CN101880694A - 一种非水相制备手性3r,5s-双羟基化合物的方法 - Google Patents
一种非水相制备手性3r,5s-双羟基化合物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101880694A CN101880694A CN2009102320802A CN200910232080A CN101880694A CN 101880694 A CN101880694 A CN 101880694A CN 2009102320802 A CN2009102320802 A CN 2009102320802A CN 200910232080 A CN200910232080 A CN 200910232080A CN 101880694 A CN101880694 A CN 101880694A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dihydroxyl compound
- substrate
- nonaqueous phase
- prepares
- dihydroxyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 45
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 claims description 29
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 18
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 claims description 15
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 8
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000003534 oscillatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002521 alkyl halide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000010531 catalytic reduction reaction Methods 0.000 claims description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 abstract 3
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 abstract 3
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 abstract 2
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 abstract 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 abstract 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 8
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 102220023258 rs387907548 Human genes 0.000 description 3
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 102220369447 c.1352G>A Human genes 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N ethyl acetoacetate Chemical compound CCOC(=O)CC(C)=O XYIBRDXRRQCHLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZIWNPUGXLXDT-UHFFFAOYSA-N ethyl hexanoate Chemical compound CCCCCC(=O)OCC SHZIWNPUGXLXDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- -1 pyrryl Chemical group 0.000 description 2
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 2
- QSKPIOLLBIHNAC-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-acetaldehyde Chemical compound ClCC=O QSKPIOLLBIHNAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029077 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Human genes 0.000 description 1
- 101710158485 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101000925662 Enterobacteria phage PRD1 Endolysin Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003524 antilipemic agent Substances 0.000 description 1
- 102220369445 c.668T>C Human genes 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000003810 ethyl acetate extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Substances OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物催化法不对称制备手性医药中间体领域，具体涉及一种以3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯为底物，以双羰基还原酶为生物催化剂，还原制备单一光学纯度的3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，具体包括以下步骤：(1)在反应液中加入底物、双羰基还原酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，振荡反应至少1小时，其中，所述反应液为有机溶剂和缓冲液的混合溶液；(2)将步骤(1)得到的产物进行分离纯化，单一光学异构体3R，5S-双羟基化合物。由于本发明采用双羰基还原酶，同时结合非水相溶剂体系和辅酶再生系统，催化合成了3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸酸乙酯，其光学纯度ee和de值均大于99.5％，底物浓度高达150g/L，具有广泛的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物催化法不对称制备手性医药中间体领域，具体涉及一种以3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯为底物，以双羰基还原酶为生物催化剂，还原制备单一光学纯度的3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法。
背景技术
3R，5S-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯结构中的两个手性中心与3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂他汀类降血脂药物的手性侧链立体构型相同，因此它是合成他汀类药物的关键手性中间体。
目前该类化合物的制备主要是通过化学合成来完成，但是存在下列问题：需用手性催化剂，生产成本高；总得率低于50％；产物的光学纯度很难达到要求；大量使用有机试剂，造成环境污染严重。
因为生物催化方法具备高度立体选择性、温和的反应条件和不造成环境污染等优势，所以如何采用生物催化技术制备3R，5S-双羟基化合物已经受到研究者高度关注和广泛研究，例如：
