CN107574158A - 手性茚醇类化合物的酶法制备及其在手性药物拉多替吉合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多种由野生型光滑假丝酵母酮还原酶(Candida glabrata ketone reductase,CgKR1)基因通过突变得到的具有改良性质的酮还原酶突变体。该酶在E.coli Rosseta(DE3)中表达，并将其与葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达制成全细胞催化剂，用于潜手性茚酮的不对称还原及多靶点治疗轻度认知功能障碍药物(R)‑拉多替吉的手性中间体的制备应用。
Description
技术领域
本发明涉及化学物质和药物制备领域，涉及手性茚醇类化合物的酶法制备及其在手性药物拉多替吉合成中的应用，具体涉及到潜手性茚酮的不对称还原及多靶点治疗轻度认知功能障碍药物(R)-拉多替吉的手性中间体的制备应用。
背景技术
光学活性手性醇作为一种可以引入手性中心的重要砌块，在药物、精细化学品、农用化学品和其他特殊材料的合成中应用十分广泛。不对称还原前手性酮是一种简单、可靠而且直接的生产光学活性手性醇的方法。与传统金属和有机催化等化学合成技术相比，羰基的不对称生物还原具有立体选择性强、原子利用率高以及生产过程对环境友好等优势。
酮还原酶，也叫作羰基还原酶，或者醇脱氢酶，是一种可以将酮羰基还原成相应醇的氧化还原酶。光滑假丝酵母酮还原酶(CgKR1)最初由沈乃东等通过基因挖掘的方法发现(Adv.Synth.Catal.2012,354,1765–1772)，并通过定向进化方法提高其稳定性及对邻氯苯甲酰基甲酸甲酯(Methyl o-Chlorobenzoylformate,CBFM)的活性(Journal ofBiotechnology,2015,203:54-61.)。
手性茚醇类化合物具有广泛的药理活性，例如抗帕金森氏病药物雷沙吉兰，多靶点认知功能障碍(MCI)的候选药物拉多替吉的结构中就含有该结构片段。相比手性α-苯基取代的脂肪醇的研究，手性茚醇的研究成果较少，主要是因为环状结构立体位阻较大，不利于手性催化剂或酶的定向选择。
在前期工作的基础上，我们选用四种潜手性茚酮底物1a-4a进行研究，并进一步选用拉多替吉中间体4a作为我们的研究目标，探索该方法的应用价值。
拉多替吉(Ladostigil)是一种新型的治疗轻度认知功能障碍(MCI)的候选药物，其R型异构体的活性和安全性都远远好于S型异构体。药理研究证明小剂量的拉多替吉具有很好的神经保护作用(Curr Drug Targets,2012,13(4):483-494.)。
目前拉多替吉的合成路线主要为以下三条：
路线1：WO9827055A1
Chorev等首次报道的路线，采用(R)-1-氨基茚满为原料，成本较高，反应步骤长，反应收率较低，造成手性原料的很大浪费。
路线2：Journal of Organic Chemistry,2006,71,4130-4140.
Herzig等报道的路线，较简单，但得到的产物为消旋体，需拆分出R型对映体，而另外50％的S-构型需要弃去。
路线3：US20060199974A1
本路线中，关键步骤采用Ru-TsDPEN催化氢转移反应，将酮转变为S-手性醇，再经过亲核取代反应得到R-构型拉多替吉。该路线的问题是催化剂用量大，且多步反应收率较低。黎星术等对此法进行改进(Tetrahedron:Asymmetry,2012,23,333-338.)，关键步骤采用Ru-Cs-DPEN催化剂在含表面活性剂的甲酸钠-水体系中进行，收率为67％，e.e.值为89％，但金属残留及e.e.值不高的问题仍限制了其应用。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种酮还原酶突变体。
本发明还提供了所述的酮还原酶突变体作为催化剂在制备手性茚醇类化合物的应用。
本发明由野生型光滑假丝酵母酮还原酶1(Candida glabrata ketoreductase 1，CgKR1)基因(SEQ ID NO.1)通过突变得到具有改良性质的酮还原酶突变体，并在大肠杆菌工程菌中表达。所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任意序列具有至少90％同源性。其中序列SEQ ID NO.2来自野生型CgKR1，其他序列通过定点突变方法获得。该酮还原酶突变体对茚酮类底物具有不同活性及选择性，能将茚酮类化合物选择性还原为不同构型的茚醇。
进一步地，本发明所述的酮还原酶突变体的序列如SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16或18所示。
