CN109468347A - 生物催化合成光学活性2r-氟代羧酸和2r-羟基羧酸的方法 - Google Patents

生物催化合成光学活性2r-氟代羧酸和2r-羟基羧酸的方法 Download PDF

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Abstract

生物催化合成光学活性2R‑氟代羧酸和2R‑羟基羧酸的方法，以α‑氟乙酸或α‑氟乙酸及其衍生物作为底物，以氟乙酸脱卤酶为生物催化剂，催化底物进行脱氟水解反应，最终产生并且分离得到手性纯的2R‑氟代羧酸和2R‑羟基羧酸及其衍生物。本发明立体选择性强，催化制备2R‑氟代羧酸和2R‑羟基羧酸的步骤简单，一步到位，解决目前手性化合物合成广泛存在的光学纯度低、产率低和污染环境等问题。另外，本发明方法将反应体系放大至g级实验，得到了产率和ee值较高的产物，因此本发明用于工业化生产成本低廉，能耗也较低。

Description

生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法。
背景技术
手性化合物由于具有特殊的立体结构，其对映体常表现出不同的物理化学特性和生理活性，近年来在新材料开发、新药设计、精细化学品合成等领域中发挥重要作用。酶催化是因为酶的活性中心是一个不对称的结构，有利于识别消旋体，在一定条件下酶只能催化外消旋体中的一个对映体发生反应而成为不同的化合物，从而使两个对映体分开。氟乙酸脱卤酶是一种从假单胞菌、莫拉氏菌、镰刀菌、伯克氏菌等分离出的一种酶,主要用于降解含氟有机化合物。
2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸作为医药、农药和光学材料的重要中间体，由于其本身所特有的光学活性，以及作为手性合成子,常用于合成更为复杂化合物。手性纯的α-羟基羧酸可引起角质脱落，对皮肤干燥、细微皱纹、斑点有显著的改善作用，因此，广泛应用于化妆品行业；此外,手性纯的羟基羧酸也是合成手性药物和农药的中间体。
目前，利用化学方法制备手性化合物，即利用手性配体以及化学催化剂(常为过渡金属)等，通过不对称合成来获取手性纯的化合物，存在原材料匮乏，光学纯度低和反应效率不高的缺点。且这类方法还存在试剂昂贵、反应条件苛刻(高温高压与强酸强碱)、环境污染等问题，对于实际工业生产的操作和需求都是一大挑战。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，本发明有选择性强、反应条件温和、环境友好等优点，尤其适用于高光学纯度2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸等化学品的制造。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，包括以下步骤：（1）将氟乙酸脱卤酶的表达载体转入表达菌株中，培养表达；（2）收集表达好的全细胞或无细胞提取物进行冷冻干燥作为生物催化剂；（3）以α-氟代羧酸或α-氟代羧酸及其衍生物为底物，加入生物催化剂，在缓冲液中进行反应，得反应液；（4）将反应液进行酸化，加入萃取剂进行萃取，得萃取液；（5）将萃取液进行层析分离，获取手性纯的2R-羟基羧酸和2R-氟代羧酸。
以α-氟代羧酸为底物时反应式如式（Ⅰ）所示。
（Ⅰ）
进一步，步骤（1）中所述氟乙酸脱卤酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1 所示。
所述SEQ ID NO.1：MPDLADLFPGFGSEWINTSSGRIFARVGGDGPPLLLLHGFPQTHVMWHRVAPKLAERFKVIVADLPGYGWSDMPESDEQHTPYTKRAMAKQLIEAMEQLGHVHFALAGHDRGARVSYRLALDSPGRLSKLAVLDILPTYEYWQRMNRAYALKIYHWSFLAQPAPLPENLLGGDPDFYVKAKLASWTRAGDLSAFDPRAVEHYRIAFADPMRRHVMCEDYRAGAYADFEHDKIDVEAGNKIPVPMLALWGASGIAQSAATPLDVWRKWASDVQGAPIESGHFLPEEAPDQTAEALVRFFSAAP
进一步，步骤（2）中所述生物催化剂为具有氟乙酸脱卤（氟、氯、溴、碘）酶氨基酸序列的同类蛋白酶。
进一步，步骤（3）中生物催化合成反应体系为：pH=6.5～8.7，30～100℃条件下，于30～100mM三羟甲基氨基甲烷-硫酸缓冲体系中，底物与生物催化剂的质量比为50～100∶1，控制搅拌转速为100～300 rpm，反应时间为1～3h。
进一步，步骤（2）中所述生物催化剂为脱氟酶RPA1163，每升反应液的生物催化剂用量为10～50g。
进一步，步骤（5）中所述萃取液通过柱层析的分离手段得到手性纯的2R-羟基羧酸和2R-氟代羧酸。
进一步，步骤（1）中所述氟乙酸脱卤酶的表达载体包括pET28a、pET30a和pBAD。
进一步，步骤（1）中所述的编码基因的重组宿主菌包括 BL21(DE3)和Roseta。
本发明所使用的生物催化剂氟乙酸脱卤酶，是一种从假单胞菌、莫拉氏菌、镰刀菌、伯克氏菌等分离出的一种酶。本发明者发现，所述氟乙酸脱卤酶在反应过程中负责将碳氟键裂解，能够立体选择性的将（S)-α-氟代羧酸转化，脱去氟原子形成2R-羟基羧酸，从而实现α-氟代羧酸的手性拆分，获取手性纯的2R-羟基羧酸和2R-氟代羧酸。
本发明有益效果：本发明方法以α-氟乙酸或其衍生物作为底物，通过蛋白质或酶工程菌株的细胞及其提取物制备生物催化剂，不仅工艺路线简单，反应条件温和，没有污染，在一定范围内，能够通过不断控制氟乙酸脱卤酶的加入来实现光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的高浓度积累，而且底物转化率可高达50%，ee值达到99%；成本低廉，能耗也较低。
附图说明
图1是氟乙酸脱卤酶的蛋白胶对比图（泳道1：蛋白marker ，泳道2：纯化的氟乙酸脱卤酶，泳道3：用于催化反应的含有氟乙酸脱卤酶的大肠杆菌）；
图2是氟代扁桃酸的核磁碳谱图；
图3是氟代扁桃酸的核磁氢谱图；
图4是氟代扁桃酸的核磁氟谱图；
图5是氟代扁桃酸甲酯的气相色谱图；
图6是氟代扁桃酸与酶反应后产物酯化后的气相色谱图；
