CN107299105A

CN107299105A - 西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因、其缺失DNA片段、缺失突变体及其应用

Info

Publication number: CN107299105A
Application number: CN201710687638.0A
Authority: CN
Inventors: 尚泓泉; 徐小利; 梁慎; 赵卫星; 常高正; 李晓慧; 杨晓明; 程丹丹; 高宁宁; 康利允; 王彬; 王龙飞
Original assignee: Henan Zhumadian Agricultural School; INSTITUTE OF HORTICULTURE HENAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: Henan Zhumadian Agricultural School; INSTITUTE OF HORTICULTURE HENAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2017-10-27
Anticipated expiration: 2037-08-11
Also published as: CN107299105B

Abstract

本发明公开了一种西瓜枯萎病菌致病性基因FonAGL3、其缺失DNA片段、缺失突变体及其应用。旨在解决西瓜枯萎病生物防治的技术问题。本发明根据西瓜枯萎病菌T‑DNA插入突变体库分析和筛选发现的一种源于西瓜尖孢镰刀菌的致病性基因FonAGL3，采用基因同源置换原理，用抗性基因潮霉素B（ HPH）基因DNA片段替换目的基因FonAGL3的DNA片段，通过构建该基因缺失载体及野生型菌株FON‑11‑06遗传转化获得FonAGL3基因缺失突变体，该FonAGL3突变体菌剂具有良好枯萎病防治效果，且环境友好，防治成本低廉。

Description

西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因、其缺失DNA片段、缺失突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种西瓜枯萎病菌致病性基因FonAGL3、其缺失DNA片段、缺失突变体及其应用。

背景技术

西瓜枯萎病是由西瓜尖孢镰刀菌侵染引起的西瓜维管束系统病害；病原主要通过根部伤口或根毛顶端细胞间隙侵入，在寄主管壁细胞间和细胞内生长后，进入维管束，分解破坏细胞，使导管内积累果胶类物质，堵塞导管，影响水分运输，进而引起植株萎蔫。西瓜枯萎病自幼苗至成株均可发病，以座瓜期和瓜膨大后期发病最重。幼苗受害，出苗前可造成烂种；出土后发病，子叶、真叶呈失水状萎蔫，茎基部变褐收缩呈猝倒状，拔出苗子可见根部黄褐色腐烂。成株期受害，初期病株下部叶片失水萎蔫，茎蔓基部向上褪绿。后期病部呈棕褐色，发软，常纵裂，有胶状红色物质溢出。病株基部潮湿时，布满白色至粉红色霉状病原分生孢子，剖视茎基部至根部，可见维管束变黄褐色。迄今，己发现西瓜枯萎病有4个生理小种，即生理小种0、1、2和3，中国以生理小种1占优势。在农业生产中，枯萎病型尖孢镰刀菌除危害西瓜外，寄主范围广泛 , 可引起100 多种植物维管束萎蔫病害，如川红花、甘蔗、芝麻、粉蕉、凤梨以及瓜类和豆类等多种植物，尤其对葫芦科植物、香蕉、番茄和棉花等高经济价值作物有严重危害作用。

西瓜枯萎病菌实现侵染致病要通过一系列的复杂途径及其变化：菌体侵入寄主导管后，分泌降解寄主细胞壁相关酶：如内切多聚半乳糖醛酸酶（endoPGs）、外切α-1,4-半乳糖醛酸酶（exoPGs）、果胶酸内裂解酶（PL）、木聚糖酶（XYL）等，破坏导管周围薄壁组织、细胞，造成导管堵塞, 妨碍水分运输,同时，分泌一些镰刀菌酸等病原毒素伤害质膜，加速植株萎蔫。近年来，人们在尖孢镰刀菌分泌、侵入、定居、穿透和扩展等阶段及其镰刀菌生长、产孢、发育和致病性等分子生物学过程开展了较为全面的研究，研究领域涉及：细胞建成、信号途径（PKA、G蛋白(Fgb1和Fga1)、MAPK途径(Fμs3/Kss1、Ste12、 FoHog1等)、转录因子（Con7-1、Snt2和ftf1）、植物防卫物质解毒、细胞自噬等。