本发明提供了一种核酸。优选地，所述的核酸选自SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13、15或17中的任一核酸序列。其表达的蛋白如上文所示。
本发明提供一种表达载体，该载体包含编码上述酮还原酶突变体的核酸且能在宿主细胞中进行表达。
本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的表达载体，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母和毕赤酵母等。优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了一种使用上述酮还原酶突变体制成的生物催化剂(包括全细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶等多种形式)催化茚酮类化合物的对映选择性还原的方法。所述方法以潜手性茚酮类化合物为底物，在适于将其还原为手性茚醇的反应条件下与本发明中的生物催化剂接触。
所述的生物催化剂是由上述酮还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达在同一宿主细胞中制成的全细胞催化剂；本发明中，葡萄糖与GDH构成辅酶再生系统，常见的辅因子再生系统包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、甲酸和甲酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、仲醇(如异丙醇)和仲醇脱氢酶、亚磷酸和亚磷酸脱氢酶、分子氢和氢化酶以及电化学等方法，优选地为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。
所述反应是在辅酶存在下，在pH5～7、温度为25～40℃的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，在生物催化剂作用下进行的，其中，所述的辅酶为NADP+，所述所述的磷酸盐缓冲溶液(Na2HPO4/NaH2PO4)浓度为100mM，pH 6.0。
上述方法中的潜手性茚酮类化合物如式(I)所示，
(I)
其中，R1可以为苯环上的单取代基或多取代基，可以为H、羟基、氨基、巯基、C1～C5饱和或不饱和烷基、C1～C4烷基氧基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基、C1～C4酰胺基。
R2可以为羟基、酮羰基、C1～C5烷基、C1～C4烷基氧基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基、C1～C4酰胺基等取代基。
优选地，R1为H、羟基、甲氧基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基、C1～C5烷基；
R2为H、酮羰基、C1～C5烷基。
本发明合成了化合物1a、2a、3a、4a，并在生物催化剂的作用下，制备化合物1b、2b、3b、4b。
本发明的主要反应步骤如下：
1.化合物1a的合成：
3-苯丙酸经多聚磷酸(PPA)脱水环合得到化合物1a。反应温度80～100℃，以90℃为宜。本反应中PPA既作为溶剂又作为脱水剂。
2.化合物3a的合成
2.1对甲氧苯丙酸的合成
对甲氧苯甲醛与米氏酸经克脑文格尔缩合、还原、脱羧，得到对甲氧苯丙酸。其中，对甲氧苯甲醛与米氏酸的摩尔比为1:1～1:1.5，对甲氧苯甲醛与甲酸的摩尔比为1:1.5～1:2.5。优选地，对甲氧苯甲醛、米氏酸、甲酸、三乙胺的摩尔比为1:1:3:1.2。
2.2化合物3a的合成
对甲氧苯丙酸与氯化亚砜反应制得酰氯，后者在三氯化铝催化下化合得到化合物3a。其中，对甲氧苯丙酸与氯化亚砜的摩尔比为1:1.5～1:8，对甲氧苯丙酸与三氯化铝的摩尔比为1:1～1:2。优选地，对甲氧苯丙酸、氯化亚砜、三氯化铝的摩尔比为1:7.8:1.1。
3.化合物2a的合成
化合物3a与无水三氯化铝反应，脱甲基得到化合物2a。其中，化合物3a与无水三氯化铝的摩尔比为1:2.5～1:4，以1:3为宜。
4.化合物4a的合成
在干燥乙腈中，化合物2a与N-乙基-N-甲基氨基甲酰氯在碳酸钾作用下缩合得到化合物4a。N-乙基-N-甲基氨基甲酰氯按专利CN101580482B的方法制得。其中，2a与N-乙基-N-甲基氨基甲酰氯的摩尔比为1:1.1～1:2.5，2a与碳酸钾的摩尔比为1:1～1:2.5。优选地，化合物2a、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氯、碳酸钾的摩尔比为1:1.5:2。
5.化合物1b-4b的合成