图7氟乙酸脱卤酶催化氟代扁桃酸的水解的反应进程曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
实施例中所用到的培养基和缓冲溶液配方：
平板培养基配方（1 L）：酵母粉（生工生物工程股份有限公司）5 g、蛋白胨 (生工生物工程股份有限公司)10 g、氯化钠 (上海展云化工有限公司)10 g、琼脂（生工生物工程股份有限公司）15g。
溶菌肉汤培养配方（1 L）：酵母粉（生工生物工程股份有限公司）5 g、蛋白胨 (生工生物工程股份有限公司)10 g、氯化钠 (上海展云化工有限公司 )10 g。
超级肉汤培养配方（1 L）：酵母粉（生工生物工程股份有限公司）24 g、蛋白胨 (生工生物工程股份有限公司)12 g、甘油 (生工生物工程股份有限公司 )4 mL。
磷酸盐溶液(1L)：磷酸二氢钾 ( 上海展云化工有限公司 ) 23.1 g、磷酸氢二钾三水合物 ( 上海展云化工有限公司 ) 164.3 g。
实施例
本实施例利用生物催化合成光学活性R-氟代扁桃酸和R-扁桃酸，如（Ⅱ）所示。
（Ⅱ）
在本实施例中，以2-氟代扁桃酸为底物，以氟乙酸脱卤酶为生物催化剂手性拆分得到手性纯的2R-氟代扁桃酸酸和R-扁桃酸，包括以下步骤：
（1）将表达氟乙酸脱卤酶的质粒转入表达菌株中，培养表达。
将含氟乙酸脱卤酶基因的表达质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3) 中，将菌液涂在含卡那霉素的固体培养基上，过夜培养，将单菌落挑选含50μg mL-1卡那霉素的溶菌肉汤中，37℃培养过夜。将约1%种子培养物转移到超级肉汤中，加50μg mL-1卡那霉素。表达条件为：在37℃中培养约2～3h。直到OD值为0.6～0.8，加入1 mM 异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖诱导蛋白表达，同时温度降至25℃， 20小时后用离心机收集，然后用50mM三羟甲基氨基甲烷-硫酸 (pH=8.0) 缓冲溶液洗两次，然后冷冻干燥。氟乙酸脱卤酶的蛋白胶对比图如图1所示。
（2）收集表达好的全细胞，冷冻干燥。
（3）以氟代扁桃酸为底物，以收集好的全细胞冻干粉作为生物催化剂，将3 g 氟代扁桃酸溶于100 mL 三羟甲基氨基甲烷-硫酸缓冲液中，调节pH为8，加入1 g含氟乙酸脱卤酶的细胞冻干粉，在60 ℃，220 rpm反应2 h。
（4）反应后的体系进行酸化（pH=1），加入（乙酸乙酯）萃取剂进行萃取。萃取液进行气相检测，GC图谱见附图5，6。
实施例中气相检测条件为：100 ℃～120 ℃，5 ℃/min，120 ℃：5 min，120 ℃～220 ℃，10 ℃/min，220 ℃：5 min。所使用的色谱柱：CYCLOSIL-B，30 m×0.25 mmID。
（5）通过柱层析等分离手段分离得到手性纯的2R-氟代扁桃酸酸和R-扁桃酸。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Pro Asp Leu Ala Asp Leu Phe Pro Gly Phe Gly Ser Glu Trp Ile
1 5 10 15
Asn Thr Ser Ser Gly Arg Ile Phe Ala Arg Val Gly Gly Asp Gly Pro
20 25 30
Pro Leu Leu Leu Leu His Gly Phe Pro Gln Thr His Val Met Trp His
35 40 45
Arg Val Ala Pro Lys Leu Ala Glu Arg Phe Lys Val Ile Val Ala Asp
50 55 60
Leu Pro Gly Tyr Gly Trp Ser Asp Met Pro Glu Ser Asp Glu Gln His
65 70 75 80
Thr Pro Tyr Thr Lys Arg Ala Met Ala Lys Gln Leu Ile Glu Ala Met
85 90 95
Glu Gln Leu Gly His Val His Phe Ala Leu Ala Gly His Asp Arg Gly
100 105 110
Ala Arg Val Ser Tyr Arg Leu Ala Leu Asp Ser Pro Gly Arg Leu Ser
115 120 125
Lys Leu Ala Val Leu Asp Ile Leu Pro Thr Tyr Glu Tyr Trp Gln Arg
130 135 140
Met Asn Arg Ala Tyr Ala Leu Lys Ile Tyr His Trp Ser Phe Leu Ala
145 150 155 160
Gln Pro Ala Pro Leu Pro Glu Asn Leu Leu Gly Gly Asp Pro Asp Phe
165 170 175
Tyr Val Lys Ala Lys Leu Ala Ser Trp Thr Arg Ala Gly Asp Leu Ser
180 185 190
Ala Phe Asp Pro Arg Ala Val Glu His Tyr Arg Ile Ala Phe Ala Asp
195 200 205
Pro Met Arg Arg His Val Met Cys Glu Asp Tyr Arg Ala Gly Ala Tyr
210 215 220
Ala Asp Phe Glu His Asp Lys Ile Asp Val Glu Ala Gly Asn Lys Ile
225 230 235 240
Pro Val Pro Met Leu Ala Leu Trp Gly Ala Ser Gly Ile Ala Gln Ser
245 250 255
Ala Ala Thr Pro Leu Asp Val Trp Arg Lys Trp Ala Ser Asp Val Gln
260 265 270
Gly Ala Pro Ile Glu Ser Gly His Phe Leu Pro Glu Glu Ala Pro Asp
275 280 285
Gln Thr Ala Glu Ala Leu Val Arg Phe Phe Ser Ala Ala Pro
290 295 300