西瓜枯萎病在我国各地西瓜栽培区均有发生，该病害可造成西瓜产量下降30%，甚至绝收。近年来西瓜栽培尤其是保护地面积迅速扩大，重茬连作面积增大，保护地高温高湿造成西瓜枯萎病越来越普遍，越来越严重，给西瓜产业造成巨大经济损失。目前，人们采用了种种措施加强对西瓜枯萎病的防治，如嫁接育苗、抗病育种、化学防治等，但其效果都具有一定的局限性，还造成一定的负面作用：嫁接育苗对西瓜成熟期、品质有着重要的影响；抗病育种长周期性及其抗原的缺乏、化学防治大量使用农药带来环境污染、生态破坏和病害抗药性等负面影响等。人们希望寻找更加高效环境友好型生物农药，实现西瓜枯萎病害的有效防治。

发明内容

本发明要解决的技术问题是根据西瓜枯萎病菌T-DNA插入突变体库分析和筛选研究所发现的一种源于西瓜尖孢镰刀菌的致病性基因FonAGL3，通过该基因缺失载体构建及遗传转化获得FonAGL3基因缺失突变体，该FonAGL3突变体菌具有良好枯萎病防治效果，且环境友好，防治成本低廉。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明研究通过西瓜枯萎病菌T-DNA插入突变体库分析和筛选，新发现了一种源于西瓜尖孢镰刀菌的致病性基因FonAGL3，其核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

所述西瓜枯萎病菌致病性基因FonAGL3编码的cDNA，其具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

所述西瓜枯萎病菌致病性基因FonAGL3表达的蛋白质，其具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

经由以下构建方法获得西瓜枯萎病菌FonAGL3基因缺失DNA片段：

（1）第一轮PCR：以西瓜枯萎病菌基因组DNA为模板，以引物对alg3UF/alg3UR和alg3DF/alg3DR分别扩增目的基因FonAGL3上游和下游侧翼片段，以引物对HPHF/HPHR扩增抗性基因片段，分别回收Up、Down和HPH片段待用；

（2）第二轮PCR：将第一轮PCR产物混合作为模板，模板按照Up、HPH、Down的摩尔数比为1：2：1的原则，以Up和Down与HPH重叠部分为引物，不另外添加引物，其余组分按照常规PCR50μl体系添加；

（3）第三轮PCR：以第二轮PCR产物为模板，alg3UF/alg3DR为引物，扩增含Up+HPH+Down的全长拼接序列；

（4）将50μl足量第三轮PCR产物回收，不少于10μg的Up+HPH+Down拼接PCR片段用于FonAGL3基因缺失遗传转化；

以上各步骤所用引物序列如下：

P1 alg3UF：AGTTTCGTCATCGACAGGTTCC

P2 alg3UR：TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCCTCTATGTAAG CCCGACCTCT GGT

P3 alg3DF：ATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTCGTACTTATATATCTGGTTCGCGT

P4 alg3DR：ATCGCGATAT TTATGTCTTC AGCT

P5 HPHF：GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA

P6 HPHR：GAACCCGCGGTCGGCATCTACTCTAT

P7 alg3NF：AGTCCACACTACACCAAACGA

P8 alg3NR：ATATCATCCT TCAGTGACAG T

其中，引物alg3UR和alg3DF分别包含与抗性基因潮霉素B(HPH+)抗性标记基因两端序列一致的20-25个碱基。

在所述步骤（1）中，采用常规PCR 50μl反应体系：模板 1-100ng, HPHF(10uM) 2μl， HPHR(10uM) 2μl，dNTP(10mM) 2μl, 聚合酶 5-10U，聚合酶缓冲液5μl 水补足至50μl；PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸10min；采用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

在所述步骤（2）中，采用反应体系：模板 1-100ng，10mM dNTP 1μl，聚合酶 5-10U，聚合酶缓冲液5μl 水补足至50μl；PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45s，56℃退火45 s，72℃延伸5min，10个循环后，72℃延伸10min。

在所述步骤（3）中，采用50μl反应体系：模板 1-100ng，alg3UF(10uM) 2μl，alg3DR(10uM) 2μl，dNTP(10mM) 2μl，聚合酶 5-10U，聚合酶缓冲液5μl 水补足至50μl；PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5min，35个循环后，72℃延伸10min；采用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

