CN108239618A

CN108239618A - 共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN108239618A
Application number: CN201611202462.7A
Authority: CN
Inventors: 金圣芳; 张敏洁; 黄悦
Original assignee: SHANGHAI JINGXIN BIOLOGICAL MEDICAL CO Ltd; Zhejiang Jingxin Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI JINGXIN BIOLOGICAL MEDICAL CO Ltd; Zhejiang Jingxin Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2018-07-03
Also published as: EP3561049A4; EP3561049A1; WO2018113476A1; JP2020513758A

Abstract

本发明公开了一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌及其应用。本发明实现了两种酶的高水平共表达，简化了酶的发酵工艺，降低了生产成本。根据本发明方法构建获得的基因工程菌可将高浓度的奥美拉唑硫醚催化转化为埃索美拉唑，具有优越的工业化应用价值。

Description

共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌及其应用，尤其涉及一种高水平共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌，及其在制备手性亚砜类化合物，特别是埃索美拉唑中的应用。

背景技术

质子泵抑制剂(Proton pump inhibitors，PPIs)是近几十年来临床上广泛应用的一类用于治疗胃溃疡的药物，传统的质子泵抑制剂主要为手性亚砜类药物，例如如埃索美拉唑、左旋泮托拉唑和右旋兰索拉唑等。其中埃索美拉唑是S构型的奥美拉唑，其化学名称为5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为119141-88-7，化学结构如下式I所示；奥美拉唑的化学名称为5-甲氧基-2-[(4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)亚硫酰基]-3H-苯并咪唑，CAS登录号为73590-58-6，其化学结构如下式II所示。

与奥美拉唑相比，埃索美拉唑具有肝脏首过效应较低、血药浓度高、血浆半衰期长、生物利用度高、药物间相互作用小、药效强而持久等优势，尤其适合用于特殊人群，如老年人、肾功能不全和轻中度肝功能不全患者。此外，埃索美拉唑还适用于已经治愈的食管炎患者以防止复发的长期维持治疗，与适当的抗菌疗法联合用药可根除幽门螺杆菌，并且能愈合与幽门螺杆菌感染相关的十二指肠溃疡，防止与幽门螺杆菌相关的消化性溃疡复发。埃索美拉唑以其卓著的品质名列2004年全球畅销药物第5位，销售额高达43亿美元。

目前拉唑类药物的生物酶合成法主要有以下两种：一种是采用野生菌株进行全细胞催化，另一种是载有单加氧酶的基因工程菌、外加辅酶或者辅酶再生系统进行催化。US5840552A通过筛选获得一系列可用于生物氧化反应的菌株，制备拉唑类化合物，催化手性选择性较好，产物ee值大于99％，但是缺点是产物浓度较低，为ppm级。CN 102884178A公开了一种非天然存在的单加氧酶，用于催化合成拉唑类化合物，然而该方法还需要另外再加入辅助因子和用于该辅助因子再生的酶，虽然该法获得的产物浓度较高，但是由于各个酶需要分别发酵获得，操作工序繁琐，成本较高，并且其一批次反应可催化的底物浓度比较低(仅33g/L)，因而不适合工业化生产。

发明内容

鉴于以上问题，本发明的目的是提供一种共表达环己酮单加氧酶(CHMO)和异丙醇脱氢酶(KRED)的基因工程菌、构建方法、及其在制备手性亚砜类化合物中的应用，特别是在制备埃索美拉唑中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌同时含有环己酮单加氧酶基因和异丙醇脱氢酶基因。优选在上述基因工程菌中，环己酮单加氧酶CHMO的基因和异丙醇脱氢酶KRED的基因整合在同一个表达载体比如质粒中。其中所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12，所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24；编码所述环己酮单加氧酶的基因的核苷酸序列相应分别选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11，编码所述异丙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列相应分别选自SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23。

所述共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌可采用以下方法构建：

(1)以环己酮单加氧酶基因片段为模板，通过PCR扩增扩展并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因片段插入质粒中，将连接后获得的载体转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞(全式金生物技术有限公司提供)中，构建获得重组质粒pETC-n；

(2)以异丙醇脱氢酶基因片段为模板，通过PCR扩增扩展并利用BamH I和XhoI内切酶位点将该基因片段插入至上述步骤(1)构建获得的重组质粒pETC-n中，将连接后获得的载体转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，构建获得重组表达载体pETCK-n；

(3)用上述构建获得的重组表达载体pETCK-n转化表达宿主，用引物T7/T7term做菌落PCR，验证无误后，获得共表达环己酮单加氧酶基因和异丙醇脱氢酶基因基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-n。