(1)Wolberg等(参见：Angew.Chem.Int.Ed.200，39：4306-4308；Chem.Eur.J.2001，7：4562-4571)利用细菌Lactobacllus brevis将一种β，δ-双羰基底物中的δ-羰基还原成δ-羟基，但产物的非对映体过量值(enantiomericexcess，ee)只有98.1％，且需用其他方法引入另一个手性中心。
(2)去氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)能够以乙醛和氯乙醛为底物，通过两步醛缩反应同时引入两个手性中心得到3R，5S-双羟基产物(ee＞99.9，de＝96.6％)(参见：J.Am.Chem.Soc.1994，116：8422-8423；J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2004，101：5788-5793)，但该方法的缺点是酶用量较大、底物抑制作用很强并且初始反应原料为易燃易爆试剂，故难以用于工业生产。
(3)Guo等(参见：Tetrahedron：Asymmetry 2006，17：1589-1602)利用Acinetobacter species SC13874还原3R，5S-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯制备得到3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸酸乙酯，但63.3％的非对映体过量值阻碍了该方法的应用。
(4)腈基水解酶亦可以用于3R，5S-双羟基化合物的制备，但底物的合成难度大，产物分离困难(Org.Process.Res.Dev.2006，10：661-665)。
(5)公开号为CN 101429514A的中国发明专利申请公开说明书公开了一种应用双羰基还原酶在制备3R，5S-双羟基化合物的方法，是一个最为成功的生物催化方法，所述双羰基还原酶能够催化3R，5S-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯还原成3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯，产物的de和ee值均高于99.5％，且底物转化率高达99.9％，不过该方法的不足之处是反应的底物浓度较低(10g/L)。
发明内容
本发明目的是提供一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，以3R，5S-双羰基化合物为底物，以双羰基还原酶为生物催化剂，催化还原底物得到3R，5S-双羟基化合物；具体包括以下步骤：
(1)在反应液中加入底物、双羰基还原酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，10～50℃条件下，振荡反应至少1小时；
其中，所述反应液为有机溶剂和缓冲液的混合溶液，有机溶剂和缓冲液的体积比为1∶9～9∶1；所述缓冲液的pH值为4.0～8.0；所述底物的浓度为10～100g/L；所述双羰基还原酶的用量为0.5～9U/mL；所述甲酸脱氢酶用量为1～5U/ml；
(2)将步骤(1)得到的产物进行分离纯化，单一光学异构体3R，5S-双羟基化合物；
其中，3R，5S-双羰基化合物的通式为：
3R，5S-双羟基化合物的通式为：
式中，R1选自：芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂烷基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基R2为烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。
优选的技术方案中，R1选自：苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯基、碳原子数1～6的烷基、碳原子数3～8的环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂烷基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；R2为碳原子数1～6的烷基、碳原子数3～8的环烷基、卤烷基或卤环烷基。
上述技术方案中，所述双羰基还原酶为公开号为CN101429514A的中国发明专利申请公开说明书中所述双羰基还原酶，所述双羰基还原酶由与SEQ IDNO.1具有80％以上的同源性的氨基酸序列组成。
优选的技术方案中，所述的双羰基还原酶由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成。
上述技术方案中，所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系属于本领域技术人员公知的常规现有技术，通常包括甲酸盐、辅酶NAD+和甲酸脱氢酶，本领域技术人员可以根据实际情况选择合适的组分和用量。
上述技术方案中，所述溶剂选自：乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲苯和正己烷中的一种或一种以上的混合物。
上述技术方案中，所述步骤(1)中的振荡反应的转速一般在100～300rpm，优选150～250rpm。
上述技术方案中，所述步骤(2)的分离提纯方法可以是：将反应液用有机溶剂萃取，合并有机相，减压蒸干，纯化后即得到所述产物。
优选的技术方案中，步骤(1)中所述有机溶剂选自：甲苯或正己烷；步骤(1)中所述缓冲液选自：磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲液的制备均为现有技术。
上述技术方案所述反应过程可用如下反应式表示：
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.由于本发明采用双羰基还原酶，同时结合非水相溶剂体系和辅酶再生系统，催化合成了3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯，其光学纯度ee和de值均大于99.5％，底物浓度高达150g/L，具有广泛的实际应用价值。
2.本发明的制备方法简单、过程可控，效率极高，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例一
一种制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤：在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠9.5-140mg，3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10～150mg，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD+20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶27.2mg(4U/ml)，双羰基还原酶上清65μl(6U/ml)，最后加入正己烷500μl；在常温、振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止反应后，分离提纯，样品进行高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。
在底物浓度小于等于100g/L时转化率大于99％，125g/L时的转化率为95.1％，并且产物3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的ee和de值均高于99.5％。
上述双羰基还原酶可以通过以下方法得到：将含有诱导表达的双羰基还原酶的大肠杆菌细胞用0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，按20％的比例重悬，高压破细胞，12000rpm离心15～20min获得双羰基还原酶上清，其酶活力为90U/ml。
上述甲酸脱氢酶可以采用如下方法制备：将含有诱导表达的甲酸脱氢酶的大肠杆菌细胞用0.05M(pH＝7.0)磷酸钾缓冲液，按20％的比例重悬，高压破细胞，12000rpm离心15～20min获得甲酸脱氢酶上清，冷冻干燥，使用时粉末加入反应体系。
3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯的转化率和产物3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯纯度用反相C18柱(5μm，4.6×250mm，Shimadzu，Japan)进行高效液相(Shimadzu 2010A HT，Japan)分析(Chirality，2008，20：51-53；Acta.Biochim.Biophys.Sin.2009，41：163-170)。产物的ee和de值用手性液相色谱柱Chiralcel OD-RH(5μm，150×4.6mm，Daicel，USA)进行分析(Chirality，2008，20：51-53；Acta.Biochim.Biophys.Sin.200941：163-170)。