经由以下方法可制得西瓜枯萎病菌FonAGL3基因缺失突变体：

（1）原生质体制备

①用灭菌擦镜纸过滤PDA培养10d后的西瓜尖孢镰刀，配制成1×10⁶分生孢子/ml的分生孢子悬浮液，接种到100 ml的PDA液体培养液中，25℃，180 rpm摇培10h，三层灭菌擦镜纸过滤，用0.7 M NaCl溶液冲洗多次，直到幼殖体悬浮液无分生孢子，将收集的幼殖体转移到三角瓶中待用；

②分别称取0.2 g溶菌酶、蜗牛酶和纤维素酶溶解在10ml的0.7 M NaCl溶液中，用细菌滤器过滤酶溶液到装有幼殖体的玻璃三角瓶中，充分摇匀，30℃，100 rpm摇培裂解3 h；用灭菌擦镜纸过滤酶解混合液，并用0.7 M NaCl溶液冲洗一次，收集滤液，4℃，5000 rpm，离心10 min，弃上清；原生质体沉淀用2 ml的0.7 M NaCl溶液重悬浮，4℃，5000 rpm，离心2min，弃上清；原生质体沉淀再用1ml的STC溶液重新悬浮，4℃，5000 rpm，离心2 min，弃上清；原生质体沉淀再用800 µl STC溶液重新悬浮，并逐滴加入200 µl的SPTC溶液，放置于冰上待用；

（2）原生质体转化

将30 µl目的DNA溶液、1ml原生质体悬浮液和10 µl肝素钠溶液加入离心管中，轻轻吸打混匀，冰上静置30 min；逐滴加入1/3体积的SPTC溶液，颠倒混匀，避光室温静置20 min；将转化混合液（DNA溶液、原生质体悬浮液和肝素钠）加入到灭菌的50 ml玻璃三角瓶中，并加入20 ml的RM再生培养液，避光室温静置2 h后，25℃，95 rpm过夜摇培；15h后，将复苏好的菌丝倒入温度适中的PDA培养基中，培养基含有100µg/ml潮霉素B，倒平板，25℃培养2～3d后挑转化子；

（3） FonAGL3基因缺失突变体鉴定

以转化子的基因组DNA为模板在FonAGL3基因内部设计引物alg3NF/alg3NR进行PCR扩增，而缺失突变体菌株PCR不能够扩增出553bp片段，表明该转化子是基因缺失突变体。

在所述步骤（3）中，PCR扩增反应体系为：alg3NF（10μM）1μl，alg3NR（10μM）1μl，taqE 5U，10xbμffer 2.5μl，模板1-100ng，dNTP（10μM） 1μl，H₂O add to 25μl。PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5min，35个循环后，72℃延伸10min。

所述西瓜枯萎病菌FonAGL3基因缺失突变体在防治西瓜枯萎病中的应用。

本发明积极有益的技术效果在于：

1.在明确源于西瓜尖孢镰刀菌基因FonAGL3及其表达产物的基础上，提供了其缺失表达载体的构建方法及其缺失突变体的获得途径。

2.明确了西瓜尖孢镰刀菌基因FonAGL3在致病性、培养性状和菌体形态等具有重要的调控功能。

3.所构建的西瓜尖孢镰刀菌基因FonAGL3缺失突变体具有良好枯萎病防治的效果，该突变体作为生物工程菌及生防制剂，且环境友好，防治成本低廉。

4.所发现的西瓜尖孢镰刀菌基因FonAGL3从一种新的角度阐明了西瓜尖孢镰刀菌病原的致病分子机理。

附图说明

图1为本发明FonAGL3基因缺失载体的构建示意图；

图2为野生型FON-11-06菌株和突变体A6325菌株培养性状对比图；其中，图2-A和图2-B为野生型FON-11-06菌株在PDA平板上培养4d后的培养性状，图2-A菌落正面，图2-B菌落背面；图2-C和图2-D为突变体A6325菌株在PDA平板上培养4d后的培养性状，图2-C菌落正面，图2-D菌落背面；

图3为野生型FON-11-06菌株和突变体A6325菌株的形态对比图；其中，图3-A：野生型FON-11-06菌株形态，图3-B：突变体A6325菌株形态；

图4为尖镰孢菌对西瓜苗的致病性对比图；其中，图4-A：阴性对照；图4-B：阳性对照，图4-C：接种突变体A6325菌株；

图5为不同处理条件下的西瓜秧苗发病情况对比图，其中，图5-A为阴性对照：不接种，H₂O；图5-B为阳性对照，接种野生型FON-11-06；图5-C为接种突变体A6325后再接种野生型FON-11-06 。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的生化试剂及原料如无特别说明，均为常规市售产品；所涉及的试验方法及步骤，如无特别说明，均为常规方法、步骤。

