CN105579585A - 龙涎香醇的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种龙涎香醇的制造方法，其中，其包括使四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应而得到龙涎香醇。

Description

龙涎香醇的制造方法
技术领域
本发明涉及一种龙涎香醇的制造方法。
背景技术
龙涎香(ambergris)是一种从7世纪时开始在世界各地使用的高级香料，也作为中药使用。人们认为龙涎香是抹香鲸通过消化管分泌物使食物(章鱼、乌贼等)的不消化物结石化，排泄而形成的物质，但是详细的生成机理是不明确的。龙涎香的主要成分是龙涎香醇，龙涎香在海上悬浮时通过日光和氧被氧化分解，生成具有各种香味的化合物。
龙涎香的主要成分龙涎香醇作为香料或药剂使用，但是无法从自然界大量获取。因此，提出了各种有机合成方法。
例如，在日本特开平10-236996号公报中公开了一种简便且低成本、高效率地制备(+)-龙涎香醇的方法，其中，其包含下述工序：由龙涎香内酯制备新的磺酸衍生物，对该磺酸衍生物偶联上γ-环香叶基卤化物的光学活性体。
而且，在TetrahedronAsymmetry,(2006)Vol.17,pp.3037-3045(不对称四面体，2006年，第17卷，第3037-3045页)中公开了一种通过茱莉亚偶联(JuliaCoupling)反应对由(±)(5,5,8a-三甲基八氢-1H-螺[萘-2,2’-环氧乙烷]-1-基)甲醇合成的2-((1R,2R,4aS,8aS)-2-(甲氧基甲氧基)-2,5,5,8a-四甲基十氢萘-1-基)乙醛和由(±)甲基6-羟基-2,2-二甲基环己烷羧酸酯合成的5-((4-((S)-2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)丁烷-2-基-磺酰)-1-苯基-1H-四唑进行汇集合成，得到龙涎香醇的方法。
另一方面，已知一种通过使用角鲨烯-藿烯环化酶的突变型酶(D377C、D377N、Y420H、Y420W等)，由角鲨烯得到单环性三萜的3-脱氧蓍醇A的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,(1999)Vol.63,pp.2189-2198(生物科学·生物技术·生物化学，1990年，第63卷，第2189-2198页)；Biosci.Biotechnol.Biochem.,(2001)Vol.65,pp.2233-2242(生物科学·生物技术·生物化学，2001年，第65卷，第2233-2242页)；Biosci.Biotechnol.Biochem.,(2002)Vol.66,pp.1660-1670(生物科学·生物技术·生物化学，2002年，第66卷，第1660-1670页))。
而且，已报告了四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶是与由四异戊二烯-β-姜黄烯生成4环性的C35萜烯醇的反应和由角鲨烯生成2环性的三萜的反应这2种反应相关的二功能性酶(J.Am.Chem.Soc.,(2011)Vol.133,pp.17540-17543(美国化学会志，2011年，第133卷，第17540-17543页))。
发明内容
发明要解决的课题
由于现有的龙涎香醇的有机合成方法需要很多合成阶段，反应系统复杂，达不到产业化。而且，与龙涎香醇的生成相关的具体的酶是未知的。
因此，本发明的目的在于，提供一种能比现有的已知有机合成法简便地制备龙涎香醇的龙涎香醇的制造方法。
解决课题的手段
本发明如下所述。
[1]一种龙涎香醇的制造方法，其中，其包含：
使四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应，得到龙涎香醇。
[2]如[1]中记载的龙涎香醇的制造方法，其中，四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶来自芽孢杆菌属细菌。
[3]如[1]或[2]中记载的龙涎香醇的制造方法，其中，四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶来自巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌中的任意一种。
[4]如[1]～[3]中任意1项记载的龙涎香醇的制造方法，其中，所述制造方法还包含：
使能由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的突变型角鲨烯-藿烯环化酶与角鲨烯反应，得到3-脱氧蓍醇A。
[5]如[4]中记载的龙涎香醇的制造方法，其中，突变型角鲨烯-藿烯环化酶在从由通过序列编号1表示的氨基酸序列中第377位、420位、607位以及612位所组成的群组中选出的至少一个部位上具有氨基酸置换。
[6]如[4]或[5]中记载的龙涎香醇的制造方法，其中，突变型角鲨烯-藿烯环化酶具有通过序列编号2、序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6、序列编号7以及序列编号8中的任意一者表示的氨基酸序列。
[7]如[1]～[6]中任意1项记载的龙涎香醇的制造方法，其中，四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶具有通过序列编号16、序列编号17、以及序列编号18中的任意一者表示的氨基酸序列。
发明的效果
根据本发明，提供一种能比现有的已知有机合成法简便地制备龙涎香醇的龙涎香醇的制造方法。
具体实施方式
在本说明书中，“工序”一词不只是独立的工序，与其他的工序不能明确地区别的情况下，只要能达成其工序所期望的目的，也包含于本用语中。
在本说明书中，使用“～”表示的数值范围表示包含分别作为最小值以及最大值的记载于“～”前后的数值的范围。
在本说明书中，组合物中的各成分的量在相应于组合物中的各成分的物质为多种类存在的情况下，在没有特别限制的情况下，表示组合物中存在的所述多种类的物质的总量。
在本发明中，存在用本技术领域中公知的一字符表示(例如，甘氨酸残基用“G”表示)或者三字符表示(例如，甘氨酸残基用“Gly”表示)氨基酸序列中的氨基酸残基的情况。
在本发明中，与蛋白质以及多肽的氨基酸序列相关的“％”，没有特别限制的情况下，以氨基酸残基的个数为基准。
以下，对本发明的实施方式进行说明。这些说明以及实施例是用于例示本发明，并不是用于限制本发明的范围。
本发明的龙涎香醇的制造方法是一种包含有使四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应得到龙涎香醇的龙涎香醇的制造方法。
在本发明中，通过使四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应制造龙涎香醇，因此，能简便地制造龙涎香醇。
已知四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶是一种由作为C30的直链不饱和烃的角鲨烯生成2环性萜烯醇的酶，并且已知能将单末端具有单环的3-脱氧蓍醇A作为底物使用。而且，对于四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶而言，明确了如果将3-脱氧蓍醇A作为底物使用，则使3-脱氧蓍醇A的未环化的一端选择性地环化，生成两末端环化化合物。本发明是基于这些见解而完成的。根据四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的上述活性，将单末端具有单环的3-脱氧蓍醇A作为材料，能使用1种酶简便地制备龙涎香醇。
本发明的龙涎香醇的制造方法，其包含：使四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应得到龙涎香醇(以下，称为“龙涎香醇生成工序”)。并且，根据需要包含其他工序。
龙涎香醇为(1R,4aα)-1-[(E)-6-[(S)-2,2-二甲基-6-亚甲基环己基]4-甲基-3-己烯基]十氢-2,5,5,8aβ-四甲基萘-2α-醇，其是一种组成式为C30H52O、分子量为428.745的两末端环化化合物，并且是一种具有以下结构的三萜醇(CAS登录编号：473-03-0)。
在本发明的龙涎香醇的制造方法中，将3-脱氧蓍醇A作为四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的底物使用。
3-脱氧蓍醇A为(S)-1,1-二甲基-3-亚甲基-2-((3E,7E,11E)-3,8,12,16-四甲基十七烷-3,7,11,15-四烯-1-基)环己烷，其组成式为C30H50，是具有以下结构的单末端环化化合物。该化合物在本发明中作为用于生成龙涎香醇的材料使用。关于3-脱氧蓍醇A的获取方法，没有特别的限制，可以是通过化学合成所得的物质，也可以是来自现有化合物采用酶反应所得到的物质。
本发明的制造方法优选为进一步包含：使突变型角鲨烯-藿烯环化酶与角鲨烯反应得到3-脱氧蓍醇A(以下，称为“3-脱氧蓍醇A生成工序”)。由此，通过使用突变型角鲨烯-藿烯环化酶与四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶这2种酶反应，能将价格低廉的角鲨烯作为材料，高效简便地制备龙涎香醇。
[3-脱氧蓍醇A生成工序]
在3-脱氧蓍醇A生成工序中，使能由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的突变型角鲨烯-藿烯环化酶与角鲨烯反应得到30脱氧蓍醇A。在本说明书，对“突变型角鲨烯-藿烯环化酶”，没有特别限制的情况下，是指能由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的突变型角鲨烯-藿烯环化酶
在本发明中，突变型角鲨烯-藿烯环化酶是指改变野生型角鲨烯-藿烯环化酶后的酶，并且是能由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的酶。野生型角鲨烯-藿烯环化酶作为一种使角鲨烯闭环而生成5环性的藿烯或藿烷醇的酶(EC5.4.99.-)而被熟知，在脂环酸芽孢杆菌属、发酵单胞菌属、慢生根瘤菌属等原核生物中广泛存在。野生型角鲨烯-藿烯环化酶的氨基酸序列是已知的，例如，酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的野生型角鲨烯-藿烯环化酶的氨基酸序列(序列编号1)(表1)用基因库(GenBank)登录编号：AB007002表示。
[表1]
来自酸热脂环酸芽孢杆菌的野生型角鲨烯-藿烯环化酶
突变型角鲨烯-藿烯环化酶是一种在野生型角鲨烯-藿烯环化酶的氨基酸序列上有突变，具有能由角鲨烯生成单环的3-脱氧蓍醇A的活性的酶。如果野生型角鲨烯-藿烯环化酶的氨基酸序列上含有突变，则发生不完全的环化反应，已知在与角鲨烯反应的情况下，在野生型中生成五环化合物时，单环化合物的生成成为可能。
作为突变型角鲨烯-藿烯环化酶，从3-脱氧蓍醇A的生成效率的观点出发，优选在用序列编号1表示的氨基酸序列中、在从由377位、420位、607位以及612位所组成的群组中的至少一个部位上具有氨基酸置换的突变型角鲨烯-藿烯环化酶，更优选这些部位中的1个或2个上具有突变的突变型角鲨烯-藿烯环化酶，进一步优选这些部位中的任意1个上具有突变的突变型角鲨烯-藿烯环化酶。
突变型角鲨烯-藿烯环化酶中的上述突变部位是相对的，例如，“377位”在377位的N末端一侧的氨基酸残基缺少1个的情况下，实际上成为376位。而且，野生型角鲨烯-藿烯环化酶的氨基酸序列，是根据本来具有所述酶的生物物种，在含有与角鲨烯-藿烯环化酶的本来的功能无关的物种固有的突变的情况下，在使用本领域中公知的方法进行比对后的位置上进行读取替换后的序列。
突变型角鲨烯-藿烯环化酶中的氨基酸置换，是相对于野生型的氨基酸残基置换为其他的氨基酸残基。作为与野生型的氨基酸残基置换的其他的氨基酸残基，只要是置换后的突变型角鲨烯-藿烯环化酶能由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的氨基酸残基，则可以是任意氨基酸残基。
作为突变型角鲨烯-藿烯环化酶中的突变部位以及置换氨基酸，优选用序列编号1表示的氨基酸序列中的下述突变部位以及置换氨基酸。
(i)377位的天冬氨酸残基(D)置换为半胱氨酸残基(C)或天冬酰胺残基(N)。
(ii)420位的酪氨酸残基(Y)置换为组氨酸残基(H)或色氨酸残基(W)。
(iii)607位的亮氨酸残基(L)置换为苯丙氨酸残基(F)或色氨酸残基(W)。
(iv)612位的酪氨酸残基(Y)置换为丙氨酸残基(A)。
作为突变型角鲨烯-藿烯环化酶，优选在用序列编号1表示的氨基酸序列中，具有从由上述(i)～(iv)所组成的群组中选出的至少1者的置换的酶，更优选具有从由上述(i)～(iv)所组成的群组中选出的1种或2种的置换的酶，进一步优选具有从由上述(i)～(iv)所组成的群组中选出的1种的置换的酶。
如果突变型角鲨烯-藿烯环化酶保持由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的功能，则在野生型角鲨烯-藿烯环化酶的氨基酸序列中，除了上述突变部位以外，也可以具有置换、缺失、插入或者添加1个或多个氨基酸的序列。在该情况下，置换、缺失、插入或者添加的1个或多个氨基酸残基的数量根据氨基酸残基的蛋白质的立体结构中的位置、氨基酸残基的种类等不同，具体地，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个。
对突变型角鲨烯-藿烯环化酶的来源没有特别的限制，例如，优选来自脂环酸芽孢杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌或慢生根瘤菌属细菌的突变型角鲨烯-藿烯环化酶。从酶活性的观点出发，突变型角鲨烯-藿烯环化酶更优选为来自脂环酸芽孢杆菌属细菌的突变型角鲨烯-藿烯环化酶，其中，特别地优选来自酸热脂环酸芽孢杆菌的突变型角鲨烯-藿烯环化酶。
作为突变型角鲨烯-藿烯环化酶，从酶活性的观点出发，优选以下记载的多肽A～G(序列编号2～8)。表2中，用“突变(mutation)”表示的突变以外的氨基酸残基与用序列编号1表示的氨基酸序列中的氨基酸残基相同。
[表2]
多肽名称 来源 突变 序列编号
A 酸热脂环酸芽孢杆菌 D377C 2
B 酸热脂环酸芽孢杆菌 D377N 3
C 酸热脂环酸芽孢杆菌 Y420H 4
D 酸热脂环酸芽孢杆菌 Y420W 5
E 酸热脂环酸芽孢杆菌 L607F 6
F 酸热脂环酸芽孢杆菌 L607W 7
G 酸热脂环酸芽孢杆菌 Y612A 8
在构成突变型角鲨烯-藿烯环化酶的多肽A～G中包含，具有分别地在用序列编号2～8表示的各氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且保持由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的功能的多肽。用序列编号2～8表示的各氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加的氨基酸残基的数量，具体地优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步地优选为1～5个。
在构成突变型角鲨烯-藿烯环化酶的多肽A～G中包含，分别地相对于用序列编号2～8表示的各氨基酸序列整体，具有例如80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，更优选为97％以上，更优选为98％以上，特别地优选为99％以上的序列同一性，并且保持由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的功能的多肽。
能表达突变型角鲨烯-藿烯环化酶的多核苷酸能基于野生型的序列信息获取。作为能表达突变型角鲨烯-藿烯环化酶的多核苷酸，例如，可举例具有用序列编号9～15表示的碱基序列的多核苷酸A～G(表3)。表3中，除了用“突变位点(mutationsite)”表示部位以外，与酸热脂环酸芽孢杆菌的野生型角鲨烯-藿烯环化酶基因的碱基序列(基因库(GenBank)登录编号：AB007002)相同。
[表3]
多核苷酸名称 突变 突变位点 碱基 序列编号
A D377C 1129-1131 gac→tgc 9
B D377N 1129-1131 gac→aac 10
C Y420H 1258-1260 tac→cac 11
D Y420W 1258-1260 tac→tgg 12
E L607F 1819-1821 ctc→ttc 13
F L607W 1819-1821 ctc→tgg 14
G Y612A 1834-1836 tac→gcc 15
在多核苷酸A～G中包含，具有分别地在用序列编号9～15表示的各碱基序列中置换、缺失、插入或者添加1个或多个碱基的碱基序列，并且对保持由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的功能的多肽进行编码的多核苷酸。用序列编号9～15表示的各碱基序列中置换、缺失、插入或添加的碱基的数量，具体地优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步地优选为1～5个。
在多核苷酸A～G中包含，分别地相对于用序列编号9～15表示的各碱基序列整体，具有例如80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，更优选为97％以上，更优选为98％以上，特别地优选为99％以上的序列同一性，并且对保持由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的功能的多肽进行编码的多核苷酸。
在核苷酸A～G中包含，分别地相对于用序列编号9～15表示的各碱基序列的各互补链，在严格的条件下杂交的，对保持由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的功能的多肽进行编码的多核苷酸。
杂交是根据公知的方法或基于公知的方法的方法，例如，能根据MolecularCloning3rd(J.Sambrooketal.,ColdSpringHarborLab.Press,2001)(《分子克隆第三版》，J.Sambrook等,冷泉港实验室出版社,2001年)中记载的方法等进行。严格的条件是指形成特异的杂种、不形成非特异的杂种的条件。作为典型的严格的条件，例如，可举例钾浓度为约25mM～约50mM，以及镁浓度约1.0mM～约5.0mM。作为本发明的条件的1个实例，可举例在Tris-HCl缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷-HCl缓冲液)(pH8.6)、25mM的KCl、以及1.5mM的MgCl2中进行杂交的条件，但是并不限定于此。作为其他的严格的条件，在MolecularCloning3rd(J.Sambrooketal.,ColdSpringHarborLab.Press,2001)(《分子克隆第三版》，J.Sambrook等,冷泉港实验室出版社,2001年)中有所记载。本领域的技术人员能通过改变杂交反应的条件，即，杂交反应液的盐浓度等容易地选择严格的条件。
作为为了表达对突变型角鲨烯-藿烯环化酶进行编码的多核苷酸而使用的重组载体，没有特别的限制，可举例pET-3a等能在大肠杆菌中表达的载体、pHT01等能在枯草杆菌中表达的载体、pYES2等能在酵母中表达的载体等。通过将对突变型角鲨烯-藿烯环化酶进行编码的多核苷酸导入至这些载体中，能得到酶表达用载体。作为成为酶表达用载体的导入对象的宿主细菌，能根据使用的重组载体的种类适宜地选择，例如，可举例BL21(DE3)等大肠杆菌、168株等枯草杆菌，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等酵母。
根据需要，重组载体也可以具有启动子、剪接信号、聚A(polyA)添加信号、选择性标记、核糖体结合序列(SD序列)、NOS等终止子等。作为选择性标记，例如，可以使用氯霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因等抗生素抗性基因等公知的物质，没有特别的限制。
重组载体也可以含有为了确认作为目的的基因的导入的报告基因。作为该种报告基因，可举例GUS(β-葡萄糖醛酸酶)基因、荧光素酶基因、GFP(绿色荧光蛋白质)基因等。
突变型角鲨烯-藿烯环化酶对通过将酶表达用载体导入至细菌等中所得的转化体进行培养而生成。用于转化体的培养的培养基可以是通常使用的培养基，根据宿主的种类适宜地选择。例如，在培养大肠杆菌的情况中，使用LB培养基等。在培养基中，也可以添加相应于选择性标记的种类的抗生素。
突变型角鲨烯-藿烯环化酶也可以是从通过培养能表达所述酶的转化体所得的培养液中将酶萃取提纯的物质。而且，也可以直接使用含有从培养液中的转化体中萃取的酶的萃取液。对于从转化体中萃取酶的方法而言，可以使用公知的方法。酶的萃取工序可以含有，例如，在萃取溶剂中破碎转化体，并将细胞内容纳的物质与转化体的破碎碎片分离的工序。在所得的细胞内容纳的物质中，含有作为目的的突变型角鲨烯-藿烯环化酶。在本说明书中，将从细胞中萃取的、与细胞的破碎碎片分离的细胞内容纳的物质称作“无细胞萃取液”。
关于转化体的破碎方法、细胞内容纳的物质与微生物体的破碎碎片的分离方法、萃取溶剂的组成以及pH条件，直接使用与在下述的龙涎香醇生成工序中的记载事项相同的事项。
突变型角鲨烯-藿烯环化酶，可以单独使用一种，也可组合两种以上使用。
突变型角鲨烯-藿烯环化酶与角鲨烯的反应条件，如果是能进行酶反应的条件，则没有特别的限制。例如，能基于突变型角鲨烯-藿烯环化酶的活性等适宜地选择反应温度以及反应时间。从反应效率的观点出发，优选反应温度以及反应时间为，例如，4℃～100℃以及0.1小时～48小时，优选为30℃～60℃以及16小时～24小时。从反应效率的观点出发，pH条件为，例如3～10，优选为6～8。
反应溶剂如果是不抑制酶反应的物质，则没有特别地限制，能使用通常使用的缓冲液等。而且，例如，能使用与在酶的萃取工序中使用的萃取溶剂相同的溶剂。而且，也可以将含有突变型角鲨烯-藿烯环化酶的萃取液(例如，无细胞萃取液)作为酶溶液直接用于反应中。
从反应效率的观点出发，3-脱氧蓍醇A生成反应中的突变型角鲨烯-藿烯环化酶与其底物角鲨烯的浓度比，作为相对于酶的底物的摩尔浓度比(底物/酶)，优选为10～10000，更优选为100～5000，更优选为1000～3000，进一步优选为1000～2000。
从反应效率的观点出发，相对于反应溶剂的总质量，用于酶反应的角鲨烯的浓度，优选为0.000001质量％～0.002质量％，更优选为0.00001质量％～0.0002质量％。
通过使用突变型角鲨烯-藿烯环化酶的反应所得的3-脱氧蓍醇A在用公知的方法提纯后，能提供于与四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的反应。
作为3-脱氧蓍醇A的提纯方法，只要能将反应液中的3-脱氧蓍醇A提取出，则没有特别的限制，可以从通常使用的提纯方法中适宜地选择。作为提纯方法，具体地，可举例溶剂萃取、再结晶、蒸馏、色谱柱、高效液相色谱法(HPLC)等。
突变型角鲨烯-藿烯环化酶与角鲨烯反应的反应工序也可以重复进行数次。由此，能提高3-脱氧蓍醇A的收率。在重复进行数次反应工序的情况中，也可以含有将成为底物的角鲨烯再投入至反应系中的工序、在通过公知的方法使酶失活后对反应液中的反应生成物进行回收以及提纯的工序等。在进行角鲨烯的再投入的情况中，可以根据反应液中的突变型角鲨烯-藿烯环化酶的浓度、反应液中残存的底物的量等，适宜地设定投入时期、投入量。
[龙涎香醇生成工序]
在龙涎香醇生成工序中，使四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应，得到龙涎香醇。
四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶分类为EC4.2.1.129，是能够催化由水和四异戊二烯-β-姜黄烯生成芭喜萜烯醇A(バチテルペノールA，baciterpenolA)的反应或由角鲨烯生成8α-羟基聚丙烯酸坡里破烷-13,17,21-三烯(8α－ヒドロキシポリポダ－13,17,21－トリエン)的反应的酶。
已知四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶作为芽孢杆菌属细菌等细菌生成的酶。从反应效率的观点出发，四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶优选为来自芽孢杆菌属细菌。
来自芽孢杆菌属细菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶优选为来自巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)等的酶，从反应效率的观点出发，更优选为来自巨大芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的酶，特别地优选为来自巨大芽孢杆菌的酶。
芽孢杆菌属细菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列是公知的。
来自巨大芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列用基因库(GenBank)登录编号：ADF38987表示(序列编号16)(表4)。
来自枯草芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列用基因库(GenBank)登录编号：AB618206表示(序列编号17)(表5)。
来自地衣芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列用基因库(GenBank)登录编号：AAU41134表示(序列编号18)(表6)。
从反应效率的观点出发，作为四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶，优选为具有用序列编号16、序列编号17或序列编号18表示的氨基酸序列的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶，更优选为具有用序列编号16表示的氨基酸序列的的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶。
[表4]
来自巨大芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶
[表5]
来自枯草芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶
[表6]
来自地衣芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶
在四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶中包含，具有在用序列编号16～18表示的各氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，并且保持由3-脱氧蓍醇A生成龙涎香醇的功能的多肽。用序列编号16～18表示的各氨基酸序列中置换、缺失、插入或添加的氨基酸残基的个数具体地优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步地优选为1～5个。
在四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶中包含，分别地相对于用序列编号16～18表示的各氨基酸序列整体，具有例如80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，更优选为97％以上，更优选为98％以上，特别地优选为99％以上的序列同一性，并且保持由3-脱氧蓍醇A生成龙涎香醇的功能的多肽。
四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶，也可以是基于芽孢杆菌属细菌制作的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的氨基酸序列，以及/或者芽孢杆菌属细菌具有的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶基因的碱基序列在基因工程学上得到的物质。作为在基因工程学上制备四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶时使用的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶基因，可举例具有芽孢杆菌属细菌保有的野生型基因的碱基序列的多核苷酸或者基于所述野生型基因的碱基序列合成的多核苷酸。
芽孢杆菌属细菌保有的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶基因的碱基序列是公知的。
对于巨大芽孢杆菌，已知基因库(GenBank)：CP001982.1的基因组序列的2130781号～2132658号的多核苷酸(序列编号19、基因库(GenBank)：CP001982.1的基因组序列的第2130781号的碱基作为第1号的碱基的碱基序列)。
对于枯草芽孢杆菌，已知基因库(GenBank)：AB618206中记载的多核苷酸(序列编号20)。
对于地衣芽孢杆菌，已知基因库(GenBank)：CP000002.3的基因组序列的2209539号～2211428号的多核苷酸(序列编号21，基因库(GenBank)：CP000002.3的基因组序列的第2209539号的碱基作为第1号的碱基的碱基序列)。
在对四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶进行编码的多核苷酸中包含，具有在用序列编号19～21表示的各碱基序列中置换、缺失、插入或添加1个或多个碱基的碱基序列，并且对保持由3-脱氧蓍醇A生成龙涎香醇的功能的多肽进行编码的多核苷酸。用序列编号19～21表示的各碱基序列中置换、缺失、插入或添加的碱基的数量，具体地优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步地优选为1～5个。
在对四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶进行编码的多核苷酸中包含，相对于用序列编号19～21表示的各碱基序列整体，具有例如80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，更优选为97％以上，更优选为98％以上，特别地优选为99％以上的序列同一性，并且对保持由3-脱氧蓍醇A生成龙涎香醇的功能的多肽进行编码的多核苷酸。
在对四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶进行编码的多核苷酸中，包含相对于用序列编号19～21表示的各碱基序列的各互补链，在严格的条件下进行杂交的、对保持由3-脱氧蓍醇A生成龙涎香醇的功能的多肽进行编码的多核苷酸。杂交的条件以及严格的条件与对突变型角鲨烯-藿烯环化酶描述的条件相同。
作为四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶，例如，可举例用序列编号19～21中的任意一者表示的碱基序列编码的多肽，可举例用序列编号19或序列编号20表示的碱基序列编码的多肽，可举例用序列编号19表示的碱基序列编码的多肽。
作为为了表达对四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶进行编码的多核苷酸而使用的重组载体，没有特别的限制，可举例pColdTF等能用大肠杆菌表达的载体、pHT01等能用枯草杆菌表达的载体、pYES2等能用酵母表达的载体等。通过将对四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶进行编码的多核苷酸导入至这些载体中，能得到酶表达用载体。作为酶表达用载体的导入对象的宿主细菌，能根据使用重组载体的种类适宜地选定，例如，可举例BL21(DE3)等大肠杆菌、168株等枯草杆菌、酿酒酵母等的酵母等。
根据需要，重组载体与可以具有启动子、剪接信号、聚A(polyA)添加信号、选择性标记、核糖体结合序列(SD序列)、NOS等终止子等。作为选择性标记，使用例如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因等抗生素抗性基因等公知的物质，没有特别的限制。
重组载体也可以含有用于确认作为目的的基因的导入的报告基因。作为这样的报告基因，可举例GUS(β-葡萄糖醛酸酶)、荧光素酶基因、GFP(绿色荧光蛋白质)基因等。
四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶通过对将酶表达用载体导入至细菌等中所得的转化体进行培养而生成。用于转化体的培养的培养基可以是通常使用的培养基，根据宿主的种类适宜地选择。例如，在培养大肠杆菌的情况中，使用LB培养基等。在培养基中，也可以添加相应于选择性标记的种类的抗生素。
四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶，也可以是从通过培养能表达所述酶的转化体所得的培养液中将酶萃取提纯的物质。而且，也可以直接使用含有从培养液中的转化体中萃取的酶的萃取液。对于从转化体中萃取酶的方法而言，可以使用公知的方法。酶的萃取工序可以含有，例如，在萃取溶剂中破碎转化体，并将细胞内容纳的物质与转化体的破碎碎片分离的工序。在所得的细胞内容纳的物质中，含有作为目的的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶。
作为转化体的破碎方法，可以使用将转化体破碎、并能回收酶溶液的公知的方法，例如，可举例超声波破碎、玻璃珠破碎等。对于破碎的条件没有特别的限制，只要是10℃以下以及15分钟等酶不失活的条件即可。
作为细胞内容纳的物质与微生物体的破碎碎片的分离方法，可举例沉淀分离、离心分离、过滤分离以及这些的2种以上的分离方法的组合等。使用这些方法的分离条件对本领域的技术人员而言是公知的，在离心分离的情况中，例如，为8000×g～15000×g以及10分钟～20分钟。
作为萃取溶剂，可以是作为酶的萃取溶剂通常使用的溶剂，例如，可举例Tris-HCl缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷-HCl缓冲液)、磷酸钾缓冲溶液等。萃取溶剂的pH在酶的稳定性这一点上，优选为3～10，更优选为6～8。
在萃取溶剂中，也可以含有界面活性剂，作为界面活性剂，可举例非离子界面活性剂、两性离子界面活性剂等。作为非离子型界面活性剂，可举例聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(Tween80)等聚氧乙烯脱水山梨醇单脂肪酸酯、n-辛基β-D-葡萄糖苷等烷基葡萄糖苷、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯、聚甘油硬脂酸酯等聚甘油脂肪酸酯等。作为两性离子界面活性剂，可举例作为烷基甜菜碱的N,N-二甲基-N-十二烷基甘氨酸甜菜碱等。除此以外，也能使用曲拉通X-100(TritonX-100)、聚氧乙烯(20)十六烷基醚(Brij-58)、壬基酚聚氧乙烯醚(TergitolNP-40)等本技术领域中通常使用的界面活性剂。
从酶的稳定性的观点出发，萃取溶剂中的界面活性剂的浓度，优选为0.001质量％～10质量％，更优选为0.10质量％～3.0质量％，进一步地优选为0.10质量～1.0质量％。
从酶活性的观点出发，在萃取溶剂中，优选含有二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等还原剂。作为还原剂，优选为二硫苏糖醇。萃取溶剂中的二硫苏糖醇的浓度优选为0.1mM～1M，更优选为1mM～10mM。通过在萃取溶剂中存在二硫苏糖醇，在酶中的二硫键等结构的保持变得容易，酶活性有相对上升的倾向。
从酶活性的观点出发，在萃取溶剂中，优选含有乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂。萃取溶剂的EDTA的浓度优选为0.01mM～1M，更优选为0.1mM～10mM。通过在萃取溶剂中存在EDTA，由于降低酶活性的金属离子被螯合，酶活性有相对上升的倾向。
在萃取溶剂中，除了上述成分以外，也可以含有能在酶萃取溶剂中添加的公知的成分。
四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶既可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应的条件只要是能进行酶反应的条件，则没有特别的限制。例如，能基于四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的活性等适宜地选择反应温度以及反应时间。从反应效率的观点出发，优选反应温度以及反应时间为，例如，4℃～100℃以及0.1小时～48小时，优选为30℃～60℃以及16小时～24小时。从反应效率的观点出发，pH条件为，例如3～10，优选为6～8。
反应溶剂如果是不抑制酶反应的物质，则没有特别地限制，能使用通常使用的缓冲溶液等。而且，例如，能使用与在酶的萃取工序中使用的萃取溶剂相同的溶剂。而且，也可以将含有四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的萃取液(例如，无细胞萃取液)作为酶溶液直接用于反应中。
从反应效率的观点出发，龙涎香醇生成反应中的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与其底物3-脱氧蓍醇A的浓度比作为，作为相对于酶的底物的摩尔浓度比(底物/酶)，优选为10～10000，更优选为100～5000，更优选为1000～3000，进一步优选为1000～2000。
从反应效率的观点出发，相对于反应溶剂的总质量，用于酶反应的3-脱氧蓍醇A的浓度，优选为0.000001质量％～0.002质量％，更优选为0.00001质量％～0.0002质量％。
四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应的反应工序也可以重复进行数次。由此，能提高龙涎香醇的收率。在重复进行数次反应工序的情况中，也可以包含：将成为底物的3-脱氧蓍醇A再投入至反应系中的工序、在通过公知的方法使酶失活后对反应液中的反应生成物进行回收以及提纯的工序等。在进行3-脱氧蓍醇A的再投入的情况中，可以根据反应液中的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的浓度、反应液中残存的底物的量等，适宜地设定投入时期、投入量。
在含有3-脱氧蓍醇A生成工序和龙涎香醇生成工序的情况下，从龙涎香醇的生成效率以及制造方法的简便性的观点出发，本发明的龙涎香醇的制造方法，优选为使通过来自脂环酸芽孢杆菌属细菌的突变型角鲨烯-藿烯环化酶和角鲨烯的反应所得的3-脱氧蓍醇A与来自芽孢杆菌属细菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶反应生成龙涎香醇的方法。更优选为，使通过来自酸热脂环酸芽孢杆菌的突变型角鲨烯-藿烯环化酶和角鲨烯的反应所得的3-脱氧蓍醇A与来自巨大芽孢杆菌或者枯草芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶反应生成龙涎香醇的方法。
[其他的工序]
本发明的龙涎香醇的制造方法也可以进一步包含对生成的龙涎香醇进行提纯的提纯工序。作为龙涎香醇的提纯方法，只要能提取出反应液中的龙涎香醇，则没有特别地限制，可以从通常使用的提纯方法中适宜地选择。作为提纯方法，具体地，可举例溶剂萃取、再结晶、蒸馏、色谱柱、HPLC等。
能使用气相色谱层析-质量分析(GC-MS)以及核磁共振装置(NMR)通过常用方法确认所得的生成物为龙涎香醇。
[实施例]
以下，在实施例中对本发明进行详细地说明。但是，本发明并不限于任何所述实施例。
[实施例1]
将角鲨烯作为材料，通过使突变型角鲨烯-藿烯环化酶与角鲨烯反应的工序、使四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应的工序这两个工序得到龙涎香醇，所述2工序的反应方案如下所示。
(1)3-脱氧蓍醇A的合成
准备通过含有对突变型角鲨烯-藿烯环化酶(序列编号2)进行编码的多核苷酸(序列编号9)的重组载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)(Biosci.Biotechnol.Biochem.,(1999)Vol.63,pp.2189-2198(生物科学·生物技术·生物化学，1999年，第63卷，第2189-2198页)。在含有氨苄青霉素(50mg/L)的LB培养基(6L)中对该转化体进行接种，在37℃进行16小时的振荡培养。培养后，通过离心(6000×g，10分钟)进行集菌。用50mM的Tris-HCl缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷-HCl缓冲液)(pH8.0)清洗菌体后，用300mL的缓冲液A[50mM的Tris-HCl缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷-HCl缓冲液)(pH8.0)，含有1v/v％的曲拉通X-100(TritonX-100)]进行悬浮，使用UP2005超声波仪(赫优讯超声(HielscherUltrasonics)，泰尔托(Teltow)，德国)进行超声波破碎(4℃，15分钟)。对破碎处理后的样品进行离心(12000×g，15分钟)，将离心后所得的上清液作为无细胞萃取液A。
将角鲨烯(50mg)与曲拉通X-100(TritonX-100)(1g)进行混合，溶液化后添加至缓冲液A(5mL)中，制备角鲨烯液。将全部该角鲨烯液加入至无细胞萃取液A中作为反应液，在60℃进行16小时的培养。在反应液中，角鲨烯(底物)与突变型角鲨烯-藿烯环化酶(酶)的摩尔比(底物/酶)为约1000。
培养后，将含有15质量％氢氧化钾的乙醇溶液(KOH/MeOH，450mL)添加至反应液中，使酶反应终止。然后，向反应液中添加n-己烷(750mL)，进行3次反应生成物的萃取。将所得的萃取物加入至硅胶柱色谱(溶剂：n-己烷)，得到纯的3-脱氧蓍醇A(42.2mg)。使用气相色谱层析-质量分析(GC-MS)以及核磁共振装置(NMR)确认3-脱氧蓍醇A的结构。
(2)龙涎香醇的合成
准备通过将编码来自巨大芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶(序列编号16)的多核苷酸(序列编号19)编入的重组载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)(J.Am.Chem.Soc.,(2011)Vol.133,pp.17540-17543(美国化学会志，2011年，第133卷，第17540-17543页)。在LB培养基(18L)中对该转化体进行接种，在37℃进行3小时的振荡培养。培养后，添加0.1M的异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在15℃进行24小时的振荡培养，诱导四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的表达。
然后，用50mM的Tris-HCl缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷-HCl缓冲液)(pH8.0)清洗通过离心(6000×g，10分钟)集菌的菌体后，用540mL的缓冲液B[含有50mM的Tris-HCl缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷-HCl缓冲液)(pH7.5)、0.1v/v％的曲拉通X-100(TritonX-100)、2.5mM的二硫苏糖醇、1mM的EDTA]进行悬浮，使用UP2005超声波仪(赫优讯超声(HielscherUltrasonics)，泰尔托(Teltow)，德国)进行超声波破碎(4℃，20分钟)。对破碎处理后的样品进行离心(12300×g，20分钟)，将离心后所得的上清液作为无细胞萃取液B。
将所述工序(1)中所得的3-脱氧蓍醇A(35mg)混合至曲拉通X-100(TritonX-100)(700mg)，溶液化后添加至缓冲液B(5mL)中，制备3-脱氧蓍醇A液。将全部的该3-脱氧蓍醇A液添加至无细胞萃取液B(180mL)中作为反应液，在30℃进行16小时的培养。在反应液中，3-脱氧蓍醇A(底物)与四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶(酶)的摩尔比(底物/酶)为约1000。
培养后，将含有15质量％氢氧化钾的乙醇溶液(KOH/MeOH，220mL)添加至反应液中，进一步地在70℃进行30分钟的加热处理，使酶反应终止。然后，向反应液中添加n-己烷(400mL)，进行3次反应生成物的萃取。将所得的萃取物添加至曲拉通X-100(TritonX-100)(470mg)中使其溶液化，添加至缓冲液B(5mL)后，添加至无细胞萃取液B(180mL)，与上述相同地进行培养、终止反应以及n-己烷萃取。然后，进一步与上述相同地进行1次萃取物的溶液化、向无细胞萃取液B的添加、培养、终止反应以及n-己烷萃取。
将所得的萃取物加入至硅胶柱色谱(溶剂：n-己烷，n-己烷：乙酸乙酯＝100：20，容量比)，得到n-己烷：乙酸乙酯＝100:20组分。将所得的组分浓缩，加入至HPLC(溶剂，n-己烷：THF＝100:20)，得到纯的龙涎香醇(0.4mg)。使用气相色谱层析-质量分析(GC-MS)以及核磁共振装置(NMR)确认龙涎香醇的结构。而且，旋光度也与文献值大致相同。
[实施例2]
除了将四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶从来自巨大芽孢杆菌的酶改为来自枯草芽孢杆菌的酶之外，与实施例1相同地进行所述工序(1)以及(2)，进行龙涎香醇的合成。在实施例2中使用的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶为用序列编号20表示的多核苷酸所编码的酶，具有用序列编号17表示的氨基酸序列。
其结果与实施例1相同，能由角鲨烯经由3-脱氧蓍醇合成龙涎香醇。合成的龙涎香醇的产量为使用来自巨大芽孢杆菌的四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶的情况(实施例1)的10％左右。
根据本发明，能通过使用四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶，由3-脱氧蓍醇A简便地制备龙涎香醇。
根据本发明，能通过使用突变型角鲨烯-藿烯环化酶和四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶，由角鲨烯经由3-脱氧蓍醇A简便地制备龙涎香醇。
通过2013年9月5日提出的日本专利申请2013-184143号的公开的全部内容，通过参照的方式援用至本说明书中。
本说明中记载的全部文献、专利申请以及技术规格，虽然通过参照的方式引入，但是与具体且分别地记载各个文献、专利申请以及技术规格的情况相同程度地通过参照的方式援用至本说明书中。

Claims (6)

1.一种龙涎香醇的制造方法，其中，其包含：
使四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶与3-脱氧蓍醇A反应得到龙涎香醇。
2.如权利要求1所述的龙涎香醇的制造方法，其中，所述四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶来自芽孢杆菌属细菌。
3.如权利要求1或2所述的龙涎香醇的制造方法，其中，所述四异戊二烯-β-姜黄烯环化酶来自巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及地衣芽孢杆菌中的任意一种。
4.如权利要求1～3中任意1项所述的龙涎香醇的制造方法，其中，其进一步地包含：
使能由角鲨烯生成3-脱氧蓍醇A的突变型角鲨烯-藿烯环化酶与角鲨烯反应，得到3-脱氧蓍醇A。
5.如权利要求4所述的龙涎香醇的制造方法，其中，所述突变型角鲨烯-藿烯环化酶在从由通过序列编号1表示的氨基酸序列中的377位、420位、607位以及612位所组成的群组中选出的至少1个部位上具有氨基酸置换。
6.如权利要求4或5所述的龙涎香醇的制造方法，其中，所述突变型角鲨烯-藿烯环化酶具有通过序列编号2、序列编号3、序列编号4、序列编号5、序列编号6、序列编号7以及序列编号8中的任意一者表示的氨基酸序列。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107828709A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 天津大学 异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法
CN111094571A (zh) * 2017-09-01 2020-05-01 国立大学法人新潟大学 龙涎香醇的有效制备方法
CN114630905A (zh) * 2019-07-10 2022-06-14 弗门尼舍有限公司 萜烯化合物受控降解的生物催化方法
CN115011572A (zh) * 2016-03-04 2022-09-06 国立大学法人新潟大学 变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及龙涎香醇的制备方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201507170D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Givaudan Sa Process
GB201507207D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Givaudan Sa Enzymes and applications thereof
GB201618090D0 (en) 2016-10-26 2016-12-07 Givaudan Sa Product
JP7053401B2 (ja) * 2018-08-06 2022-04-12 株式会社デンソー 新規環化物及び新規環化物の製造方法
WO2021133171A1 (en) 2019-12-24 2021-07-01 Technische Universiteit Delft Recombinant fungal cell
NL2024578B1 (en) * 2019-12-24 2021-09-06 Univ Delft Tech Recombinant fungal cell
WO2021193806A1 (ja) * 2020-03-25 2021-09-30 国立大学法人新潟大学 変異型テトラプレニル－β－クルクメン環化酵素及びそれを用いたアンブレインの製造方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10236996A (ja) * 1997-02-21 1998-09-08 Kuraray Co Ltd 光学活性なアンブレインの製造方法および該製造方法に有用な中間体化合物並びに該中間体化合物の製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4700617B2 (ja) * 2003-11-26 2011-06-15 フイルメニツヒ ソシエテ アノニム パッチュリからのセスキテルペン合成酵素
BR112015032968B1 (pt) * 2013-07-04 2022-01-25 Isobionics B.V. Processo de fermentação em duas fases para produzir isoprenoide

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10236996A (ja) * 1997-02-21 1998-09-08 Kuraray Co Ltd 光学活性なアンブレインの製造方法および該製造方法に有用な中間体化合物並びに該中間体化合物の製造方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SATO T ET AL.: "Functional analysis of the DXDDTA motif in squalene-hopene cyclase by site-directed mutagenesis experiments: initiation site of the polycyclization reaction and stabilization site of the carbocation intermediate of the initially cyclized A-ring", 《BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM.》 *
田继光: "略谈两类重要的动物香料及其合成", 《云南化工》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115011572A (zh) * 2016-03-04 2022-09-06 国立大学法人新潟大学 变异型四异戊烯基-β-姜黄烯环化酶及龙涎香醇的制备方法
CN111094571A (zh) * 2017-09-01 2020-05-01 国立大学法人新潟大学 龙涎香醇的有效制备方法
CN111094571B (zh) * 2017-09-01 2023-10-27 国立大学法人新潟大学 龙涎香醇的有效制备方法
CN107828709A (zh) * 2017-11-09 2018-03-23 天津大学 异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法
CN107828709B (zh) * 2017-11-09 2021-06-25 天津大学 异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法
CN114630905A (zh) * 2019-07-10 2022-06-14 弗门尼舍有限公司 萜烯化合物受控降解的生物催化方法

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