实施例二
一种制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤：在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠9.5mg，3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10mg，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD+20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶27.2mg(4U/ml)，双羰基还原酶上清65μl(6U/ml)，最后加入正己烷500μl；在40℃、振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止反应后，分离提纯，样品进行高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。
底物转化率为76.4％，产物3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的ee和de值均高于99.5％。
实施例三
一种制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸酸乙酯的方法，包括如下步骤：在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠140mg(2M)，3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10g/L，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD+20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶27.2mg(4U/ml)，双羰基还原酶上清65μl(6U/ml)，最后加入乙醇100～400μl，在常温、振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止反应后，分离纯化，样品利用高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。
在乙醇含量为20％(v/v)时转化率为95.0％，30％时转化率为3.3％，产物3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的ee和de值均高于99.5％。
实施例四
一种制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤：在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠140mg，3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10～150g/L，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD+20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶27.2mg(4U/ml)，双羰基还原酶上清65μl(6U/ml)，最后加入二甲基亚砜500μl，在常温、振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止反应后，分离提纯，样品利用高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。
在当底物浓度低于等于125g/L时转化率为99.2％，150g/L时的转化率为84.1％。产物ee和de值均高于99.5％。
实施例五
一种制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤：在1ml的反应体系中，依次加入甲酸钠140mg，3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10～150g/L，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD+20μl(0.5mM)，甲酸脱氢酶27.2mg(4U/ml)，双羰基还原酶上清65μl(6U/ml)，最后加入甲苯400μl，在常温、振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止反应后，分离提纯，样品利用高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。
在当底物浓度低于等于75g/L时转化率为99.5％，100g/L时的转化率为90.5％。产物ee和de值均高于99.5％。
实施例六
一种制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤：在50ml的反应体系中，依次加入甲酸钠140mg，3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯5g，0.1M(pH＝6.0)磷酸钾缓冲液，NAD+1ml(0.5mM)，甲酸脱氢酶1.36g(4U/ml)，双羰基还原酶上清3.25ml(6U/ml)，最后加入正己烷25ml；在常温，200rpm条件下进行反应，在反应进行了2小时和4小时时，分别再加入双羰基还原酶100U和50U。反应中每隔1小时取样，乙醇停止反应后，用高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。底物转化率在反应12小时后达到恒定，为94.8％。停止反应，反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转蒸发有机溶剂，减压浓缩得到油状产物混合物，产物混合物用65/35乙酸乙酯/石油醚(v/v)的硅胶层析柱纯化，旋转蒸发洗脱剂得到白色粉末状3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯产物，其纯度为99％，ee和de值均高于为99.5％，产物收率为83.9％。
<110>陈依军
<120>一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法
<160>1
<210>1
<211>283
<212>PRT
<213>双羰基还原酶(diketoreductase)
<400>1
Met Thr Gly Ile Thr Asn Val Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly
1 5 10 15
Ser Gln Ile Ala Phe Gln Thr Ala Phe His Gly Phe Ala Val Thr Ala
20 25 30
Tyr Asp Ile Asn Thr Asp Ala Leu Asp Ala Ala Lys Lys Arg Phe Glu
35 40 45
Gly Leu Ala Ala Val Tyr Glu Lys Glu Val Ala Gly Ala Ala Asp Gly
50 55 60
Ala Ala Gln Lys Ala Leu Gly Gly Ile Arg Tyr Ser Asp Asp Leu Ala
65 70 75 80
Gln Ala Val Lys Asp Ala Asp Leu Val Ile Glu Ala Val Pro Glu Ser
85 90 95
Leu Asp Leu Lys Arg Asp Ile Tyr Thr Lys Leu Gly Glu Leu Ala Pro
100 105 110
Ala Lys Thr Ile Phe Ala Thr Asn Ser Ser Thr Leu Leu Pro Ser Asp
115 120 125
Leu Val Gly Tyr Thr Gly Arg Gly Asp Lys Phe Leu Ala Leu His Phe
130 135 140
Ala Asn His Val Trp Val Asn Asn Thr Ala Glu Val Met Gly Thr Thr
145 150 155 160
Lys Thr Asp Pro Glu Val Tyr Gln Gln Val Val Glu Phe Ala Ser Ala
165 170 175
Ile Gly Met Val Pro Ile Glu Leu Lys Lys Glu Lys Ala Gly Tyr Val