实施例一：西瓜尖孢镰刀菌FonAGL3基因缺失突变体的获得

1.FonAGL3基因缺失DNA片段构建

西瓜枯萎病菌FonAGL3基因敲除采用同源置换的原理，用抗性基因潮霉素B（ HPH）基因DNA片段替换目的基因FonAGL3的DNA片段，置换片段具体序列载体构建采取如图1、SEQ IDNO.4（FonAGL3基因及其上下游序列、基因缺失突变所需引物及其位置）、SEQ ID NO.5（FonAGL3基因与HPH基因置换部分序列）和SEQ ID NO.6（HPH基因）。其中，图中各步骤所用引物序列如下：

P1 alg3UF：AGTTTCGTCATCGACAGGTTCC

P2 alg3UR：TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCCTCTATGTAAG CCCGACCTCT GGT

P3 alg3DF：ATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTCGTACTTATATATCTGGTTCGCGT

P4 alg3DR：ATCGCGATAT TTATGTCTTC AGCT

P5 HPHF：GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA

P6 HPHR：GAACCCGCGGTCGGCATCTACTCTAT

P7 alg3NF：AGTCCACACTACACCAAACGA

P8 alg3NR：ATATCATCCT TCAGTGACAG T

①引物设计：引物alg3UR和alg3DF分别包含与抗性基因潮霉素B(HPH+)抗性标记基因两端序列一致的20-25个碱基；

②第一轮PCR：以西瓜枯萎病菌基因组DNA为模板，引物对Alg3UF/alg3UR和alg3DF/alg3DR分别扩增目的基因FonAGL3上游（Up）和下游(Down)侧翼片段（1-1.5Kb），引物对HPHF/HPHR扩增抗性基因片段（HPH），常规PCR 50μl反应体系：模板 1-100ng, HPHF(10uM)2μl, HPHR(10uM) 2μl, dNTP(10mM) 2μl, 聚合酶 5-10U, 聚合酶缓冲液(10*) 5μl 水补足至50μl; PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸10min；采用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。分别回收up、down和HPH片段待用；

③第二轮PCR：不需要加入引物，将第一轮PCR产物混合作为模板，模板按照Up、HPH、Down的摩尔数比为1：2：1的原则，实际操作时可以按照Up 100ng，HPH 300ng，Down 100ng的量加入，以Up和Down与HPH重叠部分为引物，不另外添加引物，其余组分按照常规PCR 50μl体系添加，反应体系：模板 1-100ng， dNTP(10mM) 1μl, 聚合酶 5-10U, 聚合酶缓冲液(10*) 5μl 水补足至50μl; PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5min，10个循环后，72℃延伸10min；

④第三轮PCR：以第二轮PCR产物为模板，alg3UF/alg3DR为引物，扩增含Up+HPH+Down的全长拼接序列（约3.5Kb），50μl反应体系：模板 1-100ng, alg3UF(10uM) 2μl， alg3DR(10uM) 2μl, dNTP(10mM) 2μl, 聚合酶 5-10U, 聚合酶缓冲液(10*) 5μl 水补足至50μl；PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5min，35个循环后，72℃延伸10min；采用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

⑤将50μl足量第三轮PCR产物回收，不少于10μg的Up+HPH+Down拼接PCR片段用于FonAGL3基因缺失遗传转化。

2.FonAGL3基因缺失载体在枯萎病菌遗传转化获得西瓜枯萎病菌FonAGL3基因缺失突变体，其步骤如下：

（1）原生质体制备

①用3层灭菌擦镜纸过滤PDA（200g土豆、20g葡萄糖、20g琼脂、1L水）培养10d后的西瓜尖孢镰刀，配制成1x10⁶分生孢子/ml的分生孢子悬浮液，接种到100 ml的PDA液体培养液中，25℃，180 rpm摇培10h，三层灭菌擦镜纸过滤，用0.7 M NaCl溶液冲洗多次，直到幼殖体悬浮液无分生孢子，将收集的幼殖体转移到20 ml三角瓶中待用。

