CN104818287B - 棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1作为抗棉花黄萎病菌靶标基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物病害领域，具体涉及棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1作为抗棉花黄萎病菌靶标基因的应用。本发明对敲除突变体ΔVdPR1和互补突变体ΔVdPR1‑C的菌落形态、生长速率、胞外酶活性以及致病力进行测定，并和野生型的各项指标进行比较分析，确定VdPR1基因是棉花黄萎病菌致病相关基因，关联微菌核的产生、黑色素的积累，对纤维素酶、蛋白酶的活性起到促进作用。

Description

棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1作为抗棉花黄萎病菌靶 标基因的应用

技术领域

本发明涉及植物病害领域，具体涉及棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1作为抗棉花黄萎病菌靶标基因的应用。

背景技术

植物病害是影响作物生产乃至全球粮食安全的重要因素，而真菌是其中重要的一大病原物类群。加强病原真菌的致病机制和寄主抗病机制的研究，寻求控制真菌病害的新途径成为科学研究的重要任务和热点。而对病原真菌基因功能的研究是解决上述问题的关键之一。

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的棉花黄萎病是一种世界性真菌病害，是世界各主要产棉国家和地区普遍发生和危害最严重的病害之一。每年给棉花生产造成巨大损失，迄今为止尚无有效的防治办法。棉花黄萎病为土传维管束病害，防治困难，难以找到很好的抗源材料，因而多年来一直未能培育出高抗黄萎病的棉花新品种。研究开发的病害防治方法和药剂亦难以达到理想的防治效果。尽管黄萎病对棉花生产造成的经济损失不容低估，但有关致病的分子机制方面的研究报道还很有限。

应用生物信息学方法分析大丽轮枝菌VdLs.17基因组序列发现，含有大量的编码碳水化合物活性酶类(Carbohydrate-activeen-zymes)如果胶酶、纤维素酶和分泌蛋白，这可能是大丽轮枝菌能够在广泛的寄主植物上定殖的重要原因之一。

TALL-PCR能够快速有效地获得T-DNA插入位点侧翼序列，已经被用于大丽轮枝菌突变体侧翼染色体DNA序列的分离。深入研究棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌与寄主植物互作的分子机制，为控制黄萎病的发生奠定了基础。

微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和黄萎病的初侵染菌源，在病害循环中起重要作用，当植物组织坏死或者早衰时，形成的微菌核与在土壤中潜伏或者二次侵染有关，其形成的数量及存活情况直接影响黄萎病的发生为害程度。因此，明确微菌核形成与萌发机制对于深入研究棉花黄萎病病害流行规律和制定防治措施具重要意义。

细胞壁作为植物的第一道物理屏障，在防御病原菌方面起重要作用。病原菌若成功侵染植物，必须要突破这一道屏障。大丽轮枝菌在侵染寄主植物时产生各种细胞壁降解酶，如果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等，这些细胞壁降解酶能降解寄主植物的细胞壁，打破寄主的物理屏障，有利于病原菌的定殖、传播和症状的扩展，细胞壁降解酶在大丽轮枝菌致病中作为毒力因子而起作用。

分泌蛋白是一类带有信号肽结构能够转运到胞外的生物大分子，通常具有酶活性或者与其它因子(自身/外界)互作而发挥功能，如碳水化合物酶类、效应物等，大丽轮枝菌分泌的胞外蛋白(复杂的糖蛋白化合物)是引起寄主萎蔫并最终发病的一个重要因素。因此，大丽轮枝菌的胞外蛋白是引起棉花产生黄萎病的重要因素之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克隆了一个来源于棉花黄萎病菌的、在致病性、黑色素积累、微菌核产生和纤维素酶、蛋白酶活性中起重要作用的，且为新的分泌蛋白基因VdPR1，通过鉴定该基因为防治棉花黄萎病害提供药物靶标。