180 185 190
Leu Asn Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asp Ala Ala Ala Glu Leu Leu
195 200 205
Val Asp Gly Ile Ala Asp Pro Glu Thr Ile Asp Lys Thr Trp Arg Ile
210 215 220
Gly Thr Gly Ala Pro Lys Gly Pro Phe Glu Ile Phe Asp Ile Val Gly
225 230 235 240
Leu Thr Thr Ala Tyr Asn Ile Ser Ser Val Ser Gly Pro Lys Gln Arg
245 250 255
Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Lys Glu Asn Tyr Ile Asp Lys Gly Lys Leu
260 265 270
Gly Leu Ala Thr Gly Glu Gly Phe Tyr Arg Tyr
275 280
Claims (7)
1.一种非水相制备手性3R，5S-双羟基化合物的方法，以3R，5S-双羰基化合物为底物，以双羰基还原酶为生物催化剂，催化还原底物得到3R，5S-双羟基化合物；其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)在反应液中加入底物、双羰基还原酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，10～50℃条件下，振荡反应至少1小时；
其中，所述反应液为有机溶剂和缓冲液的混合溶液，有机溶剂和缓冲液的体积比为1∶9～9∶1；所述缓冲液的pH值为4.0～8.0；所述底物的浓度为10～100g/L；所述双羰基还原酶的用量为0.5～9U/mL；所述甲酸脱氢酶用量为1～5U/ml；
(2)将步骤(1)得到的产物进行分离纯化，得单一光学异构体3R，5S-双羟基化合物；
其中，3R，5S-双羰基化合物的通式为：
3R，5S-双羟基化合物的通式为：
式中，R1选自：芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂烷基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基R2为烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。
2.根据权利要求1所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其特征在于，所述溶剂选自：乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲苯和正己烷中的一种或一种以上的混合物。
3.根据权利要求1所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其特征在于，步骤(1)中所述振荡反应的转速在100～300rpm。
4.根据权利要求1所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其特征在于，步骤(1)中所述缓冲液选自：磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
5.根据权利要求2所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其特征在于，步骤(1)中所述有机溶剂选自：甲苯或正己烷。
6.根据权利要求3所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其特征在于，步骤(1)中所述振荡反应的转速在200rpm。
7.根据权利要求1所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其特征在于，所述双羰基还原酶由与SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性的氨基酸序列组成。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910232080.2A CN101880694B (zh) | 2009-12-01 | 2009-12-01 | 一种非水相制备手性3r,5s-双羟基化合物的方法 |
| PCT/CN2010/076242 WO2011066755A1 (zh) | 2009-12-01 | 2010-08-23 | （3r,5s）-二羟基-6-苄氧基己酸乙酯的合成 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200910232080.2A CN101880694B (zh) | 2009-12-01 | 2009-12-01 | 一种非水相制备手性3r,5s-双羟基化合物的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101880694A true CN101880694A (zh) | 2010-11-10 |
| CN101880694B CN101880694B (zh) | 2014-06-11 |
Family
ID=43052834
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200910232080.2A Active CN101880694B (zh) | 2009-12-01 | 2009-12-01 | 一种非水相制备手性3r,5s-双羟基化合物的方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101880694B (zh) |
| WO (1) | WO2011066755A1 (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103937760A (zh) * | 2014-05-06 | 2014-07-23 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶、其编码基因及应用 |
| WO2015168999A1 (zh) * | 2014-05-09 | 2015-11-12 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶突变体及其应用 |
| CN109468347A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-03-15 | 湖南师范大学 | 生物催化合成光学活性2r-氟代羧酸和2r-羟基羧酸的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5324662A (en) * | 1992-05-15 | 1994-06-28 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Stereoselective microbial or enzymatic reduction of 3,5-dioxo esters to 3-hydroxy-5-oxo, 3-oxo-5-hydroxy, and 3,5-dihydroxy esters |
| CN101429514B (zh) * | 2007-11-08 | 2011-06-15 | 陈依军 | 一种双羰基还原酶、其基因及其应用 |
-
2009
- 2009-12-01 CN CN200910232080.2A patent/CN101880694B/zh active Active
-
2010
- 2010-08-23 WO PCT/CN2010/076242 patent/WO2011066755A1/zh active Application Filing
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103937760A (zh) * | 2014-05-06 | 2014-07-23 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶、其编码基因及应用 |
| WO2015168999A1 (zh) * | 2014-05-09 | 2015-11-12 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 双羰基还原酶突变体及其应用 |
| US10131883B2 (en) | 2014-05-09 | 2018-11-20 | Asymchem Laboratories (Tianjin) Co., Ltd | Diketoreductase mutant and application thereof |