②分别称取0.2 g溶菌酶、蜗牛酶和纤维素酶溶解在10ml的0.7 M NaCl溶液中，用细菌滤器(Millex-GP) 过滤酶溶液到装有幼殖体的玻璃三角瓶中，充分摇匀，30℃，100rpm摇培裂解3 h。用三层灭菌擦镜纸过滤酶解混合液，并用0.7 M NaCl溶液冲洗一次，收集滤液，4℃，5000 rpm，离心10 min，弃上清；原生质体沉淀用2 ml的0.7 M NaCl溶液重悬浮，4℃，5000 rpm，离心2 min，弃上清；原生质体沉淀再用1ml的STC（0.8M 山梨醇、50mM Tris-Hcl（pH8.0）、50mM CaCl₂）溶液重新悬浮，4℃，5000 rpm，离心2 min，弃上清；原生质体沉淀再用800 µl STC溶液重新悬浮，并逐滴加入200 µl的SPTC（0.8M 山梨醇、40% PEG、50mMTris-Hcl（pH8.0）、50mM CaCl₂）溶液，放置于冰上待用。

（2）原生质体转化

将30 µl目的DNA溶液(约10 ng)、1ml原生质体悬浮液和10 µl肝素钠溶液(5 mg/ml)加入离心管中，轻轻吸打混匀，冰上静置30 min；逐滴加入1/3体积的SPTC溶液，颠倒混匀，避光室温静置20 min；将转化混合液加入到灭菌的50 ml玻璃三角瓶中，并加入20 ml的RM再生培养液（0.6M NaCl、KCl、MgSO4、葡萄糖、蔗糖和甘露糖），避光室温静置2 h后，25℃，95rpm过夜摇培；15h后，将复苏好的菌丝倒入温度适中的PDA培养基中，培养基含有100µg/ml潮霉素B，倒平板，25℃培养2～3 d后挑转化子。

（3） FonAGL3基因缺失突变体鉴定

以转化子的基因组DNA为模板在FonAGL3基因内部设计引物alg3NF/alg3NR(alg3NF：AGTCCACACTACACCAAACGA; alg3NR：ATATCATCCT TCAGTGACAG T)进行PCR扩增，具体PCR扩增反应体系（25μl）：alg3NF（10μM）1μl，alg3NR（10μM）1μl，taqE 5U，10xbμffer 2.5μl，模板1-100ng，dNTP（10μM） 1μl， H₂O add to 25μl。PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5min，35个循环后，72℃延伸10min；

PCR扩增结果表明：野生型菌株FON-11-06和大多数插入转化子菌株可以扩增出553bp片段，FonAGL3基因缺失突变不能扩增出553bp片段(HPH同源置换部分), 突变体A6325菌株PCR不能够扩增出553bp片段，表明该转化子是基因缺失突变体。

实施例二：FonAGL3缺失突变体基因功能分析

1. FonAGL3缺失突变体致病力测定

① 取培养10d的FonAGL3缺失突变体PDA平板，加入无菌水20ml，配制成浓度为1x10⁵分生孢子/ml孢子悬浮液，用于接种实验；

② 取两叶一心时西瓜幼苗，去除根系基质并冲洗干净后，剪除部分须根，在FonAGL3缺失突变体分生孢子悬浮液中沾根30min后，重新定植于穴盘，每个菌株接种35棵西瓜幼苗，25℃温度下，常规管理，并观察发病情况，待发病后记录发病情况，并计算病情指数；西瓜幼苗病情调查按照如下病株分级标准：