其中上述方法中，步骤(1)所述质粒选自pET 21a质粒、pET 28a质粒、pET 22b质粒、pETDuet 1质粒、pRSFDuet 1质粒、或者pACYCDuet 1质粒。

步骤(3)所述引物T7、T7term为本领域常规引物，可市售获得；所述宿主包括但不限于大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)plysS或者Escherichia coli BL21(DE3)star。

在本发明的一个实施方案中，使用上述方法构建获得一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌同时含有环己酮单加氧酶基因和异丙醇脱氢酶基因，其中所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；编码所述环己酮单加氧酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所述，编码所述异丙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

在本发明的另一个实施方案中，使用上述方法构建获得一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌同时含有环己酮单加氧酶基因和异丙醇脱氢酶基因，其中所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；编码所述环己酮单加氧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，编码所述异丙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

在本发明的另一个实施方案中，使用上述方法构建获得一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌同时含有环己酮单加氧酶基因和异丙醇脱氢酶基因，其中所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；编码所述环己酮单加氧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所述，编码所述异丙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

在本发明的另一个实施方案中，使用上述方法构建获得一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌同时含有环己酮单加氧酶基因和异丙醇脱氢酶基因，其中所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；编码所述环己酮单加氧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所述，编码所述异丙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。

在本发明的另一个实施方案中，使用上述方法构建获得一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌同时含有环己酮单加氧酶基因和异丙醇脱氢酶基因，其中所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；编码所述环己酮单加氧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所述，编码所述异丙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

在本发明的另一个实施方案中，使用上述方法构建获得一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌同时含有环己酮单加氧酶基因和异丙醇脱氢酶基因，其中所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；编码所述环己酮单加氧酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所述，编码所述异丙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。

进一步，本发明还提供所述共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌(BL21(DE3)-pETCK-n)的摇瓶培养法，包括以下步骤：

将所述基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-n接种到含相应抗性的3-5mL液体LB培养基中，于37℃下摇床中活化12-36小时，将活化后得到的培养物按0.5％-5％(v/v)的接种量转接入发酵培养基中，25-40℃发酵培养1-3h，再加入终浓度0.05-2g/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，并置于15-35℃下诱导表达2-24h，离心、过滤或者超滤，获得菌泥，置于-80℃冻存。

其中所述接种量是指加入的经活化后的基因工程菌的体积与所述发酵培养基的体积百分比。

此外，本发明还提供所述共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌在制备手性亚砜类化合物中的应用，特别是在制备埃索美拉唑中的应用。

因此，本发明还涉及一种埃索美拉唑的制备方法，其包括：在合适的反应条件下，向反应体系中加入本发明的共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌，将反应底物奥美拉唑硫醚催化转化为埃索美拉唑。

具体地，所述埃索美拉唑的制备方法包括：首先向反应体系中加入本发明的基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-n、磷酸缓冲液(pH＝7.0-10.0)，搅匀，然后依次加入奥美拉唑硫醚、异丙醇、辅酶NADP，在氧气环境下保温(0-40℃)反应2-72h，控制液相中的奥美拉唑硫醚含量≤1wt％，比如0.95wt％、0.90wt％、0.85wt％、0.80wt％、0.75wt％、0.70wt％等，最后加入适量乙酸乙酯终止反应，静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠溶液洗2-3遍，干燥后旋干，HPLC分析，即获得高纯度的目标产品埃索美拉唑，收率≥80％，ee值≥98％。

其中上述方法中，反应物的添加顺序不是关键的。可以同时向反应体系中一起添加反应物；或者可任选的，分开添加一些反应物并在不同的时间点添加另一些反应物。

根据本发明方法，一般允许反应进行直至反应底物例如奥美拉唑硫醚基本上完全或接近完全转化，转化为目标产物埃索美拉唑。使用已知方法检测底物的转化和产物的生成，例如包括但不限于气相色谱、HPLC等。

与生物酶法合成拉唑类药物的现有技术相比，本发明一方面实现了环己酮单加氧酶与异丙醇脱氢酶在一个菌株内的高水平共表达，将环己酮单加氧酶表达菌株的发酵和异丙醇脱氢酶表达菌株的发酵变成了一个共表达菌株的发酵，减少了发酵步骤，降低了生产成本；另一方面实现了全细胞催化，避免了细胞的破碎和离心等操作，具有优越的工业化应用价值。

