CN101137663A

CN101137663A - 新型芳香异戊烯基转移酶，编码其的核酸和其使用

Info

Publication number: CN101137663A
Application number: CNA2006800077670A
Authority: CN
Inventors: T·葛山; J·P·内尔; S·P·理查德
Original assignee: Todai TLO Ltd; Salk Institute for Biological Studies
Current assignee: Todai TLO Ltd; Salk Institute for Biological Studies
Priority date: 2005-01-28
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2008-03-05
Also published as: US20100285502A1; WO2006081537A2; US7361483B2; US20060183211A1; WO2006081537A3; KR20070101359A; US20080274478A1; US7544498B2; JP2008528036A; US8124390B2

Abstract

根据本发明，涉及萘萜二醇(naphterpin)生物合成的一种新的芳香异戊烯基转移酶，Orf2，获自链霉菌属某种(Streptomyces sp.)的菌株CL190，已经被鉴定，而且阐述了其结构。这种异戊烯基转移酶能够催化异戊烯基基团与含芳香核的化合物之间的碳－碳键的形成，而且也表现出碳－氧键的形成活性。已经建立并细化了芳香异戊烯基转移酶的多种结晶结构，例如(1)异戊烯基转移酶与一种缓冲剂分子(TAPS)复合，(2)异戊烯基转移酶与二磷酸香叶酯(geranyl diphosphate(GPP))和二价镁离子的二元复合物，以及异戊烯基转移酶与一种非水解性的底物类似物，硫代二磷酸香叶酯(geranyl S－thiolodiphosphate(GSPP))的三元复合物，和或者(3)1，6－二羟基萘(1，6－DHN)或者(4)淡黄霉素(即2，5，7－三羟基－1，4－萘醌，它是1，3，6，8－四羟基萘(THN)的氧化产物))。这些结构已经分别被建立并分别细化至1.5，2.25，1.95和2.02。芳香异戊烯基转移酶的第一种结构呈现的是一种未曾预想到的非正则的(β/α)桶结构。这种带有芳香底物以及含异戊烯基底物和类似物的复合物勾勒出了其活性位点，且与提出的异戊烯基转移的亲电机理相一致。这些结构也为理解芳香异戊烯基转移酶这个结构独特的家族中的异戊二烯基链长度的测定和芳香共底物的识别提供了机理基础。这些结构信息有助于预测蛋白质的芳香异戊烯基转移酶活性。

Description

新型芳香异戊烯基转移酶，编码其的核酸和其使用

发明领域

【0001】本发明涉及芳香异戊烯基转移酶、编码其的核酸、芳香异戊烯基转移酶的结晶形式和其各种用途。在一个实施方案中，提供了预测推定的芳香异戊烯基转移酶的活性和/或底物专一性之方法。在另一个实施方案中，提供了筛选化合物的方法，以便鉴定可以与芳香异戊烯基转移酶结合的化合物和/或调节其活性的化合物。在还有另一个实施方案中，提供了筛选化合物的方法，以便鉴定芳香异戊烯基转移酶的潜在底物。在又一个实施方案中，提供了将芳香环结构异戊烯化的方法，以及控制和/或改变由芳香异戊烯基转移酶促进的异戊烯化程度的方法。在进一步的实施方案中，提供了鉴定具有最新发现的β/α圆筒状结构的蛋白质的方法。在更进一步的实施方案中，提供了控制和/或改变芳香异戊烯基转移酶底物专一性的方法。

发明背景

【0002】大自然是小分子的多产者，这些小分子不断演化以与不同生物靶标相作用。从人类健康的角度而言，通过提供许多前沿药物和化学探针来阐明与健康和疾病有关的基本的分子途径，天然产物已经大大改善了我们的生活。尽管天然产物持续提供了美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration)作为药物批准的所有新的化学实体的大约一半，在二十世纪后半期，药物发现已经从天然产物转向合成文库。这个范例的转变反映了小的天然文库的复杂性和大的组合合成文库的简单性；为了与工业上高通量筛选程序的巨大能力保持同步，将方案转变进行了合理化改革。然而，在这段时间里，组合化学文库中的新药物并没有变成产品，而此时天然产物仍是一个很重要的来源。天然产物，例如药物，占据了一个化学领域，这比组合化合物大大地更加多样，因此这也反映了此来源丰富的化学多样性。

【0003】在天然产物研究上的最新技术研究进展，涉及分离、表征、合成和生物合成，已经重新引起了学术和工业界的研究兴趣。随着现代分子生物学的来临，在过去的十年，生物合成领域已经变得繁盛起来，出现了很多建立生物合成文库的新方法，这进一步扩充了天然产物结构的多样性，从而进入了一个新的化学领域。包括组合生物合成、诱变合成和前体导向的生物合成在内的体内方法，和将化学合成和酶法(化学酶催化合成)结合的补充性体外方法，已经导致在自然界中从未遇到过的令人惊叹的新分子文库的诞生。已经按照这种形式经过生物合成操作的天然产物结构类别包括：聚酮化合物、非核糖体肽、类贴和生物碱。在这个迅速发展的领域内最重要的进展在于放线菌(土壤细菌)，放线菌提供了令人惊叹的大批天然产物，天然产物的生物合成基因典型地聚集成簇，因此容易进行基因操作。然而生物合成多样化平台中缺乏的一个显著例外是天然产物中的杂合异戊二烯种类。

【0004】天然产物，例如具有多样性的化学支架结构的异戊二烯(类萜)族，在合成有机化学界引起了很大的兴趣，因为天然产物是挑战性的合成项目，而且具有变化的生物活性和医疗特性。在类萜族中，倍半萜天然产物和相关类似物的总的合成量继续在化学文献中占据优势。在最近的十年当中，对结构上复杂萜烯的可靠的生产平台的需求显著增加，并且兴趣在不断增长。萜烯的第一流的合成方案已经被建立，但是产量低，区域选择性和对映体选择性差。尽管工程菌大肠杆菌(E.coli)有潜力使倍半萜烃类的产量达到mg/L的水平，但是更大生物活性的萜烯是被羟基、甲基、乙酰基、卤素、烃类和过氧化物官能基团高度官能化的，这需要多步生物合成机制，这些多步生物合成机制经常连接到内膜系统中，这有益于代谢偶合。通过结合生物合成的复杂性和合成的多样化，克服类萜的技术研发上的许多难题是可能的。

【0005】此外，含萜烯衍生残基的杂交化合物包含一个巨大的且多种多样的天然产物群，这些天然产物在人类健康中起重要作用(见表1)。历史上，这类化合物已经提供了重要的药物(例如，抗癌药剂长春花新碱，抗疟试剂奎宁和免疫抑制剂霉酚酸酯)以及具有挑战性的合成目标物(例如，马钱子碱和利血平)。除了天然产物，在电子传递系统中起作用的许多重要的辅酶(泛醌和质体醌)和维生素(生育酚、叶绿醌和甲基萘醌类)都含有异戊二烯残基。

表1：代表性的杂交异戊二烯，它们的来源和生物重要性

天然产物	来源	异戊二烯类杂交	生物活性
天然产物	来源	异戊二烯类杂交	生物活性	酶芬酸呋喃并色酮四氢大麻酚鱼藤酮补骨脂素新生霉素	真菌植物植物植物植物细菌	聚酮化合物聚酮化合物聚酮化合物异黄酮类化合物香豆素香豆素	免疫抑制剂支气管哮喘麻醉剂，抗吐药杀虫剂皮肤色素和刺激物抗生素

光泽汀吐根碱麦角新碱利血平长春花新碱马钱子碱lyngbyatoxin奎宁喜树碱

植物植物真菌植物植物植物蓝细菌植物植物

奎宁四氢异喹啉麦角吲哚吲哚生物碱吲哚生物碱吲哚生物碱喹啉生物碱喹啉生物碱

诱变剂生物碱催吐药(吐根)生物碱催产剂生物碱降高血压抗癌药毒素炎性试剂抗疟剂拓扑异构酶/抑制剂

【0006】大自然已经组装了多种连有类异戊二烯的支架结构物质，这些物质包括聚酮化合物(亦称混源萜类)、黄酮类化学合物、香豆素、醌、生物碱、吩嗪以及类似物。类萜单元经常通过连接到其构造单元时发生的亲电环化作用和氧化化学而被进一步精心制作，从而产生了该组中观察到的巨大的多样性。虽然大部分的这些天然产物仅含有一个不同链长度的类异戊二烯单元，但是其它天然产物含有多个异戊二烯单元，比如在三异戊烯基苯甲酰基间苯三酚(tetraprenylatedbenzoylphloroglucinol)衍生物sampsonione A-I中。

【0007】很大一部分杂交的类异戊二烯来自于真核生物，尤其是植物。例如，超过一千种的类单萜吲哚生物碱已经被表征，这使其成为一大类植物生物碱。另一方面，类萜，尤其是杂交类异戊二烯，好像只在原核生物中占有限的一部分。放线菌是一种代谢很旺盛的细菌，产生许多重要的生物合成的天然产物种类，这包括聚酮化合物、非核糖体肽、氨基糖苷类以及其类似物，然而类萜明显的稀少。因此，尽管在药物研发领域已经通过生物合成开发出其它的天然产物结构类型，杂交的类萜品种却根本不存在，这是因为对生物合成在生物化学和基因水平上的理解还是有限的。

【0008】对于杂交类异戊二烯是如何从植物、真菌和细菌中进行生物合成的基本理解，大部分基于标记前体的供给实验。连接有界面连接的二磷酸类异戊烯酯和它们的小分子构造单元的酶和其编码基因是非常少的，而大部分连接植物天然产物，比如紫草宁，或者是连接辅酶和维生素，比如泛醌、质体醌、甲基萘醌类和生育酚。最近，发现了两种原核的异戊烯基转移酶(prokaryoticprenyltransferases(PTases))，它们分别参与了链霉菌抗生素——氯新生霉素(clorobiocin)和新生霉素的生物合成，以及蓝细菌毒素——鞘丝藻毒素(lyngbyatoxin)的生物合成。这些可溶的单体PTases与以前从真核生物中鉴定出来的膜相连的PTases形成对照。

【0009】放线菌产生有限的一系列纯的和混合的类萜。抗生素新生霉素是发现的第一种带有类萜侧链的链霉菌天然产物；自此以后，这一群体已经扩大，包括了其它成员，例如萘醌类(萘萜二醇(naphterpin)、呋喃醌霉素(furaquinocin)、萘吡酮霉素)，吩嗪类(熏衣草霉素(lavanduyanin)、aestivophoenin)，莽草酸衍生醌类(skimate-derived quiones)和其它的芳香底物(见图1B)。供给实验描绘了许多生物合成的途径，包括新生霉素、萘萜二醇、和呋喃醌霉素的生物合成途径，而且供给实验揭示放线菌是利用甲羟戊酸和非甲羟戊酸(甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸盐(MEP))途径合成其类萜烯构造单元。

【0010】人们对与天然产物化学和生物合成相关的新方法的研发的兴趣在增加。异戊烯化的芳香产物看似是一类非常有前景的治疗用化合物。芳香化合物的异戊烯化经常会导致一种化合物生物活性特性的重大改变，这是通过在最终产物的骨架中生成新的碳-碳键和引入一个或多个的双键。这样的化合物能够影响哺乳动物的许多生物体系，而且能够起到抗氧化剂、抗炎症剂、抗病毒剂、抗增生剂和抗癌剂等的作用。

【0011】异戊烯基转移酶(Prenyltransferases(PTases))是泛醌类酶，它能够借助烯丙基二磷酸代类萜烯的烷基部分来催化富含电子的异戊二烯受体的烷基化作用。异戊烯基转移酶利用二磷酸类异戊二烯酯作为底物，并且催化脂肪族异戊烯基部分加成到二磷酸异戊二烯酯(isoprenoid diphosphate(IPP))、更加有序的二磷酸异戊烯酯、富含芳环的分子及蛋白质。直到现在，仅有一些“芳香”异戊烯基转移酶已经被分离，而且也显示它们每一个仅与有限范围的底物和/或异戊烯基供体发生相互作用。另外这些异戊烯基转移酶只是名义上已经作了表征；没有一个这样的异戊烯基转移酶在结构水平上进行表征。

【0012】因此，在本领域鉴定能够促进芳香化合物的异戊烯化的新酶是有必要的，以及鉴定能够调节芳香化合物的异戊烯化的化合物也是有必要的。本发明陈述了这些需要和其它的需要，并且在下面的说明书和权利要求书作了更详尽的描述。

发明概述

【0013】根据本发明，参与萘萜二醇(naphterpin)生物合成(Shin-ya，et al.，J.Antibiot.(Tokyo)43，444-447(1990))的一种新的芳香异戊烯基转移酶，Orf2，来自链霉菌属某种(Streptomyces sp.)的菌株CL190，已经被鉴定，而且阐述了其结构。这种异戊烯基转移酶催化异戊烯基与含芳香核的化合物之间的碳-碳键的形成，而且也表现出碳-氧键形成活性。已经建立并细化了这种芳香异戊烯基转移酶的多种晶体结构，例如(1)异戊烯基转移酶与缓冲剂分子(TAPS)复合，(2)异戊烯基转移酶与二磷酸香叶酯(geranyl diphosphate(GPP))和二价镁离子的二元复合物，以及异戊烯基转移酶与非水解性的底物类似物，硫代二磷酸香叶酯(geranylS-thiolodiphosphate(GSPP))的三元复合物，和(3)1，6-二羟基萘(1，6-DHN)或者(4)淡黄霉素(即2，5，7-三羟基-1，4-萘醌，它是1，3，6，8-四羟基萘(THN)的氧化产物)。这些结构已经分别被建立并细化至1.5，2.25，1.95和2.02。芳香异戊烯基转移酶的第一种结构呈现的是一种未曾预想到的非正则的(β/α)桶结构。

【0014】这种带有芳香底物和含有异戊烯基的底物和类似物的复合物勾勒出了其活性位点，且与提出的异戊烯基转移的亲电机理相一致。这些结构也为理解芳香异戊烯基转移酶这个结构独特家族中的异戊基链长的测定和底物识别提供了机理基础。这些结构信息有助于预测蛋白质的芳香异戊烯基转移酶活性。

【0015】具体而言，本公开内容描述了两种具有泛主结合活性的新的芳香异戊烯基转移酶的鉴定：Orf2，来自链霉菌属某种的菌株CL190；和HypSc，来自蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。本公开内容还描述了一种新型的β/α圆筒状的高分辨率的结构，这就为理解机理特征和与许多芳香异戊烯基受体相关的Orf2的泛主结合活性提供了有用的结构模板，以及其通过非常有序的异戊烯基链的结合表面来调整异戊烯基链长度的专一性的方式。这种β/α圆筒状催化芳香化合物的异戊烯化，接受范围广泛的芳香底物，并借助疏水相互作用与二磷酸烯丙酯底物(GPP或FPP)的烃类部分相结合。

【0016】在这里已经证实这种“生物合成桶(biosynthetic barrel)”能被作为微生物和植物来源的天然产物异戊烯化的工程设计的起点。这种结构细节——其涉及这种新表征的小分子异戊烯基转移酶的底物专一性，能够使在自然界中发现(foind)的以及合成来源的许多芳香化合物具有生物合成多样性，这通过提供酶设计和进化的结构导向的方法而进行，从而通过体内转基因的方法，导致新的异戊烯化天然产物的产生和代谢工程化，或最终用于体外化学术。

附图简要说明

【0017】图1A显示的是放线菌产生的混合类萜-聚酮化合物的结构示意图。萘萜二醇(naphterpin)的合成包括：使用GPP辅底物，将THN、淡黄霉素或其代谢产物异戊烯化。THN是在orf3编码的THN合成酶的作用下，从丙二酰单酰辅酶A中得到的。THN很容易被氧化，得到对苯二酚的衍生物，2，5，7-三羟基-1，4-萘醌(淡黄霉素)。THN骨架被进一步修饰，异戊烯化，并可被引入形成混杂的类萜-聚酮化合物，例如萘萜二醇(naphterpin)、呋喃醌霉素A(furaquinocinA)、萘吡酮酶素A和海洋霉素(marinione)。

【0018】图1B提供的是从放线菌中得到的具有代表性的混杂的类异戊二烯的结构图。如果合适，类异戊二烯单元可被加成到萘醌上(参见如图所示的萘萜二醇、海洋酶素、新海洋酶素(neomarinione)、和Q525.518)，亦可被加成到吩嗪上(参见如图所示的熏衣草霉素(lavanduyanin)和aestivophoenin B)和通过C-、N-、和O-键连接到亚硝基吡咯(参见如图所示的Q509.364)残基上。

【0019】图1C显示的是基于多序列比对的结构图。从链霉菌属某种的菌株CL190得到的Orf2基因的产物，Orf2，是一个含有307个残基的33kDa可溶性单体蛋白质。PSI-BLAST搜索揭示Orf2与其它三个细菌蛋白质之间的强同源性：从天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)获得的蛋白质(HypSc，登记号为AL939130)和前面所述的4-羟苯基丙酮酸酯：二甲基烯丙基转移酶基因，cloQ(登记号为AF329398)和novQ(登记号为AF170880)，分别来自玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)和球状链霉菌(Streptomyces spheroides)NCIMB11891。残基(单字母氨基酸编码)是根据Orf2的序列编号的。短条代表插入或缺失的部分。该比对已经被连接到已知的Orf2二级结构中，并被呈报给ESPript(可通过万维网上的因特网登录网址″prodes.toulouse.inra.fr/ESPript″得到)。编码如下：灰底上的灰色代码代表位于活性位点的残基，黑底上的白色代码代表严格保守的残基，灰色覆盖上的白色代表严格保守的且位于活性位点上的残基。灰色框内的残基代表在比对序列中类似的残基。

【0020】图2A阐述了镁离子依赖性的1.6-DHN异戊烯化。反应缓冲溶液含有50 mM的HEPES(pH7.5)，5mM的1.6-DHN和5mM的GPP，终体积为20μl。向试验混合物中加入20μg的Orf2后，反应开始。在25℃下被温育4h后，此混合物被干燥，然后点滴到薄层层析(TLC)的硅胶板上。这种TLC板用氯仿/甲醇(20∶1)混合溶剂展开。1.6-DHN和反应产物在254nm处被检测到。这两种高效液相色谱(HPLC)提纯的产物借助于质谱(MS)和核磁共振(1HNMR)分析来及进行化学分析。在泳道1(对照)中，Orf2在被加入之前被煮沸过。泳道2中的反应混合物不含MgCl2，而5mM的MgCl2被加入到泳道3。

【0021】图2B阐述的是Orf2的泛主结合活性。进行了几组实验，使用了许多种潜在的底物，即，1，3-DHN(1)，1，6-DHN(2)，2，7-DHN(3)，4-HPP(4)和几种类黄酮和聚酮化合物的衍生物，包括大豆黄素(7，4′-二羟异黄酮，5)，芒柄花素(7-羟基-4′-甲氧异黄酮，6)，非瑟酮(3，3′，4′，7-四羟基黄酮，7)，染料木黄酮(5，7，4′-三羟基异黄酮，8)，柚(苷)配基(5，7，4′-三羟黄烷酮，9)，淡黄霉素(10)，油橄榄醇(11)，油地衣酸(12)和白藜芦醇(3，4′，5-三羟基芪，13)。四种产物(即1.6-二羟基-2-香叶基萘(14)，1.6-二羟基-5-香叶基萘(15)，6-香叶基柚(苷)配基(16)和7-氧-香叶基柚(苷)配基(17))的化学结构是通过质谱(MS)和核磁共振(1HNMR)分析来测定的。反应缓冲液包括50mM的HEPES(pH7.5)、5mM的MgCl2，0.01mM的GPP，0.09 mM的[¹⁴C]GPP和0.1mM的每种底物，终体积为20μl。向试验混合物中加入30μg的Orf2后，反应开始。在25℃下被温育6h后，此混合物被干燥，然后点滴到薄层层析(TLC)的硅胶板上。这种TLC板用氯仿/甲醇(15∶1)混合溶剂展开。反应产物用[¹⁴C]成像板(Fuji Photo Film)检测。