0级：植株健壮，真叶和子叶均为绿色；

1级：1片或两片子叶轻微变黄；

2级：1-2片子叶黄化或1片子叶出现坏死斑，真叶稍微变黄、轻微萎焉；

3级：子叶枯死，真叶明显萎蔫，植株生长受阻，稍矮化；

4级：全株严重萎蔫，叶片枯黄；

5级：整株枯死，甚至倒伏；

病情指数计算公式：

病情指数=Σ（各病情等级数×该病情代表数）/(最高病情等级数×调查总株数)×100；

致病性结果表明

图4-A：阴性对照，不接种枯萎病菌的情况下，西瓜幼苗生长健壮，没有枯萎病害发生。

图4-B：阳性对照，在接种野生型FON-11-06菌株情况下，西瓜表现出明显的枯萎病症状，该菌株具有致病性。

图4-C：接种突变体A6325菌株，西瓜幼苗不发病，该突变体菌株无致病性。

2. FonAGL3缺失突变体培养性状

① 取-80℃或4℃条件下保存的镰刀菌菌株，接种于PDA平板培养基上，25℃条件下培养3-5d；

② 用直径0.4cm的无菌打孔器在①培养菌落边沿新生长菌丝上打孔呈一个个菌饼。

③ 挑取菌饼倒扣与另一个新配制的PDA培养平板中央，25℃条件下培养，4d和6d测量菌落直径并观察菌落形态、菌落颜色、气生菌丝等；

结果表明：图2-A和图2-B为野生型FON-11-06菌株在PDA平板上培养4d后的培养性状，图2-A菌落正面，图2-B菌落背面，菌落表面有大量气生菌丝，正面白色，背面呈暗红色，生长相对较慢，4d菌落直径为4.0 cm，15d后产孢量为6.5×10⁸个分生孢子/皿；图2-C和图2-D为突变体A6325菌株在PDA平板上培养4d后的培养性状，其中，图2-C菌落正面，图2-D菌落背面，菌落表面水渍状，正面和背面均无色，无气生菌丝，菌落有放射状的菌丝束，生长较快，4d菌落直径为5.1 cm，15d后产孢量为2.5×10⁷个分生孢子/皿。

3. FonAGL3缺失突变体菌体形态学分析

① 取培养7～10d FonAGL3缺失突变体A6325菌株的PDA平板，加入20mL无菌水，制备并调配成浓度为1×10⁵分生孢子/mL的分生孢子悬浮液；

② 取10µL浓度为1×10⁵分生孢子/mL的分生孢子悬浮液均匀涂布于步骤1～1.2mm厚的SNA观察平板上，于25℃下培养24～48h备用；

③ 用无菌切割刀切取大小为10mm×12mm的SNA观察培养菌块，倒扣于大小为40mm×18mm的盖玻片上，轻轻挤压，赶出盖玻片与培养物之间的气泡后，显微镜观察镰刀菌菌丝、产孢细胞及其分生孢子等。

结果表明：图3-A：野生型FO-11-06菌株形态表现为菌丝均一，较细长，细胞分隔处没有膨大现象，小型分生孢子呈椭圆型、腊肠型或肾形等。

图3-B：突变体A6325菌株形态表现为菌丝不均一，较粗大，细胞分隔处膨大现象，小型分生孢子多数呈不规则的哑铃型。

实施例三：FonAGL3基因缺失突变体在生产中的应用

① 取培养10d的FonAGL3基因缺失突变体A6325菌株PDA平板，加入无菌水20ml，经无菌擦镜纸过滤后，收集枯萎病菌分生孢子，并配制成浓度为1x10⁵分生孢子/ml孢子悬浮液，用于接种实验；

② 105粒优质西瓜种子在2%的次氯酸钠溶液中浸泡5min，清水洗净，其中70粒西瓜种子直接播种与育苗基质内，35粒西瓜种子采取FonAGL3基因缺失突变体A6325菌株浸种后，播于灭菌的基质内，25℃下培养到西瓜幼苗两叶一心；

③ 取两叶一心时西瓜幼苗，去除根系基质并冲洗干净后，其中，35棵FonAGL3基因缺失突变体A6325菌株浸种西瓜幼苗剪除部分须根，在1x10⁵分生孢子/ml野生型FON-11-06分生孢子悬浮液中沾根30min后，重新定植于穴盘；取35棵直播种子幼苗剪除部分须根，在1x10⁵分生孢子/ml野生型FON-11-06分生孢子悬浮液中沾根30min后，重新定植于穴盘；另外，剩余35棵直接播种西瓜幼苗幼苗剪除部分须根，重新定植于穴盘，25℃温度下，常规管理，并15d观察发病情况，待发病野生型对照后记录发病情况，并计算病情指数。病情指数结果表明：不接种菌株处理的西瓜幼苗不发病生长健壮（图5-A）；仅接种野生型菌株FON-11-06的西瓜幼苗全部发病死亡（图5-B）；接种两种菌株的西瓜幼苗不发病，不再表现出枯萎性状（图5-C），表明：FonAGL3基因缺失突变体作为一种新型枯萎病生防菌具有较好的枯萎病防治效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院园艺研究所；河南省驻马店农业学校