Claims (8)

1.一种生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将氟乙酸脱卤酶的表达载体转入表达菌株中，培养表达；（2）收集表达好的全细胞或无细胞提取物进行冷冻干燥作为生物催化剂；（3）以α-氟代羧酸或α-氟代羧酸及其衍生物为底物，加入生物催化剂，在缓冲液中进行反应，得反应液；（4）将反应液进行酸化，加入萃取剂进行萃取，得萃取液；（5）将萃取液进行层析分离，获取手性纯的2R-羟基羧酸和2R-氟代羧酸。
2.根据权利要求1所述的生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述氟乙酸脱卤酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1 所示。
3.根据权利要求1所述的生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，其特征在于，步骤（2）中所述生物催化剂为具有氟乙酸脱卤（氟、氯、溴、碘）酶氨基酸序列的同类蛋白酶。
4.根据权利要求1～3之一所述的生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，其特征在于，步骤（3）中生物催化合成反应体系为：pH=6.5～8.7，30～100℃条件下，于30～100mM三羟甲基氨基甲烷-硫酸缓冲体系中，底物与生物催化剂的质量比为50～100∶1，控制搅拌转速为100～300 rpm，反应时间为1～3h。
5.根据权利要求1或2或4所述的生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，其特征在于，步骤（2）中所述生物催化剂为脱氟酶RPA1163，每升反应液的生物催化剂用量为10～50g。
6.根据权利要求1～5之一所述的生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，其特征在于，步骤（5）中所述萃取液通过柱层析的分离手段得到手性纯的2R-羟基羧酸和2R-氟代羧酸。
7.根据权利要求1～6之一所述的生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述氟乙酸脱卤酶的表达载体为pET28a或pET30a或pBAD。
8.根据权利要求1～7之一所述的生物催化合成光学活性2R-氟代羧酸和2R-羟基羧酸的方法，其特征在于，步骤（1）中所述表达菌株为 BL21(DE3)或Roseta。
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