附图说明

图1是本发明的基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-n的诱导表达蛋白电泳图。其中M为蛋白质Marker，1为基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-1的诱导菌体蛋白，2为基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-2的诱导菌体蛋白，3为基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-3的诱导菌体蛋白，4为基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-4的诱导菌体蛋白，5为基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-5的诱导菌体蛋白，6为基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-6的诱导菌体蛋白。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文涉及到多种物质的添加量、含量、浓度，以及百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

在本文中，有时为了描述简便，会将某种蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于某一种环己酮单加氧酶(基因)，用于描述其催化底物反应时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该环己酮单加氧酶的基因，以此类推。

共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的微生物可以是任何转化体宿主，例如包括但不限于细菌和真菌。优选细菌，尤其是大肠杆菌，例如包括但不限于大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)plysS或者EscherichiacoliBL21(DE3)star。

当作为生物酶催化剂用于生产埃索美拉唑时，本发明可以使用共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的任何形式，例如可以是酶的形式、微生物菌体形式或其他形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体形式包括存活菌体和死亡菌体。优选基因工程菌的菌体形式。

本发明所使用的引物T7、T7term均为常规引物，本领域技术人员可根据现有技术自己合成或市售获得。

本发明所使用的质粒，例如pET 21a质粒、pET 28a质粒、pET 22b质粒、pETDuet1质粒、pRSFDuet 1质粒、或者pACYCDuet 1质粒均为本领域常规质粒，可市售获得。

本发明所述的LB培养基、发酵培养基均为常规产品，本领域技术人员可根据现有技术自己配制或市售获得，例如可参考《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)自行配置。例如所述LB培养基可采用以下配方配置：酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，加水至1000ml，pH＝7.4～7.6。所述“相应抗性的LB培养基”是指在配置LB培养基时向其中加入适量抗生素，抗生素种类因所选择的质粒而略有不同，但均为本领域常规选择，例如氨苄和/或卡那。所述发酵培养基可采用以下配方配置：Na₂HPO₄ 6g，KH₂PO₄ 3g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，CaCl₂ 0.011g，葡萄糖2～10g，加水至1000ml，pH＝7.0。

实施例1环己酮单加氧酶基因片段的合成及定点突变

通过NCBI查询环己酮-1,2-单加氧酶基因1(NCBI登录号为578026767)，合成该基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造。具体是，设计如下引物F1和R1(划线处对应相应的突变位点)，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO:2的第435位的丝氨酸(Ser)进行定点突变改造，将其突变为苏氨酸(Thr)：

正向引物F1：GGTCCACTGGCCAATACTCCTCCTATCATCG(SEQ ID NO.25)

反向引物R1：CGATGATAGGAGGAGTATTGGCCAGTGGACC(SEQ ID NO.26)

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃,45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述获得的环己酮单加氧酶基因2进行蛋白质工程改造。具体是，设计如下引物F2和R3(划线处对应相应的突变位点)，对该环己酮单加氧酶基因2的氨基酸序列SEQ ID NO:3的第386位的丝氨酸(Ser)进行定点突变改造，将其突变为天冬酰胺(Asn)：

正向引物F2：GCTTTGATGCGGGCGATGGCAACTACAAGCGCATCGACATACAG(SEQ ID NO.27)

反向引物R2：GTTGCCATCGCCCGCATCAAAGCCGGTCGCGCAAATC(SEQ ID NO.28)

PCR程序设定：

95℃预变性3min；

95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；

72℃，7min。

获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

类似地，通过NCBI查询环己酮-1,2-单加氧酶基因4(NCBI登录号为296848397)，合成该基因片段(片段两端加Nco I和BamH I内切酶片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

通过NCBI查询环己酮-1,2-单加氧酶基因5(NCBI登录号为1109637906)，合成该基因片段(片段两端加Nco I和HindIII内切酶片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

通过NCBI查询环己酮-1,2-单加氧酶基因6(NCBI登录号为1099765055)，合成该基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

实施例2异丙醇脱氢酶基因片段的合成

通过NCBI查询异丙醇脱氢酶基因1(NCBI登录号为578026822)，合成该基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

通过NCBI查询异丙醇脱氢酶基因2(NCBI登录号为938992178)，合成该基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

通过NCBI查询异丙醇脱氢酶基因3(NCBI登录号为931139619)，合成该基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。

通过NCBI查询异丙醇脱氢酶基因4(NCBI登录号为21225427)，合成该基因片段(片段两端加NdeI和XhoI内切酶片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。

通过NCBI查询异丙醇脱氢酶基因5(NCBI登录号为874510474)，合成该基因片段(片段两端加NdeI和KpnI内切酶片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。

通过NCBI查询异丙醇脱氢酶基因6(NCBI登录号为1089568368)，合成该基因片段(片段两端加NdeI和XhoI内切酶片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，相应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。