<120> 西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因、其缺失DNA片段、缺失突变体及其应用

<130> 2017

<160> 11

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1363

<212> DNA

<213> 西瓜尖孢镰刀菌

<400> 1

cataactcag gtttgggtga acctttacga attctggatc accaccacaa atcgctcgat 60

actgtcggca acgttgacct ggtcaatgct tgtctggagg atgatgctac agttgtcata 120

gtccacacta caccaaacga cctccagacc taaccaggat catgccacca ctccttcacc 180

cgaaatctcg aatgacatcg tcgctcttcg caacgacagt cgccgcatgc tttctagtcg 240

tcacgattcc gcatttgctt ccttgccccg taccccgggc ccgcttcgcc gatggagatg 300

ttatggttga cgagaatggc cgacgaatga gatggaagag gaaggatgcc aatcccaaag 360

tcgaggatgg gattgtacaa tttaacgatg tggcgagcga cgaggcagag aacgcacaag 420

atagagcaag gagggaatgc ccactgccga agccgggagg tatgctgggc gagtggttgg 480

gatttcacaa gagcgacaag gagactggac gatgaccggc aaagaatgag ctgaatgacc 540

tcaaacctgt atattgagcg tggtagctcc cttggtacgc acctggatgc ttgaatggca 600

cacagggcgg ctcccatggg ttctgtctga tatgaactcc gctgtgatcc tacaaaacat 660

ggggaaacca ttgaaacgga ttgatagaag agtgcggttc ttggagaacg ggagtaactg 720

tcactgaagg atgatatccc tcctcgaatc ccaggcccta gaggacaacc tttgttgaaa 780

cataccttag ctatgcctac ccaagagcca taaatcagaa atggcagggg ggacgaaaaa 840

tcataattag ctactcgtca tactgcatca gtttaccaga tagccaggat gttccacttg 900

gttgagaaag tagttgtgga atggcagtga agtcgggata aacacctgct aagatggttt 960

ttctaagatc tgattggcta catttctatc ttgcggagaa acacacacct ctaggtaatg 1020

caaggcaagg tacctagaaa aataagctcg ctacaataga gataaccccc atgaagtcca 1080

gaaagtatag gccagagcta ctatttgtgt aagtcaaata tagtagtgag gaagctctgg 1140

gatcaagtgc atgagatatc ccaaaatagc ccgctcaatt tggtggtagc agaatacgtt 1200

agcttggacc taacacctgt ggggttaaat caaggctgag ggacgatcgg agaattgaag 1260

atggtgacaa gcggcaagtg aagtttatct tctctgcatg ctttttgatg aaatctgatc 1320

tgatgtcatg gacacaagtt tccttcgaaa gtttgaaaac ttg 1363

<210> 2

<211> 354

<212> DNA

<213> 西瓜尖孢镰刀菌

<400> 2

atgccaccac tccttcaccc gaaatctcga atgacatcgt cgctcttcgc aacgacagtc 60

gccgcatgct ttctagtcgt cacgattccg catttgcttc cttgccccgt accccgggcc 120

cgcttcgccg atggagatgt tatggttgac gagaatggcc gacgaatgag atggaagagg 180

aaggatgcca atcccaaagt cgaggatggg attgtacaat ttaacgatgt ggcgagcgac 240

gaggcagaga acgcacaaga tagagcaagg agggaatgcc cactgccgaa gccgggaggt 300

atgctgggcg agtggttggg atttcacaag agcgacaagg agactggacg atga 354

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 西瓜尖孢镰刀菌

<400> 3

Met Pro Pro Leu Leu His Pro Lys Ser Arg Met Thr Ser Ser Leu Phe

1 5 10 15

Ala Thr Thr Val Ala Ala Cys Phe Leu Val Val Thr Ile Pro His Leu

20 25 30

Leu Pro Cys Pro Val Pro Arg Ala Arg Phe Ala Asp Gly Asp Val Met

35 40 45

Val Asp Glu Asn Gly Arg Arg Met Arg Trp Lys Arg Lys Asp Ala Asn

50 55 60

Pro Lys Val Glu Asp Gly Ile Val Gln Phe Asn Asp Val Ala Ser Asp

65 70 75 80

Glu Ala Glu Asn Ala Gln Asp Arg Ala Arg Arg Glu Cys Pro Leu Pro

85 90 95

Lys Pro Gly Gly Met Leu Gly Glu Trp Leu Gly Phe His Lys Ser Asp

100 105 110

Lys Glu Thr Gly Arg

115

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtttcgtca tcgacaggtt cc 22

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttgacctcca ctagctccag ccaagcctct atgtaagccc gacctctggt 50