化合物1a-4a经助溶剂稀释后，加入到含葡萄糖、NADP+及全细胞(含有共表达的CgKR1突变体和GDH)的PBS缓冲溶液中，使底物浓度为50～200mM。反应在pH 5～7、温度25～40℃，在摇床中进行5～13h。其中，化合物1a-4a与葡萄糖的摩尔比为1:1.5～1:8，以1:7为宜；全细胞的用量为0.02-40g/L(干重)；NADP+的浓度为0.1～0.5mM；所述的助溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、甲苯、正己烷、N,N-二甲基甲酰胺(DMSO)等，优选DMSO。转化率及e.e.值经手性HPLC检测确定。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：在手性茚醇1b-4b的合成过程中，采用了CgKR1突变体与GDH共表达制得的全细胞催化剂对映选择性还原前体酮，与化学合成方法相比，操作简便，转化率及对映选择性较高。尤其对于拉多替吉关键中间体6-(N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基)-2,3-2H-1-茚满酮(4a)，在较高的底物浓度下，e.e.值仍维持＞99.9％。
附图说明：
图1为化合物(rac)-1b与纯化的产物(R)-1b的手性HPLC谱图，用于检测转化率及e.e.值，
其中：A为化合物(rac)-1b，B为产物(R)-1b；
图2为化合物(rac)-2b与纯化的产物(S)-2b的手性HPLC谱图，用于检测转化率及e.e.值，
其中：A为(rac)-2b，B为产物(S)-2b；
图3为化合物(rac)-3b与纯化的产物(S)-3b的手性HPLC谱图，用于检测转化率及e.e.值，
其中：A为(rac)-3b，B为产物(S)-3b；
图4为化合物(rac)-4b与未纯化的产物4b的反向HPLC谱图，用于检测转化率，
其中，A为化合物(rac)-4b，B为产物4b；
图5为化合物(rac)-4b与纯化的产物(S)-4b的手性HPLC谱图，用于检测e.e.值，
其中，A为化合物-4b，B为产物(S)-4b。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能局限本发明的内容。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
实施例涉及的培养基配方。
a.YPD培养基：10g酵母提取物、20g蛋白质胨溶于900mL蒸馏水，115℃高压灭菌30min，使用前加入100mL 20％葡萄糖溶液。
b.LB培养基：0.5％酵母提取物、1％蛋白质胨与1％氯化钠(如配置固体培养基，在灭菌前加入1.5％琼脂)，115℃高压灭菌30min。
实施例1光滑假丝酵母基因组DNA的提取
光滑假丝酵母用YPD液体培养过夜后，发酵液用1mL离心管3000r/min离心5min，弃上清收集菌体，可重复几次以得到足够量的细胞；b)按TIANamp Yeast DNA Kit酵母基因组DNA提取试剂盒操作说明提取光滑假丝酵母基因组。
实施例2野生型CgKR1基因的克隆
以实施例1获得的光滑假丝酵母基因组DNA为模板进行PCR反应，反应体系如下：
扩增程序：94℃：10Min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)30个循环，72℃，10min。
引物1：CgKR1-Nco Ⅰ-F：CATGCCATGGCAATGGCTTCTGATAACAGC；
引物2：CgKR1-Bam H Ⅰ-R：CGCGGATCCTTAATTAGAGTTCTTCTCGGC；
限制性内切酶酶切位点用下划线标出；
PCR扩增得到的DNA片段用胶回收试剂盒纯化。含有pET22b质粒的E.coli DH5α用LB液体培养基37℃，220r/min培养过夜，质粒提取采用参照TIANprep Mini Plasmid Kit。
目的片段与质粒pET22b质粒限双酶切，酶切体系如下：
酶切产物用胶回收试剂盒纯化，并通过T4连接酶连接。
实施例3 E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞的制备及转化
a)从种子培养基中取0.4mL接种于20mL LB液体培养基中培养3h；b)3000r/min，5min分两次富集2mL菌体于1.5mL EP管中，弃上清；c)加入100μl冰冷TSS溶液，重新悬浮菌体，冰浴30min；d)加入20μL连接液轻轻旋转混匀，冰浴30min；e)42℃热休克60s，冰浴2min，加入600μL LB液体培养基。37℃培养，150r/min振荡培养1h；f)分别取150μL涂布于LB抗性平板。
实施例4突变体的构建
突变库的构建是利用突变引物和侧翼引物，重叠延伸PCR进行的。(突变引物如下：)