实施例3重组共表达载体的构建

参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行下述的酶切、连接或感受态细胞的制备、转化等试验。

正向引物F3：GGCCATATGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAATGAGTACCAAGATGGATTTTG(SEQ ID NO.29)

反向引物R3：CGCGGATCCTTACGCATTAGCCTGCTGTTTGG(SEQ ID NO.30)

设计引物F3和R3，分别以核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5的3个环己酮单加氧酶基因片段为模板，通过PCR分别扩增扩展所述环己酮单加氧酶基因片段(片段两端加Nde I和BamH I内切酶片段)；并利用Nde I和BamH I内切酶位点将这3个基因分别插入pET 21a质粒、pET 28a质粒或pET 22b质粒中，将连接后获得的载体转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，构建获得重组质粒，用引物T7/R3进行菌落PCR验证，提取该重组质粒，测序验证获得结果无误的重组质粒，命名为pETC-n。

正向引物F4：CGCGGATCCAAGCTTAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAATGACGGATCGTCTGAAAGGC(SEQ ID NO.31)

反向引物R4：CCGCTCGAGTTACTGGGCGGTATAGCCGCC(SEQ ID NO.32)

设计引物F4和R4，再分别以核苷酸序列为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.17的3个异丙醇脱氢酶的基因片段为模板，通过PCR扩增扩展所述异丙醇脱氢酶基因片段(片段两端加BamH I和Xho I内切酶片段)；并利用BamH I和Xho I内切酶位点将该基因分别插入上述构建获得的重组质粒pETC-n中，将连接后获得的载体转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，构建获得重组质粒，用引物F4/T7term进行菌落PCR验证，提取该重组质粒，进行测序验证，获得结果无误的重组共表达载体，命名为pETCK-n。

类似地，采用相同的方法，分别以核苷酸序列为SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9和SEQID NO.11的3个环己酮单加氧酶基因片段为模板，使用pETDuet 1质粒、pRSFDuet1质粒和pACYCDuet 1质粒进行酶切插入，构建获得重组质粒pETC-m。

然后，再分别以核苷酸序列为SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.23的3个异丙醇脱氢酶基因片段为模板，按照上述相同的方法，构建获得重组共表达载体pETCK-m。

各重组表达载体的信息如下表1所述。

表1各重组共表达载体的构建信息

实施例4：基因工程菌的构建

将上述实例3构建的各重组共表达载体分别转化至感受态细胞EscherichiacoliBL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)plysS或Escherichia coli BL21(DE3)star(全式金生物技术有限公司提供)中。用引物T7/T7term做菌落PCR，验证无误后，即获得本发明的共表达环己酮单加氧酶与异丙醇脱氢酶的基因工程菌，命名为BL21(DE3)-pETCK-n，其构建信息如下表2所示。

表2基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-n的构建信息

实施例5基因工程菌的摇瓶培养诱导表达

将上述构建获得的基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-n接种到含相应抗性的3～5ml液体LB试管培养基中，于37℃下摇床活化12-36小时，将活化后得到的培养物按0.5％-5％(v/v)的接种量转接入发酵培养基中，25-40℃发酵培养1-3h，再加入终浓度为0.05-2g/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，置于15-35℃下诱导表达2-24h，离心、过滤或者超滤获得菌泥，置于-80℃冻存。培养条件参看表3。

表3基因工程菌的摇瓶培养诱导表达条件

图1为用SDS-PAGE检测的各基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-n的蛋白表达情况。

实施例6酶活测定

采用以下方法测定本发明的基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-n的酶活：

分别取2ml实施例5获得的基因工程菌的发酵液，离心收集菌体，倒出上清液；在菌体中加入1ml磷酸钾缓冲液(50mmol，pH＝8.0)中、0.2g/L氧化型辅酶II、10mmol/L奥美拉唑硫醚和10％异丙醇，漩涡混匀；置于37℃，200rpm的摇床中振荡反应1h，HPLC检测埃索美拉唑的生成量，并计算酶活。

每单位酶活定义为每小时催化生成1μmol的埃索美拉唑所需的酶量。

HPLC检测方法如下：Shimadzu液相色谱，Phenomenex色谱柱，流动相为10mM磷酸盐(pH＝7.6):乙腈(60∶40)，流速1mL/min，柱温35℃，紫外检测波长300nm，检测时长15min。保留时间：产物(3.8min)，底物(8.2min)。