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atagagtaga tgccgaccgc gggttcgtac ttatatatct ggttcgcgt 49

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atcgcgatat ttatgtcttc agct 24

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcttggctg gagctagtgg aggtcaa 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaacccgcgg tcggcatcta ctctat 26

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agtccacact acaccaaacg a 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atatcatcct tcagtgacag t 21

Claims

1.一种西瓜枯萎病菌致病性基因FonAGL3，其核苷酸序列或其互补链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述西瓜枯萎病菌致病性基因FonAGL3编码的cDNA，其具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述西瓜枯萎病菌致病性基因FonAGL3表达的蛋白质，其具有SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。

4.一种西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因缺失DNA片段，其特征在于，通过以下构建方法获得：

以上各步骤所用引物序列如下：

P1 alg3UF：AGTTTCGTCATCGACAGGTTCC

P2 alg3UR：TTGACCTCCACTAGCTCCAGCCAAGCCTCTATGTAAG CCCGACCTCT GGT

P3 alg3DF：ATAGAGTAGATGCCGACCGCGGGTTCGTACTTATATATCTGGTTCGCGT

P4 alg3DR：ATCGCGATAT TTATGTCTTC AGCT

P5 HPHF：GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA

P6 HPHR：GAACCCGCGGTCGGCATCTACTCTAT

P7 alg3NF：AGTCCACACTACACCAAACGA

P8 alg3NR：ATATCATCCT TCAGTGACAG T

5.根据权利要求4所述的西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因缺失DNA片段，其特性在于，在所述步骤（1）中，采用常规PCR 50μl反应体系：模板 1-100ng， 10uM的HPHF 2μl，浓度10uM的HPHR 2μl，10mM dNTP 2μl, 聚合酶 5-10U，10 x buffer 5μl 水补足至50μl；PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸10min；采用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

6.根据权利要求4所述的西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因缺失DNA片段，其特性在于，在所述步骤（2）中，采用反应体系：模板 1-100ng， 10mM dNTP 1μl，聚合酶 5-10U，聚合酶缓冲液5μl 水补足至50μl；PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5min，10个循环后，72℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述的西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因缺失DNA片段，其特性在于，在所述步骤（3）中，采用50μl反应体系：模板 1-100ng， 10uM的 alg3UF 2μl，10uM的alg3DR 2μl，10mM的 dNTP 2μl，聚合酶 5-10U，聚合酶缓冲液5μl 水补足至50μl；PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5min，35个循环后，72℃延伸10min；采用1％琼脂糖凝胶检测PCR扩增结果。

8.一种西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因缺失突变体，其特征在于，由以下方法制得：

（1）原生质体制备

（2）原生质体转化

将30 µl目的DNA溶液、1ml原生质体悬浮液和10 µl肝素钠溶液加入离心管中，轻轻吸打混匀，冰上静置30 min；逐滴加入1/3体积的SPTC溶液，颠倒混匀，避光室温静置20 min；将DNA溶液、原生质体悬浮液和肝素钠组成的转化混合液加入到灭菌的50 ml玻璃三角瓶中，并加入20 ml的RM再生培养液，避光室温静置2 h后，25℃，95 rpm过夜摇培；15h后，将复苏好的菌丝倒入温度适中的PDA培养基中，培养基含有100µg/ml潮霉素B，倒平板，25℃培养2～3 d后挑转化子；

（3） FonAGL3基因缺失突变体鉴定

9.根据权利要求8所述的西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因缺失突变体，其特征在于，在所述步骤（3）中，PCR扩增反应体系为：10μM的 alg3NF 1μl，10μM的 alg3NR 1μl，taqE5U，10xbμffer 2.5μl，模板1-100ng，10μM 的dNTP 1μl，H₂O add to 25μl；PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸5min，35个循环后，72℃延伸10min。

10.权利要求8所述西瓜枯萎病菌致病性FonAGL3基因缺失突变体在防治西瓜枯萎病中的应用。