为了解决上述技术问题，本发明提供了棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1作为抗棉花黄萎病菌靶标基因的应用，其中，所述棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明克隆了棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1(Pathogenicity RelatedGene)，其来自大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)，该基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1，该基因的ORF序列具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

本发明同时提供了上述基因VdPR1编码的蛋白质序列，该蛋白质序列具有SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:3所示的第1位至第19位序列为信号肽序列。

本发明通过筛选农杆菌介导的T-DNA插入技术建立的大丽轮枝菌突变体库，获得了致病力减弱的突变菌株vdpr1。Southern杂交证实该突变菌株为T-DNA单插入突变体。借助TAIL-PCR技术和VdLs.17的基因组数据库，获得了T-DNA插入的侧翼序列，并从野生型菌株Vd080中成功克隆得到了致病相关基因VdPR1。

本发明构建了VdPR1敲除载体，利用农杆菌介导的转化将载体转入野生型菌株Vd080，得到基因缺失突变体ΔVdPR1；在敲除突变体ΔVdPR1中重新导入VdPR1基因，获得互补突变体ΔVdPR1-C。

本发明对敲除突变体ΔVdPR1和互补突变体ΔVdPR1-C的菌落形态、生长速率、胞外酶活性以及致病力进行测定，并和野生型的各项指标进行比较分析。结果表明：敲除突变体ΔVdPR1微菌核和黑色素产量明显降低，在不同碳源(蔗糖、脱脂奶粉、纤维素、淀粉)的培养基上生长速率也发生了变化，其中在纤维素为唯一碳源的培养基上降低了21％，在脱脂奶粉为唯一碳源的培养基上降低了15％。致病力测定结果表明，敲除突变体ΔVdPR1的致病力也显著降低，棉株的病情指数仅为野生型的41％，降低了59％。因此，确定VdPR1基因是棉花黄萎病菌致病相关基因，关联微菌核的产生、黑色素的积累，对纤维素酶、蛋白酶的活性起到促进作用。

附图说明

图1：A：突变菌株vdpr1的southern杂交检测；B：VdPR1基因结构和T-DNA插入位置示意图；

图2：互补突变体ΔVdPR1-C绿色荧光观察；

图3：VdPR1基因转录水平的测定，A：敲除突变体ΔVdPR1；B：互补突变体ΔVdPR1-C；

图4：突变体菌株在PDA培养基上的菌落形态；

图5：突变体菌株在不同碳源(蔗糖、脱脂奶粉、纤维素、淀粉)培养基上生长示意图；

图6：突变体的致病力测定(A、C：野生型Vd080和突变体侵染的棉花表型；B、D：病情指数)。

棉花黄萎病菌(Virticillium dahliae)菌株Vd080，于2012年3月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是：CGMCC No.5904。

具体实施方式

实施例1：VdPR1基因的分离和克隆

通过对强致病力棉花黄萎病菌菌株Vd080(保藏号：CGMCC No.5904的T-DNA插入突变体库进行致病力测定，筛选获得了致病性显著降低的突变体vdpr1。Southern杂交证实该突变体是T-DNA单拷贝插入，利用TAIL-PCR和VdLs.17基因组数据库，获得致病相关基因VdPR1。

1.1Southern杂交确定突变体vdpr1T-DNA插入拷贝数

根据T-DNA上大小约为500bp的潮霉素片段序列设计Southern杂交探针引物HygP-F/R。低致病力突变体vdpr1的基因组DNA 5ng，NEB buffer 10μL，BamHⅠ3μL，补水至100μL。37℃消化5h，之后，65℃水浴10min，终止酶切反应。探针制备、DNA变性、转移、杂交及显色方法按照试剂盒说明书进行。

以T-DNA上的潮霉素区段做探针的Southern blot结果表明，探针在低致病力突变体vdpr1基因组上只有一个杂交信号。说明T-DNA在突变体VdPR1中为单拷贝(图1A)。