酶活检测结果参看表4。从表4可以看出，基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-2的酶活最好，其次是基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-3，并且它们的酶活均高于基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-1的酶活，申请人推测原因可能是由于前两个基因工程菌是基于突变的环己酮-1,2-单加氧酶基因构建而导致的；基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-4、BL21(DE3)-pETCK-5、BL21(DE3)-pETCK-6的酶活相对较差一些。

表4：本发明的基因工程菌的酶活

实施例7酶催化制备埃索美拉唑

分别称取10g实施例5获得的基因工程菌BL21(DE3)-pETCK-1、BL21(DE3)-pETCK-2、BL21(DE3)-pETCK-3的发酵液，加入80mL磷酸缓冲液(pH＝7.0-10.0)搅匀，依次加入奥美拉唑硫醚1g、异丙醇20mL、氧化型辅酶II 0.006mg，在氧气环境下保温(0-40℃)反应，反应2-72h，控制液相中的奥美拉唑硫醚含量<1wt％，加入200mL乙酸乙酯终止反应，静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠洗2遍，干燥后旋干，经HPLC检测，获得目标产品埃索美拉唑，ee值>98％，收率均高于80％。

各基因工程菌的反应条件参看表5。

表5：基因工程菌的反应条件及反应结果

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域技术人员应当理解，其对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 浙江京新药业股份有限公司

上海京新生物医药有限公司

<120> 共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌及其应用

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355 360 365

Val Glu His Glu Leu Asp Val Val Val Phe Ala Thr Gly Phe Glu Ala

370 375 380

Val Glu Gly Ser Tyr Arg Gln Met Glu Ile Arg Gly Arg Gly Gly Val

385 390 395 400

Thr Ile Glu Glu His Trp Gly Asp Thr Pro Ala Ser Tyr Leu Gly Val

405 410 415

Asn Val Ser Gly Phe Pro Asn Met Phe Met Val Tyr Gly Pro Asn Ser

420 425 430

Val Phe Ser Asn Leu Pro Thr Ala Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp Ile

435 440 445

Thr Asp Leu Val Arg Met Met Glu Glu Arg Asp Leu Thr Ser Ile Glu

450 455 460

Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Gly Trp Thr Glu Leu Cys Thr Gln Ile

465 470 475 480

Ala Asp His Ser Leu Phe Pro Lys Val Asn Ser Trp Ile Phe Gly Ala

485 490 495

Asn Ile Pro Gly Lys Lys Lys Arg Val Leu Phe Tyr Phe Ala Gly Leu

500 505 510

Gly Asn Tyr Arg Gln Lys Leu Gly Asp Val Ala Ala Ala Asp Tyr Glu

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Gly Phe Met Leu Lys Gly Asn Pro Ser Val Val Thr Ala

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<210> 9

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

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<210> 10

<211> 544

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Met Ser Thr Thr Lys Ala Lys Arg Ala Asp Asn Gly Gly Ala Lys Glu

1 5 10 15

Leu Asp Val Leu Val Val Gly Ala Gly Phe Ala Gly Val Tyr Leu Leu

20 25 30

Asp Arg Leu Arg Gly Met Gly Met Ser Val Gln Ala Ile Glu Ala Gly

35 40 45

Ser Gly Leu Gly Gly Val Trp Tyr Trp Asn Cys Tyr Pro Gly Ala Arg

50 55 60

Val Asp Ser Pro Gly Pro Met Tyr Gln Phe Ser Arg Glu Asp Leu Trp

65 70 75 80

Arg Asp Trp Lys Phe Thr Glu Leu Tyr Pro Ala Trp Pro Glu Ile Arg

85 90 95

Asp Tyr Phe His Tyr Leu Asp Glu Lys Leu Asp Leu Ser Arg Asp Ile

100 105 110

Arg Phe Asn Ala Arg Val Glu Glu Ala Glu Phe Asp Ala Ala Ser Asn

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Pro Gln Gln Gly Leu Asp Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly

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195 200 205

Ala Gln Leu Thr Val Phe Gln Arg Thr Pro Asn Leu Ala Leu Pro Met

210 215 220

Arg Gln Lys Arg Leu Asp Asp Asp Thr Ile Leu Arg Met Lys Lys Gly

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Tyr Pro Val Ala Tyr Glu Lys Arg Arg Thr Thr Leu Gly Gly Phe Asp

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Tyr Gln Ser Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Val Ser Ala Glu Glu Arg

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Val Gly Ser Phe Asn Asp Leu Leu Ile Asp Glu Gln Ser Asn Arg Ala

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Ala Tyr Asp Phe Trp Arg Asp Lys Thr Arg Ala Arg Ile Lys Asp Pro

