α-糖苷。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一株新菌株--野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)IFE008,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC No.13990,保藏日期2017年4月7日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101。
本发明还提供一种所述野油菜黄单胞菌在糖基化反应中的应用。
进一步,所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源,以麦芽糖为助剂,加入底物,以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质,在30-40℃下反应完全,获得糖基化底物;所述底物为对苯二酚、L-薄荷醇、丁香酚或异丁香酚中的一种。
进一步,所述酶源用量以缓冲液体积计为5~20g/L(优选10g/L),所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为200~1000g/L(优选800g/L),所述底物用量以缓冲液体积计为5~50g/L。
进一步,所述酶源按如下方法制备:以体积浓度1%接种量取野油菜黄单胞菌IFE008的-80℃甘油贮存液,接种于新鲜MPY液体培养基,30℃摇床培养24小时,转速180rpm,接着以体积浓度2%接种量转接到新鲜MPY液体培养基,30℃、180rpm摇床培养18-20h,离心收集湿菌体,冷冻干燥,获得冻干粉;所述MPY培养基组成:麦芽糖50.0g/L,酵母粉2.0g/L,蛋白胨10.0g/L,MgSO4·7H2O1.0g/L,溶剂为蒸馏水,pH7.0。
本发明所述底物为对苯二酚时,所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源,以麦芽糖为助剂,加入对苯二酚,以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质,在40℃下反应完全,获得α-熊果苷;所述酶源用量以缓冲液体积计为10g/L,所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为800g/L,所述底物用量以缓冲液体积计为50mM。
本发明所述底物为L-薄荷醇时,所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源,以麦芽糖为助剂,加入L-薄荷醇,以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质,在40℃下反应完全,获得L-薄荷醇-α-糖苷;所述酶源用量以缓冲液体积计为10g/L,所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为800g/L,所述底物用量以缓冲液体积计为50mM。
本发明所述底物为丁香酚或异丁香酚时,所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源,以麦芽糖为助剂,加入丁香酚或异丁香酚,以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质,在40℃下反应完全,获得丁香酚-α-糖苷和异丁香酚-α-糖苷;所述酶源用量以缓冲液体积计为10g/L,所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为800g/L,所述底物用量以缓冲液体积计为50mM。
与现有技术相比,本发明有益效果主要体现在:本发明菌株具备高活性糖基转移酶活性,能够同时对多种小分子化合物包括对苯二酚、L-薄荷醇、丁香酚和异丁香酚进行有效糖基化。
(四)附图说明
图1BOX-PCR和M13-PCR扩增指纹图谱,A:BOX-PCR扩增指纹,B:M13-PCR扩增指纹。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1野油菜黄单胞菌的筛选
取染病的和腐烂的野油菜菜叶10g,直接加入到50mL生理盐水中,摇床放置30min,将悬浊液用生理盐水梯度稀释,涂布于半选择性的NSCA培养基(淀粉15g/L,营养琼脂粉23g/L,放线菌酮100mg/L,溶剂为蒸馏水,pH值自然)平板,28℃好氧培养48h。挑取浅黄色凸粘液单菌落反复进行NSCA平板划线分离,重复三次得到纯化的菌株IFE008,供下一步鉴定用。
形态观察:
1)菌落特征观察:用肉眼直接观察,挑选菌落直径在2~4mm之间,表面光滑,浅黄色凸粘液等符合野油菜黄单胞菌菌落形态特征。2)划线到YDC培养基平板(酵母粉10.0g/L,葡萄糖20.0g/L,碳酸钙粉20.0g/L,琼脂15.0g/L,溶剂为蒸馏水,pH值自然),菌落呈深黄色,光滑凸起,粘液状。3)细胞形态观察:用光学显微镜观察,革兰氏阴性菌,细胞直杆状。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。
16S rDNA测序鉴定:以体积浓度1~2%接种量取-80℃甘油贮存液接种于NGA培养基(牛肉膏3.0g/L,蛋白胨5.0g/L,葡萄糖2.5g/L,琼脂粉15.0g/L,溶剂为蒸馏水,pH值自然)中,28℃振荡静置培养24h。取适量培养液离心2min(4000rpm,4℃),弃尽上清液,得到适量菌体,用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。用细菌通用引物27F/1541R(27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,1541R:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA)扩增16s rDNA,反应条件为:94℃预变性3min后进入以下循环:94℃变性40s,56℃退火35s,72℃延伸80s,30个循环;72℃延伸10min。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将PCR扩增产物直接寄送上海生工基因测序,分别用27F和1541R测序,拼接序列如SEQ ID NO.1所示,在NCBI网站上进行BLAST序列比对,确定菌株IFE008为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)IFE008,已于2017年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.13990,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
实施例2野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990的M13-PCR和BOX-PCR的指纹扩增
BOX-PCR指纹扩增:以体积浓度1~2%接种量取-80℃甘油贮存液接种于NGA培养基中,28℃振荡静置培养24h。取适量培养液离心2min(4000rpm,4℃),弃尽上清液,得到适量菌体,用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。采用BOX引物(CTACGGCAAGGCGACGCTGACG)进行PCR扩增。反应体系为:Mg2+的浓度为3.0mmol/L,引物浓度为1.0μmol/L,DNA模板浓度为4.8ng/μL-0.48ng/μL,每种核苷酸的浓度为200μmol/L,TaqDNA聚合酶添加量为2.5U/25μL。PCR反应程序为:94℃3min,53℃2min,72℃ 3min后进入以下循环:94℃变性40s,53℃30s,72℃延伸2min,35个循环;72℃延伸10min。取15μL的PCR产物用于118%的琼脂糖凝胶电泳(15cm×15cm)分离,在6.5V/cm稳压条件下电泳4h。用GoldView DNA染料染色,在紫外光下成像,即得M13-PCR指纹,如图1中A。
M13-PCR指纹扩增:以体积浓度1~2%接种量取-80℃甘油贮存液接种于NGA培养基中,28℃振荡静置培养24h。取适量培养液离心2min(4000rpm,4℃),弃尽上清液,得到适量菌体,用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。采用M13引物(GAGGGTGGCGGTTCT)进行PCR扩增。反应体系为:Mg2+的浓度为3.5mmol/L,引物浓度为2.0μmol/L,DNA模板浓度为4.8ng/μL-0.48ng/μL,每种核苷酸的浓度为200μmol/L,Taq DNA聚合酶添加量为2.5U/25μL。PCR反应程序为:94℃3min,42℃2min,72℃ 3min后进入以下循环:94℃变性40s,42℃20s,72℃延伸2min,35个循环;72℃延伸10min。取15μL的PCR产物用于118%的琼脂糖凝胶电泳(15cm×15cm)分离,在6.5V/cm稳压条件下电泳4h。用GoldViewDNA染料染色,在紫外光下成像,即得M13-PCR指纹,如图1中B。
实施例3野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990细胞催化对苯二酚生产α-熊果苷
该实验所用的培养基为MPY培养基:麦芽糖50.0g/L,酵母粉2.0g/L,蛋白胨10.0g/L,MgSO4·7H2O1.0g/L,溶剂为蒸馏水,pH7.0。
以体积浓度1%接种量取-80℃甘油贮存液,直接接种于新鲜MPY液体培养基,30℃摇床培养24小时,转速180rpm。接着以体积浓度2%接种量转接到新鲜MPY液体培养基,30℃、180rpm摇床培养18-20h,离心收集湿菌体细胞,用于对苯二酚的糖基化反应。
取500mL离心收集的野油菜黄单孢菌IFE008细胞,用液氮冻干;取5g冻干的细胞溶解在500ml的硼酸缓冲液(pH8.0)中;直接加入400g的麦芽糖和2.75g的对苯二酚;将反应液倒入1L的烧杯中,放置于40℃水浴锅中,搅拌1h;转化反应的产物用于HPLC分析,测得产物α-熊果苷浓度约为20mM,转化率为40%。
HPLC分析条件。样品前处理:100μL反应液,加入到900μL的0.01mol/L稀盐酸中;12000×g离心5min,用0.22μm滤膜过滤,将滤液加入液相样品瓶中;色谱柱:Cl8柱,250×4.6mm;柱温:25℃;流动相:CH3OH(甲醇):H2O:C2HF3O2(三氟乙酸)=90:10:0.01(体积比);流速:0.8mL·min-1;检测器:紫外检测器;检测波长:287nm;进样量:10μL。底物对苯二酚的出峰时间一般为5-5.5min,产物α-熊果苷的出峰时间为6.5-7.5min。
实施例4野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990细胞催化L-薄荷醇生产L-薄荷醇-α-糖苷
以体积浓度1%接种量取-80℃甘油贮存液,接种于新鲜MPY液体培养基,30℃摇床培养24小时,转速180rpm。接着以体积浓度2%接种量转接到新鲜MPY液体培养基,30℃、180rpm培养18-20h,离心收集湿菌体细胞,用于对苯二酚的糖基化反应。