PCR扩增条件：94℃：10Min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)35个循环，72℃：10min。所得基因片段经过纯化，按如下PCR扩增
按实施例2中所述PCR获得目的片段并连接到pET22b载体上，按实施例3所述转化到E.coli Rosetta(DE3)中。
实施例5突变体表达
a)取单菌落接种于4ml氨苄西林抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养6h后得到种子液；b)取20μl种子液接种于20ml氨苄西林抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至培养液OD600达到0.8-1.0时加入终浓度0.5mM IPTG，并将温度降至20℃诱导表达20h；c)4000rpm×15min离心培养液收集菌体，生理盐水洗涤两次后用0.1M pH6.0磷酸钠缓冲液重选菌体，加入终浓度1mg/ml溶菌酶，30℃，200rpm破碎1h后，4℃下，10000rpm离心收集上清进行筛选。
实施例6葡萄糖脱氢酶表达
将含有pET22b-GDH质粒的E.coli Rosetta(DE3)按照实施例5所述的方法表达获得葡萄糖脱氢酶。
实施例7酮还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达
以pET22b-GDH质粒为模板，PCR扩增目的片段，所用引物如下：
PCR条件如下：
目的片段与质粒pRSFDuet-1质粒限双酶切，酶切体系如下：
酶切产物用胶回收试剂盒纯化，并通过T4连接酶连接。
按实施例3所述将重组质粒转化到大肠杆菌中。
以实施例4所得的突变体为模板，PCR扩增目的片段，所用引物如下：
PCR条件如下：
目的片段与质粒pRSFDuet-1质粒限双酶切，酶切体系如下：
酶切产物用胶回收试剂盒纯化，并通过T4连接酶连接。
按实施例3所述将重组质粒转化到大肠杆菌中。并按实施例5中所述的方法共表达两种酶。将所得的菌体以80g/L的蔗糖溶液为保护剂进行冻干。
实施例8化合物1a的合成
在500mL茄形瓶中加200g PPA，加热至90℃，搅拌下分批加入20g 3-苯丙酸(0.133mol)，维持90℃搅拌0.5h，TLC检测反应完全。停止反应，加碎冰水1000mL，搅匀，冷至室温，200mL二氯甲烷萃取两次，每次，合并有机层，饱和食盐水洗两次，加无水NaSO4干燥过夜。过滤，减压回收溶剂，得淡黄色片状晶体17.1g，收率97.2％，m.p.41.2～42.0℃(文献值：39～42℃)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.77(d,J＝7.6Hz,1H),7.59(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.49(d,J＝7.6Hz,1H),7.38(t,J＝7.2Hz,1H),3.21-3.10(m,2H),2.74-2.66(m,2H).
实施例9化合物3a的合成
(1)对甲氧苯丙酸的合成
对甲氧基苯甲醛34.0g(0.25mol)、米氏酸36.0g(0.25mol)、甲酸—三乙胺5:2(mol/mol)混合液70mL，加干燥的DMF 50mL搅拌溶解，室温搅拌过夜。次日加热回流2h。冷至室温，加水750mL，用2N盐酸调至pH为2左右，立即析出大量固体，冰浴中搅拌10min，抽滤，冰水洗，收集滤饼加水500mL，加30％氢氧化钠溶液调pH 8～9，活性炭脱色，滤液用2N盐酸调至pH 2左右，抽滤，冰水洗，晾干，得白色粉末37.1g，收率82.4％，m.p.102～103℃(文献值：102～103℃)。
(2)化合物3a的合成
对甲氧苯丙酸18.0g(0.1mol)，溶于无水二氯甲烷500mL，滴加氯化亚砜80mL(0.78mol)后加干燥DMF1mL，加热回流2h。减压浓缩至干。残余油状物溶于二氯甲烷500mL，分批慢慢加入无水三氯化铝15.0g(0.11mol)，控温5℃以下，加毕，室温搅拌1h。反应液倾入1000mL冰冷饱和食盐水中，分出有机层，水层经300mL二氯甲烷萃取两次，合并有机层，3％氢氧化钠溶液洗涤三次，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸除溶剂得红色固体，甲醇-水＝2:1为溶剂重结晶得淡黄色针状结晶10.0g，收率61.7％，m.p.:108～110℃(文献值：107～108℃)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.40-7.35(m,1H),7.22-7.16(m,2H),3.84(s,3H),3.11-3.04(m,2H),2.75-2.69(m,2H).
实施例10化合物2a的合成
在500ml茄形瓶中加入化合物3a 8.1g(0.05mol)及20g无水AlCl3，加入250mL重蒸甲苯后，在N2保护下110℃回流3h。将反应液冷却至室温。倒入大烧杯中，在冰浴下，缓慢加入250mL 2N盐酸洗涤一次后，分液，弃去水层。用40g/L氢氧化钠溶液250mL洗涤三次后弃去酯层。合并水层，经活性炭脱色后用2N盐酸调节pH＝1～2，250mL乙酸乙酯萃取三次后合并萃取液，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，减压除去溶剂，得淡黄色固体。甲醇重结晶后得到淡黄色晶体6.0g，收率81.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(s,1H),7.38(d,J＝8.2Hz,1H),7.10(dd,J＝8.2,2.5Hz,1H),6.93(d,J＝2.4Hz,1H),3.02-2.92(m,2H),2.65-2.56(m,2H).
实施例11化合物4a的合成
向10.5g(0.07mol)化合物2a及19.3g(0.14mol)碳酸钾中，加入500mL干燥乙腈，在室温搅拌下缓慢滴加N-乙基-N-甲基氨基甲酰氯14.1g(0.12mol)。反应混合物在80℃回流反应10h。反应结束后，减压蒸除溶剂并向剩余物中加入175mL水稀释。混合物用175mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂。所得粗产品用乙醇重结晶，得到白色晶体13.6g，收率83.4％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.50-7.42(m,2H),7.36(dt,J＝8.5,2.5Hz,1H),3.45(dp,J＝28.1,7.0Hz,2H),3.17-2.95(m,5H),2.78-2.66(m,2H),1.22(dt,J＝22.6,7.1Hz,3H).LC/MS(EI+APCI)m/z:[M+H]+234.3.
实施例12化合物1a-4a的酶促选择性还原
向0.05mmol化合物1a-4a中加入100μL DMSO，超声使其溶解。另向900μL PBS缓冲液(100mM，pH6.0)中加入69.3mg(0.35mmol)葡萄糖、0.4mg NADP+(0.5mM)及含有CgKR1突变体和GDH的冻干细胞40mg(40g/L)。将化合物1a-4a的DMSO溶液加入到PBS混悬液中，在37℃摇床中反应7h，并用80g/L的氢氧化钠溶液维持反应混合物的pH～6.0。反应结束后，反应混合物用1mL乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，产物经400MHz 1H-NMR确证，e.e.值经手性HPLC检测得到。将不同突变体催化所得的产物合并，经硅胶柱层析纯化后，用于比旋光度的检测。
(R)-1b.[α]D 20＝-21.15(c 0.156,CHCl3),60.7％ee(R).1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.45–7.39(m,1H),7.30–7.21(m,3H),5.30–5.20(m,1H),3.06(ddd,J＝16.1,8.5,4.8Hz,1H),2.82(ddd,J＝15.6,8.3,6.7Hz,1H),2.49(dddd,J＝13.2,8.4,6.9,4.8Hz,1H),1.95(dddd,J＝13.5,8.5,6.6,5.3Hz,1H).
(S)-2b.[α]D 25＝7.36(c 0.734,CH3CN),99.0％ee(S).1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.10(s,1H),6.97(d,J＝8.0Hz,1H),6.72(d,J＝2.3Hz,1H),6.58(dd,J＝8.1,2.4Hz,1H),5.13(d,J＝6.1Hz,1H),4.93(q,J＝6.6Hz,1H),2.76(ddd,J＝15.2,8.7,3.6Hz,1H),2.56(dt,J＝15.4,7.9Hz,1H),2.36–2.21(m,1H),1.72(dtd,J＝12.6,8.3,6.6Hz,1H).
(S)-3b.[α]D 25＝3.10(c 0.452,CHCl3),9.8％ee(S).1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.14(d,J＝8.2Hz,1H),6.96(d,J＝2.5Hz,1H),6.82(dd,J＝8.3,2.5Hz,1H),5.21(t,J＝6.2Hz,1H),3.81(s,3H),2.98(ddd,J＝15.6,8.5,4.5Hz,1H),2.75(dt,J＝15.3,7.5Hz,1H),2.51(dddd,J＝12.9,8.2,6.9,4.5Hz,1H),1.94(dddd,J＝13.1,8.6,6.8,5.5Hz,1H).
(S)-4b.[α]D 20＝21.54(c 3.5,CHCl3),＞99.9％ee(S).1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.20(d,J＝8.1Hz,1H),7.15(s,1H),6.98(d,J＝8.2Hz,1H),5.19(t,J＝6.2Hz,1H),3.53–3.35(m,3H),3.11–2.95(m,4H),2.77(dt,J＝15.6,7.6Hz,1H),2.50(dddd,J＝12.8,8.2,6.9,4.5Hz,1H),1.95(dddd,J＝12.9,8.5,6.9,5.6Hz,1H),1.21(dt,J＝21.7,6.9Hz,4H).LC/MS(EI+APCI)m/z:[M+H]+236.3.