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Ser Asn Val Ser Leu Val Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ile Glu Lys Val

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Leu Val Leu Ala Thr Gly Phe Asp Ala Val Thr Gly Gly Leu Thr Ser

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Ile Asp Ile Trp Gly Thr Asp Gly Arg Thr Leu Lys Gln Lys Trp Ala

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Asp Gly Val Arg Ala His Leu Gly Met Ala Ser Ala Gly Tyr Pro Asn

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Leu Leu Phe Val Tyr Gly Pro His Ser Pro Asn Ala Phe Ala Asn Gly

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Ile Pro Arg Ala Asp Ser Trp Trp Val Gly Ala Asn Ile Pro Gly Lys

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<212> DNA

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<400> 11

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<210> 12

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<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

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Gly Val Gly Gly Val Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Arg Cys

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Asp Val Glu Ser Val Asp Tyr Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Ala Leu Gln

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Arg Glu Phe Trp Glu Glu Lys Val Arg Ala Val Ile Asp Asp Pro Arg

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Val Ala Glu Leu Leu Val Pro Arg Asp His Pro Ile Gly Thr Lys Arg

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<211> 252

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 18

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Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

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Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala

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Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ctctccagca cctacgggca ccgcccgatg gcggggggtg cgcactactc ggccaccaag 480

gccgccgtcg agcagatgac gcggagctgg gcactggaac tggccgacga gggtgtccgt 540

gtcaactcgg tcgctcccgg ccccacccgc accgacgtca tgctgcacgc cggtctgacg 600

ccggaggcgg ccaacgacat gtacgcgtac gagcgcgacc gcatcccgac ccaccacatc 660

gcgcacgcgg acgaggtggc tcactggatc ctccgtatgg cggacccggc cggacgccat 720

gccaccggtc aggtgatcac cgtcgacggc ggcctggaac tcatctga 768

<210> 20

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 20

Met Ser Pro Asn Gln Ser His Glu Thr Phe Ser Gly His Val Val Ile

1 5 10 15

Val Thr Gly Ala Gly Thr Gly Ile Gly Arg Ala Thr Ala Val Ala Phe

20 25 30

Ala Glu Ser Gly Ala His Val Leu Ala Val Gly Arg Arg Glu Ala Leu

35 40 45

Leu Lys Glu Thr Ala Ala Ala His Ser His Ile Asp Val Leu Ala Ile

50 55 60

Asp Ile Cys Gly Asp Glu Ala Pro Gly Lys Val Val Asp Ala Ala Val

65 70 75 80

Glu Arg Trp Gly Arg Leu Asp His Leu Ile Asn Asn Ala Gly Ala Thr

85 90 95

Ala Val Met Pro Leu Ala Glu Ala Glu Lys Gln Thr Ile Val Asp Leu

100 105 110

Leu Ala Leu Asn Val Val Ala Pro Ser Leu Leu Ala Arg Glu Ala Leu

115 120 125

Pro His Leu Arg Arg Thr Ser Gly Ser Ile Ile Asn Leu Ser Ser Thr

130 135 140

Tyr Gly His Arg Pro Met Ala Gly Gly Ala His Tyr Ser Ala Thr Lys

145 150 155 160

Ala Ala Val Glu Gln Met Thr Arg Ser Trp Ala Leu Glu Leu Ala Asp

165 170 175

Glu Gly Val Arg Val Asn Ser Val Ala Pro Gly Pro Thr Arg Thr Asp

180 185 190

Val Met Leu His Ala Gly Leu Thr Pro Glu Ala Ala Asn Asp Met Tyr

195 200 205

Ala Tyr Glu Arg Asp Arg Ile Pro Thr His His Ile Ala His Ala Asp

210 215 220