1.2TAIL-PCR技术获得VdPR1的基因信息

根据双元载体pCTHyg(建ATMT库所用)的T-DNA左臂(LB)和右臂(RB)内侧DNA序列，分别设计3′和5′步移引物R-SP1、R-SP2、R-SP3和L-SP1、L-SP2和L-SP3，Genome Walking试剂盒提供的简并引物AP1、AP2、AP3和AP4，步移引物与随机引物成对作为模板扩增T-DNA左右臂侧翼序列，引物序列见表1。所用反应程序及反应体系均按照Genome Walking试剂盒的方法进行。反应结束后，取上述第一轮、第二轮、第三轮的反应产物于1％的琼脂糖凝胶电泳上检测。分别回收3′端和5′端第三轮TAIL-PCR特异产物，克隆测序。测序结果先与T-DNA进行两两比对，随后和美国Broad研究所在线共享的大丽轮枝菌VdLs.17的基因组数据库http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/verticil-lium-dahliae进行比对分析，发现T-DNA插入到VdPR1基因第一外显子区，并提取致病相关基因VdPR1的基本信息。该基因位于大丽轮枝菌的第一条染色体上，由2239个碱基组成，包括4个外显子和3个内含子，编码蛋白序列长度为464个氨基酸。

1.3VdPR1基因的克隆

以野生型菌株Vd080的DNA为模板克隆基因全长并测序；利用BLAST软件在NR数据库(non-redundant sequence database)上比对发现，除了与VDAG_00904(VdLs.17)相似性100％，未发现其他氨基酸序列相似性在80％以上的基因，其编码的蛋白序列C端具有PA14Superfamily的保守结构域，该结构域与细菌β-葡糖苷酶的插入，酵母的粘附素，细菌毒素有关。在野生型菌株Vd080的cDNA文库中克隆该基因的编码序列并测序(图1B)。DNA序列见为SEQ ID NO:1，ORF序列见为SEQ ID NO:2。

1.4VdPR1基因编码蛋白的分泌特性预测

分泌蛋白预测按以下流程进行：应用亚细胞定位Y-Loc(http://www.abi.inf.uni -tuebingen.de/Services/YLoc/)预测基因编码蛋白在真菌模式的亚细胞定位；通过信号肽预测软件Signal P4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析编码蛋白N端的信号肽；利用跨膜结构预测软件TMHMM2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析编码蛋白的跨膜结构域；应用跨膜拓扑学和信号肽预测软件big-PI Predictor(http://mendel.imp.ac.at/sat/gpi/fungi-server.html)预测蛋白的GPI锚定位点和信号肽。结果得出，VdPR1基因编码蛋白为分泌蛋白，其亚细胞定位于Secretome pathway，具有信号肽，无跨膜结构域，无GPI锚定位点。

实施例2：VdPR1基因敲除载体和互补载体的构建

2.1敲除载体的构建

首先采用常规PCR方法，分别用引物P1/P3和P4/P6从野生型Vd080的基因组中扩增VdPR1基因上游1.2kb序列和下游1.2kb序列，通过引物HPH-F和HPH-R从质粒pUC-Hyg中获取1.8kb的潮霉素抗性基因盒序列，其中引物P3、P4和HPH-F、HPH-R具有反向互补的接头。然后结合融合PCR技术，将上游片段、潮霉素抗性基因盒和下游片段按照1:3:1融合，获得上游-潮霉素-下游片段的融合产物。其次利用巢式PCR手段，以三片段融合产物为模板，用带有Gateway BP反应接头的特异引物P2和P5进行扩增。最后，通过Gateway BP反应将此片段整合到pGKO2-Gateway载体并转化大肠杆菌Trans 1，筛选阳性克隆并测序验证，获得敲除载体pGKO-VdPR1。引物序列见表1。

2.2互补载体的构建

根据野生型菌株Vd080中VdPR1基因序列(包括该基因的前端启动子区约1kb、基因区2239bp以及终止密码子后端约500bp的序列)，结合带有氯嘧磺隆抗性的骨架双元载体载体pSULPH-gfp的多克隆位点，设计高特异引物COM-F/R,从野生型菌株Vd080的基因组中扩增获得目的基因，连接于克隆载体pEASY-T1，通过酶切位点Xma I和BsrG I分别正向插入pSULPH-gfp质粒中，转化大肠杆菌Trans 1，筛选阳性克隆并测序验证，获得互补载体pSUL-VdPR1，引物序列见表1。

实施例3：VdPR1基因敲除突变体和互补突变体的获得

3.1敲除突变体的获得

采用冻融法将敲除载体pGKO-VdPR1转入农杆菌AGL-1，用于野生型菌株Vd080的遗传转化，将大丽轮枝菌Vd080的孢子液浓度调为5×10⁶CFU/mL与农杆菌AGL-1(OD＝0.3–0.4)等体积混匀，取200ul混合液涂布于平铺于IM培养基(200μmol/L AS)的微孔滤膜，于25℃培养箱中培养2天。将上述微孔滤膜转移到PDA筛选培养基(50μg/mL Cef，50μg/mL Spe，50μg/mL Hyg和50μmol/L F₂dU)上进行，25℃培养5d以上，直至转化子菌落出现。用牙签挑取少量菌丝加入200ul无菌水中，制备孢子悬浮液，涂WA(Cef、Spe、Hyg、F₂dU)平板，25℃培养2d，用体式显微镜观察孢子萌发情况，挑选单个萌发孢子于PDA平板(Cef、Spe、Hyg、F₂dU)上，于25℃培养箱中培养5天，挑取5mm菌饼于Czapek液体培养基中，25℃，150r/min振荡培养7d，收集菌丝并提取基因组。以Vd080为阳性对照，根据VdPR1基因设计检测引物Test-F/R(扩增片段大小约为500bp)，用Test-F/R引物进行PCR验证，敲除突变体没有出现500bp的目的条带，用HPH-F/R引物PCR扩增出1.8kb大小的潮霉素抗性基因，从而筛选出敲除突变体ΔVdPR1，引物见序列表1。

3.2互补突变体的获得

互补载体pSUL-VdPR1的遗传转化基本步骤与敲除载体的转化相似，采用冻融法将互补载体pSUL-VdPR1转入农杆菌AGL-1，用于敲除突变体ΔVdPR1的遗传转化。筛选互补转化子则在添加有50μg/mL Cef，50μg/mL Spe，50μg/mL Hyg和50μg/mL Chl的PDA培养基上进行，25℃培养5d后转化子菌落出现。根据双元载体pSULPH-gfp中GFP基因设计引物GFP-F/R(扩增片段大小约为800bp)，用COM-F/R、GFP-F/R引物对互补转化子的基因组DNA进行PCR验证，均得到了预期大小的目的片段。因互补突变体可以表达绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下观察显示3个互补突变体呈现明显的荧光(图2)，引物序列见表1。

根据突变体中靶标基因VdPR1被替换掉的DNA序列设计引物RT-F/R，以V.dahliae的β-tubulin基因(Vdβt)为内参，RT-PCR检测突变体中靶标基因的转录水平的变化。结果表明，敲除突变体ΔVdPR1中VdPR1不表达(图3A)，而互补突变体ΔVdPR1-C中VdPR1表达量接近野生型(图3B)。

表1引物序列

注：下划线部分代表与HPH-F/R或P3/P4反向互补的序列；波浪线部分代表GatewayBP反应的接头序列attB1和attB2；虚线部分代表酶切位点

实施例4：突变体的生物学性状分析

4.1菌落形态观察

取5μL浓度为1×10⁷CFU/mL孢子悬浮液滴于PDA平板上，25℃恒温培养11天，并分别于3d、5d、7d、9d和11d采用十字交叉法测定菌落生长直径，计算生长速率。观察发现与菌核型的野生菌株Vd080相比，敲除突变体ΔVdPR1为菌丝型，互补突变体ΔVdPR1-C为菌核型(图4)，初步推测VdPR1基因与微菌核和黑色素的合成有关。生长速率测定结果表明，敲除突变体ΔVdPR1的生长速率比野生型Vd080降低了18％，互补突变体ΔVdPR1-C的生长速率则恢复到野生型Vd080的水平。

4.2胞外酶活性的测定

取5μL浓度为1×10⁷CFU/mL的孢子悬浮液，置于不同碳源(蔗糖、脱脂奶粉、纤维素、淀粉)培养基中，每个菌株3个重复，25℃恒温静置培养11天，记录菌落的生长形态。并分别于3d、5d、7d、9d和11d采用十字交叉法测定菌落生长直径，计算生长速率。以野生型Vd080菌株为对照，通过比较菌落周围透明圈的有无或大小判断突变体菌株间胞外酶产生的差异。

在不同碳源(蔗糖、脱脂奶粉、纤维素、淀粉)培养基中，破坏掉VdPR1基因的敲除突变体ΔVdPR1菌落中的微菌核和黑色素含量比野生型菌株Vd080明显减少，说明该基因在微菌核形成过程中发挥重要作用。在以纤维素为唯一碳源的培养基上，敲除突变体ΔVdPR1的生长速率比野生型Vd080降低了21％，而互补突变体ΔVdPR1-C的生长速率则明显回升，与野生型Vd080相比差异不显著，说明VdPR1基因参与控制纤维素酶的活性。在脱脂奶粉为唯一碳源的培养基上，敲除突变体ΔVdPR1的生长速率比野生型Vd080降低了15％，而互补突变体ΔVdPR1-C的生长速率则明显回升，与野生型Vd080相比差异不显著，推测VdPR1基因对蛋白酶的活性有促进作用。在分别以蔗糖、淀粉为碳源的培养基上，敲除突变体和互补突变体的生长速率与野生型Vd080相比差异不显著(图5)。

实施例5：突变体的致病力测定

以陆地棉感病品种冀棉11为鉴别寄主，采用无底纸钵定量蘸根接种法，测定突变体的致病力。于棉苗第一片真叶平展时接种，每钵接种10ml孢子浓度为1×10⁷cfu/mL的孢子悬浮液。将野生型棉花黄萎病菌菌株Vd080和T-DNA插入突变体vdpr1作为对照，每个菌株设置3个重复，每个重复28-30株棉苗。接种后9d、15d、19d和24d调查并计算棉株病情指数。

结果表明，野生型菌株Vd080接种仅7天后，棉花叶片开始出现萎蔫,黄化，24天后出现了多数棉株死亡，病情指数高达52.11±3.7(P<0.01)，而3个敲除突变体对棉花的致病力明显减弱，在10天后才出现病叶，24天后的病情指数为20.42±2.0～22.28±2.7，仅为野生型Vd080的41％，降低了59％(图6A和图6B)，表明敲除突变株ΔVdPR1系统侵染棉花的能力显著降低。互补突变体ΔVdPR1-C的致病力则得到明显恢复，侵染24天后，3个互补突变体的病情指数为45.64±1.4～51.03±3.5，接近于野生型(图6C和图6D)，该结果进一步表明，VdPR1是大丽轮枝菌的致病相关基因。

Claims (2)

1.一种棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌灭活的方法，其特征在于，所述方法包括，使棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1失活的步骤，所述棉花黄萎病菌的致病相关基因VdPR1的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种棉花黄萎病致病菌大丽轮枝菌灭活的方法，其特征在于，所述方法包括，使棉花黄萎病菌的致病相关蛋白VdPR1失活的步骤，所述棉花黄萎病菌的致病相关蛋白VdPR1由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因编码。