【0022】图3集中显示了不同类型的蛋白质圆筒状拓扑结构的比较图。从上到下显示了蛋白质圆筒状结构的二维拓扑图和三维视图。每个二级结构单元(用圆形(或螺旋状带)表示的螺旋和用三角形(或扁平带)表示的β-链)都维持一定的方向性(N到C)，它或向上(朝向图形平面的外部)或向下(进入图形平面)。这些结构单元的方向能从连接线推导出，也能从链的方向推导出。

【0023】图3A阐述的是一种α/β圆筒状结构图(例如，一种人类的醛酮还原酶，它络合有NADP⁺和葡萄糖-6-磷酸(pdb登录代码为2ACQ))。

【0024】图3B阐述的是一种β/α圆筒状结构图(例如，与GSPP、DHN2和Mg2+络合的链霉菌属某种的菌株CL190产生的Orf2芳香异戊烯基转移酶)。

【0025】图3C阐述的是一种α+β圆筒状结构图(例如，来自天蓝色链霉菌A3的ActVA-Orf6单加氧酶(pdb登录代码1LQ9)的二聚体铁氧还蛋白样α+β夹心折叠)。

【0026】图3D阐述的是一种β-圆筒状结构图(例如，人类脂肪酸结合蛋白，M-FABP，络合有一分子的硬脂酸(pdb登录代码为1HMT)。

【0027】图3E阐述的是一种α-α圆筒状结构图(例如，褐家鼠(Rattusnorvegicus)蛋白质法尼基转移酶的β-亚基，它同时络合有法尼基化的Ras4B肽产物和法尼基-二磷酸的底物(pdb登录代码为1KZO))。

【0028】图4集中显示了不同络合物中Orf2活性位点的近视图。

【0029】图4A阐述的是如下络合物：TAPS分子、结合的GPP和带有1，6-DHN或淡黄霉素的GPP。

【0030】图4B阐述的是二价金属结合位点的结构图。这张具有代表性的2f0-fc电子云密度图(截取自1.0σ水平的标准化图)显示了Mg²⁺离子的八面体配位作用，其中两个氧原子(一个来自Asp 62，一个来自GSPP分子的二磷酸盐部分)和四个水分子一起形成了这个八面体配位几何结构。

【0031】图4C提供了Orf2活性位的示意图。参与Mg²⁺、GSPP和1，6-DHN结合的侧链用作为灰色点划线的氢键和配位键描述。黑色点划线代表的是水分子之间的直接氢键。以与图4A中相同方向显示的该近视图，相对于图4B中描述的，沿着垂直轴被旋转180度。这个半圆圈描述的是两底物之间的范德华力。假定的深度序列编码(depth queuing coding)如下：灰色代表的是GSPP-1，6-DHN平面后面的残基，黑色代表的是同一平面上的残基，而深黑色代表的是前面的残基。

【0032】图5显示的是提出的Orf2活性位点上的芳环异戊烯化反应的机理的结构示意图。这组图描绘了芳香底物和相邻的GPP分子的结合、香叶基碳正离子(标记为G⁺)的形成、异戊烯基链的旋转以形成一个多产的构象、1，6-DHN的芳环上的碳正离子的亲电攻击、σ-络合物的形成和水分子的最终去质子。

【0033】图6显示的是Orf2同源物的活性位模型。CloQ/NovQ和HypSc的建模是用Orf2作为结构模版来进行的。不同活性位之间代表着潜在的重大变异的侧链，被示出并标记。在不同模型中保守的残基包括Asp 110、Lys 119、Asn 173、Tyr 175、Tyr 216和Arg 228，其中为了清楚起见，只有Asp 110和Arg 228被显示出。

【0034】图7涉及HypSc的功能测评。这样，按照上面图2A描述地，使用1，6-DHN作为异戊烯基受体(在1-4的每一个泳道中)对HypSc异戊烯基转移酶的活性进行试验测试，在泳道1中没有异戊烯基受体，在泳道2和3中含有DMAPP，在泳道4中含有GPP，在泳道2中没有使用Mg²⁺。这些样品在室温下被过夜温育。

【0035】图8是本发明实施过程中预期使用的计算机系统的示意图。

发明详述

【0036】萘萜二醇(naphterpin)是一个由链霉菌属某种的菌株CL190产生的具有生物活性的天然产物(半倍萜类抗氧化试剂)，这是通过甲羟戊酸类异戊二烯的生物合成途径和聚酮化合物生物合成途径得到的(参见，例如Shin-ya，et al.，Tetrahedron Lett.31，6025-6026(1990)；Shin-ya，et al.，J.Antibiot.(Tokyo)43，444-447 (1990)；和Seto，et al，Tetrahedron Letters 37(44)：7979(1996)，亦见图1A)。这种化合物是由三羟基萘醌的衍生物和香叶基部分组成的。在本领域已知，THN是在III型聚酮合成酶(THN合成酶)的作用下由5分子丙二酰基辅酶A(CoA)生物合成的，所述合成酶是由灰色链霉菌(streptomyces griseus)(参见Funa，et al.，Nature400，897-899(1999))和天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)(参见Izumikawa etal.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.30：510-515(2003))克隆而来的。含萘醌环的化合物，包括萘萜二醇、呋喃醌霉素、萘吡酮酶素和海洋酶素，是经对称性的聚酮化合物的中间体1，3，6-四羟基萘醌(THN；参见Shin-ya，et al.，J.Antibiot.(Tokyo)43，444-447(1990))(图1A)生物合成的。在灰色链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)中，THN是查耳酮合成酶样的III型聚酮合成酶(PKS)的产物，这种合成酶被称为THN合成酶(THNS)(Austin and Noel，Nat Prod Rep 20(1)：79-110(2003)。THN很容易(或被酶催化)发生氧化反应，形成氢醌的衍生物，即2，5，7-三羟基-1，4-萘醌(淡黄霉素)，其一部分随后发生聚合反应，形成各种有色聚合化合物(Funa et al.，Nature400(6747)：897-9(1999))。

【0037】THN骨架除了可用来生产颜料外，在链霉菌属某种的菌株CL190中还可以进一步被改性并结合入萘萜二醇(Shin-ya et al.，J.Antibiot(Tokyo)45(1)：124-5(1992))。

【0038】在放线菌中，到现在为止已经克隆出三种甲羟戊酸基因簇，即从CL190，Kitasatospora griseola(类萜霉素的生产者)(参见Hamano，et al.，Biosci.Biotechnol.Biochem.65：1627-1635(2001))和游动放线菌属某种(Actinoplanes sp.)的某一菌株A40644(BE-40644的生产者)(参见Kawasaki，et al.，J.Amibiot.56：957-966(2003))。所有这些基因簇编码以下物质：甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、磷酸甲羟戊酸激酶、异戊烯二磷酸异构酶、3-羟基-3-甲基戊二酰基(HMG)-辅酶A还原酶和甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)合成酶。每个基因的顺序也是相同的，而且各个同源基因相互之间具有50％至80％的氨基酸同一性。

【0039】与甲羟戊酸途径基因簇的高保守性相对比，许多基因分布在它们的侧翼区域。例如，香叶基香叶基二磷酸合成酶，即类萜菌素生物合成中的一种关键的酶，仅在甲羟戊酸激酶基因的上游区域被编码，而类萜菌素生物合成的基因簇位于其更上游区域。此外，法尼基二磷酸合成酶，即BE-40644生物合成的一种关键的酶，仅仅位于甲羟戊酸激酶基因的上游区域，而BE-40644生物合成的基因簇位于甲羟戊酸途径基因簇的下游区域。

【0040】综合上述事实，提出了如下假设：甲羟戊酸途径基因是簇生的；类萜生物合成的基因通常是在生产类萜的放线菌中簇生的；和甲羟戊酸途径基因簇可能是从生产类萜的放线菌中克隆类萜生物合成基因的一个良好的标记。基于此假设，为了克隆萘萜二醇生物合成基因簇，对从CL190中克隆出的甲羟戊酸途径基因簇的侧翼区域进行测序。

【0041】为了理解这种混合的萜烯/聚酮化合物衍生的天然产物的生物合成途径，负责萘萜二醇生产的基因簇由于接近于编码MVA途径生物合成酶的基因而被鉴定。含有MVA途径基因的基因簇的上游区显示出三个新的开放阅读框或orf，已经被指定为orfl、orf2和orf3。表2概括了这些Orf的比较分析，这些Orf带有编码功能表征过的蛋白质的基因。PSI-BLAST搜索揭示Orf2与其它三个细菌蛋白质之间的同源性：从天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)获得的蛋白质(HypSc，登记号为AL939130)和前面所述的4-羟苯基丙酮酸酯：二甲基烯丙基转移酶基因，cloQ(登记号为AF329398)和novQ(登记号为AF170880)，分别来自玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)和球状链霉菌(Streptomycesspheroides)NCIMB11891(图1B)。

【0042】为了进一步理解上面提到的这些基因的功能，通过断裂Orf2基因制得了突变的链霉属某种(菌株CL190)。该突变体没有表现出生产萘萜二醇的能力。Orf2和功能表征过的异戊烯基转移酶CloQ/NovQ之间的高度同源性(Pojer et al.，Proc Natl Acad Sci USA 100：2316-2321(2003))(图1B)，以及Orf3编码与THNS具有氨基酸相似性的III型聚酮合成酶这样的事实，证实了Orf2编码异戊烯基转移酶，此酶涉及在Orf3(也可能是其它剪切酶(tailoring enzyme))的作用下将香叶基转移到THN或者THN的衍生物上。

【0043】当在大肠杆菌(E.coli)中被表达时，Orf2，作为一种分子量为33KDa可溶的单体蛋白质，具有307个残基。为了测定酶的活性，将纯化的重组Orf2蛋白质与下面的异戊烯基(香叶基)受体中的一种——即二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP，C5)、香叶基二磷酸酯(GPP，C10)或法尼基二磷酸酯(FPP，C15)——以及几个带有一个或多个芳香基的潜在的底物(即异戊烯基受体)温育。许多THN类似物(例如1，3-二羟基萘(1，3-DHN)、1，6-DHN、2，7-DHN和淡黄霉素)被观察到可以作为Orf2的底物，即Orf2能将其转变成其异戊烯基化的衍生物(参见图2A和2B)。Orf2也能将CloQ/NovQ(Pojer et al，supra)的底物4-羟基苯丙酮酸(4-HPP)转变成其异戊烯基化的衍生物。与之相比，相关的分子，苯丙氨酸或酪氨酸都不能充当底物(参见图2B)。DMAPP被观察到不具有活性，观察到GPP的相对活性最高，而观察到FPP具有弱活性。总之，Orf2识别各种底物。

【0044】此外，含二羟基的THN类似物被观测到具有体外活性，而且具有很强的Mg²⁺依赖性(图2A和2B)。因此，当Orf2与1，6-DHN和GPP温育时，这两种异戊烯化的产物，1，6-DHN-P1和1，6-DHN-P2，很容易用薄层色谱法来检测(TLC，图2A和2B)。用与GPP和1，6-DHN大规模的温育生产足够数量的这两种产物(其比例接近于10∶1)，以用质谱法(MS)和¹H核磁共振法(¹H NMR)分析来阐明它们的结构：分析结果表明这些化合物，反式-5-香叶基-1，6-DHN和反式-2-香叶基-1，6-DHN，是被认为是新的天然产物(参见图2A)。

【0045】通过对Orf2与各种类黄酮、异黄酮类和其相关的化合物(例如白藜芦醇；参见图2B)相互作用的能力进行分析试验，证实Orf2很有潜力作为模板使新的芳香族天然产物变得多样化。虽然在大豆黄素(7，4-二羟异黄酮)、芒柄花素(7-羟基-4′-甲氧异黄酮)、染料木黄酮(5，7，4′-三羟基异黄酮)和白藜芦醇(3，4′，5-三羟基芪)的存在下，Orf2显示出异戊烯基转移酶的活性，但是在具有非瑟酮(3，3′，4′，7-四羟基黄酮)的同样实验条件下则具有很低的或没有活性。在柚(苷)配基(4，5，7′-三羟黄烷酮)和GPP存在下，两种反应产物6-香叶基柚(苷)配基和7-氧-香叶基柚(苷)配基被鉴定(采用质谱法(MS)和1H核磁共振法(1HNMR)；参见图2B)。6-香叶基柚(苷)配基(亦被称为bonannione A；参见Bruno，Heterocycles 23(5)：1147-1153(1985))，是异戊烯化的黄烷酮，其呈现出显著的抗菌活性(Schutz，Phytochemistry 40：1273-1277(1995))。7-氧-香叶基柚(苷)配基以醚部分的形式容纳了异戊烯基单元，这仅在异黄酮中偶尔被发现，是一种新型的异戊烯化类黄酮。

【0046】在酒花中，仅仅痕量组分，6-香叶基柚(苷)配基由含量更丰富的酒花类黄酮(2′，4′，6′，4-四羟基-3′-香叶基查耳酮)异构化反应(环化反应)形成。有趣的是，已经有报道称使用蜡叶芽枝孢霉(Cladosporium herbarum)作为实验真菌，测试出各种黄色羽扁豆成分具有抗真菌活性。发现对于异黄酮来说，6-异戊烯基和3′-异戊烯基化合物比8-异戊烯基类似物具有更强的真菌毒性作用，而且异戊烯基基团转变成环化的衍生物则会极大地减少或者消除对真菌的毒性作用。

【0047】Orf2在油橄榄醇和油地衣酸的存在下，也是具有活性的(见图2B)。这些化合物是治疗性植物衍生的聚酮化合物-萜烯的天然产物Δ⁹-四氢大麻醇(Δ⁹-THC)生物合成中的中间体。Δ⁹-THC是在大麻(Cannabis sativa)的漂白亚麻纤维卷中发现的主要的心理活性组分。其一种合成的Δ⁹-THC类似物，即dronabinol，现在被用来减轻反胃/呕吐和增加食欲，以抵抗癌症和艾滋患者的体重下降。大麻中主要的心理活性组分，Δ⁹-THC主要是通过活化两种专一的大麻化学成分的受体(CB1和CB2)而影响大脑活动的。这些受体也是结合到的内源性大麻化学成分上，这些化学成分是由人体天然产生的。大麻化学成分信号系统的最新研究表明，这些成分涉及到越来越多的病理症状。因为参与大麻(Cannabissativa)中Δ⁹-THC生物合成的香叶基异戊烯基转移酶活性直到现在仅仅在细胞提取液中检测到过，我们决定在油橄榄醇和油地衣酸(Δ⁹-THC的生物合成中的两种假定的中间体)的存在下测定Orf2的活性：Orf2的反应产物借助两种Δ⁹-THC前体在薄层层析中可被检测到，这与大麻(Cannabis sativa)内源性酶不同，后者的活性仅在油橄榄醇分子存在下可被观察到。这些结果表明鉴于调节内大麻素系统的能力，开创新的治疗方法是极有希望的。

【0048】因此，根据本发明，提供了具有α/β圆筒状结构的芳香异戊烯基转移酶。

【0049】本文所使用的“α/β圆筒状结构(beta/alpha barrel structure)”，指封闭的β-折叠，包括绕着中心β-圆筒状核心排列的反向平行的β-链，自身被α-螺旋的环包围，α-螺旋形成β/α圆筒的外部的、暴露于溶剂的表面。因此，芳香异戊烯基转移酶被观察到具有独特的β/α圆筒状二级结构。

【0050】此蛋白质是第一种已被鉴别且进行了结构表征的、参与混合的聚酮化合物-类异戊二烯生物合成途径的酶，即萘萜二醇的生物合成。尽管这个蛋白质家族已经从链霉菌属细菌鉴别和表征，但是在植物体内还发现了许多异戊烯化的芳香族天然产物。例如四羟基大麻醇(tetrohydrocannabinol(THC))这种重要的治疗性的天然产物是混合的聚酮化合物-类异戊二烯。生物合成的逻辑性也将指示植物体内很可能含有与Orf2具有类似结构和功能的酶，但是这样的酶迄今为止还没有被鉴定。倘若这种可能性存在的话，Orf2/CloQ/NovQ/HypSc被认为是这个分布广泛且具有催化兴趣的酶家族中首先被鉴定的成员。

【0051】只要变体多肽保持异戊烯基转移酶的活性，根据本发明的示例性芳香异戊烯基转移酶具有SEQ ID NO：2所示出的氨基酸序列或者其保守的变异。在此使用的“保守的变异”指的是一个氨基酸残基被另一具有生物学相似性的残基所取代。保守的变异的例子包括：一个疏水性残基，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、或甲硫氨酸，被另一个所取代；或一个极性残基被另一个取代，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，谷氨酰胺取代天冬酰胺，以及类似的取代。其他“保守的变异”的例证性的例子还包括以下变化：丙氨酸变成丝氨酸；精氨酸变成赖氨酸；天冬酰胺变成谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变成谷氨酸；半胱氨酸变成丝氨酸；谷氨酰胺变成天冬酰胺；谷氨酸变成天冬氨酸；甘氨酸变成脯氨酸；组氨酸变成天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变成亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变成缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变成精氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸；甲硫氨酸变成亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变成酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变成苏氨酸；苏氨酸变成丝氨酸；色氨酸变成酪氨酸；酪氨酸变成色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸变成异亮氨酸或亮氨酸，以及类似的变异。“保守的变异”这个术语还包括用取代的氨基酸替代未取代的氨基酸。

【0052】本文所考虑的修饰或取代并不局限于氨基酸的取代。为了各种目的，例如增加稳定性、溶解性或者结构的考虑，本领域的技术人员将会认识到引入其他修饰的需要(例如采用剔除、取代或添加的方式)。这样的其他修饰的范例包括插入稀有氨基酸、右旋氨基酸、糖基化位点、形成特异性二硫键桥的胞嘧啶。修饰的肽可以采用化学方法合成；或分离的基因可以被定点诱变；或合成基因可以被合成并在细菌、酵母、杆状病毒、组织培养物以及类似物中表达。

【0053】本文所考虑了具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列基本相同的序列的芳香异戊烯化转移酶。假如“基本相同的”多肽保持异戊烯化转移酶的活性，此处的“基本相同的”就意味着多肽或氨基酸展示出与参考的氨基酸或核酸序列至少50％，优选60％，更优选70％、更优选80％、更优选85％、更优选90％及最优选95％的同源性。

【0054】可选地，根据本发明的芳香异戊烯基转移酶与SEQ ID NO：2所指的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。序列的同源性和同一性经常是通过序列分析软件(例如，序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)，威斯康星大学生物技术中心(University ofWisconsin Biotechnology Center)，遗传学计算机小组(the Genetics Computer Group)，大学街1710号，麦迪逊，邮编53750(1710 University Avenue，Madison，WI 53705))测得的。在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中的术语“同一性”指相同的或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或亚序列，这是当在比较窗(comparison window)或指定区域内进行比较或比对以获得最大的一致性时，如利用任何一个序列比较算法或通过人工比对和视觉观察所测量到的。而在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中的术语“同源性”指同源的或具有特定百分比的同源氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或亚序列，这是当在比较窗或指定区域内进行比较或比对以获得最大的一致性时，如利用任何一个序列比较算法或通过人工比对和视觉观察所测量到的。上面提到的程序允许通过测定两个相比较序列之间的同源性程度，用相似的氨基酸取代某一氨基酸。

【0055】对于序列分析，典型地就是某一个序列充当参照序列，测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参照序列输入计算机，如果需要可以设定子序列坐标，并设定序列算法程序的参数。可以使用默认的程序参数，或者设定可选的参数。然后序列比较算法就根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性的百分比。

【0056】此处使用的“比较窗口”包括涉及这样的片段(典型地含有大约20到大约600个连续的残基)，在其中，在两个序列被最优比对之后，一个序列与含有相同数目的连续残基的参考序列相比较。在本领域中用于比较的序列比对方法是众所周知的。用于比较的最佳序列比对能通过下述算法进行，例如通过Smith&Waterman的局部同源算法(local homology algorithm)，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；通过Needleman&Wunsch的同源比对算法(homology alignment algorithm)，J.Mol. Biol.48：443(1970)；通过Person & Lipman的相似性搜索方法(searchsimilarity method)，Proc.Natl.Acad.Sd.USA 85：2444(1988)；通过这些算法的计算机执行(威斯康星遗传软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFir、FASTA和TFASTA，遗传学计算机小组(Genetics Computer Group)，575Science Dr.，Madison，WI)；或者通过人工的比对和视觉观察。除了BLAST程序(美国国家生物信息中心的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool))之外，其它测定同源性和同一性的算法包括，例如ALIGN、AMAS(多重序列比对分析(Analysis of Multiply Aligned Sequences))AMPS(蛋白质多重序列比对(Protein Multiple Sequence Alignment))、ASSET(比对片段的统计评估工具(Aligned Segment Statistical Evaluation Tool))、BANNDS、BESTCOR、BIOSCAN(生物序列比较分析终端(Biological Sequence Comparative AnalysisNode))、BLIMPS(改进的区段搜索器(BLocks IMProved Searcher)))、FASTA、Intervals&Points、BMB、CLUSTAL V、CLUSTAL W、CONSENSUS、LCONSENSUS、WCONSENSUS、Smith-Waterman算法、DARWIN、Las Vegas算法、FNAT(强制的核苷酸比对工具(Forced Nucleotide Alignment Tool))、Framealign、Framesearch、DYNAMIC、FILTER、FSAP(Fristensky序列分析包)、GAP(全球比对程序(Global Alignment Program))GENAL、GIBBS、GenQuest、ISSC(敏感序列比较(Sensitive Sequence Comparison))、LALIGN(局部序列比对(localSequence Alignment))、LCP(局部目录程序(Local Content Program))、MACAW(多重比对的构建和分析工作台(Multiple Alignment Construction & AnalysisWorkbench))、MAP(多重比对程序(Multiple Alignment Program))、MBLKlP、MBLKN、PIMA(模式引导的多重序列比对(Pattern-Induced Multi-sequenceAlignment))、SAGA(采用遗传学算法的序列比对(Sequence Alignment by GeneticAlgorithm))和WHAT-IF。这样的比对程序也能被用来筛选基因组数据库以鉴定具有基本相同序列的聚核苷酸序列。许多基因组数据库是可以利用的，例如一大部分人类基因组可以作为人类基因组测序项目(J.Roach，可在万维网上查询网址″weber.u.Washington.edu/～roach/human genome progress 2.html″)(Gibbs，1995)的一部分被利用。含有基因组信息的几个数据库，带有一些功能信息的评注，被不同的组织维护着，这些数据库可以通过万维网上(www)的因特网访问，例如在网址″tigr.org/tdb″；″genetics.wisc.edu″；″genome-www.stanford.edu/～ball″；″hiv-web.lanl.gov″；″ncbi.nlm.nih.gov″；″ebi.ac.uk″；″Pasteur.fr/other/biology″和″genome.wi.mit.edu″。

【0057】一个有用的算法例子是BLAST和BLAST2.0算法，分别在Altschul etal，Nucl.Acids Res.25：3389-3402(1977)和Altschul et al，J. MoL Biol.215：403-410(1990)这两篇文献中有所描述。进行BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心的网站，“www.ncbi.nlm.nih.gov”公开获得。此算法涉及，首先鉴定高分值序列对(high scoring sequence，HSP)，这是通过鉴定要查询序列中长度为W的短字符串(word)进行的，当此字符串与数据库序列中相同长度的字符串联配时，其或者匹配或者满足某些正值的阈值T。T指相邻的字符串计分阈值(Altschul et al，supra)。这些初始的相邻字符命中(hit)充当种子，启动搜索以找到更长的含有这些命中的高分值序列对(HSP)。只要累积的联配分值能够增加，这些字符命中就沿着每个序列向两端延伸。对于核苷酸序列，累积分值使用参数M(一对匹配残基的赏值(reward score)；总是大于0)来计算。对于氨基酸序列，计分矩阵被用来计算累积分值。当遇到以下情形时，字符命中延伸在每一个方向停止：累积的联配分值由达到的最大值下降了数量X；由于一个或多个负分值残基联配的累积，累积的分值变成零或零以下；或者到达了序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)采用的默认值为，字符长度(W)是11，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，以及对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用的默认值为，字符长度(W)是3，期望值(E)是10，还有BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl，Acad.Sci USA 89：10915(1989))，联配(B)是50，期望值(E)是10，M＝5，N＝-4，以及对两条链进行比较。

【0058】Blast算法也可以对两个序列之间的相似性进行统计学分析(参见，例如Karlin & Altschul，Proc.NatlAcad.Sci USA 90：5873(1993))。Blast算法提供的相似性的一个量度为最小合计概率(smallest sum probability，P(N))，它表明了两个核苷酸或氨基酸序列间将偶然地相匹配的概率。例如，如果将测试的核酸与参考核酸比较得到的最小合计概率小于约0.2，更优选的小于约0.01，最优选的小于约0.001，就认为此核酸与参考核酸是相似的。

【0059】在一个实施方案中，蛋白质和核酸序列的同源性可以借助基本局部比对搜索工具(“BLAST”)来测评。特别地，有五种特殊的BLAST程序可被用来执行如下任务：

(1)BLASTP和BLAST3将氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库比较；

(2)BLASTN将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库比较；

(3)BLASTX将查询核苷酸序列(两链)的六框架的概念翻译产品(six-frame conceptual translation product)与蛋白质序列数据库比较；

(4)TBLASTN将查询蛋白质序列与以所有的六阅读框(两链)翻译的核苷酸序列数据库比较；和

(5)TBLASTX将核苷酸查询序列的六框架翻译产品与核苷酸序列数据库的六框架翻译产品比较。

【0060】BLAST程序通过鉴定查询氨基酸或核酸序列与测试序列之间的相似片段——其在本文中称为“高分值片段对(high-scoring segments pair)”，来鉴定同源序列，所述测试序列优选从蛋白质或核酸序列数据库得到。高分值片段对优选利用计分矩阵(scoring matrix)来鉴别(即联配)，其中有许多计分矩阵在本领域是众所周知的。优选地，使用的计分矩阵是BLOSUM62矩阵(Gonnet et al.，Science256：1443-1445(1992)；Henikoffand Henikoff，Proteins 17：49-61(1993))。次优选地，PAM或PAM250矩阵，它们也可以被使用(参见，例如Schwartz and Dayhoff，eds.，Matricesfor，Detecting Distance Relationships：Atlas of Protein Sequence and Structure，Washington：National Biomedical Research Foundation (1978))。BLAST程序可以通过美国国家医学图书馆获得，例如通过因特网“ncbi.nlm.nih.gov”得到。

【0061】上述算法所使用的参数可以根据所研究的序列长度和同源性程度进行调整。在某些实施方案中，在不存在使用说明书的情况下，这些参数可以设定为该算法所默认的参数。

【0062】按照本发明的另一方面内容，提供了编码任何一种上述异戊烯基转移酶的核酸，包括遗传密码子简并性所包括的所有变异。根据本发明的示例性核酸包括在严格的杂交条件下，与SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列(或其互补序列)特异性杂交的核酸，其中所述的核酸编码芳香异戊烯基转移酶。

【0063】杂交方法为分子生物学领域里的技术人员所熟知。“可特异性杂交的”和“特异性互补的”这两个术语表明具有足够程度的互补性，以便在第一个核酸和DNA或RNA靶标之间形成稳定的且特异的结合。第一个核酸并不需要与可特异性的杂交的靶序列具有100％的互补性。在满足特异结合的条件下，当互补性程度足以避免第一个核酸与非靶序列之间的非特异结合的时候，第一个核酸是可特异性杂交的。这样的结合被称为特异性杂交。

【0064】两个核酸分子关系密切的另一个可选指示是这两个分子可相互杂交。在某一些实施方案中，例如在低严格性、中等严格性和高严格性条件下，orf2核酸变异体可以与公开的orf2核酸序列(或其阅读框)杂交。导致特定严格程度的杂交条件将取决于选择的杂交方法的特点和杂交核酸序列的组成和长度而变化。一般来说，尽管洗涤时间也会影响杂交的严格性，但是杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(例如，Na+浓度)将决定杂交的严格性。Smabrook等人(编)，MolecularCloning：ALaboratory Manual，2nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，chapters 9 and 11，讨论了获得特定严格性程度所必须的杂交条件的计算方法。

【0065】下面示例性的各组杂交条件并不意味着是限制性的。高严格性的条件包括在5×SSC中于60℃杂交16小时，在室温(RT)下用2×SSC洗涤两次，各15分钟，和65℃下用0.5×SSC杂交液洗涤两次，各20分钟。中等严格性的条件包括在5×-6×SSC中于65℃-70℃下杂交16-20小时，室温下用2×SSC杂交液洗涤两次，各5-20分钟，和55℃-70℃下用1×SSC杂交液洗涤两次，各30分钟。低严格性的条件包括在6×SSC中于室温至55℃下杂交16-20小时，以及在室温至55℃下用2×-3×SSC洗涤两次，各20-30分钟。

【0066】可选地，根据本发明的核酸包括与SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的核酸，其中所述的核酸编码芳香异戊烯基转移酶。

【0067】为了研究结构特征及异戊烯基链长度的测定、芳香底物的选择性和异戊烯基转移的机理，测定了、四种Orf2底物/底物类似物的复合物的X射线晶体结构，即复合有TAPS缓冲液分子的Orf2，含有GPP和Mg²⁺的orf2二元复合物，含有非水解性的GPP类似物(GSPP)、Mg²⁺和1，6-DHN的Orf2三元复合物和含有GPP、Mg²⁺和淡黄霉素的Orf2三元复合物(结果总结在表3中)。

【0068】Orf2的三维结构是由形成一个新颖的桶形结构的结构域组成(图3)。该新的桶，在这里被称为β/α桶(β/α-barrel)，是一个封闭的β-折叠，其包含足够的反向平行的β-链以形成中央β-桶核心(centralβ-barrel core)(典型的范围为大约6到12条β-链)，这个中央β-桶核心被α-螺旋环包围，α-螺旋环形成外部的、暴露于溶剂的圆筒表面。在β/α桶状结构包含10条β-链的特例中，二级连接几乎符合(aaββ)5的分类，但更专业的被描述为(aaββ)4-(aββ)-a命名，在此结构中螺旋6和8，两者都涉及晶格里的蛋白间连接，呈现为一个螺旋状的“结(kink)”。

【0069】β/α圆筒状结构的疏水性最强的部分位于圆柱形β-圆筒的外表面和周围α-螺旋的带之间的区域。此外，位于圆筒内部的许多疏水性残基提供形成了GPP和GSPP分子的异戊二烯基的尾部，而底物和底物类似物的二磷酸酯或硫代二磷酸酯头部基团分别指向“上部的”、圆筒的极性更强的端部，在这里形成了Mg²⁺配位键。典型的是，圆筒的底部被短的C-末端螺旋覆盖着。在β/α圆筒结构包含10条β-链的特例中，C-末端螺旋将是α11。

【0070】此处还阐明了结构相关的蛋白质，这些蛋白质或者属于TIM圆筒状结构家族，或者属于β-圆筒状结构家族，这两个家族均呈现具有与β/α圆筒状结构截然不同的连接方式的圆筒状折叠(fold)(见图3)。TIM圆筒状蛋白质(即，pdb登录代码2ACQ表示的醛酮还原酶家族)是由重复的β-链-环-α-螺旋-环基序组成，大部分经常含有8个重复单元，平行的β-链形成了开放圆筒的内部，螺旋形成了整个蛋白质的外部带(Gerlt and Raushel，Curr Opin Chem Biol7(2)：252-64(2003))(图3A)。

【0071】包括人类脂肪酸结合蛋白在内的β-圆筒状蛋白质(FABP，pdb登录代码为1HMT)，是由排列成椭圆形圆筒状的10条反向平行的β-链所组成的，此圆筒底部覆盖有两个短的α螺旋(Gerlt and Raushel，Curr Opin Chem Biol7(2)：252-64(2003))(图3A)。

【0072】另一类显示出被螺旋包围的椭圆形β-圆筒的蛋白质是二聚体铁氧还蛋白样α+β夹层折叠：来自天蓝色链霉菌A3的ActVA-Orf6单体酶(pdb登录代码1LQ9)就属于后一种类，而且是一种小型酶，它能在位于β-折叠和α-螺旋之间的两个活性位点上氧化相对较大的三环芳香底物(图3C)。

【0073】α/β圆筒已被定义为大结构(至少含200个氨基酸)，主要是由交互的α-螺旋和β-链组成，其中平行的β-链形成中心(“hub”)，外面环绕着α-螺旋“轮胎(tire)”(见Branden and Tooze，Introduction to protein structure.Second edn.(1999)，New York：Garland)，然而α+β这类结构包括这样的蛋白质，其主要含有反向平行的β-折叠，而且含有隔离的α-螺旋和β-折叠区域。关于这一点，提出：α/β种类的定义，包括仅仅由α-螺旋连接的平行的β-链组成的蛋白质结构域，应当扩大至包含Orf2的新结构——β/α圆筒状结构。这种β/α圆筒状结构将引入新的β/α圆筒状结构类别，它包括被α-螺旋连接并包围的反向平行的β-链，作为α/β-种类的亚类，但是与α/β-圆筒状亚类是不同的。

【0074】有趣的是，在异二聚体人类蛋白法尼基转移酶的β-亚基中可以发现最后一种类型的圆筒状结构，即α-α圆筒状结构域，所述法尼基转移酶催化Ras和几个其它信号蛋白的羧基末端的异戊烯化反应(Park et al.，Science 275(5307)：1800-4(1997)(图3D)。这种结构域呈现一种完全不同的总体折叠，但是也呈现出与本文中Orf2所描述的类似的富含芳香环的底物结合袋和活性位点拓扑学(Park etal.，supra；Long et al.，Nature 419(6907)：645-50(2002))。

【0075】事实上，似乎类异戊烯基二磷酸酯合成酶、蛋白质异戊烯基转移酶和异戊烯基转移酶(PTase)——它们都涉及异戊烯基化合物的结合，在有关活性位点环境方面采用类似的策略。在大多数情况下，异戊烯基链的结合发生在带有高度保守残基的疏水性大通道里。反式法尼基二磷酸酯合酶的结构展示出作为同型二聚体连接的两个相同的亚基，这就形成了四层的螺旋束；这些螺旋中的八个组合在一个结构域里，此结构域类似于前面的蛋白质异戊烯基转移酶所描述的α-α结构域。顺式二聚体酶——从大肠杆菌(E.coli)和腾黄微球菌(M.luteus)获得的十一萜烯基焦磷酸酯合酶(UPPS)的结构，显示出两个疏水性通道，每个通道被两个α-螺旋和四个β-链包围。两种UPPS酶需要Mg²⁺以获得活性，即使它们两个都缺乏典型的异戊烯基二磷酸的镁盐结合基序(即，㈩/D)DXXD基序)，这种基序在大部分其他的反式异戊烯基转移酶和萜烯合成酶中均可发现。类萜环化酶，例如并环戊二烯合酶、5-表-马兜铃烯合酶和车轮虫烯合酶的结构，具有称为“类萜合成酶折叠(terpenoid synthase fold)”的相似的结构特征——带有10-12个大部分反式平行的α-螺旋，也正如在类异戊烯基焦磷酸酯合成酶和蛋白质异戊烯基转移酶中所观察到的结构(参见Liang，Eur J Biochem 269(14)：3339-54(2002))。所有上面所列举的结构与本文所描述的β/α圆筒状折叠结构有很大的不同。

【0076】尽管在Orf2的第一种结构中结合的TAPS分子初步指出了靠近Asp62的二磷酸酯结合位点的大致位置(图4A)，但是与GPP或非水解性类似物(GSSPP)复合的这种结构准确地确定了参与整个GPP底物的识别和结合的残基(图4B和4C)。靠近圆筒状结构的极性开放端的Lys119、Asn173和Arg228，以氢键与GSPP分子的末端β-磷酸酯结合(图4C)。连接到香叶基链上的α-磷酸酯与Tyr216和Lys284以氢键结合，而且也会和Mg²⁺离子发生配位。该Mg²⁺离子完整的配位几何结构成呈现出完美的八面体对称性，含有四个在赤道(平伏)排列的水分子和两个轴向定位的氧原子，由Asp62的侧链羧酸酯和GSPP分子的α-磷酸酯非桥联氧原子提供(图4B和4C)。尽管不存在(N/D)DXXD基序，次保守的残基Asp110——在三级结构中靠近Asp62，它通过四个(平伏)赤道排列的水分子的一个间接地与Mg2+离子发生配位。Tyr121位于连接二磷酸酯部分和C10香叶基链的桥联原子(GSPP中的硫和GPP中的氧)的能形成氢键的距离之内。最后，GPP或GSPP分子中的疏水性香叶基链紧靠着VaI 49，Phe 123，Met 162，Tyr 175和Tyr 216的侧链(图4C)。

【0077】与Mg²⁺、GSPP和1，6-DHN或淡黄霉素的三元复合物描述了芳香底物结合位点的化学特性(图4A、4B和4C)。1，6-DHN倚靠GSPP的异戊二烯基的尾部，隐蔽(sequester)在侧链Met162和Phe213之间。由短的C-端基螺旋提供的Gln295和Leu298侧链沿着底物结合囊(袋，pocket)的囊壁排成一行，这个囊还与Phe213、Ser214和Tyr288的侧链有另外的接触。尽管1，6-DHN和淡黄霉素的芳香环平面位于相同的活性位点方向上，但是淡黄素，是以与Ser214，Tyr288和Gln295形成的额外的几对氢键的方式结合在与1，6-DHN略有不同的位置(图4A)。

【0078】尽管不愿束缚于任何理论，底物和产物的结构与烷基化反应的亲电芳香环取代是一致的。理论上讲，对于芳香底物的异戊烯基化反应，有两种催化机理可以被考虑。一种机理认为是对GPP的C1的碳原子介导的亲核攻击，二磷酸酯部分作为离去基团，Mg²⁺的配位作用和二磷酸酯结合位点的基本性质稳定了此过程。这种类似于Sn2的机理也已经被用来描述蛋白质香叶基转移酶(Park et al.，supra；Long et al.，supra)。另一种机理我们可以联想到参与到烯丙基二磷酸的生物合成和异戊烯基的环化作用的萜烯合酶，这种机理还认为是碳氧离子介导的亲电捕获作用，这是针对FPP合酶的反式-异戊烯基转移酶反应(Tarshis et al.，Biochemistry 33(36)：10871-7(1994))和许多萜烯合酶(环化酶)的二次新陈代谢过程(Cane，in Comprehensive Naturals Products Chemistry：Isoprenoids，D.E.Cane，Editor，1998，Elsevier Science：Oxford，UK)。

【0079】1，6-DHN的C5原子——此原子被鉴定为异戊烯化的位点，或者淡黄霉素的C3原子与GSPP的C1原子之间的距离分别为4和7。很明显，这些距离与最近所描述的人类蛋白质香叶基转移酶中结合的香叶基二磷酸(FPP)分子上的C1原子与其肽底物上的Cys残基之间的距离7.3距离相类似(Long，2002supra)。即使类似Sn2的机理已经提出用于异戊烯基转移酶，与底物和产物的结构相关的这些距离，以及对断裂的异戊烯基链的构象转变的明显需要，与Orf2介导的芳香底物的烷基化作用的亲核芳香取代机理是一致的(见图5)。

【0080】图5描述了以1，6-DHN作为异戊烯基受体基团由Orf2催化的全部反应模型。首先，碳氧离子中间体被认为由二磷酸酯部分的离子化产生的，这是通过Mg2+的配位作用，与Lys119、Arg228、Asn173和Lys284的氢键的静电作用和共底物的结合作用共同引发的。香叶基碳氧离子上的带正电的C1原子会旋转朝向位于异戊烯基受体7远的靶双键(正如前面对人类蛋白质香叶基转移酶的描述；亦可参见Long，2002，supra)。含有Tyr121、Tyr175和Tyr216在内的“酪氨酸带状物”，被10个碳原子的GPP所包围着，而且与人类蛋白质香叶基转移酶中所观察到的带状物相类似(Park et al.，见上文；Long et al.，Biochemistry 37(27)：9612-8(1998)，这种带状物通过阳离子-π相互作用可以有助于稳定和固定碳阳离子中间体(Wise and Croteau，Comprehensive Naturals Products Chemistiy：Isoprenoids，D.E.Cane，Editor，1998，Elsevier Science：Oxford，UK)。

【0081】这一步涉及到反应性的亲电子试剂与1，6-DHN分子分子的C5原子相结合，从而形成共振稳定的碳阳离子或σ-复合物(Olah and Mo，J.Am.Chem.Soc.94：9241(1972))(图5)。最后，与GPP分子的二磷酸酯部分有着相互作用的Tyr216，也与保守的高度有序的水分子网络以氢键结合，而所述水分子与二磷酸酯部分相连，而且恰好位于共底物结合位置的上方。这些水分子中的一个分子，在图5中被突出表示出来，被安放在理想的位置以从阳离子的σ-复合物的异戊烯化的C5原子上夺取一个酸性质子，从而允许恢复业已含有共价结合(tethered)的香叶基链的中性芳香环。

【0082】为了确定某些活性位点残基的酶学重要性，对Orf2进行了的一些基本的突变研究，残基的活性是用含突变酶的细胞提取液来监测的。D62S和D62N单突变体，以及D62S/S51R和D62N/S51K双突变体，仅在GPP的存在下(在Mg²⁺的存在或不存在下)呈现出残基活性，而用GPP或DMAPP作为异戊烯基受体时并没有观察到D62A单突变体的可检测的活性，这就表明了D62在催化过程中的重要性。

【0083】为了解密异戊烯基二磷酸酯链长度的选择性、芳香底物识别的分子决定因素和二价阳离子的依赖性，使用Orf2的三维构造作为结构模板，对CloQ(玫瑰产色链霉菌（Streptomyces roseochromogenes)，登记号AF329398)、NovQ(球状链霉菌(Streptomyces spheroides)NCIMB 11891，登记号AF170880)和HypSc(蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)，登记号AL939130)这三个序列进行了同源性模拟(图6)。这些序列之间较大程度的全序列同一性，以及Orf2与CloQ/NovQ/HypSc之间相当大程度的活性位点保守性，表明芳香族异戊烯基转移酶家族所具有的β/α圆筒状折叠结构的保守性。

【0084】在HypSc模型中，Asp62被Asn残基所取代，与之相互补，Ser52被Arg残基所取代。还有，正如在CloQ/NovQ模型中观察到的一样，在Arg65和Glu278之间盐桥键的存在，从模拟的过程来看好像是为了防止异戊烯基供体与比C5更长的(即，C10或C15)烷基链的结合。从该模拟分析来看，从蓝色链霉菌推断出的蛋白质将预期(有望)显示出DMAPP专一性和不依赖于Mg²⁺的异戊烯基转移酶活性。

【0085】为了证实此模型，从基因组DNA被亚克隆HypSc，在大肠杆菌中以八-组氨酸标记蛋白的形式被过量表达，后被提纯以进行Ni²⁺-鳌合层析。然后用DMAPP和GPP作为异戊烯基供体来测定提纯的酶的异戊烯基转移酶活性。在不存在Mg²⁺的情况下使用DMAPP和1，6-DHN作为底物，可以检测到显著的异戊烯基转移酶活性，这与本文阐述的基于模型的假设——关于本发明酶的链长选择性和Mg²⁺非依赖性——相一致。

【0086】根据本发明的另一方面，提供了此处所描述的结晶形态的芳香异戊烯基转移酶的组合物。这些组合物可任意地包括芳香异戊烯基转移酶的一个或更多的底物。此处所使用的“底物”指那些易于受到本发明的异戊烯基转移酶的作用的化合物，例如，四羟基萘及其类似物，同系物和代谢物等的这些反应性的芳香化合物。

【0087】此处所使用的“类似物”指的是与上面所描述的芳香底物相关联的化合物，它们保留了其生物活性，但是具有一个或多个相对于亲本化合物的取代和/或修饰，例如-O-取代为-CH₂-。作为一种选择，类似物也可能有相对较少的基本的结构相似性，但是也会依然呈现底物的的生物活性，这是由于它具有相似的二级和/或三级结构特征、电子特性及类似特性。

【0088】此处所使用的“同系物”指的是与上面所描述的芳香底物相关联的化合物，它们存在或不存在简单的单元，例如一个亚甲基单元，或多个这样的单元，例如-(CH₂)x-。

【0089】此处所使用的“代谢物”指的是与上面所描述的芳香底物相关联的化合物，这种形式的化合物是通过在人类或动物体内身体对给药形式的该化合物作用而得到的，例如含有甲基的化合物的去甲基类似物，该去甲基类似物是在施用甲基化的化合物之后，在身体内由身体对这种甲基化的化合物发生作用而得到的。

【0090】根据本发明，X射线晶体学能够阐明结晶形态的三维结构。典型的是，X射线晶体学对晶体的初步表征是能够确定晶胞的类型以及其在晶体中的方位。“ 晶胞(unit cell)”这个术语指的是晶体中最小且最简单的体积单元，它是能完全代表晶体类型的单元。晶胞的尺寸可以由六个参数确定：尺寸a、b和c，角度α、β和γ。一个晶体可被看作是由多个晶胞有效组装成的点阵(排列，assay)。Hahn，THE INTERNATIONAL TABLES FOR CRYSTALLOGRAPHY，VOLUME A，4th Ed.，Kluwer Academic Publishers(1996)；和Shmueli，THE INTERNATIONALTABLES FOR CRYSTALLOGRAPHY，VOLUME B，lst Ed.，Kluwer AcademicPublishers这两本书中提供了结晶学术语的详述。“空间群(space group)”这个术语涉及到晶胞的对称性。在一个空间群的名称(例如，P2)中，首字母表示晶格类型，其他符号表示在晶胞中不改变其外形而进行的对称操作。

【0091】“硒代甲硫氨酸取代”指的是产生化学改性形式的蛋白质晶体的方法。此蛋白质由细菌在培养基中被表达，此培养基被消耗掉甲硫氨酸，补充上硒代甲硫氨酸。硒因此就被嵌入到晶体中，代替甲硫氨酸的硫。对晶体进行X射线衍射分析确定硒的位置(一个或多个)。从此信息中可以得到相位(phase)信息，进而构建此蛋白质的三维结构。

【0092】“重金属原子的衍生化作用”指的是产生化学改性形式的蛋白质晶体的方法。在实际操作中，晶体被浸泡在含有重金属原子的盐或有机金属化合物的溶液中，比如氯化铅、苹果酸金、乙酸双氧钠及类似物，它们将扩散穿过晶体并结合到蛋白质的表面。结合重金属原子的位置能通过对浸泡过的晶体进行X射线衍射分析来测定。此信息然后可以用于构建相位信息，而相位信息可以用于构建酶的三维结构，这在Blundel and Johnson，PROTEIN CRYSTALLOGRAPHY，Academic Press(1976)中有所描述，其在此处以引用方式并入本文。

【0093】从X射线衍射图样中得到的信息可以被用来测定其它同源多肽的结合位点的三维结构。这可以通过使用本领域中众所周知的商业可利用的软件来实现，这些软件能够从一系列结构坐标产生分子或其一部分的三维图象的描述。结合结构域也可以由各种计算机模拟来预测。根据已知结构的X射线坐标，也可设计出对已知结构的突变或变异。

【0094】根据本发明，示例性的分离的芳香异戊烯基转移酶借助附录1中所列的结构坐标已经被进一步表征。

【0095】根据本发明的另外一个方面，提供了预测推定的芳香异戊烯基转移酶的活性和/或底物的转一性的方法。这些方法包括以下步骤：

将已知的芳香异戊烯基转移酶的三维描述和推定的芳香异戊烯基转移酶的三维描述相对比，这两种描述之间的差别就可以预测芳香异戊烯基转移酶的活性和/或其底物的专一性。

【0096】根据本发明的另外一个方面，提供了筛选与芳香异戊烯基转移酶可以结合的化合物的方法，所述的方法包括以下步骤：

对与芳香异戊烯基转移酶或其片段的一个或多个结构域有相互作用的潜在结合试剂进行模拟，而所述结构域是由这种芳香异戊烯基转移酶或其片段的许多原子坐标所确定的；

然后测定所述的潜在结合试剂与所述芳香异戊烯基转移酶底物竞争以结合所述芳香异戊烯基转移酶的能力。

【0097】此处所使用的“分子置换(molecular replacement)”涉及建立结构坐标未知的多肽的初步模型，通过对其结构坐标已知的分子进行定位并放置在未知晶体的晶胞中，以更好地解释未知晶体所观测到的衍射图案。然后就能从此模型中计算相位，与所观测到的振幅相结合，以对坐标未知的结构进行近似的傅立叶合成。转而对这个模型进行任何若干形式的精修，以提供未知晶体最终的精确结构(Lattman，Meth.Enzymol.115：55-77(1985)；Rossmann，MG.，ed.，THEMOLECULAR REPLACEMENT METHOD(1972)，Int.Sci.Rev.Ser.No.13，Gordon& Breach，New York)。使用此处提供的芳香异戊烯基转移酶的结构坐标，分子置换方法就可以被用来测定芳香异戊烯基转移酶结晶形态的突变体、同源物或其不同结晶状态的结构坐标。

【0098】根据本发明，芳香异戊烯基转移酶，或其一部分，与任何已知或推定的底物和/或结合剂结合或复合之后，可以被结晶。一系列这种复合物的结晶结构就可以通过分子置换和与天然的芳香异戊烯基转移酶对比的方法来确定。芳香异戊烯基转移酶分子或其对应底物和/或结合剂中的潜在修饰位点，可以根据芳香异戊烯基转移酶和其底物和/或结合剂发生作用的位点来鉴定。此信息提供了测定最有效结合相互作用的另外一种工具，例如在芳香异戊烯基转移酶与推定的化学实体或化合物之间的加强的疏水性相互作用，这甚至可在任何的合成或改性之前进行。

【0099】上面提到的所有复合物均可以通过此处所描述的熟知的X射线衍射技术来研究，而且采用计算机软件，比如X-PLOR(Yale University，1992，MolecularSimulations，Inc.发布)，可以相对于2-3分辨率的X射线数据，将复合物的结构精确至R值大约或小于0.2。参见，例如Blundel & Johnson，supra；Methods inEnzymology，vol.114 and 115，H.W.Wyckoff et al.，eds.，Academic Press(1985)。因而，利用这种信息可以优化已知类别的芳香异戊烯基转移酶的底物和/或其结合剂，比如天然的THN，而且也可以设计、改性和/或合成新类别的芳香异戊烯基转移酶的底物和/或其结合剂。

【0100】芳香异戊烯基转移酶的底物和/或其结合剂，例如结合和/或调节根据本发明的芳香异戊烯基转移酶多肽的化合物，其模拟或设计一般涉及到考虑两方面的因素。第一，此化合物或分子必须能物理上或结构上与芳香异戊烯基转移酶分子相结合。在芳香异戊烯基转移酶与其推定的底物和/或结合剂结合过程中重要的非共价分子相互作用力包括氢键、范德华力、疏水作用及类似的作用力。

【0101】第二，这种化合物或分子必须能够呈现一种构象，允许其与芳香异戊烯基转移酶分子相结合。尽管这种化合物或分子的某些部分不直接参与这种结合，但是这些部分仍可以影响此分子的整体构象。这进而会对与受体的亲和力有重要影响。这种构象需要包括这种化合物或分子的整体的三维结构和方位，这与所有或一部分结合位点或化合物或分子的功能基团间的空间相关的，这种分子或化合物包括几个与芳香异戊烯基转移酶直接作用的化学实体。

【0102】此处所使用的术语“模拟(modeling)”指的是利用计算机产生的分子代表——这与物理分子相反，对芳香异戊烯基转移酶和已知或测试化合物或分子之间的相互作用进行的分析。

【0103】借助计算机模拟技术在实际的合成之前就可以分析测试化合物与芳香异戊烯基转移酶的潜在的结合。如果给定化合物的理论结构表明其与芳香异戊烯基转移酶的相互作用力和结合作用不够充分，这种化合物的合成或测试可能被取消。然而，如果计算机模拟表明具有很强的相互作用力，就可以测试这种分子与芳香异戊烯基转移酶结合的能力。本领域中测定芳香异戊烯基转移酶活性的方法已经被人们所熟知(在此处被鉴别或讨论)。测定潜在结合剂的效果的方法可以在芳香异戊烯基转移酶已知的结合剂的存在下进行。例如，潜在结合剂的效果可以通过测定其与已知的结合剂的竞争能力进行分析。

【0104】测试化合物可以在计算机上通过一系列的步骤被评价和设计，其中，根据与芳香异戊烯基转移酶的单个结合袋或其它区域缔合的能力，筛选和选择化学实体或片段，所述芳香异戊烯基转移酶与其底物和/或结合剂缔合。

【0105】本领域的技术人员可以采用几种方法的一种来预测能与芳香异戊烯基转移酶结合的分子，并根据与芳香异戊烯基转移酶，尤其是芳香异戊烯基转移酶多肽的单个活性点(结合袋和/或特异的作用点)缔合的能力，筛选测试化合物。这个过程可以通过在计算机屏幕上，视觉观察例如芳香异戊烯基的结合位点开始，这基于从芳香异戊烯基转移酶晶体的X射线衍射数据所得到的结构坐标，例如在附录1种提供的那些结构坐标。然后选出的片段或化学实体可以在芳香异戊烯基转移酶的单个结合袋中以各个方向放置，或停靠(docked)。停靠(docking)是可以借助软件如Quanta和Sybyl来完成的，紧接着利用标准分子力学场(standardmolecular mechanics forcefield)，例如CHARMM和AMBER，进行能量最小化和分子动力学研究。

【0106】在这个阶段，专业的计算机软件也可以协助选择片段或化学实体的过程。这些软件包括：

1.GRID(Goodford，P.J.，″A Computational Procedure for Determining EnergeticallyFavorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules″，J.Med.Chem.，28，pp.849-857(1985))。GRID是从英国牛津市的牛津大学(OxfordUniversity，Oxford，UK)得到的。

2.MCSS(Miranker，A.and M.Karplus，″Functionality Maps of Binding Sites：AMultiple Copy Simultaneous Search Method.″Proteins：Structure.Function andGenetics，11，pp.29-34(1991))。MCSS是从Molecular Simulations，Burlington，Mass得到的。

3.AUTODOCK(Goodsell，D.S.and A.J.Olsen，″Automated Docking of Substratesto Proteins by Simulated Annealing″，Proteins：Structure.Function，and Genetics，8，pp.195-202(1990))。AUTODOCK是从加利福尼亚州拉霍拉沙克市的斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute，La Jolla，Calif.)得到的。

4.DOCK(Kuntz，I.D.et al.，″A Geometric Approach to Macromolecule-LigandInteractions″，J.Mol.Biol.，161，pp.269-288(1982))。DOCK是从加利福尼亚州的旧金山市的加利福尼亚大学(University of California，San Francisco，Calif.)得到的。

【0107】一旦选定了合适的化学实体或片断，它们就能被装配到单个化合物里，该化合物就是候选的底物和/或结合剂。装配过程是这样进行的：通过视觉观测计算机屏幕上显示的三维图像上的片段之间的相互关系，这与附录1中列出的芳香异戊烯基转移酶分子的结构坐标有关。紧接着将利用软件，比如Quanta或Sybyl，进行人工建模。

【0108】一些有用的软件，它们能帮助本领域的技术人员连接单个的化学实体或片断，包括：

1.CAVEAT(Bartlett，P.A.et al，″CAVEAT：A Program to Facilitate theStructure-Derived Design of Biologically Active Molecules″.In″MolecularRecognition in Chemical and Biological Problems″，Special Pub.，Royal Chem.Soc，78，pp.182-196(1989))。CAVEAT是从加利福尼亚州的伯克利的加利福尼亚大学(University of California，Berkeley，Calif.)得到的。

2.3D数据库系统，例如MACCS-3D(加利福尼亚州的圣莱安德罗的MDL信息系统(MDL Information Systems，San Leandro，Calif.))。这个领域在Martin，Y.C，″3D Database Searching in Drug Design″，J.Med.Chem.，35，pp.2145-2154(1992))中有所综述。

3.HOOK(可从Molecular Simulations，Burlington，Mass.得到的)。

【0109】除了以逐步的方式，即以如上所述的一次一个片段或者化学实体的方式，建立或鉴别底物和/或结合剂的方法外，利用空的结合口袋或者任选地包含已知底物(一种或多种)和/或结合剂(一种或多种)的某些部分(一种或多种)，芳香异戊烯基转移酶底物和/或结合剂也可以被设计成一个整体或“全程(从头，denovo)”合成。这些方法包括：

1.LUDI(Bohm，H.-J.，″The Computer Program LUDI：A New Method for the DeNovo Design of Enzyme Inhibitors″，J.Comp.Aid.Molec.Design，6，pp.61-78(1992))。LUDI是从加利福尼亚的圣地亚哥的生物系统技术中心(BiosymTechnologies，San Diego，Calif.)得到的。

2.LEGEND（Nishibata，Y.and A.Itai，Tetrahedron，47，p.8985(1991))。LEGEND是从Molecular Simulations，Burlington，Mass.得到的。

3.LeapForg(从Tripos Associates，St.Louis，Mo.得到的)。

【0110】根据本发明，其它的分子建模技术也可以被利用。参见，例如Cohen，N.C.etal.，″Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry″，J.Med.Chem.，33，pp.883-894(1990)。亦可参见，Navia，M.A.and M.A.Murcko，″TheUse of Structural Information in Drug Design″，Current Opinions in Structural Biology，2，pp.202-210(1992)。

【0111】一旦测试化合物或粘合剂已经通过以上方法被设计或选定，此化合物能和芳香异戊烯基转移酶结合的效率即可以采用计算机评估的方法被测试和优化。

【0112】设计或选定作为推定的底物和/或结合剂的化合物可以进一步的被计算机优化，以便在它的结合状态下，它将优选地缺乏与靶位点之间的相互排斥的静电作用。这种非补充性的(例如，静电的)相互作用包括相互排斥的电荷一电荷、双极子-双极子、和电荷-双极子的相互作用。特别的是，当底物和/或结合剂与芳香异戊烯基转移酶结合时，结合剂与芳香异戊烯基转移酶之间的所有静电相互作用之和，优选地对结合焓做出中性的或有利的贡献。

【0113】在本领域有特殊的计算机软件适用于估计化合物的变形能和静电相互作用。为这些应用设计的软件的例子包括：Gaussian92，修订本C(M.J.Frisch，Gaussian，Inc.，Pittsburgh，Pa.，1992)；AMBER，4.0版本(P.A.Kollman，University ofCalifornia at San Francisco，1994)；QUANTA/CHARMM(Molecular Simulations，Inc.，Burlington，Mass.1994)；和Insight II/Discover(Biosysm Technologies Inc.，San Diego，Calif，1994)。这些程序可以被执行，例如，使用一个硅制图工作站(Silicon Graphicsworkstation)，IRIS 4D/35或IBM RISC/6000工作站350型。其它的硬件系统和软件包将会被那些本领域的技术人员所了解，它们的计算速度和容量将会被连续改进。

【0114】根据本发明，其它的分子建模技术也可以被利用。对于示例性的综述和技术，参见，例如，Cohen et al.，″Molecular Modeling Software and Methods forMedicinal Chemistry，J.Med.Chem.，33，pp.883-894(1990)；亦可参见M.A.Naviaand M.A.Murcko，″The Use of Structural Information in Drug Design″，CurrentOpinions in Structural Biology，2，pp.202-210(1992)；L.M.Balbes et al.，″APerspective of Modern Methods in Computer-Aided Drug Design″，in Reviews inComputational Chemistry，Vol.5，K.B.Lipkowitz and D.B.Boyd，Eds.，VCH，NewYork，pp.337-380(1 994)；亦可参见，W.C.Guida，″Software For Structure-BasedDrug Design″，Curr.Opin.Struct.Biology，4，pp.777-781(1994)。

【0115】根据本发明的另一个方面，提供了筛选结合芳香异戊烯基转移酶的化合物的另外的方法，所述的方法包括以下步骤：

根据芳香异戊烯基转移酶多数个原子坐标，限定所述芳香异戊烯基转移酶的作用位点；

对空间上适合(匹配)所述的作用位点的潜在结合剂，建立模型；

在芳香异戊烯基转移酶底物存在的情况下，将所述的潜在结合剂与所述的芳香异戊烯基转移酶相接触；和

测定所述的潜在结合剂，与所述的芳香异戊烯基转移酶底物竞争而结合所述的芳香异戊烯基转移酶的能力。

【0116】根据本发明的另一个方面，提供了筛选结合芳香异戊烯基转移酶的化合物的另外的方法，所述的方法由以下步骤组成：

根据芳香异戊烯基转移酶多数的原子坐标，限定所述的芳香异戊烯基转移酶的作用位点；

对空间上适合所述的作用位点的潜在结合剂，建立模型；以及

在芳香异戊烯基转移酶底物存在的情况下，通过将所述的潜在结合剂与所述的芳香异戊烯基转移酶相接触，测定所述的潜在结合剂与所述的芳香异戊烯基转移酶底物竞争所述相互作用位点的能力。

【0117】根据本发明的还有另一个方面，提供了筛选结合芳香异戊烯基转移酶的化合物的另外的方法，所述的方法包括以下步骤：

对空间上适合芳香异戊烯基转移酶的作用位点的潜在结合剂建立模型，所述作用位点是由所述的芳香异戊烯基转移酶多数个原子坐标来确定的；

在所述的芳香异戊烯基转移酶底物存在的情况下，将所述的潜在结合剂与所述的芳香异戊烯基转移酶相接触；和

测定所述的潜在结合剂和所述的芳香异戊烯基转移酶底物竞争以结合所述的芳香异戊烯基转移酶的能力。

【0118】根据本发明的另一个方面，提供了筛选结合芳香异戊烯基转移酶的化合物的另外的方法，所述的方法包括以下步骤：

对空间上适合香异戊烯基转移酶的作用位点的潜在结合剂建立模型，所述作用位点是由所述的芳香异戊烯基转移酶多数的原子坐标来确定的；和

在所述的芳香异戊烯基转移酶底物存在的情况下，通过将所述的潜在结合剂与所述的芳香异戊烯基转移酶相接触，测定所述的潜在结合剂与所述的芳香异戊烯基转移酶底物竞争相互作用位点的能力。

【0119】根据本发明的还有另一个方面，提供了筛选结合芳香异戊烯基转移酶的化合物的另外的方法，所述的方法包括以下步骤：

测定潜在的结合剂与芳香异戊烯基转移酶底物竞争以结合所述的芳香异戊烯基转移酶的能力，其中对潜在的结合剂建立模型，以在空间上适合芳香异戊烯基转移酶的相互作用位点，而此相互作用位点是由大多数的原子坐标所确定的。

【0120】根据本发明的还有另一个方面，提供了鉴别芳香异戊烯基转移酶的潜在底物的方法，所述的方法是包括以下步骤：

根据所述的芳香异戊烯基转移酶的多数原子坐标确定所述的芳香异戊烯基转移酶的活性位点；

鉴别与所述的活性位点适合的潜在的底物；和

将芳香异戊烯基转移酶和潜在的底物相接触，然后测定其活性。

【0121】根据本发明的进一步的方面，提供了筛选化合物的方法，以确定这些化合物是否是芳香异戊烯基转移酶的底物，所述的方法包括以下步骤：

确定芳香异戊烯基转移酶与其底物或产物之间的相互作用点；

选择与所述的芳香异戊烯基转移酶有着相似的相互作用的化合物；和

测试选定的化合物被所述芳香异戊烯基转移酶转化的能力。

【0122】根据本发明的还有另一个方面，提供了筛选化合物的另外的方法，以确定这些化合物是否是芳香异戊烯基转移酶的底物，所述的方法是包括以下步骤：

选择与所述的芳香异戊烯基转移酶有相互作用点的化合物，其中所述的芳香异戊烯基转移酶与其底物或产物之间相似的相互作用点已经被确定；和

测试选定的化合物被所述芳香异戊烯基转移酶转化的能力。

【0123】根据本发明的还有另一个方面，提供了筛选化合物的另外的方法，以确定这些化合物是否是芳香异戊烯基转移酶的底物，所述的方法是包括以下步骤：

测试化合物被所述的芳香异戊烯基转移酶转化的能力，

其中所述的化合物已经被选定，它与所述的芳香异戊烯基转移酶有相互作用点，而且

其中所述的芳香异戊烯基转移酶与其底物或产物之间相似的相互作用点已经被确定。

【0124】根据本发明的还有另一个方面，提供了模拟芳香异戊烯基转移酶活性的方法，所述的方法包含将所述的芳香异戊烯基转移酶与由上面描述的任何一种方法鉴别出的有效数量的化合物相接触。

【0125】这样的化合物典型地被当作配方(制剂，formulation)的一部分来给药，此配方包含至少一种上述所描述的化合物，它们在其药学上可接受的载体中。示例性的药学上可接受的载体包括固体、溶液、乳液、分散体、胶束、脂质体和其类似物。可选地，此处使用的药学上可接受的载体还包含肠衣。

【0126】在本发明实施中预期使用的药学上可接受的载体就是那些使发明的化合物能适合于进行口服送递、脑内送递、静脉内传递、肌肉内传递、体表(局部)传递、经鼻传递及类似的传递。

【0127】因此，预期在本发明实施中使用的配方可以以固体、溶液、乳液、分散体、胶束、脂质体和其类似物的形式使用，其中所得的配方含有一种或多种本发明中的化合物作为活性成分，并与适合可口服或肠胃外施用的有机或无机载体或赋形剂相混合。活性组分可以例如与通常无毒的药学上可接受的载体化合，形成药片、药丸、胶囊、栓剂、溶液、乳液、悬浮液、和其它适合使用的形式。能被利用的载体包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯树胶、凝胶、manitol、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、硅胶、马铃薯淀粉、尿素、中等链长的甘油三酯、右旋糖苷和其它适合于制备的载体形式，它们是固体、半固体或液体的形式。此外，还可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、着色剂和香料。在配方中含有足够数量的活性成分以能够在这个过程或疾病的情况下产生满意的效果。

【0128】在本发明实施中预期使用的、含有活性成分的配方可以是适合口服使用的形式，例如药片、片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳液、硬的或软的胶囊、糖浆或酏剂。打算用于口服的配方可以跟据本领域所熟知的、用于制备药物组合物的任何一种方法制备；为了提供制药学上外观雅致口味怡人的制剂(preparation)，这样的配方可以含有一种或多种试剂，所述试剂选自增甜剂，如葡萄糖、乳糖、或糖精，调味剂，如薄荷油、鹿蹄草或樱桃油，着色剂和防腐剂。含有活性成分混合以所使用的医药上可接受的赋形剂的药片(片剂)，例如可以是(1)惰性稀释剂，例如碳酸钙、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；(2)粒化的或碎裂的试剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉或褐藻酸；(3)粘合剂，如黄芪胶、玉米淀粉、凝胶或阿拉伯树胶；(4)润滑剂，如硬脂酸镁、位阻酸(steric acid)或滑石。这些药片(片剂)可以不被包被或者它们也可利用已知的技术进行包被，以延长其在肠胃道内的分解和吸收，从而在较长的时期内提供持续的作用。例如，延时材料，例如甘油一硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯可以被使用。为了达到控制释放的目的，它们也可以利用如在美国专利4,256,108；4,160,452；和4,265,874中所描述的那些技术进行包被，以形成渗透性的治疗片剂。

【0129】在某些情况下，预期口服用的配方可以是硬凝胶胶囊的形式，其中活性成分与惰性的固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土相混合。它们也可以是软凝胶胶囊的形式，其中活性成分与水性或油性介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油相混合。

【0130】在本发明实施中预期使用的配方也可以是无菌可注射悬浮液的形式。这种悬浮液，可以根据已知的方法使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂进行配制。这种无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中形成的无菌可注射溶液或悬浮液，如1，3-丁二醇溶液。无菌的非挥发油也通常被用来当作溶剂或悬浮介质。对于这个目的来说，任何刺激性少的非挥发油均可以被利用，包括合成的甘油一脂或甘油二酯，脂肪酸，天然生产的植物油，像芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油等等，或者合成的脂肪媒介物，像乙烷基油酸盐或类似物。缓冲剂，防腐剂，抗氧化剂和类似物根据需要也可能被混合进来。

【0131】对于药物的直肠给药，在本发明中实践中预期使用的配方也可以以栓剂的形式给药。这些配方也可以通过将药物与合适的无刺激性的赋形剂相混合而制备，所述赋形剂例如可可豆黄油、合成的聚乙烯乙二醇的甘油酯醚，它们在通常温度下为固态，但是在直肠腔内液化和/或溶解，从而释放药物。因为个别被试者在严重症状下可能会呈现广泛的变化，而且每种药物有其独特的治疗特性，对于每个被试者而言精确的给药方式和使用的剂量就由医师来判断。

【0132】达到特殊治疗目标的有效的剂量，当然将决定于要治疗的病情的严重性以及被试者的体重和身体的一般状况。本领域的技术人员都知道决定“有效数量”的要考虑的一般的各种因素，这些因素被描述在，例如Gilman etal.，eds.，Goodman And Gilman′s：The Pharmacological Bases of Therapeutics，8th ed.，Pergamon Press，1990；和Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，MackPublishing Co.，Easton，Pa.，1990，此处的每一篇都以引用方式并入本文。

【0133】“有效数量”这个术语，当应用到在本发明实施中预期使用的化合物时，就意味着达到满意的治疗效果所必需的数量，例如，对于治疗性的化合物已经被给药或达到体内平衡来说，能有效地治疗、治愈或减轻某个施用治疗化合物的疾病的症状的一个水平，或建立体内平衡的一个水平。因为个别被试者在严重症状下可能表现出非常广泛的变化，而且每个药物或活性剂有其独特的治疗特性，对每个使用者来说，准确的给药方式，施用的剂量和治疗方案就由医师来判断。

【0134】上面描述的激励芳香异戊烯基转移酶活性的方法能应用于许多情况下。举例来说，抗化学疗法的癌细胞经常通过P-糖蛋白的超表达进行调节，P-糖蛋白是一种质膜ABC(ATP结合盒)转运蛋白，它利用ATP-的水解来逐出细胞毒性药物。最近已经报道异戊烯化类黄酮可以作为人体多抗药性蛋白(MRP1)潜在的抑制剂，MRP1属于ABC转运蛋白超家族。这种异戊烯化的化合物中有一些表现出抗HIV的效应。最近，已经鉴定出在啤酒中含有通常形式的异戊烯化类黄酮：6-和8-柚皮素，黄腐粉和异黄腐粉在啤酒花(Hamulus lupulus L.)中含有很高的浓度，而且它们的雌激素的药力已经在体外和动物模拟的系统中被测定，数据表明它们是比异黄酮类具有更大药力的雌激素(参见Milligan et al，J Clin EndocrinolMetab 84：2249-52(1999))。

【0135】根据本发明的另一个方面，提供了鉴别芳香异戊烯基转移酶的潜在调节剂的方法，所述的方法包括以下步骤：

根据芳香异戊烯基转移酶多肽的多数的原子坐标，确定芳香异戊烯基转移酶多肽或其片段；

对与芳香异戊烯基转移酶多肽的一个或多个结构域发生相互作用的潜在结合剂进行模拟；

将潜在结合剂与芳香异戊烯基转移酶多肽相接触；和

测定所述的潜在结合剂调节芳香异戊烯基转移酶的生物功能的能力，由此鉴定芳香异戊烯基转移酶多肽的潜在调节剂。

【0136】此处所使用的“调节剂”指的是这样的化合物(一种或多种)，它们直接地(通过与异戊烯基转移酶的结合)或间接地(作为与异戊烯基转移酶相结合的化合物的前体，或作为能促进由所述前体产生与异戊烯基转移酶相结合的化合物的诱导剂)诱导异戊烯基转移酶的活性或者抑制异戊烯基转移酶的活性。在本发明实施中考虑使用的示例性的调节剂包括类黄酮、异黄酮和类似物。

【0137】根据本发明的另外一个方面，提供了另外一种鉴别芳香异戊烯基转移酶的活性的潜在调节剂的方法，所述的方法是由以下步骤组成：

根据芳香异戊烯基转移酶多肽的多数原子坐标，确定所述的芳香异戊烯基转移酶的活性位点；

在底物存在下，将适合(适应，匹配fit)活性位点的潜在化合物与芳香异戊烯基转移酶相接触；和

测定所述的化合物调节与所述的底物相关的所述的芳香异戊烯基转移酶的活性。

【0138】根据本发明的另外一个方面，提供了另外一种鉴别芳香异戊烯基转移酶的活性的潜在调节剂的方法，所述的方法包括以下步骤：

接触与活性位点适合的潜在化合物，所述活性位点是根据芳香异戊烯基转移酶多肽的多数的原子坐标确定的；和

测定所述的化合物调节所述的芳香异戊烯基转移酶活性的能力。

【0139】根据本发明的另一个方面，提供了筛选调节芳香异戊烯基转移酶活性的化合物的方法，所述的方法包括以下步骤：

测定芳香异戊烯基转移酶与其底物或底物模拟物之间的相互作用点；

选定与所述的芳香异戊烯基转移酶有着相似的相互作用的化合物；和

测试选定的化合物调节芳香异戊烯基转移酶活性的能力。

【0140】此处所使用的“调节”指的是异戊烯基转移酶的调节剂间接或直接地诱导异戊烯基转移酶的活性或者抑制异戊烯基转移酶的活性的能力。根据本发明，考虑用于调节的示例性过程包括胆固醇的新陈代谢、油脂动态平衡的调节、胆汁传送和吸收的刺激、涉及到胆汁酸(包括肠内的胆汁酸结合蛋白质(IBABP))的排泄和传送的基因表达的调节，胆盐输出泵(BSEP)和微管多特异阳离子转运体(cMOAT)，和其类似物。

【0141】根据本发明的另一个方面，提供了筛选调节芳香异戊烯基转移酶活性的化合物的方法，所述的方法包括以下步骤：

选出与芳香异戊烯基转移酶有相互作用点的化合物，其中所述的芳香异戊烯基转移酶与其底物或底物模拟物之间相似的相互作用点已经被测定出来；和

测定选定的化合物调节所述的芳香异戊烯基转移酶活性的能力。

【0142】根据本发明的另一个方面，提供了筛选调节芳香异戊烯基转移酶活性的化合物的其他方法，所述的方法是包括下步骤：

测试化合物调节芳香异戊烯基转移酶活性的能力，

其中所述的化合物已经被选出，它与所述的芳香异戊烯基转移酶有相互作用点，而且

其中所述的芳香异戊烯基转移酶与其底物或底物模拟物之间相似的相互作用点已经被测定出来。

【0143】根据本发明的还有另一个方面，提供了芳香底物异戊烯化的方法，所述的方法包含：

在异戊烯化的条件下，将芳香底物与芳香异戊烯基转移酶相接触，如本文所述。

【0144】根据本发明的另一个方面，提供了鉴别具有β/α圆筒状结构的蛋白质的方法，所述的方法包含：

比较本文描述的芳香异戊烯基转移酶的三维表示和具有β/α圆筒状结构的推定蛋白质的三维表示，其中这两种表示之间的相似性预示具有β/α圆筒状结构的芳香异戊烯基转移酶蛋白。

【0145】根据本发明的另一方面，提供了控制由芳香异戊烯基转移酶引发的异戊烯化的程度方法，所述的方法包含：

改变所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个活性位点残基，以改变活性位点的尺度，从而足以能控制所述的芳香异戊烯基转移酶引发的异戊烯化的程度。

【0146】此处所使用的“异戊烯化程度”指的是加到底物上的类异戊二烯单元的数目。这包括在多个位点上的异戊烯化，以及单个位点上引入一个或多个类异戊二烯单元。

【0147】根据本发明的另外一个方面，提供了改变由芳香异戊烯基转移酶促进的异戊烯化程度，所述的方法包括：

改变所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个活性位点残基，以致于改变活性位点的尺寸，使之足以能改变由芳香异戊烯基转移酶促进的异戊烯化程度。

【0148】根据本发明的另外一方面，提供了控制芳香异戊烯基转移酶底物专一性的方法，所述的方法包括：

改变所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个活性位点上的残基，以致于改变活性位点的尺寸，使之足以能控制与芳香底物相关的所述的芳香异戊烯基转移酶的选择性，此底物被所述的芳香异戊烯基转移酶异戊烯化。

【0149】此处所使用的“底物专一性”指的是酶识别底物的选择性。具有选择性的异戊烯基转移酶将只能识别单一或有限数量的底物，相反非选择性(泛主的)异戊烯基转移酶将会识别许多的底物。

【0150】根据本发明的另一方面，提供了改变芳香异戊烯基转移酶的底物专一性的方法，所述的方法包括：

改变所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个活性位点上的残基，以致于改变活性位点的尺寸，使之足以能改变与芳香底物相关的所述的芳香异戊烯基转移酶的选择性，此底物被所述的芳香异戊烯基转移酶异戊烯化。

【0151】根据本发明的另一方面，提供了控制芳香异戊烯基转移酶供体专一性的方法，所述的方法包括：

改变所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个活性位点上的残基，以改变所述活性位点的尺寸，使之足以能够控制与异戊二烯基供体相关的所述芳香异戊烯基转移酶的选择性，此供体被应用于使芳香底物异戊烯化。

【0152】此处所使用的“供体专一性”指的是酶识别异戊二烯基供体的选择性。具有选择性的异戊烯基转移酶将只识别单一的或有限数目的异戊二烯基供体，相反非选择性的(泛主的)异戊烯基转移酶将会识别许多异戊二烯基供体。示例性的异戊二烯基供体包括二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP，C5)、异戊烯基二磷酸(IPP，C5)、香叶基二磷酸(GPP，C10)、法尼基二磷酸(FPP，C15)和类似物。

【0153】根据本发明的另一方面，提供了改变芳香异戊烯基转移酶供体专一性的方法，所述的方法包括：

改变所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个活性位点上的残基，以改变活性位点的尺寸，使之足以能够改变与异戊二烯基供体相关的所述芳香异戊烯基转移酶的选择性，此供体被应用于使芳香底物的异戊烯化。

【0154】根据本发明另外一个方面，提供了在一个计算机可读介质上的计算机程序，所述的计算机程序包括指令(instruction)，该指令使计算机根据芳香异戊烯基转移酶多数的原子坐标确定这种芳香异戊烯基转移酶或其片段。

【0155】根据本发明的另外一方面，提供了计算机，用于根据X射线衍射数据测定至少一部分的结构坐标，所述数据来源于芳香异戊烯基转移酶分子或分子复合物，或者所述的芳香异戊烯基转移酶分子或分子复合物的同系物，所述的计算机包括：

(i)计算机可读的数据存储介质，包括用机器可读的数据编码的数据存储材料，其中所述的数据包括至少一部分附录1中的结构坐标；

(ii)计算机可读的数据存储介质，包括用计算机可读数据编码的数据存储材料，其中所述的数据包含X射线衍射数据，该X射线衍射数据从芳香异戊烯基转移酶分子或分子复合物，或者所述的芳香异戊烯基转移酶分子或分子复合物的同系物得到；

(iii)工作存储器，用来储存处理所述的(i)和(ii)中的计算机可读数据的指令。

(iv)与所述的工作存储器和所述的计算机可读的数据存储介质(i)和(ii)相连的中央处理器，用来对(i)中的机器可读数据进行傅立叶变换，以及将(ii)中所述的计算机可读数据加工成结构坐标；和

(v)与所述的中央处理器相连的显示器，用于显示所述分子或分子复合物的所述结构坐标。

【0156】此处所使用的术语“计算机”可以由以下元件组成：中央处理器(例如，英特尔公司(Intel Corporation)的奔腾III(Pentium III)，或来自于Sun、摩托罗拉(Motorola)、康柏(Compaq)、AMD或国际商用机器(International BusinessMachines)的类似处理器，以及类似物)，工作存储器，它可以是随机存储器或磁心存储器(core memory)，大容量存储器(例如，一个或多个软盘驱动器、光盘驱动器或磁带，其上含有记录的数据)，至少一个显示终端，至少一个键盘以及其相随输入输出设备和连接线。典型的是，计算机包括处理、存储和操作输入数据的机制。专业技术人员能够很容易地鉴别当前可利用的计算机系统的任何一个是否是适合的。也应当意识到，该计算机能够连接到计算机网络或更宽区域的网络中的其他计算机系统上，从而将该计算机上含有的信息提供给集中访问(centralizedaccess)。

【0157】用于输入机器可读数据的预期的输入设备包括，例如，电话调制解调器线，电缆调制解调器，只读光盘(CD-ROM)，键盘或磁盘驱动器。有利的是，该计算机可以包括或被安装有从数据存储元件或输入装置读取数据的合适的软件，例如，适用于下面详细描述的理性的药物设计的计算机程序。预期的输出设备包括本领域已知的传统系统，例如，显示终端、打印机或者用于进一步存储输出的数据的磁盘驱动器。

【0158】本发明的实施方案包括系统(例如，基于因特网的系统)，尤其是能够存储和操作本文所描述的坐标和序列信息的计算机系统。图8以方块图的形式阐明了计算机系统100的一个例子。此处所使用的“计算机系统”指的是硬件元件，软件元件和用于分析如附录1中列出的坐标和序列的数据存储元件。典型的是，计算机系统100包括处理、存取(访问)和操作序列数据的处理器。处理器105可以是任何一种知名型号的中央处理器，比如，举例来说，英特尔公司(IntelCorporation)的奔腾III(Pentium III)，或来自于Sun、摩托罗拉(Motorola)、康柏(Compaq)、AMD或国际商用机器(International Business Machines)的类似处理器。

【0159】典型的是，计算机系统100是一般用途的系统，它包括处理器105和用于存储数据的一个或多个内部数据存储元件110，和获取存储在数据存储元件上的数据的一个或多个数据检索设备。专业技术人员很容易能鉴别出任何一个当前可利用的计算机系统是合适的。

【0160】在一个特殊的实施方案中，计算机系统100包括连接到总线(bus)上的处理器105，该总线被连接到主存储器115(更优的作为随机存储器(RAM)执行)和一个或多个内部数据存储设备110，比如硬件驱动和/或其他含有上面存储有数据的计算机可读介质。在某一些实施方案中，计算机系统100进一步包括了一个或多个数据检索设备118，用于读取存储在内部数据存储设备110上的数据。

【0161】数据检索设备118可以表示为，例如，软盘驱动器、光盘驱动器或磁带驱动器，能够与远程数据存储系统相连的调制解调器(例如，通过因特网)，以及类似物。在某一些实施方案中，内部数据存储设备100是一个可拆卸的计算机可读介质，比如软盘、光盘、磁带和类似物，其上含有控制逻辑和/或数据。计算机系统100可有利地包括合适的软件或程序设计有合适的软件，一旦插入数据检索设备，这些软件就能读取来自数据存储单元的控制逻辑和/或数据。

【0162】计算机系统100包括显示器120，它用于将输出显示给计算机使用者。也应当注意到，计算机系统100能被连接到网络或更广泛的网络里的其它计算机系统125a-c上，从而提供给计算机系统100以集中访问。

【0163】在执行当中，访问和处理附录1中的坐标和序列的软件，(例如，搜索工具、比较工具和模拟工具等等)，可以驻留在主存储器115。

【0164】随处都可以找到这样的计算机程序，它们能够能够执行模拟结构和底物所必需的活性，这是利用本文提供的晶体结构信息进行的。例子包括，但不限于，下面所列出的计算机程序：

Catalyst Databases^TM——一种信息检索程序，可以访问化学数据库，比如BioByte Master File，Derwent WDI和ACD；

Catalyst/HYPO^TM——建立化合物和假设的模型，以解释与候选药物结构有关的活性的变化；

Ludi^TM——通过鉴别和匹配互补极性和疏水基团，使分子适合蛋白质的活性位点；

Leapfrog^TM——在使用者的控制下利用设定参数的算法“生长”新的配体。

【0165】此外，根据此处的学说，各种一般用途的机器都可以用来执行编写的程序，或它可以更方便地构建更专业的装置来执行操作。但是，优选地，这是在程序化的系统上执行的一个或多个计算机程序中实施的。每个系统包括至少一个处理器，至少一个数据存储系统(包括易失性的和非易失性的的记忆和/或存储元件)，至少一个输入设备和至少一个输出设备。该程序在处理器上被执行以实现此处描述的功能。

【0166】提供了下面这些例子，以进一步阐明本发明的各个方面。这些例子是非限制性的，而且不应当被解释为限定了本发明的任何方面。

实施例

【0167】除非另外说明，所有的溶剂和试剂是从Aldrich化学公司(AldrichChemical Company)(Milwaukee，WI)得到的。

实施例1：ORF2的克隆

【0168】粘粒pCLC7(参见Takagi et al.，J Bacterid 182：41534157(2000))，其含有甲羟戊酸途径基因簇和侧翼区域，是从CL190克隆而得的，并被测序。Orf2的DNA序列通过标准的技术测定，被提出为SEQ ID NO：1。Orf2的氨基酸序列是从DNA序列中推导出来的，被提出为SEQ ID NO：2。

【0169】这个序列示出了在9.0kb-BamHI-BamHI DNA片段中的三个完全的orf1，即orf1、orf2和orf3，所述片段含有甲羟戊酸激酶和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(参见图6中的pCL3301)。为了推测每个orf的功能，进行了数据库检索。表2总结了检索结果。

表2

ORF	氨基酸	最同源的蛋白质及其登记号
ORF	氨基酸	最同源的蛋白质及其登记号	ORF1ORF2ORF3	319aa307aa410aa	阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)RNA聚合酶ECF-亚家族σ因子，AP005050天蓝色链霉菌A3(2)蛋白，AL391041抗生链霉菌(Streptomyces antibioticus)III型聚酮化合物合成

ORF4

177aa

霉，AB084489红梅素链霉菌(Streptomyces erythraeus)，AY078067

【0170】ORF2也表现出和前面所描述的4-羟苯丙酮酸：二甲基烯丙基转移酶，cloQ(登记号为AF329398)和novQ(登记号为AF170880)的序列相似性，这两个酶分别来自玫瑰产色链霉菌(Streptomyces roseochromogenes)和球状体链霉菌(Streptomyces spheroides)NCIMB11891(Pojer et al.，supra)。ORF3最有可能编码III型聚酮化合物合酶，它能产生THN。这些数据确认了ORF2编码香叶基转移酶，它催化香叶基转移到在ORF3的作用下产生的THN或THN衍生物上。

实施例2：ORF2基因的克隆、表达和提纯

【0171】来自链霉菌属某种的菌株CL190(GenBank登录号AB187169)的Orf2基因通过对来自CL190的全基因组DNA的PCR扩增而被克隆的，这当中使用了设计用于连接到大肠杆菌(E.coli)表达载体pQE30(Qiagen)中的寡核苷酸，以产生表达质粒pQEORF2。pQEORF2的PCR扩增，使用设计用于连接到大肠杆菌表达载体pHIS8(Jez et al.，Biochemistry 39(5)：890-902(2000))中的寡核苷酸，是使用正向引物序列：

5′-GGG GGG GGA TCC TCC GAA GCC GCT GAT GTC G-3′(SEQ ID NO：3；BamHl位点用下划线示出)，

和反向引物序列：

5′-GGG GGG GAA TTC TCA GTC CTC CAG CGA GTC G-3′(SEQ ED NO：4；EcoXI位点用下划线示出)，

来实施的，产生了表达载体pHIS8ORF2。pHIS8ORF2的构建物从Novagen(新属)被转化进入大肠杆菌BL21(DE3)。重组Orf2蛋白质是采用Jez et al.，supra之前所描述的标准实验方案获得和提纯的。硒代甲硫氨酸(Se-Met)-取代的蛋白质是采用甲硫氨酸途径抑制方法(Doublié，1 997)，从在M9基础培养基(minimal medium)中生长的大肠杆菌中得到的，并采用如天然蛋白质所描述的方法被提纯的。

实施例3：ORF2的结晶

【0172】Orf2蛋白质最初的晶体(50μm x 30 μm x 10μm)是在4℃下通过蒸汽扩散的方法得到的。2μl悬滴，含有15mg.ml^-1蛋白质和结晶缓冲溶液(28％[w/v]PEG 4000、0.3 M的硝酸镁、2 mM的DL-二硫苏糖醇(DTT)、0.1 M的PIPES，pH为8.5)的1∶1的混合物，经500μl同样溶液的储存液上方平衡过夜，产生细小的衍射晶体。更大的晶体是在同样条件下通过宏观种晶技术(macro-seedingtechnique)获得的。晶体短暂地浸泡在防冷冻溶液(28％[w/v]PEG 4000、15％(v/v)的甘油、0.3 M的硝酸镁、2 mM的DTT、0.1 M TAPS，pH为8.5)中以达到稳定，然后在收集数据之前在液氮中被闪冻。Orf2晶体属于P21212空间群，其平均的晶胞尺寸为a＝71、b＝92、c＝48、α＝β＝γ＝90°，而且每个不对称的晶胞内含有一个单体，溶剂的含量为45％。Se-Met取代的晶体是通过上面描述的方法得到的(Doublie，Methods Enzymol 276：523-30(1997))。各种复合物是将野生型的Orf2晶体浸泡在稳定溶液中得到的，所述稳定溶液含有5 mM GPP、10mM GSPP和40 mM 1，6-DHN、和10 mM GSPP和10mM淡黄霉素(GPP和GSPP是从阶梯生物科技有限公司(Echelon Biosciences Inc.)购买的)。

实施例4：结构的测定和精修(refinement)

【0173】多波长不规则散射(MAD)数据组是在美国Brookhaven NationalLaboratory，光线X8C上，从嵌入Se-Met的蛋白质晶体的硒边缘采集的。利用HKL2000(Otwinowski and Minor，Methods Enzymol 307-326(1997))处理数据，数据被缩减成单一组的索引强度(indexed intensities)，分辨率1.6。在BrookhavenNational Laboratory(BNL)(BNL)，European Synchrotron Facility(ESRF)和在Stanford Synchrotron Radiation Laboratory(SSRL)，在室内收集了各种复合物的单波长数据组(表1)。相位、密度的改变和自动建模是使用7个已识别的硒位点，采用下列程序组实施的：Solve/Resolve(Terwilliger，Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 58(Pt 11)：1937-40(2002)；Terwilliger and Berendzen，Acta Crystallogr DBiol Crystallogr 55(Pt 4)：849-61(1999))，从而提供了高质量的最初电子密度图。另外几轮建模和精修分别通过程序O(Jones，The O Manual，1993，Upsalla，Sweden)和CNS(Brünger，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54(Pt5)：905-21(1998))来完成的。该第一模型被用于通过利用AMoRe的分子置换来解析(resolve)各种复合物(Navaza，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57(Pt10)：1367-72(2001))。

实施例5：Orf2的异戊烯基转移酶活性的检测

【0174】所使用的基础反应缓冲液包含50mM HEPES(pH7.5)、5mM MgCl₂、5mM DTT(根据需要)，5mM的异戊二烯基受体(DHN1，DHN2和DHN3；参见图2B)，和任选地5 mM FPP or GPP，总体积为20μl。通过向基础的实验混合物中加入20μg的ORF2蛋白质，开始反应(对照除外)。在室温下被温育4h后，反应混合物用SpeedVac干燥，干燥好的残余物被点到硅胶的TLC板上。此板用氯仿和甲醇(15-30∶1)展开。在紫外光254nm处，检测反应产物。

【0175】在异戊二烯基受体DHN1和DHN2，以及异戊二烯基供体FPP或GPP的情况下，观察到异戊烯基转移酶活性。对于异戊二烯基受体DHN3，在GPP情况下，观察到异戊烯基转移酶活性。

【0176】对于ORF2和(a)1，6-DHN(2)，(b)2，7-DHN(3)，(c)大豆黄素(7，4’-二羟异黄酮，5)，(d)染料木黄酮(5，7，4′-三羟基异黄酮，8)，(e)柚(苷)配基(5，7，4′-三羟黄烷酮，9)，(f)油橄榄醇(12)和(g)白藜芦醇(3，4′，5-三羟基芪，13)，进行了另外的实验。这些异戊二烯基受体给出了下面的反应产物：

(a)5-香叶基-1，6-DHN和2-香叶基-1，6-DHN；

(b)1-香叶基-2，7-DHN和1，6-二香叶基-2，7-DHN；

(c)7-O-香叶基-大豆黄素；

(d)7-O-香叶基-染料木黄酮；

(e)6-香叶基-柚(苷)配基和7-O-香叶基-柚(苷)配基；

(f) 2-香叶基-柚(苷)配基和4-香叶基-油橄榄醇，和

(g)4-香叶基-白藜芦醇。

实施例6：Orf2的Mg ²⁺ 依赖性异戊烯基转移酶活性

【0177】所使用的基础反应缓冲液包含50mM HEPES(pH7.5)、5mM DTT(根据需要)、5mM的异戊二烯基受体、DHN2和5mM GPP，总体积为20μl。含有镁元素的反应混合物含有5mM MgCl₂。通过向基础实验混合物中加入20μg的ORF2，开始反应(对照除外)。在室温下被温育4h后，反应混合物用SpeedVac干燥，干燥好的残余物被点到硅胶的TLC板上。此板用氯仿和甲醇(15-30∶1)展开。在紫外光254nm处检测反应产物。

【0178】反应混合物中镁存在的情况下，异戊烯化的产物很容易被观察到，然而反应混合物中不存在镁的情况下，观察不到异戊烯化的产物。

实施例7：ORF2与不同的类黄酮化合物和其它化合物的泛主活性

【0179】所使用的基础反应缓冲液包含50mM HEPES(pH7.5)、5mM DTT(根据需要)、5mM MgCl₂、0.1mM的每一种异戊二烯基受体、0.1mM GPP和0.01mM的[¹⁴C]GPP，总体积为20μl。通过向基础实验混合物中加入20μg的ORF2蛋白质，开始此反应(对照除外)。在室温下被温育4h后，反应混合物用SpeedVac干燥，干燥好的残余物被点到硅胶的TLC板上。此板用氯仿和甲醇(15-30∶1)展开。反应产物用磷酸显影剂检测。检测到的化合物有大豆黄素、非瑟酮、芒柄花素、染料木黄酮、柚配[苷]基、4-HPP和DHN2。

【0180】对于每一个测试的异戊二烯基受体，都很容易能观察到异戊烯化的产物。

实施例8：链霉菌属某种的菌株CL190中的ORF2敲除突变体

【0181】为了考察ORF2的功能，通过orf2的移码突变(frame-shift mutation)构建了ORF2敲除突变体。这样，含有orf2的9.0 kb-BamHI-BamHI DNA片段被克隆入pUC1 18(Takara，Kyoto，Japan)的BamHI位点，pUC118是E.coli的载体。得到的质粒pCL3301用EcoRI消化，然后3.5-kb EcoRI-EcoRI DNA片段被克隆入pUC118的EcoRI位点，产生pCL3301E3。此外，pCL3301中的2.0-kb BamHI-EcoRIDNA片段，被克隆入pBluescript(Takara，Kyoto，Japan)的BamHI-EcoRI位点，产生pCL3301E2。pCL3301E3用BglII消化，其识别位点在靶orf2，然后用T4 DNA聚合酶(Takara)进行平末端化。接着，这个平末端的DNA片段进行自连接，产生pCL3301E3Bg，它含有带有移框突变的orf2。从pCL3301E3Bg剪切下来的3.5-kbEcoRI-EcoRI DNA片段，被克隆入pCL3301BE2的EcoRI位点，产生pBluedORF2。最后，5.0-kb XbaI-KpnI片段，其两个识别位点均在pBluedORF2载体上，被连接到pSE101的同一个位点上(参见Dairi et al.，Biosci Biotechnol Biochem59：1835-1841(1995))，产生pSEdORF2，其中pSE101是链霉菌属-大肠杆菌穿梭载体。

【0182】用pSEdORF2转化链霉菌属某种的菌株CL190(正如Kieser等人在″Practical Streptomyces Genetics″，eds.The John Innes Foundation，Norwich(2000)，General considerations about gene cloning in Streptomyces.pp.211-228中所描述的)，然后在含有20μg/ml的硫链丝菌肽的R2YE板上选出想要的转化体。接着，这种转化体在含有20μg/ml的硫链丝菌肽的SK2液体培养基中30℃下培养三天。如先前Kieser等人描述的，从该转化体的菌丝体制备原生质体，并在没有硫链丝菌肽的R2YE培养基中被再生。每个再生的菌落同时接种在有或没有硫链丝菌肽的Bennet板上，然后从中选出对硫链丝菌肽敏感的菌落，从而得到ORF2敲除突变体，链霉菌属某种额菌株CL190 dORF2-8。通过PCR技术确认该突变体实际上含有orf2中的移码突变(图7)。

【0183】按照Shin-ya等人在J.Antibiot.(Tokyo)43，441-447(1990)所报道的，培养构建突变体和CL190。通过离心收获酶令素菌(myceria)，然后CL190产生的萘萜二醇(naphterpin)采用与以前报道的同样方法((Shin-ya et al.，supra))从CL190酶令素菌中萃取出来。这种突变体的酶令素菌也采用同样的方法萃取出来的。按照前面描述的方法，将这两种萃取物在硅胶-薄层层析仪(TLC)上进行分析。分析结果是，在CL190的萃取物中检测到了萘萜二醇(naphterpin)，而在突变体的萃取物中没有检测到(图7)。此结果明确表明ORF2对于萘萜二醇(naphterpin)的生物合成是必需的。

实施例9：数据库检索

【0184】序列和结构同系物的数据库检索可以借助以下软件执行：PSI-BLAST和VAST(经因特网可在万维网网址″ncbi.nlm.nih.gov″获得)，SSM和DALL(经因特网可在万维网网址″ebi.ac.uk/msd-srv/ssm″获得)，CE(经因特网可在万维网网址″cl.sdsc.edu/ce.html″获得)和DEJAVU(经因特网可在万维网网址″portray.bmc.uu.se/″获得)，在下列文库中检索：蛋白质数据库(Protein Data Bank)(经因特网可在万维网网址″rcsb.org/pdb/″获得)，蛋白质结构分类库(StructuralClassification of Proteins)(SCOP，经因特网可在万维网网址″scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop″获得)，和CATH蛋白质结构分类库(CATH Proteinstructure classification)(经因特网可在万维网网址″biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath″获得)。

实施例10：建模

【0185】用Orf2作为模板，利用Modeller-4软件包(SaIi et al.，Proteins23(3)：318-26(1995))，建立了CloQ/NovQ和Hypsc的模型(参见图6)。对于每一条序列，计算并评估了五种不同的模型。然后根据Orf2结构与不同模型的叠合，对多序列比对(联配)进行手动修订。接着再次运行Modeller，如果需要，对反复产生的模型进行视觉检测并调整。模型的质量通过PROCHECK进行评估(参见Laskowski，et al.，J Appl Cryst 26：283-291(1993))。列出了不同活性位点之间呈现潜在的显著变异的侧链，并作了标记。不同模型中的保守残基包括Asp110、Lys119、Asn173、Br175、Br216和Arg228，其中清楚起见仅列出了Asp110和Arg228。

实施例11：CloQ/NovQ和HypSc模型的比较

【0186】尽管活性位点残基显著的对应程度与同系物模型的正确性(有效性)相一致，但主要活性位点残基上的微小但重要的差异就为CloQ/NovQ的较短异戊二烯基链长专一性以及芳香底物选择性的差别提供了原因(Pojer et al.，supra)。此外，Hypsc的同系物模型与该推定的蛋白质内的异戊二烯基的链长专一性的假设相一致。Tyr121，其涉及到Orf2中GPP的结合，在所有的其他序列中被Trp(CloQ/NovQ中的115，和Hypsc中的117)取代：模拟的环的方位与Tyr是相同的，尽管增加的巨大体积可以更好地隐蔽DMAPP的较短的C5异戊二烯基链。Ser64和Gly286，其分别被Arg(CloQ/NovQ中的59，和HypSc中的61)和Glu(CloQ/NovQ/HypSc中的274)所取代，看似容易(poised)形成其内部盐桥，此盐桥精确地位于GPP分子的第二个C5异戊二烯单元的上方，GPP分子在实验中位于Orf2的活性位点上。在Hypsc异戊烯基转移酶模型中观察到的相同的变化预测了这种酶也将会将DMAPP用作异戊二烯基供体。显著地，在Orf2中，GPP分子的香叶基链的末端紧挨着圆筒的开口，这就为Orf2能够容纳FPP单元的C15异戊二烯基链提供了可能的原因。

【0187】此外，Orf2与CloQ/NovQ和HypSc模型的结构联配揭示了Orf2需要二价阳离子的分子决定因素。Asp62，其通过配位的Mg²⁺离子直接参与Orf2对二磷酸根的结合，在Hypsc中被Asn保守性所取代，而在CloQ/NovQ中变成了Ser57。以一种互补的方式，Orf2中的Ser51在CloQ/NovQ中被带正电的Lys47所取代，在HypSc中是被带正电的Arg47取代；在Orf2中观察到，这两种取代，具有很小的旋转异构体重排，能够位于Mg²⁺离子的上方。而且，这些基本的侧链安放在这里，理想上是为了对GPP分子的带负电的α-磷酸根产生静电结合。然而，Asp110，其通过水分子间接参与结合Mg²⁺离子，在所有被检测的序列中是保守的(图1B)；这就解释了为何CloQ和NovQ在不存在Mg²⁺离子的情况下具有活性，但是在存在2.5mM Mg²⁺离子的情形下表现出最大的活性(Pojer et al，supra)。与CloQ对4-HPP的专一性相关，Orf2的Gln161和Ser177，在CloQ中被Arg153和169所取代，并且被安置以便有可能结合4-HPP底物的带负电的尾链。

【0188】该分析让人能够预测HypSc酶是否是异戊烯基转移酶，仅接受DMAPP作为底物，然而不需要Mg²⁺来获得其活性；基于此同系物模型的假设已经通过HypSc的克隆、蛋白质表达和酶学测定而得到证实(参见图7)。

表3

晶体学数据、相位和精修统计表

数据组	SeMet-Orf2			Wt+TAPS	Wt+GPP	Wt+GSPP+1.6-DHN	Wt+GSPP+淡黄霉素
	SeMet-Orf2							λ1(inf，minf”)	λ2(峰值，minf’)	λ3(远程的)
	光线波长()空间群晶胞，a，b，c()分辨率()外壳(l砧t shell)()观察资料全部的^a个别的^a冗余^a，b完全度^a，b(％)I/σI^bRsym^b，c(％)硒位点的编号FOM^d中心的偏心的	BNL-X8C0.9793P2121271.3，91.2，48.350-1.551.61-1.55156510868281.8(1.9)98.2(98.2)15.3(2.2)7.4(49.9)	BNL-X8C0.97915P2121271.4，91.2，48.450-1.551.57-1.52162052913361.8(1.5)97.5(91.1)14.7(1.7)6.6(48.3)70.570 55					λ1(inf，minf”)	λ2(峰值，minf’)	λ3(远程的)	BNL-X8C0.9641P2121271.3，91.1，48.350-1.501.55-1.50170494952741.8(1.5)98(94.8)14.3(1.7)7.2(55.7)	BNL-X6A0.934P2121271.3，91.2，48.350-1.451.42-1.40139582493902.84(1.94)78.3(50.4)37.34(38 9)9.7(51.5)	Salk Inst1.54178P2121274.6，91.9，48.899-2.252.29-2.2570572161554.4(4.2)98(99.9)13.5(2.5)8.6(54.8)	ESRF-BM30A0.9797P2121271.3，90.2，47.599-1.952.00-1.95115225229605.0(5.1)99.5(99.6)32.3(35.5)8.6(51.2)	SSRL-9.1P2121273.6，91.6，48.650-2.022.09-2.02110252217904.5(5.0)99.1(99.5)31.9(38.0)9.0(57.2)
R_晶体 ^e/R_游离 ^f(％)遗失的残基数蛋白质的原子数水分子结合的离子^g底物和/或粘合剂的原子数^hRm.s.i键长()Rm.s.d.键角(°)平均B-因子(²)蛋白质水底物和/或结合剂					21.42 (24.22)2322254000.0051.213.622.80		23.0(25.8)623324290150.0051.216.227.720.5	22.25(25.1 )523382053190.0061.228.235.367.4	24.1(27.1)62332346310.0061.243.542.552.5	23.0(26.8)623323203320.0071.129.442.641.0

^a对于SeMet数据组，当计算独特的反射和完整度的个数时，F⁺和F^-被认为是不等价的

^b括号内的数是对于最高分辨率的外壳来说的

^cRsym＝∑_h|I_h-<I_h|/∑_h(I_h)，其中<I_h>是对称性的均等反射的平均强度。

^dFOM是价值指数

^eR_晶体＝∑||F_obs-F_calc|/∑| F_obs |，其中加和是针对精修所使用的数据来说。

^fR_游离因子是使用排除精修数据之后的5％数据(测试组)计算得到的R_c晶体。

^g离子键指的是Mg²⁺，(NO₃)^2-离子

^h底物和/或结合剂原子指的是TAPS，GPP，GSPP和1，6-DHN，GSPP和淡黄霉素分子。

【0189】因而，表3总结了结构特征，伴随有异戊二烯基链长度的测定，芳香底物的选择性和异戊二烯基基团的转移机理，这是通过得到四种Orf2底物/底物类似物的复合物的X射线晶体结构而测得的，即复合有TAPS缓冲剂分子的Orf2，含有GPP和Mg²⁺的二元Orf2复合物，带有非水解性的GPP类似物、GSPP、Mg²⁺和1，6-DHN的三元Orf2复合物，和带有GSPP、Mg²⁺和淡黄霉素的三元Orf2复合物。

实施例12：hypSc的异戊烯基转移酶活性的检测

【0190】实施例5中所描述的实验用hypSc和下述物质重复进行：(a)1，6-DHN(2)、(b)2，7-DHN(3)、(c)大豆黄素(7，4’-二羟异黄酮，5)、(d)染料木黄酮(5，7，4′-三羟基异黄酮，8)、(e)柚(苷)配基(5，7，4′-三羟黄烷酮，9)、(f)油橄榄醇(12)，和(g)白藜芦醇(3，4′，5-三羟基芪，13)。这些异戊二烯基受体产生了以下反应产物：

(a)5-二甲基烯丙基-1，6-DHN；

(b)1-二甲基烯丙基-2，7-DHN；

(c)没有检测到反应产物；

(d)没有检测到反应产物；

(e)6-二甲基烯丙基-柚配基；

(f)2-二甲基烯丙基-油橄榄醇和4-二甲基烯丙基-油橄榄醇，和

(g)4-二甲基烯丙基-白藜芦醇。

实施例13：来自海洋放射菌的混合类异戊二烯的生物合成

【0191】有PTases Orf2和HypSc在手头，就能够鉴别出具有不同底物专一性的另外的放射菌类PTases。为了达到这个目的，汇编了一组能产生多种混杂类异戊二烯天然产物的海洋放射菌(参见图1B，表4)。

表4

菌株	产混杂类异戊二烯的放线菌
	产混杂类异戊二烯的放线菌				天然产物	连接	异戊二烯	芳香底物
	链霉属某种CL190CNB632	萘萜二醇海洋霉素(marinione)+类似物	CC	GPPFPP	天然产物	连接	异戊二烯	芳香底物	羟基萘羟基萘

CNH099CNQ525CNQ509S.purpeofuscus

海洋霉素新海洋霉素(neomarinione)熏衣草花青苷Q525.518Q509.364Q509.366aestivophoenins

CCNCx2OCN和C

FPPFPPGPPDMAPP/GPPGPPFPPDMAPP

羟基萘羟基萘吩嗪羟基萘吩嗪硝基吡咯吩嗪

【0192】菌株CNH099生产三种类异戊二烯化学类型，即法尼基化的萘萜二醇类似物海洋霉素、重排的衍生新海洋霉素和lavanducyanin。用标记前体进行的饲养实验描绘了这些代谢产物的生物合成过程。在海洋霉素之间的萘醌核共同体的生物合成必须通过一个对称性的pantaketide中间体来进行，比如THN，以满足所观察到的标记模式。淡黄霉素，THN的一种已知的自氧化产物，其通过S-腺苷甲硫氨酸直接键合或甲基化到C10上，可以在新海洋霉素生物合成中充当中间体。FPP，由MEP途径衍生得到，提供了类半倍萜烯侧链。异戊烯化可以经通过连接FPP的C3的C-异戊烯化而直接发生，或者也可间接地通过淡黄霉素C5或C7-羟基的O-异戊烯化而进行，接着是克莱森(Claisen)重排，产生了同样的呋喃中间体。质子协助的线性二烯的环化作用，接着进行Wagner-Meerwein重排，产生新海洋霉素。

【0193】对各个生物合成基因簇的初步搜索，允许在大肠杆菌-链霉菌的穿梭粘粒pOJ446中产生粘粒文库，允许在此菌株中开发出用于同源重组基因系统，所述同源重组涉及基于pKC1139的温度敏感型质粒从E.coli接合转移到CNH099，和允许对编码THN和吩嗪生物合成的基因进行序列分析。此外已经制备了越夏绯红霉素(aestivophoenin)生产者Streptomyces purpeofuscus的一个pOJ446粘粒文库。此信息对于新型芳香PTases的鉴别和克隆是有用的。

实施例14：复合到香叶基化产物上的Orf2的X射线晶体结构

【0194】分别与GPP和1，6-DHN以及萘萜二醇进行温育的Orf2的反应产物，已经分别被鉴别为反式-5-香叶基-1，6-DHN/反式-2-香叶基-1，6-DHN和6-香叶基-萘萜二醇/7-O-香叶基-萘萜二醇(参见图2B)。这些化合物的大规模生产能在体外进行，使用本文所描述的500uL反应体积的实验缓冲液并加入了20-50mM的GPP和20-50mM的1，6-DHN或(2S)-萘萜二醇。培育过夜，得到的溶液的样品用HPLC-MS进行分析，来估计其产量和反应程度。多个反应能结合在一块进行(大约1-10个单反应)，每次萃取用等体积的乙酸乙酯，进行两次，合并有机萃取物进行干燥，然后溶解在最小量的甲醇中，紧接着注入到高效液相(HPLC)中，在制备型反相柱中提纯。然后对提纯的产物进行表征。纯化的反式-5-香叶基-1，6-DHN、反式-2-香叶基-1，6-DHN、6-香叶基-萘萜二醇和7-O-香叶基-萘萜二醇能够溶解在100％的乙醇或甲醇中，接近饱和(大约100-200mM)。这四种Orf2产物复合物中的每一种均能通过共结晶和浸泡的策略来制得。为了确保Orf2晶体中最大的产物含量，共结晶和浸泡这两种方法均利用了栅格(grid)，这样各个产物的浓度在5到25 mM之间变化。

实施例15：创造能有效利用DMAPP的Orf2突变体并在DMASPP和1，6-DHN的存在下阐明其三维结构

【0195】为了进一步确定异戊二烯基二磷酸链长的选择性、芳香底物识别的分子决定因素和二价阳离子的依赖性，借助Orf2的三维坐标作为结构模板，对CloQ、NovQ和HypSc序列进行同源物建模(图6)。尽管活性位点残基的对应性(相应性)程度与上面所讨论的同源物模型相一致，主要活性位点残基上的细小的差别可以解释CloQ/NovQ的较短异戊二烯基的链长专一性以及芳香底物选择性的差别。另外，来自蓝色链霉菌的一种新鉴定的PTase的同源物模型，HypSc，引起了作为DMAPP-专一性的、不依赖于Mg2+离子的一种PTase的HypSc的生物化学表征。HypSc中的异戊二烯基链长依赖性可以采用多种方法来评价。一种方法涉及到产生一组有限的定点突变体，这基于在图6中所示的CloQ/NovQ和HypSc的初始同源物模型。另一种方法涉及产生若干1024成员突变体文库，其含有所有可能的氨基酸排列，它们是由Orf2与HypSc或CloQ/NovQ的对比分析得到的，而且它们位于以前所描述的香叶基结合位点的中心。

【0196】第一组Orf2突变体可以采用传统的QuickChange方案来构建。特别地，Trp残基(在CloQ/NovQ中的残基115和HypSc中的残基117)取代Orf2中的Br121。与Orf2中的酚环相比，HypSc/CloQ/NovQ中的吲哚环所增加的体积可以更好的容纳DMAPP较短的C5异戊二烯链。此外，在HypSc/CloQ/NovQ中，Arg和Glu残基分别取代Orf2中的Ser64和Gly286(CloQ/NovQ中的残基59和274，HypSc中的残基61和274)。在DMAPP-专一性的PTases中的这个明显的盐桥在GPP分子的第二个异戊二烯单元的位置上方建立平衡。显然，在HypSc的同源物模型中的这个变化，引起了对作为DMAPP专一性的PTase的新发现的蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)酶进行生物化学表征。这个对酶工程有相当指导性的方法使得相邻残基对异戊二烯基链长度的测定的潜在影响降到了最小。如果这个诱变策略不能明显地改变Orf2的异戊二烯基的链长专一性，一个更大的突变体Orf2文库能够通过实施例17中所描述的SCOPE方法来制备。

【0197】比较性同源物建模，其常用于初步选择残基以进行进一步的功能检查，是使用Orf2作为结构模板，采用软件包Modeller-4来执行的。随着新序列被鉴别，能够建立另外的模型。对于每一个序列，有五种不同的模型被计算和评估。然后根据Orf2结构与单个模型的重叠，对多序列联配进行手工修改。然后重新运行Modeller-4，如果需要，再次视觉检查和调整反复产生的模型。模型的质量采用PROCHECK来评价。

实施例16：定量PTase动力学分析的开发

【0198】为了测定PTases的稳态动力学参数，能够采用辐射TLC分析(radiometric TLC assay)。考虑使用的典型的反应缓冲液是由50mM的HEPES(pH 7.5)，0.1-10mM的芳香受体，0.1-5 mM的[¹⁴C]-DMAPP、[¹⁴C]-GPP或[¹⁴C]-FPP(New England Nuclear)和5mM的MgCl₂组成，其终体积为20μl。通过向试验混合物中加入10ng-5μg的PTase，反应开始。能够选择酶的浓度范围，以达到最优的PTase浓度，其遵循Michaelis-Menten动力学。进行温育，在1-120的初始时间范围内采集4-6个时间点，每个点采集三份。可以用乙酸乙酯结束反应。萃取物能够被蒸干，再溶解于甲醇，然后应用到Whatman LK6D TLC硅胶板上。TLC板可以用氯仿/甲醇(20∶1)溶剂混合物展开。芳香反应产物能在254nm处被检测或借助成像板采用自动射线照相术检测。产物能够定量分析，这是如下进行的：将TLC板刮下来的那部分放到科勒姆闪烁液(Ecolume scintillation fluid)中，用闪烁计数器检测[¹⁴C]的放射性，并采用[¹⁴C]-DMAPP，[¹⁴C]-GPP or[¹⁴C]-FPP的最终特异放射性将修正的cpm转换成产物的纳摩尔(nmol)数。可以从最初的速度测量中测定动力学常数，其中产物的形成与所监控的时间段(对于低活性的PTase或其突变体，最长可达两小时)呈线性关系。考虑到应用了两种底物，用饱和浓度(典型的是50mM)的芳香受体来确定异戊二烯基供体的K_M值，用饱和浓度(典型的是50mM)的异戊二烯基供体来确定芳香受体的K_M值。为了达到50mM的异戊二烯基供体，用冷的DMAPP、GPP或FPP将放射性样品稀释至50mM，并进行了适当的稀释修正。

实施例17：基于UPLC-MS的快速定性分析，其用于监控异戊二烯基团的转移

【0199】一种有效的分析技术，对于异戊烯化反应的定性(或半定量)分析来说是合乎需要的。特别地，要被监控的生物合成转化包括野生型以及突变体PTase的天然底物或非天然底物的异戊烯化(通过IPP、GPP和FPP)。这种分析的效率是根据速度、分辨率和灵敏度来定义的。对于评价若干1024突变体文库来说，此分析必须含有很大数目的样品(高通量)，而且必须提供对小体积(亚毫升)的反应体积的分析(考虑到反应的数量和试剂的相关费用)。除了利用对类异戊二烯二磷酸的选择性来筛选相对于天然底物的这些酶以及酶文库之外，关于各种非天然底物，此筛选可能也是合乎需要的，所述的非天然底物被设计用于探究结构与反应的关系，这两者的关系控制着化学结构单元的区域专一性的异戊烯化作用。最后，考虑到已确定的Orf2的泛主性和其能产生多个产物，这个分析也必须分辨和鉴定每个反应的多个异戊烯化的种类。

【0200】考虑到这些要求，与ESCi质谱仪(UPLC-MS)偶联的超高效液相色谱(UPLC-MS)已经被认为是一种能满足以上分析要求的合适技术。简单地说，UPLC是分析技术领域的最新进展。当柱长被标准化时，相对于使用5 μm颗粒的标准高效液相色谱(HPLC)，这种新的1.7μm颗粒技术，连同其接近15000 psi的操作压力，一起使得能够得到1.7×分辨率、3×速度和1.7×灵敏度。然而，当将分辨率标准化(L/dp)时，实现了此技术最大的好处；相对于传统的HPLC 5μm颗粒，此处得到的是1×的分辨率、9×的分析速度和三倍的灵敏度。在分析速度和灵敏度方面的这些显著变化对于达到定性分析是有益的。