Glu Val Ala His Trp Ile Leu Arg Met Ala Asp Pro Ala Gly Arg His

225 230 235 240

Ala Thr Gly Gln Val Ile Thr Val Asp Gly Gly Leu Glu Leu Ile

245 250 255

<210> 21

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

atgacgaagg tgactgttgt gacaggtgcg tcccgtgggc ttggcgaggc cattgtgaag 60

cagattctgg ccagaaatgc tgacgctaaa gtggtggccg ttgccagatc ggccgagaat 120

ttacagaagc tcgagaaagg ctcggagggt cgggttttgg ctgtggcagg cgatgtgacc 180

aggccagaga ccatacatag gctcattgag gagactgtgg caaaattcgg ccgaatcgac 240

tcggttgtgg tcaacgccgg cgttctagag cccgtccagc acattgattc gctcgacgtg 300

gacctcgtca ggcgtctcta cgaggtcaac ctgttctctg tgatggatct ggtgagacag 360

accttgcctt acatgcgtca atcaaaagga agttatctgt ttgtgtcgtc tggggcgtcc 420

accaagccct acgatgcctg gtctgcttac ggatcttcga aagcagcact caaccacttc 480

tgtttgagtc tggccaccga ggagccgctt atcagagctc tctccattgc acctggagtc 540

gtcgatacag acatgcagca ggatatccgc gaggtttttg ggcaaaatat ggccccagat 600

gccctcaaga ggtttacgga cttgcacgag aacaagcagc tgctggcccc tgaagtgccg 660

ggaggtttct atgcttcact ggcgctaaga ggagtcccag agaatttgaa tggtagatat 720

gtgagatatg atgattcaga gttgaaggag tacgcc 756

<210> 22

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 22

Met Thr Lys Val Thr Val Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Leu Gly Glu

1 5 10 15

Ala Ile Val Lys Gln Ile Leu Ala Arg Asn Ala Asp Ala Lys Val Val

20 25 30

Ala Val Ala Arg Ser Ala Glu Asn Leu Gln Lys Leu Glu Lys Gly Ser

35 40 45

Glu Gly Arg Val Leu Ala Val Ala Gly Asp Val Thr Arg Pro Glu Thr

50 55 60

Ile His Arg Leu Ile Glu Glu Thr Val Ala Lys Phe Gly Arg Ile Asp

65 70 75 80

Ser Val Val Val Asn Ala Gly Val Leu Glu Pro Val Gln His Ile Asp

85 90 95

Ser Leu Asp Val Asp Leu Val Arg Arg Leu Tyr Glu Val Asn Leu Phe

100 105 110

Ser Val Met Asp Leu Val Arg Gln Thr Leu Pro Tyr Met Arg Gln Ser

115 120 125

Lys Gly Ser Tyr Leu Phe Val Ser Ser Gly Ala Ser Thr Lys Pro Tyr

130 135 140

Asp Ala Trp Ser Ala Tyr Gly Ser Ser Lys Ala Ala Leu Asn His Phe

145 150 155 160

Cys Leu Ser Leu Ala Thr Glu Glu Pro Leu Ile Arg Ala Leu Ser Ile

165 170 175

Ala Pro Gly Val Val Asp Thr Asp Met Gln Gln Asp Ile Arg Glu Val

180 185 190

Phe Gly Gln Asn Met Ala Pro Asp Ala Leu Lys Arg Phe Thr Asp Leu

195 200 205

His Glu Asn Lys Gln Leu Leu Ala Pro Glu Val Pro Gly Gly Phe Tyr

210 215 220

Ala Ser Leu Ala Leu Arg Gly Val Pro Glu Asn Leu Asn Gly Arg Tyr

225 230 235 240

Val Arg Tyr Asp Asp Ser Glu Leu Lys Glu Tyr Ala

245 250

<210> 23

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

atggctagga ccgcgctcgt caccggcgcc accagcggga tcggcctcgc cgtcgccaag 60

cagctcgccg aagccgggca tcaggtgttc ctctgcgccc gcaacgacgt ctcgccgacc 120

gtcaagcagc tgcgcgcgga cggcttcgag gtcgacggga ccgaatgcga cgtccggtcc 180

gagacggacg tccaggcgtt cgtgcaggca gcggtcgacc ggtacggccc ggtggacatc 240

ctggtcaaca acgcgggccg cagtggcggc ggggtcaccg ccgatctggt cgacgagctg 300

tggttcgacg tgatcgacac caacctgcac ggggtgttcc ggatgacccg cgcggtgctc 360

aacaccggcg ggctgcggca ccggccgtgg gggcggatcg tgaacatcgc gtcgaccgcg 420

ggcaagcagg gcgtggtgct gggcgcgccg tattcggcgt cgaagcacgc ggtcgtcggg 480

ttcaccaagt cattgggcaa cgagctggga aagacgggga tcacggtcaa cgcggtctgc 540

cctggttacg tcgaaacgcc gatggcgcag cgggtccggc agggttacgc ggccgcgtgg 600

gacatcagcg aggacgaggt gctcgaccgg ttccaggcca agatcccgct cggccggtac 660

agcaccccgg aggaggtcgc cggcctggtc ggctacctcg tctcggaccc ggccggctcg 720

atcaccgcgc aggcgctgaa cgtctgcggc ggcctcggca acttctga 768

<210> 24

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 24

Met Ala Arg Thr Ala Leu Val Thr Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Leu