实施例13高效液相分析底物和产物
检测底物1a及其产物的条件为：色谱柱：OD-H，流动相：正己烷：异丙醇＝95:5，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：30℃，检测器：UV检测器。
检测底物2a及其产物的条件为：色谱柱：OD-H，流动相：正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝85:15:0.1，流速：0.8ml/min，波长：25420nm，柱温：25℃，检测器：UV检测器。
检测底物3a及其产物的条件为：色谱柱：OD-H，流动相：正己烷：异丙醇＝95:5，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：30℃，检测器：UV检测器。
检测底物4a的转化率的条件为：色谱柱：ODS，流动相：甲醇：水＝50:50，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：UV检测器。
检测产物4b的e.e.值的条件为：色谱柱：OB-H，流动相：正己烷：异丙醇＝60:40，流速：0.5ml/min，波长：254nm，柱温：40℃，检测器：UV检测器。
实施例13各突变体对1a-4a的活性及对映选择性的测定结果(建议如下的突变体以序列的序号表述)
a转化率.b产物的对映体过量值(ee)c产物的绝对构象(通过与文献中，或可信样品中手性HPLC的保留时间对比确定)
实施例14化合物4a的酶促选择性还原，放大底物规模
向1.51g(6.5mmol)化合物4a中加入6.5mL DMSO，超声使其溶解。另向58.5mL PBS缓冲液(100mM，pH6.0)中加入9g(45.5mmol)葡萄糖、27mg NADP+(0.5mM)及含有F92V/Y208I突变体和GDH的冻干细胞2.6g(40g/L)。将化合物4a的DMSO溶液加入到PBS混悬液中，在37℃以磁力搅拌的方式反应9h，并用80g/L的氢氧化钠溶液维持反应混合物的pH～6.0。反应结束后，反应混合物用65mL乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，快速硅胶柱层析得到灰色油状物1.24g，收率81.4％，手性HPLC检测产物e.e.＞99.9％。
序列表
<110> 沈阳药科大学
<120> 手性茚醇类化合物的酶法制备及其在手性药物拉多替吉合成中的应用
<130> 20170823
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 光滑假丝酵母(Candida glabrata)
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<212> PRT
<213> 光滑假丝酵母(Candida glabrata)
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Claims (10)
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ IDNO.2、4、6、8、10、12、14、16或18中的任意序列具有至少90％同源性。
2.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16或18的任意序列。
3.一种核酸，其能够编码权利要求1或2中所述的酮还原酶突变体。
4.如权利要求3所述的核酸，其特征在于，所述的核酸选自SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13、15或17中的任一核酸序列。
5.一种表达载体，该载体含有权利要求3或4所述的核酸且能在宿主细胞中进行表达。
6.一种宿主细胞，其含有权利要求4所述的表达载体。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，该宿主细胞是大肠杆菌。
8.权利要求1或2所述的酮还原酶突变体在制备手性茚醇中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，以茚酮类化合物为底物，在生物催化剂作用下，将其还原为手性茚醇，其反应式如下：
其中，R1可以为苯环上的单取代基或多取代基，可以为H、羟基、氨基、巯基、C1～C5饱和或不饱和烷基、C1～C4烷基氧基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基、C1～C4酰胺基。
R2可以为羟基、酮羰基、C1～C5烷基、C1～C4烷基氧基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基、C1～C4酰胺基。
优选地，R1为H、羟基、甲氧基、N-乙基-N-甲基氨基甲酰氧基、C1～C5烷基；
R2为H、酮羰基、C1～C5烷基。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物催化剂可以为细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶的形式，是由权利要求1中所述的酮还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶共表达在同一宿主细胞中制成的全细胞催化剂；所述反应是在辅酶存在下，在pH5～7、温度为25～40℃的磷酸盐缓冲溶液中进行的，其中，所述的辅酶为NADP+。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116731988A (zh) * | 2023-04-17 | 2023-09-12 | 重庆普佑生物医药有限公司 | 全合成酮还原酶及应用该酮还原酶的制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102618513A (zh) * | 2012-05-04 | 2012-08-01 | 华东理工大学 | 一种羰基还原酶、基因和突变体及在不对称还原羰基化合物中的应用 |
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Application publication date: 20180112 |