【0201】对于方法的开发来说，此平台另外一个好处源于分析时间缩短了五倍。更适宜地，这些试验是用微孔板(96或384-孔格式)来进行的，PTase、类异戊二烯二磷酸和芳香底物依次从储备液中加入到板上，且在此板上混合。突变体酶的文库很方便地利用小规模(5-10ml)的培养和自动的Qiagen机器人进行平行纯化，该机器人用于组氨酸标记的蛋白质的平行纯化。达到最优的反应时间之后，反应停止，并被加载到UPLC样品识别器或管理器中，进行分析。目标操作参数包括LC运行时间<5min(短至1min的运行时间是可以得到的)以及停止后的反应产物的直接注射，以消除样品损失问题。如果直接注射对于高通量生产来说是不可行的，就可以包含一个用极性较低的有机溶剂而进行的萃取步骤，然后样品可以从反应孔的上层直接提取，甚至有时被覆盖以解决任何蒸发和随后的样品浓度问题。

【0202】最终，可以通过引发MS采集的二极管阵列UV检测来实现产物的检测。因为像0.1μl这么低的注射体积是可能的，而且保留(滞留)时间如此短，每个样品小于5ml的总体积通过ESCi MS直接运行，以确保所有的峰值被检测到。存在很明显的离子信息时，对异戊烯化的产物的检测将会很容易。Mass Lynx数据管理系统允许数据自动分析，通过预先规定的产物质量表快速鉴别出有意义的峰。

实施例18：结构的阐明

【0203】大规模的体外反应和全细胞发酵均能直接在Waters 600 HPLC或Agilent 1100 HPLC上分析，这些仪器装备有发光二极管阵列检测(photodiode arraydetection)(PDA)、自动取样和组分收集。使用YMC ODS-AQ 4.6 x 150mm的反相柱进行分离，反相柱具有线性溶剂梯度，溶剂为水至甲醇中的0.15％TFA，其流速为0.5ml/min，进行30min。可选择地，样品首先用乙酸乙酯萃取，在MgSO₄上干燥，过滤，干燥和在甲醇中再次溶解以待分析。在可能的情况下，色谱峰是通过与可信的标准物共注射而识别出的。在装备有PDA检测器和一个可用于低分辨率物质分析的在线MicroMass ZQ ESCi(组合的APCI-ESI)质谱仪的WatersAquity UPLC上，可以进行自动筛选。纯组分的分离可以用20 x 250mm YMC填充ODS-A HPLC柱对预分组样品来进行，此色谱柱能在高达10ml/min的流速下运行。

【0204】在Bruker DRX-300和DRX-600光谱仪或者Varian Unity Inova 500光谱仪上，通过1D和2D-NMR光谱术，能够阐明纯的代谢物的结构。质子和碳的排列能够从COSY、HSQC、HMBC和nOe光谱数据中得到。同核的¹H连接物(连接，connective)能通过相位灵敏的、双量子过滤的COSY实验(double-quantumfiltered COSY experiment)测定的。单键的异核¹H-¹³C连接物能通过梯度增强的质子检测的HSQC实验(gradient-enhanced proton-detected HSQC experiments)来测定。双键或三键的¹H-¹³C连接物能通过梯度增强的质子检测的HSBC实验来测定。同核的¹H nOe能够通过差别nOe实验(difference nOe experiment)和二维ROSEY实验(two-dimensional ROESY experiment)得到，以产生相对立体化学，然而新化合物的绝对立体化学经常能通过修改的Mosher分析方法或单晶X射线分析完成。适当的时候，标记有稳定同位素(例如醋酸[1，2-¹³C₂]钠或[U-¹³C₆β]葡萄糖)的生物合成中间体能够被施用于培养物，有助于通过¹³C INADEQUATE或相关的实验进行类似物鉴定。通过TOF-ESI(TSRI质谱实验室(TSRI Mass SpectroscopyLaboratory))或FAB能够进行高分辨率的物质测定。其他的表征技术包括旋光测定法(Polarimetry)(Perkin-Elmer 341 Polarimeter)和傅立叶转换红外光谱术(Fourier-Transform Infrared Spectroscopy)(NicoletFT-IR)。

【0205】虽然通过参考本发明的某些优选的实施方案，已经详细的描述了本发明，但是应该理解的是，对其更改或改变都在本发明所描述和权利要求的精神和范围内。

附录1

程序：CNS1.1

作者：BRUNGER，ADAMS，CLORE，DELANO，GROS，GROSSE-KUNSTLEVE，JIANG，KUSZEWSKI，NILGES，PANNU，READ，RICE，SIMONSON，WARREN

在精修中使用的数据：

分辨率范围高值(RESOLUTION RANGE HIGH)(ANGSTROMS)：1.95

分辨率范围低值(RESOLUTION RANGE LOW)(ANGSTROMS)：29.74

数据截止值(DATA CUTOFF)(SIGMA(F))：0.0

数据截止高值(DATA CUTOFF刚GH)(ABS(F))：1386159.12

数据截止低值(DATA CUTOFF LOW)(ABS(F))：0.000000

完全性(工作+测试)(COMPLETENESS(WORKING+TEST))(％)：99.4

反射数(NUMBER OF REFLECTIONS)：22923

对在精修中使用的数据进行拟合(FIT TO DATA USED IN REFINEMENT)：

交叉确认法(CROSS-VALIDATION METHOD)：全部

自由R值测试设置的选择(FREE R VALUE TEST SET SELECTION)：随机

R值(工作设置)(R VALUE(WORKING SET))：0.241

自由R值(FREE R VALUE)：0.271

自由R值测试设置大小(FREE R VALUE TEST SET SIZE)(％)：5.0

自由R值测试设置计数(FREE R VALUETESTSETCOUNT)：1154

自由R值的估计误差(ESTIMATED ERROR OF FREE R VALUE)：0.008

在最高分辨率接收器内的拟合(FIT INTHE HIGHEST RESOLUTION BIN)：

所使用的接收器的总个数(TOTAL NUMBER OF BINS USED)：6

接收器分辨率范围高值(BINRESOLUTION RANGE HIGH)(A)：1.95

接收器分辨率范围低值(BIN RESOLUTION RANGE LOW)(A)：2.07

接收器完全性(工作+测试)(BIN COMPLETENESS(WORKING+TEST))(％)：99.7

接收器中的反射(工作设置)(REFLECTIONS IN BIN(WORKING SET))：3569

接收器R值(工作设置)(BIN R VALUE(WORKING SET))：0.352

接收器自由R值(BIN FREE R VALUE)：0.386

接收器自由R值测试设置大小(BIN FREE R VALUE TEST SET SIZE)(％)：4.9

接收器自由R值测试设置计数(BIN FREE R VALUE TEST SET COUNT)：184

接收器自由R值的估计误差(ESTIMATED ERROR OF BIN FREE R VALUE)：0.028

在精修中使用的非氢原子的个数：

蛋白质原子：0

核酸原子：0

异型杂原子：0

溶剂原子：0

B值：

来自 WILSION 曲线(A**2)：25.5

平均的B值(全部，A**2)：43.5

全部各向异性B值

B11(A**2)：-3.35

B22(A**2)：-13.96

B33(A**2)：17.30

B12(A**2)：0.00

B13(A**2)：0.00

B23(A**2)：0.00

大量溶剂建模(BULK SOLVENT MODE LING)：

所使用的方法：平面模型

KSOL：0.355809

BSOL：42.5443(A**2)

估计的配位误差(ESTIMATED COORDINATE ERROR)：

来自LUZZATI曲线的ESD(A)：0.30

来自SIGMAA的ESD(A)：0.35

低分辨率截止值(LOW RESOLUTIION CUTOFF)：(A)：5.00

交叉-确认的估计配位误差(CROSS-VALIDATED ESTIMATED COORDINATE ERROR)：

来自C-V LUZZATI 曲线的ESD(A)：0.35

来自C-V SIGMAA的ESD(A)：0.36

来自理想值的RMS偏差(RMS DEVIATIONS FROM IDEAL VALUES)：

键长(A)：0.006

键角(度)：1.2

两面角(度)：24.4

假角(度)：0.89

各向同性热量模型(ISOTROPIC THERMAL MODEL)：受限制的各向同性热量因子限定(ISOTROPIC THERMAL FACTOR RESTRAINTS).RMS SIGMMA

主链键 (A**2)：无效；无效

主链键角 (A**2)：无效；无效

侧链键 (A**2)：无效；无效

侧链键角 (A**2)：无效；无效

NCS模型：无

NCS限定 RMS SIGMMA/重量

组1的位置(A)：无效；无效

组1的B-因子(A**2)：无效；无效

参数文件(PARAMETER FILE)1：CNS_TOPPAR/protein_rep.param

参数文件2：CNSJTOPPAR/diia-rnLrep.param

参数文件 3：CNSJTOPP AR/water_rep.p3ram

参数文件4：CNSJTOPP AR/ion.param

参数文件5：CNSPAR：gspp_dhn2_no3.param

拓扑文件(TOPOLOGY FILE)1：CNSJTOPP AR/protein.top

拓扑文件2：CNS JTOPP AR/dna-ma.top

拓扑文件3：CNSJTOPPARAvater.top

拓扑文件4：CN SJTOPP AR/ion.top

拓扑文件5：CNSPAR：gspp_dhn2_no3.top

其它的精修标记：无效

SEQRES 1A 514 GLU ALA ALA ASP VAL GLU ARG VAL TYR ALA ALA MET GLU

SEQRES 2A 514 GLU ALA ALA GLY LEU LEU GLY VAL ALA CYS ALA ARG ASP

SEQRES 3A 514 LYS ILE TYR PRO LEU LEU SER THR PHE GLN ASP THR LEU

SEQRES 4A 514 VAL GLU GLY GLY SER VAL VAL VAL PHE SER MET ALA SER

SEQRES 5A 514 GLY ARG HIS SER THR GLU LEU ASP PHE SER ILE SER VAL

SEQRES 6A 514 PRO THR SER HIS GLY ASP PRO TYR ALA THR VAL VAL GLU

SEQRES 7A 514 LYS GLY LEU PHE PRO ALA THR GLY HIS PRO VAL ASP ASP

SEQRES 8A 514 LEU LEU ALA ASP THR GLN LYS HIS LEU PRO VAL SER MET

SEQRES 9A 514 PHE ALA ILE ASP GLY GLU VAL THR GLY GLY PHE LYS LYS

SEQRES 10A 514 THR TYR ALA PHE PHE PRO THR ASP ASN MET PRO GLY VAL

SEQRES 11A 514 ALA GLU LEU SER ALA ILE PRO SER MET PRO PRO ALA VAL

SEQRES 12A 514 ALA GLU ASN ALA GLU LEU PHE ALA ARG TYR GLY LEU ASP

SEQRES 13A 514 LYS VAL GLN MET THR SER MET ASP TYR LYS LYS ARG GLN

SEQRES 14A 514 VAL ASN LEU TYR PHE SER GLU LEU SER ALA GLN THR LEU

SEQRES 15A 514 GLU ALA GLU SER VAL LEU ALA LEU VAL ARG GLU LEU GLY

SEQRES 16A 514 LEU HIS VAL PRO ASN GLU LEU GLY LEU LYS PHE CYS LYS

SEQRES 17A 514 ARG SER PHE SER VAL TYR PRO THR LEU ASN TRP GLU THR

SEQRES 18A 514 GLY LYS ILE ASP ARG LEU CYS PHE ALA VAL ILE SER ASN

SEQRES 19A 514 ASP PRO THR LEU VAL PRO SER SER ASP GLU GLY ASP ILE

SEQRES 20A 514 GLU LYS PHE HIS ASN TYR ALA THR LYS ALA PRO TYR ALA

SEQRES 21A 514 TYR VAL GLY GLU LYS ARG THR LEU VAL TYR GLY LEU THR

SEQRES 22A 514 LEU SER PRO LYS GLU GLU TYR TYR LYS LEU GLY ALA TYR

SEQRES 23A 514 TYR HIS ILE THR ASP VAL GLN ARG GLY LEU LEU LYS ALA

SEQRES 24A 514 PHE ASP MG2 GSP DH2 NO3 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 25A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP PTP

SEQRES 26A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 27A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 28A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 29A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 30A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 31A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 32A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 33A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 34A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 35A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 36A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 37A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 38A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 39A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

SEQRES 40A 514 TIP TIP TIP TIP TIP TIP TIP

CRYST1 71.319 90.243 47.513 90.00 90.00 90.00 P 21 21 2 4

ORIGX1 1.000000 0.000000 0.000000 0.00000

ORIGX2 0.000000 1.000000 0.000000 0.00000

ORIGX3 0.000000 0.000000 1.000000 0.00000

SCALE1 0.014022 0.000000 0.000000 0.00000

SCALE2 0.000000 0.011081 0.000000 0.00000

SCALE3 0.000000 0.000000 0.021047 0.00000

序列表

SEQmNO：1：

orf2的DNA序列>

ATGTCCGAAGCCGCTGATGTCGAGCGCGTGTACGCGGCCATGGAGGAAGCGGCTGGACT

GCTGGGTGTGGCCTGCGCACGCGACAAGATCTATCCGCTGCTGAGCACGTTCCAGGACA

CGCTCGTCGAGGGCGGCAGCGTCGTCGTCTTCTCCATGGCGAGCGGGCGTCATTCCACGG

AACTGGACTTCAGCATCTCGGTGCCGACCAGCCACGGCGACCCGTACGCCACCGTCGTG

GAAAAGGGGCTGTTCCCGGCGACCGGCCACCCCGTGGACGACCTGCTCGCGGACACCCA

GAAGCACCTTCCGGTCTCCATGTTCGCCATCGACGGCGAGGTCACCGGCGGCTTCAAGAA

GACGTACGCCTTCTTCCCCACCGACAACATGCCCGGCGTCGCCGAGCTGAGCGCCATCCC

CTCCATGCCGCCGGCCGTCGCCGAGAACGCGGAGCTGTTCGCCCGCTACGGTCTGGACA

AGGTCCAGATGACGTCGATGGACTACAAGAAGCGGCAGGTCAACCTCTACTTCAGCGAG

CTGAGCGCGCAGACCCTGGAGGCGGAATCCGTCCTCGCCCTGGTGCGCGAGCTGGGCCT

GCACGTGCCGAACGAGCTGGGCCTGAAGTTCTGCAAGCGCTCCTTCTCGGTCTACCCCAC

CCTCAACTGGGAGACCGGCAAGATCGACCGGCTGTGTTTCGCCGTCATCTCCAACGACCC

CACCCTGGTGCCGTCCTCGGACGAGGGCGACATCGAGAAGTTCCACAACTACGCGACCA

AGGCGCCGTACGCGTACGTCGGCGAGAAGCGCACCCTCGTCTATGGGCTCACGCTGTCG

CCCAAGGAGGAGTACTACAAGCTGGGCGCGTACTACCACATCACCGATGTCCAGCGCGG

ACTGCTGAAGGCGTTCGACTCGCTGGAGGACTGA

SEQ DNO：2：

ORF2的氨基酸序列>

MSEAADVERVYAAMEEAAGLLGVACARDKIYPLLSTFQDTLVEGGSWVFSMASGRHSTEL

DFS ISVPTSHGDPYATVVEKGLFPATGHPVDDLLADTQKHLPVSMFAIDGEVTGGFKKTYAF

FPTDNMPGVAELSAIPSMPPAVAENAELFARYGLDKVQMTSMDYKKRQVNLYFSELSAQTL

EAESVLALVRELGLHVPNELGLKFCKRSFSVYPTLNWETGKIDRLCFAVISNDPTLVPSSDEG

DIEKFHNYATKAPYAYVGEKRTLVYGLTLSPKEEYYKLGAYYHITDVQRGLLKAFDSLED

SEQ ID NO：3：

5’- GGG GGG GGA TCC TCC GAA GCC GCT GAT GTC G-3’

SEQ ID NO：4：

5’-GGG GGG GAA TTC TCA GTC CTC CAG CGA GTC G-3’

Claims

1.芳香异戊烯基转移酶，其具有β/α圆筒状结构。

2.根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶，其中所述的芳香异戊烯基转移酶具有SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列，或其保守的变异。

3.根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶，其中所述的芳香异戊烯基转移酶与SEQ ID NO：2中阐述的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。

4.核酸，其编码权利要求1所述的异戊烯基转移酶。

5.核酸，其编码根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶。

6.组合物，其包含晶体形式的、根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶。

7.根据权利要求6所述的组合物，进一步包括所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个底物。

8.根据权利要求6所述的组合物，具有附录1中所提出的结构坐标。

9.一种预测推定的芳香异戊烯基转移酶的活性和/或底物专一性的方法，所述的方法包括：

将已知的芳香异戊烯基转移酶的三维描述和推定的芳香异戊烯基转移酶的三维表示相比较，这两种表示之间的差别就可以预测芳香异戊烯基转移酶的活性和/或底物的专一性。

10.一种筛选与根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶可以结合的化合物的方法，所述的方法包括：

测定潜在结合试剂与芳香异戊烯基转移酶底物竞争以结合芳香异戊烯基转移酶的能力，其中潜在结合的许多原子坐标。

11.一种鉴定根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶的潜在底物的方法，所述的方法包括：

根据所述的芳香异戊烯基转移酶的许多原子坐标，确定所述的芳香异戊烯基转移酶的活性位点；

鉴别与所述的活性位点适合的潜在的底物；和

将芳香异戊烯基转移酶和潜在的底物相接触，并测定其活性。

12.一种筛选化合物以确定它们是否是芳香异戊烯基转移酶底物的方法，所述的方法包括：

测试化合物被根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶转化的能力，

其中所述的化合物已经被选定，它与所述的芳香异戊烯基转移酶有作用点，而且

其中所述的芳香异戊烯基转移酶与其底物或产物之间类似的作用点已经被确定。

13.一种刺激芳香异戊烯基转移酶活性的方法，所述的方法包括将所述的芳香异戊烯基转移酶与权利要求12的方法所鉴定的有效数量的化合物相接触。

14.一种鉴定根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶的活性的潜在调节剂的方法，所述的方法包括：

接触与活性位点适合的潜在化合物，这些活性位点是根据所述芳香异戊烯基转移酶的许多原子坐标确定的；和

15.一种筛选调节根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶的活性的化合物的方法，所述的方法包括：

测试化合物调节所述芳香异戊烯基转移酶活性的能力，

其中所述的芳香异戊烯基转移酶与其底物或产物之间类似的相互作用点已经被确定。

16.一种将芳香底物异戊烯化的方法，所述的方法包括：

在异戊烯化的条件下将芳香底物与根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶相接触。

17.一种鉴定具有β/α圆筒状结构的蛋白质的方法，所述的方法包括：

将根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶的三维表示和推定的具有β/α圆筒状结构的蛋白质的三维表示相比较，其中这两种描述之间的相似性就可以预测具有β/α圆筒状结构的芳香异戊烯基转移酶蛋白质。

18.一种控制或改变由根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶所促进的异戊烯化程度的方法，所述的方法包括：

改变或更改所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个活性位点残基，以致于改变活性位点的尺寸，从而足以控制或改变由芳香异戊烯基转移酶促进的异戊烯化程度。

19.一种控制或改变由根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶的底物专一性的方法，所述的方法包括：

改变或更改所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个活性位点残基，以致于改变活性位点的尺寸，从而足以控制或改变与芳香底物相关的芳香异戊烯基转移酶的选择性，所述底物被所述的香异戊烯基转移酶异戊烯化。

20.一种控制或改变根据权利要求1所述的芳香异戊烯基转移酶供体专一性的方法，所述的方法包括：

改变或更改所述的芳香异戊烯基转移酶的一个或多个活性位点残基，以改变活性位点的尺寸，从而足以能够控制或改变与异戊二烯基供体相关的所述芳香异戊烯基转移酶的选择性，此供体被应用于使芳香底物异戊烯化。

21.在计算机可读介质上的计算机程序，所述的计算机程序包括指示，所述指示使得计算机能够根据芳香异戊烯基转移酶的许多原子坐标确定所述芳香异戊烯基转移酶或其片段。