1 5 10 15

Ala Val Ala Lys Gln Leu Ala Glu Ala Gly His Gln Val Phe Leu Cys

20 25 30

Ala Arg Asn Asp Val Ser Pro Thr Val Lys Gln Leu Arg Ala Asp Gly

35 40 45

Phe Glu Val Asp Gly Thr Glu Cys Asp Val Arg Ser Glu Thr Asp Val

50 55 60

Gln Ala Phe Val Gln Ala Ala Val Asp Arg Tyr Gly Pro Val Asp Ile

65 70 75 80

Leu Val Asn Asn Ala Gly Arg Ser Gly Gly Gly Val Thr Ala Asp Leu

85 90 95

Val Asp Glu Leu Trp Phe Asp Val Ile Asp Thr Asn Leu His Gly Val

100 105 110

Phe Arg Met Thr Arg Ala Val Leu Asn Thr Gly Gly Leu Arg His Arg

115 120 125

Pro Trp Gly Arg Ile Val Asn Ile Ala Ser Thr Ala Gly Lys Gln Gly

130 135 140

Val Val Leu Gly Ala Pro Tyr Ser Ala Ser Lys His Ala Val Val Gly

145 150 155 160

Phe Thr Lys Ser Leu Gly Asn Glu Leu Gly Lys Thr Gly Ile Thr Val

165 170 175

Asn Ala Val Cys Pro Gly Tyr Val Glu Thr Pro Met Ala Gln Arg Val

180 185 190

Arg Gln Gly Tyr Ala Ala Ala Trp Asp Ile Ser Glu Asp Glu Val Leu

195 200 205

Asp Arg Phe Gln Ala Lys Ile Pro Leu Gly Arg Tyr Ser Thr Pro Glu

210 215 220

Glu Val Ala Gly Leu Val Gly Tyr Leu Val Ser Asp Pro Ala Gly Ser

225 230 235 240

Ile Thr Ala Gln Ala Leu Asn Val Cys Gly Gly Leu Gly Asn Phe

245 250 255

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

ggtccactgg ccaatactcc tcctatcatc g 31

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

cgatgatagg aggagtattg gccagtggac c 31

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

gctttgatgc gggcgatggc aactacaagc gcatcgacat acag 44

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

gttgccatcg cccgcatcaa agccggtcgc gcaaatc 37

<210> 29

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

ggccatatga ataattttgt ttaactttaa gaaggagata taatgagtac caagatggat 60

tttg 64

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

cgcggatcct tacgcattag cctgctgttt gg 32

<210> 31

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

ggcggatcca agcttaataa ttttgtttaa ctttaagaag gagatataat gacggatcgt 60

ctgaaaggc 69

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

ccgctcgagt tactgggcgg tatagccgcc 30

Claims

1.一种共表达环己酮单加氧酶和异丙醇脱氢酶的基因工程菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌同时含有环己酮单加氧酶基因和异丙醇脱氢酶基因。

3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法如下：

(1)以环己酮单加氧酶基因片段为模板，通过PCR扩增扩展并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因片段插入至质粒中，将连接后获得的载体转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，构建获得重组质粒pETC-n；

(2)以异丙醇脱氢酶基因片段为模板，通过PCR扩增扩展并利用BamH I和Xho I内切酶位点将该基因片段插入至上述步骤(1)构建获得的重组质粒pETC-n中，将连接后获得的载体转入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中，构建获得重组表达载体pETCK-n；

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，步骤(1)中所述质粒选自pET 21a质粒、pET 28a质粒、pET 22b质粒、pETDuet 1质粒、pRSFDuet 1质粒、或者pACYCDuet1质粒。

5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，步骤(1)的PCR扩增扩展设计的正、反向引物序列分别如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示；步骤(2)的PCR扩增扩展设计的正、反引物序列分别如SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32所示。

6.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，步骤(3)中所述宿主为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coli BL21(DE3)plysS或者Escherichiacoli BL21(DE3)star。

7.根据权利要求1、2或3所述的基因工程菌，其特征在于，所述环己酮单加氧酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.12，所述异丙醇脱氢酶的氨基酸序列选自SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24。

8.根据权利要求7的基因工程菌，其特征在于，编码所述环己酮单加氧酶基因的核苷酸序列相应分别选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11，编码所述异丙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列相应分别选自SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23。

9.一种制备埃索美拉唑的方法，其特征在于，在合适的反应条件下，向反应体系中加入权利要求1-8中任一项所述的基因工程菌，将反应底物奥美拉唑硫醚催化转化为埃索美拉唑。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，控制反应体系的液相中的奥美拉唑硫醚的含量≤1wt％。