取500mL离心收集的野油菜黄单孢菌IFE008细胞,用液氮冻干;5g冻干的细胞溶解在500ml的硼酸缓冲液(pH8.0)中;直接加入400g的麦芽糖和2.0g的L-薄荷醇;将反应液倒入1L的烧杯中,放置于40℃水浴锅中,搅拌24h;转化反应的产物用于HPLC分析,测得产物L-薄荷醇-α-糖苷的浓度约为1g/L,转化率为20%。
HPLC分析条件。取反应液0.5ml的反应液,加入到1.2ml的甲醇中,12000rpm离心5min;用0.22μm滤膜过滤,将滤液加入液相样品瓶中。色谱柱:Cl8柱,250×4.6mm;柱温:30℃;流动相:CH3OH(甲醇):H2O:C2HF3O2(三氟乙酸)=70:30:0.01(体积比);流速:1.0mL·min-1;检测器:视差折光检测器;进样量:10μL。底物L-薄荷醇的出峰时间一般为8.5-9.0min,产物L-薄荷醇-α-糖苷的出峰时间为14.5-15.5min。
实施例5野油菜黄单胞菌CGMCC No.13990细胞催化丁香酚或异丁香酚生产丁香酚-α-糖苷或已丁香酚-α-糖苷
以体积浓度1%接种量取-80℃甘油贮存液,接种于新鲜MPY液体培养基,30℃摇床培养24小时,转速180rpm。接着以体积浓度2%接种量转接到新鲜MPY液体培养基,30℃、180rpm培养18-20h,离心收集细胞,用于对苯二酚的糖基化反应。
取500mL离心收集的野油菜黄单孢菌IFE008细胞,用液氮冻干;5g冻干的细胞溶解在500ml的硼酸缓冲液(pH8.0)中;直接加入400g的麦芽糖和终浓度50mM(以缓冲液体积计)的丁香酚或异丁香酚;将反应液倒入1L的烧杯中,放置于40℃水浴锅中,搅拌0.5h;转化反应的产物用于HPLC分析,测得产物丁香酚-α-糖苷或已丁香酚-α-糖苷的浓度约为6mM,转化率为20%。
HPLC分析条件。样品前处理:400μL反应液,加入到600μL的甲醇中;12000×g离心5min,用0.22μm滤膜过滤,将滤液加入液相样品瓶中;色谱柱:Cl8柱,250×4.6mm;柱温:40℃;流动相:CH3OH(甲醇):H2O:C2HF3O2(三氟乙酸)=60:40:0.01(体积比);流速:1.0mL·min-1;检测器:紫外检测器;检测波长:280nm;进样量:10μL。底物丁香酚的出峰时间一般为6.0min,产物丁香酚-α-糖苷的出峰时间为12.0min。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
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gtaagagctt gctcttatgg gtggcgagtg gcggacgggt gaggaataca tcggaatcta 60
ctctttcgtg ggggataacg tagggaaact tacgctaata ccgcatacga cctacgggtg 120
aaagcggagg accttcgggc ttcgcgcgat tgaatgagcc gatgtcggat tagctagttg 180
gcggggtaaa ggcccaccaa ggcgacgatc cgtagctggt ctgagaggat gatcagccac 240
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aataagcacc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaagggtg caagcgttac 480
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gtacacaccg cccgtcacac catgggagtt tgttgcacca gaag 1364
Claims (5)
1.野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)IFE008,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC No.13990,保藏日期2017年4月7日,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101。
2.一种权利要求1所述野油菜黄单胞菌IFE008在糖基化反应中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于所述的应用以野油菜黄单胞菌IFE008经诱导培养获得的湿菌体冻干粉为酶源,以麦芽糖为助剂,加入底物,以pH8.0硼酸缓冲液为反应介质,在30-40℃下反应完全,获得糖基化底物;所述底物为对苯二酚、L-薄荷醇、丁香酚或异丁香酚中的一种。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述酶源用量以缓冲液体积计为5~20g/L,所述麦芽糖用量以缓冲液体积计为200~1000g/L,所述底物用量以缓冲液体积计为5~50g/L。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述酶源按如下方法制备:以体积浓度1%接种量取野油菜黄单胞菌IFE008的-80℃甘油贮存液,接种于新鲜MPY液体培养基,30℃摇床培养24小时,转速180rpm,接着以体积浓度2%接种量转接到新鲜MPY液体培养基,30℃、180rpm摇床培养18-20h,离心收集湿菌体,冷冻干燥,获得冻干粉;所述MPY培养基组成:麦芽糖50.0g/L,酵母粉2.0g/L,蛋白胨10.0g/L,MgSO4·7H2O1.0g/L,溶剂为蒸馏水,pH7.0。
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