| CN109468347A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-03-15 | 湖南师范大学 | 生物催化合成光学活性2r-氟代羧酸和2r-羟基羧酸的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101880694B (zh) | 2014-06-11 |
| WO2011066755A1 (zh) | 2011-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103333942B (zh) | 左旋吡喹酮的合成方法 | |
| CN101818178A (zh) | 一种酶法制备l-2-氨基丁酸的方法 | |
| CN108690854B (zh) | 一种利用化学-酶法生产l-草铵膦的方法 | |
| CN113637713A (zh) | 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法 | |
| CN105579585A (zh) | 龙涎香醇的制造方法 | |
| CN103173503A (zh) | 重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备 (s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法 | |
| CN101921742B (zh) | 一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用 | |
| CN1159447C (zh) | 微生物发酵法生产香料苯乙醇的工艺 | |
| CN101880694B (zh) | 一种非水相制备手性3r,5s-双羟基化合物的方法 | |
| CN100999746A (zh) | 酶法合成γ－D－谷氨酰－L－色氨酸的方法 | |
| CN101407513A (zh) | 一种核苷类似物的合成方法 | |
| CN105969836B (zh) | 一种酶法拆分阿巴卡韦手性中间体文斯内酯的方法 | |
| D’Antona et al. | Synthesis of novel cyano-cyclitols and their stereoselective biotransformation catalyzed by Rhodococcus erythropolis A4 | |
| CN108285908B (zh) | 一种固定化双酶催化合成(s)-1-(2,6-二氯-3-氟-苯基)乙醇的方法 | |
| CN114657170B (zh) | 一种高稳定性固定化酶的制备方法 | |
| CN101665811B (zh) | 一种制备s-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法 | |
| CN1476440A (zh) | 一种内酯化方法 | |
| CN104846025B (zh) | 一种制备(2s，3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸甲酯的方法 | |
| CN110791483B (zh) | 一种短链还原酶及其制备方法和应用 | |
| CN102558261A (zh) | 一种核苷酸类似物及其合成和应用 | |
| CN103409402B (zh) | 醛缩酶突变体 | |
| CN102936590A (zh) | 一种腈水解酶及其基因序列与应用方法 | |
| CN103993010A (zh) | 用于生产d-对羟基苯甘氨酸的dna分子、重组质粒以及重组菌 | |
| CN111849954A (zh) | 一种HMFO@MOFs复合物材料及其制备方法和应用 | |
| CN103710324B (zh) | 利用半胱氨酸水解酶家族成员制备(‑)γ内酰胺的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NANJING BIDIKE PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: CHEN YIJUN Effective date: 20140721 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 215002 SUZHOU, JIANGSU PROVINCE TO: 211100 NANJING, JIANGSU PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20140721 Address after: 211100 Tianyuan East Road, Jiangning District, Jiangsu 118-2, Nanjing Patentee after: NANJING BIOTICA PHARMACEUTICAL Co. Address before: 215002, 4, building 104, Lane 42, Lotus Lane, Suzhou, Jiangsu Patentee before: Chen Yijun |
|
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: CHANGZHOU JINLONG BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: NANJING BIDIKE PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20150512 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 211100 NANJING, JIANGSU PROVINCE TO: 213000 CHANGZHOU, JIANGSU PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150512 Address after: 213000, Changzhou, Jiangsu Province town of new North Wei Village Riverside Industrial Park Patentee after: CHANGZHOU JINLONG BIOLOGICAL MEDICINE Co.,Ltd. Address before: 211100 Tianyuan East Road, Jiangning District, Jiangsu 118-2, Nanjing Patentee before: NANJING BIOTICA PHARMACEUTICAL Co. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211101 Address after: 213163 No. 99, Changhong West Road, Niutang Town, Wujin District, Changzhou City, Jiangsu Province Patentee after: Jinlong Technology Group Co.,Ltd. Address before: 213000 Riverside Industrial Park, Weicun, Chunjiang Town, Xinbei District, Changzhou City, Jiangsu Province Patentee before: CHANGZHOU JINLONG BIOLOGICAL MEDICINE Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230824 Address after: 618400 Chengnan New District, Shifang City, Deyang City, Sichuan Province Patentee after: Sichuan Tongrentai Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 213163 No. 99, Changhong West Road, Niutang Town, Wujin District, Changzhou City, Jiangsu Province Patentee before: Jinlong Technology Group Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |