CN107828709B - 异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法，步骤：①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA；构建质粒1；将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌，消除质粒1，得到合成鲨烯的重组大肠杆菌，菌株1；将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯‑藿烯环化酶基因D377C SHC和巨大芽孢杆菌环化酶基因BmeTC连接为一条片段后插入大肠杆菌表达质粒p5C，得到质粒4；③将质粒4转化入菌株1，得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌，菌株4；实验证明，异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌发酵得到龙涎香醇。

Description

异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法。

背景技术

龙涎香醇((+)-Ambrein)是一种三环三萜化合物，是名贵天然动物香料和传统中药龙涎香中的主要成分，是龙涎香香气的来源，同时也是发挥镇痛、抗炎等药效的活性成分。龙涎香醇一般在高端香水市场中被应用，由于其在自然界中十分难得，使龙涎香醇在香水工业和医药方面上的应用受到了制约。

龙涎香醇最初由抹香鲸科动物抹香鲸(Physeter macrocephalus)的肠内分泌物龙涎香中分离所得，被认为是抹香鲸体内未完全消化食物而形成的一种病理性结石。龙涎香的获得有两种渠道,一是自抹香鲸体内排泄后,在海上漂浮,或被冲刷到海岸上为人们拾得。二是通过人工捕鲸所取得。自从1984年全世界禁止商业性捕鲸后,世上尚存的龙涎香已经少之又少。龙涎香醇的获得成为了行业难题，这使得龙涎香、龙涎香醇愈发地珍贵，人工拾得的天然龙涎香也远不能满足龙涎香醇在香水工业上的需求。

Oritani等以法呢基乙酸和1-溴甲基-3,3-二甲基-1-环己烯为底物，试图通过8步化学反应完成(+)-Ambrein的化学全合成。合成路径分为两个模块，第一个模块是以法呢基乙酸为底物合成二萜单元；第二个模块是以1-溴甲基-3,3-二甲基-1-环己烯为底物合成单萜单元，最后通过格氏耦合反应(Grignard coupling)将二萜和单萜单元连接在一起，形成龙涎香醇的三萜分子碳骨架。然而在关键的最后一步格式耦合反应中，单萜底物单元与二萜底物单元组合所形成的化合物出现了立体结构分化，除(+)-Ambrein之外，还产生(-)-Ambrein。Tanimoto等于1997年采用了与之前相同的合成路线，但在单萜底物单元的合成上实现了选择性的(1S)-(+)-2,2-二甲基-6-亚甲基-1-氯甲基环己烷合成，最终规避了其对映异构体(-)-Ambrein的形成，实现了龙涎香醇单一立体结构的合成。

虽然化学合成龙涎香醇取得了一定进展，但是，化学合成方法非常复杂，收率很低，远远不能满足工业生产的要求。近年来，采用合成生物学技术异源合成了一些天然产物，但在微生物中异源合成龙涎香醇还未见报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法。

本发明的第二个目的是提供一种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。

本发明的第三个目的是提供上述异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的用途。

本发明的第四个目的是提供第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法。

本发明的第五个目的是提供第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。

本发明的第六个目的是提供第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的用途。

本发明的技术方案概述如下：

异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC.47076的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA；

构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1；

将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC.47076中，通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9整合于大肠杆菌基因组上，以阿拉伯糖诱导质粒1的消除，得到合成鲨烯的重组大肠杆菌，命名为菌株1；

所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列以SEQID NO.1所示；所述供体DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.28所示；所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.8所示；

②将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377C SHC和巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC通过融合PCR连接为一条片段后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点，得到质粒4；

所述突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377C SHC的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示；

所述巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC的核苷酸序列以SEQ ID NO.3所示；

所述质粒p5C的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.33所示；

③将质粒4转化入菌株1，得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌，命名为菌株4；

所述质粒4的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.31所示。

上述方法构建的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。

上述异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌发酵生产龙涎香醇的应用。

第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因与大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC.47076的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA；

构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1；

将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC.47076中，通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因整合于大肠杆菌基因组上，以阿拉伯糖诱导质粒1的消除，得到合成鲨烯的重组大肠杆菌，命名为菌株1；

所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因的核苷酸序列以SEQ IDNO.1所示；所述供体DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.28所示；所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.8所示；

②将巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC和突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377C SHC通过融合PCR连接为一条片段BmeTC -Linker1- D377C SHC后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点，得到质粒5；

所述BmeTC -Linker1- D377C SHC基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示；

所述质粒p5C的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.33所示；

③将质粒5转化入菌株1，得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌，命名为菌株5；

所述质粒5的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.32所示。

第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法构建的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌菌株5。

异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌菌株5发酵生产龙涎香醇的应用。

本发明的优点：

本发明成功构建了异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。实验证明，本发明的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌发酵得到龙涎香醇。

附图说明

图1.质粒的遗传图谱。其中A为质粒1、B为质粒2、C为质粒3、D为质粒4、E为质粒5；

图2.大肠杆菌胞内代谢产物的GC-MS分析。其中A为鲨烯标准品、B为菌株1、C为菌株2、D为菌株3、E为菌株4、F为菌株5、G为龙涎香醇标准品；H为鲨烯标准品质谱图、I菌株1胞内产物中检测到的鲨烯的质谱图、J为龙涎香醇标准品质谱图、K为菌株4胞内产物中检测到的龙涎香醇的质谱图、L为菌株5胞内产物中检测到的龙涎香醇的质谱图；

图3.菌株4和菌株5中龙涎香醇的产量对比。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

说明：

1.截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合成酶基因简称为：ERG9。

2.突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因简称为：D377C SHC。

3.巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因简称为：BmeTC。

4.突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶和巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶融合表达的融合蛋白质基因简称为：BmeTC-Linker1-D377C SHC。

实施例1合成鯊烯的重组大肠杆菌的构建

为了在大肠杆菌基因组上构建出鲨烯合成代谢途径，首先将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9构建在组成型trc启动子下游成为一个操纵子模块trcp-ERG9。

将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC.47076(以下简称大肠杆菌ATCC.47076)的lacZ基因位点上下游同源臂融合为供体DNA；

构建靶向lacZ基因位点的gRNA的表达质粒为质粒1。

将供体DNA与质粒1一同转化入大肠杆菌ATCC.47076中，通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9整合于大肠杆菌ATCC.47076基因组上，以阿拉伯糖诱导质粒1的消除，得到合成鲨烯的重组大肠杆菌，命名为菌株1。

靶向lacZ基因位点的gRNA序列gRNA-lacZk1见序列表(SEQ ID NO.5)。构建表达gRNA-lacZk1的质粒，以(SEQ ID NO.6)和(SEQ ID NO.7)为引物，以质粒pGRB(Yifan Li etal.,Metabolic Engineering.2014,31:13-21)为模板，由PCR扩增获得待组装片段进行Golden Gate克隆反应，从而获得gRNA-lacZk1表达质粒，命名为质粒1(图1A)。

ERG9基因表达模块的trc启动子设计在引物中，以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ATCC.204508的基因组为模板，以序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10为引物，扩增得到ERG9基因表达模块trc-ERG9。同源重组所需的供体DNA片段除ERG9基因表达模块外还需要大肠杆菌lacZ基因位点的上、下游同源臂两个部分：在lacZ基因中选取483bp片段作为上游同源臂lacZ-up，在lacZ基因中选取493bp片段作为下游同源臂lacZ-down。以序列SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12为引物、大肠杆菌ATCC.47076基因组为模板进行PCR扩增，得到lacZ-up片段。以序列SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14为引物、大肠杆菌ATCC.47076基因组为模板进行PCR扩增，得到lacZ-down片段。将trc-ERG9、lacZ-up、lacZ-down三部分以融合PCR连接成为同源重组所需的供体DNA片段。

通过电转化法将表达gRNA-lacZk1的质粒1和供体DNA(lacZ-up—trc-ERG9—lacZ-down)共转化入大肠杆菌ATCC.47076中，实现CRISPR-Cas9介导的基因组编辑，将ERG9基因整合到大肠杆菌基因组上。在培养基中加入0.2％的阿拉伯糖以诱导质粒1的消除，得到具有鲨烯合成模块的重组大肠杆菌，命名为菌株1。

具体的大肠杆菌转化方法为：将50ng质粒1和100ng供体DNA片段混合后加入到50ul大肠杆菌ATCC.47076感受态细胞中，利用电转仪进行点击转化。电击后加入1ml LB培养基，置于30℃、220rpm条件下复壮2h，收集菌体涂布于氨苄青霉素筛选LB平板中，30℃培养至长出单菌落。挑取菌落进行菌落PCR验证，挑选阳性转化子。正确的阳性转化子接于含有0.2％阿拉伯糖的LB液体培养基中培养，以阿拉伯糖诱导质粒1的消除。质粒消除后的阳性转化子进行测序，验证ERG9基因有无突变，测序正确的阳性转化子，命名为菌株1。

截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列以SEQ IDNO.1所示；

供体DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.28所示；

质粒pGRB的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.34所示；

质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.8所示。

实施例2异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法

一、龙涎香醇合成相关酶表达载体的构建

①根据突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶氨基酸残基序列，进行针对大肠杆菌的密码子优化，由金斯瑞生物科技有限公司设计并合成出突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377C SHC(SEQ ID NO.2)。

将D377C SHC基因片段插入大肠杆菌表达质粒p5C(Zhenquan Lin et al.,Microbial Cell Factories.2014,13(1):104)的SacI和BamHI酶切位点，得到质粒2。

具体步骤为：以D377C SHC基因序列(SEQ ID NO.2)为模板、以序列SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16为引物，PCR扩增出D377C SHC基因片段。将D377C SHC基因片段与大肠杆菌表达质粒p5C经SacI和BamHI内切酶酶切后的片段进行重组连接，得到质粒2(图1B)。

②以巨大芽孢杆菌CGMCC 1.10466的基因组为模板，扩增并得到巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC(SEQ ID NO.3)。

将巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC插入大肠杆菌表达质粒p5C的KpnI酶切位点，得到质粒3。

具体步骤为：以巨大芽孢杆菌CGMCC 1.10466的基因组为模板，以序列SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18为引物，扩增出BmeTC基因片段。将BmeTC基因片段与大肠杆菌表达质粒p5C经KpnI内切酶酶切后的片段进行重组连接，得到质粒3(图1C)。

③分别以人工合成的D377C SHC基因(SEQ ID NO.2)和巨大芽孢杆菌CGMCC1.10466的基因组为模板，扩增出D377C SHC基因片段和BmeTC基因片段。将D377C SHC基因片段和BmeTC基因片段通过融合PCR连接后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点，得到质粒4。

具体步骤为：以D377C SHC基因序列(SEQ ID NO.2)为模板,以序列SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20为引物，扩增出D377C SHC基因片段；以巨大芽孢杆菌(1.10466，CGMCC)的基因组为模板，以序列SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22为引物，扩增出BmeTC基因片段；将D377C SHC基因片段与BmeTC基因片段以融合PCR的方式连接成一条DNA片段，将此DNA片段与大肠杆菌表达质粒p5C经EcoRI和KpnI内切酶酶切后的片段进行重组连接，得到质粒4(图1D)。

所述质粒2的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.29所示；所述质粒3的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.30所示；所述质粒4的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.31所示。

二、龙涎香醇大肠杆菌生产菌株的构建

将质粒2、3分别转化进入所构建的具有鲨烯合成模块的菌株1中，得到对照菌株2和对照菌株3。

质粒2、3分别转化进入菌株1的方法为：将50ng质粒2(或质粒3)加入到50ul菌株1的感受态细胞中，利用电转仪进行点击转化。加入1ml LB培养基，置于30℃、220rpm条件下复壮2h，收集菌体涂于氨苄青霉素筛选LB平板中，30℃培养至长出单菌落。挑取菌落进行菌落PCR验证，挑选阳性转化子，进行测序验证，测序正确的阳性转化子，命名为菌株2(或菌株3)。

将质粒4转化进入所构建的具有鲨烯合成模块的菌株1中，得到合成龙涎香醇的重组大肠杆菌，命名为菌株4。

质粒4转化进入菌株1的方法为：将50ng质粒4加入到50ul菌株1的感受态细胞中，利用电转仪进行点击转化。加入1ml LB培养基，置于30℃、220rpm条件下复壮2h，收集菌体涂于氨苄青霉素筛选LB平板中，30℃培养至长出单菌落。挑取菌落进行菌落PCR验证，挑选阳性转化子，进行测序验证，测序正确的阳性转化子，命名为菌株4。

实施例3第二种异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法

一、合成龙涎香醇的BmeTC -Linker1- D377C SHC融合蛋白质的表达载体构建

设计将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶和巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶融合表达的融合蛋白质基因(BmeTC -Linker1-D377C SHC)。将BmeTC -Linker1- D377C SHC基因(SEQ ID NO.4)插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点，得到质粒5。

融合蛋白质的设计原则是：将BmeTC基因的终止密码子删除，以连接肽(Linker1)氨基酸序列衔接，再接上带有终止密码子的D377C SHC基因片段。由于BmeTC核苷酸序列的终止密码子的缺失，在将mRNA序列翻译成氨基酸序列的过程中，反应不会终止，直到遇到D377C SHC核苷酸序列的终止密码子，于是两个蛋白就通过Linker1连接为一体。Linker1短肽序列为GSTSSGSG，相对应的核苷酸序列见序列表(SEQ ID NO.23)，设计在引物SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26中。

具体步骤为：以巨大芽孢杆菌CGMCC 1.10466的基因组为模板、以序列SEQ IDNO.24和SEQ ID NO.25为引物，PCR扩增BmeTC基因片段。以D377C SHC基因序列(SEQ IDNO.2)为模板、以序列SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27为引物，PCR扩增出D377C SHC基因片段。将扩增得到的BmeTC基因片段和D377C SHC基因片段以融合PCR的方式连接为一条DNA片段，命名为BmeTC -Linker1- D377C SHC基因。将BmeTC -Linker1- D377C SHC基因片段与大肠杆菌表达质粒p5C经EcoRI和KpnI内切酶酶切后的片段进行重组连接，得到质粒5(图1E)。

所述质粒5的DNA序列以SEQ ID NO.32所示。

二、龙涎香醇大肠杆菌生产菌株的构建

将质粒5转化进入所构建的具有鲨烯合成模块的菌株1中，得到合成龙涎香醇的重组大肠杆菌，命名为菌株5。

质粒5转化进入菌株1的方法为：将50ng质粒5加入到50ul菌株1的感受态细胞中，利用电转仪进行点击转化。加入1ml LB培养基，置于30℃、220rpm条件下复壮2h，收集菌体涂于氨苄青霉素筛选LB平板中，30℃培养至长出单菌落。挑取菌落进行菌落PCR验证，挑选阳性转化子，进行测序验证，测序正确的阳性转化子，命名为菌株5。

实施例4重组菌株的发酵过程和代谢物的提取与测定

一、重组菌株的发酵过程与代谢物提取

以所构建的菌株1进行微生物发酵，检测胞内代谢产物中鲨烯的生成。

将-80℃保存的重组菌株1转接于4mL不含抗生素的液体LB试管中，置于30℃，220rpm条件下过夜培养，直至OD₆₀₀为2左右，按3％的接种量将菌液接种于30mLTB摇瓶培养基中，置于30℃，220rpm条件下培养48h。取10mL发酵液离心并收集菌体，弃去上清，加入2mL正己烷，在冰上用超声细胞破碎仪破碎细胞，提取胞内代谢产物于正己烷溶剂中。

以所构建的菌株4和菌株5进行微生物发酵，以对照菌株2和3作为对照，检测菌株4和菌株5胞内代谢产物中龙涎香醇的生成。

将-80℃保存的重组菌株2、3、4、5转接于4mL含氨苄青霉素的液体LB试管中，置于30℃，220rpm条件下过夜培养，直至OD₆₀₀为2左右，按3％的接种量将菌液接种于30mLTB摇瓶培养基中，置于30℃，220rpm条件下培养48h。取10mL发酵液离心并收集菌体，弃去上清，加入2mL正己烷，在冰上用超声细胞破碎仪破碎细胞，提取胞内代谢产物于正己烷溶剂中。

二、代谢产物的HPLC测定和GC-MS测定

GC-MS测定：

气相色谱柱选用Agilent的HP-5ms色谱柱进样，体积1uL，溶剂延时6min。进样口温度：290℃；检测器温度：280℃；氦气流速：1.1mL/min；分流比：5:1；柱温：起始温度220℃，以3℃/min的速度升温，达到300℃时结束；MS扫描离子范围:40-450Da。

HPLC测定：

液相色谱条件：进样量20μL，色谱柱为大连依利特公司的ODS-BP色谱柱，规格为5μm，250mm*4.6mm；流动相为甲醇：乙腈＝4:6(V/V)，流速：1mL/min；紫外检测波长为203nm；柱温为30℃。制作龙涎香醇浓度的标准曲线用于定量分析菌株4和5中龙涎香醇的产量。

三、测定结果

A：导入鲨烯合成模块的菌株1中检测到鲨烯的合成(图2-A、图2-B、图2-H、图2-I)。

B：对照菌株2和3中未检测到龙涎香醇的合成(图2-C、图2-D)，菌株4、菌株5中检测到龙涎香醇的合成(图2-E、图2-F、图2-G、图2-J、图2-K、图2-L)。

C：菌株4、菌株5中龙涎香醇的产量分别为：1.47mg/L，1.03mg/L。(图3)

序列表

<110> 天津大学

<120> 异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌及其构建方法

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60

aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120

cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180

catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240

atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300

gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360

gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420

caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480

gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540

tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600

aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660

accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720

gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780

ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840

ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900

gttatggcca ttgcaacctt ggctttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960

gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020

tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080

ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140

taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200

aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtga 1257

<210> 2

<211> 1896

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcagaac aattagttga agctccagca tacgctagaa ctttggatag agctgttgaa 60

tatttgttgt cttgtcaaaa ggatgaaggt tactggtggg gtccattgtt gtcaaacgtt 120

acaatggaag ctgaatacgt tttgttgtgt catatcttgg atagagttga tagagataga 180

atggaaaaga ttagaagata tttgttgcat gaacaaagag aagatggtac ttgggcttta 240

tacccaggtg gtccaccaga tttggatact acaatcgaag catacgttgc tttgaagtac 300

atcggcatgt ctagagatga agaaccaatg caaaaagctt tgagattcat tcaatcacaa 360

ggtggtatcg aatcttcaag agtttttaca agaatgtggt tggctttagt tggtgaatat 420

ccatgggaaa aagttccaat ggttccacca gaaatcatgt tcttgggtaa aagaatgcca 480

ttgaacatct atgaattcgg ttcttgggca agagctactg ttgttgcatt gtctattgtt 540

atgtcaagac aaccagtttt tccattacca gaaagagcta gagttccaga attgtatgaa 600

acagatgttc caccaagaag aagaggtgca aaaggtggtg gtggttggat ttttgatgca 660

ttagatagag ctttgcatgg ttaccaaaag ttgtctgttc atccttttag aagagctgca 720

gaaattagag cattggattg gttgttagaa agacaagctg gtgacggttc atggggtggt 780

attcaaccac catggttcta cgcattgatc gctttgaaga tcttggatat gactcaacat 840

ccagctttta ttaaaggttg ggaaggtttg gaattatacg gtgttgaatt agattatggt 900

ggttggatgt ttcaagcttc tatttcacca gtttgggata ctggtttggc agttttggct 960

ttaagagctg caggtttacc agcagatcat gatagattgg ttaaagctgg tgaatggttg 1020

ttagatagac aaattacagt tccaggtgac tgggcagtta aaagaccaaa tttgaaacca 1080

ggtggtttcg ctttccaatt cgataacgtt tactacccag atgttgattg tactgcagtt 1140

gttgtttggg ctttgaatac attgagatta ccagatgaaa gaagaagaag agatgctatg 1200

actaaaggtt ttagatggat tgttggtatg caatcttcaa atggtggttg gggtgcttat 1260

gatgttgata acacatctga tttgccaaac catatcccat tctgtgattt cggtgaagtt 1320

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tatgatgatg catggaaagt tattagaaga gctgttgaat acttgaagag agaacaaaaa 1440

ccagatggtt cttggtttgg tagatggggt gttaattatt tgtacggtac tggtgctgtt 1500

gtttcagcat tgaaagctgt tggtatcgat acaagagaac catacatcca aaaagcattg 1560

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gaagatccag cttatgctgg taaaggtgct tctactccat cacaaacagc atgggcttta 1680

atggcattga ttgctggtgg tagagcagaa tcagaagctg caagaagagg tgttcaatat 1740

ttggttgaaa cacaaagacc agatggtggt tgggatgaac catattacac tggtacaggt 1800

tttccaggtg acttctattt gggttacact atgtacagac atgtttttcc aacattggca 1860

ttaggtagat acaaacaagc tattgaaaga agataa 1896

<210> 3

<211> 1878

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

<400> 3

atgatcatat tgctaaagga agttcagcta gagattcagc gaagaatcgc ctatctgcgc 60

ccaacacaaa aaaatgacgg gtcatttcgc tactgttttg aaacaggcgt tatgcctgat 120

gcgtttttaa ttatgcttct tcgcaccttt gatttagata aagaagtgtt gattaaacaa 180

ttaaccgaac ggatcgtttc ccttcaaaat gaagatggtc tttggacgtt gtttgatgat 240

gaagaacata acttatccgc cactattcaa gcttatacag ctcttttata ttcagggtat 300

taccaaaaaa acgaccggat tttgcgaaaa gcagaaagat atattataga ttcgggaggc 360

atttcgcgcg ctcattttct tacaagatgg atgctttctg ttaacggttt atacgagtgg 420

ccaaagctat tttacctccc gctttctctt ttgctcgtgc ctacctatgt accgcttaac 480

ttttatgaat taagcaccta tgccagaatt cacttcgttc cgatgatggt agcaggaaac 540

aaaaaatttt cacttacttc taggcataca ccttctcttt ctcatttaga tgtaagagaa 600

cagaaacagg aatcggagga aactactcaa gaatcacgcg cttctatttt tttagtcgac 660

catttaaaac agctggcttc tttaccttct tacatccaca agcttggtta tcaagcagcg 720

gagcgttaca tgctagaaag aattgaaaaa gacggaacac tctacagcta cgccacctct 780

acttttttta tgatttacgg tcttttggct cttggctata aaaaagattc atttgtgatc 840

caaaaagcaa ttgacggtat ttgttcacta cttagtacat gcagcggcca cgtgcacgta 900

gaaaactcca cgtcaaccgt ttgggatacc gcgctgctat cttacgctct acaggaagca 960

ggtgtaccgc agcaagatcc tatgattaaa ggcacaactc gctacttaaa gaaaagacag 1020

catacaaagc ttggagattg gcagtttcat aacccaaata cagcacctgg aggctggggg 1080

ttttccgata ttaatacgaa taaccctgac ttagacgata cgtctgctgc tatcagagct 1140

ctttctagaa gagcacaaac cgatacagat tatttggagt cttggcaaag aggcattaac 1200

tggctgctgt ccatgcaaaa caaagacggg ggttttgctg catttgaaaa aaatactgac 1260

tctattttat ttacttatct cccgcttgaa aatgcaaaag atgcagcgac ggatccggct 1320

actgccgatt taaccggtcg agtgcttgag tgcctcggaa actttgctgg tatgaataaa 1380

tcccaccctt cgattaaagc tgcagtaaaa tggctgtttg atcatcagtt ggataacggg 1440

agctggtacg gccggtgggg agtttgctac atttacggaa cgtgggccgc tattacagga 1500

cttcgtgctg taggggtttc tgcttctgat ccgcgtatca tcaaagctat caactggctc 1560

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aaatatgtgc cactatcgtt tagcacccct tctcaaacgg cttgggctct cgatgcttta 1680

atgacaatat gtccattaaa agatcgatcc gttgaaaaag gaattaaatt tttactgaat 1740

ccaaatctta cagagcagca aactcattac cccacgggaa ttggtcttcc tggacaattt 1800

tatattcagt accacagcta caatgatatt tttcctcttc ttgcacttgc ccactacgca 1860

aaaaaacatt cttcgtaa 1878

<210> 4

<211> 3795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgatcatat tgctaaagga agttcagcta gagattcagc gaagaatcgc ctatctgcgc 60

ccaacacaaa aaaatgacgg gtcatttcgc tactgttttg aaacaggcgt tatgcctgat 120

gcgtttttaa ttatgcttct tcgcaccttt gatttagata aagaagtgtt gattaaacaa 180

ttaaccgaac ggatcgtttc ccttcaaaat gaagatggtc tttggacgtt gtttgatgat 240

gaagaacata acttatccgc cactattcaa gcttatacag ctcttttata ttcagggtat 300

taccaaaaaa acgaccggat tttgcgaaaa gcagaaagat atattataga ttcgggaggc 360

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ccaaagctat tttacctccc gctttctctt ttgctcgtgc ctacctatgt accgcttaac 480

ttttatgaat taagcaccta tgccagaatt cacttcgttc cgatgatggt agcaggaaac 540

aaaaaatttt cacttacttc taggcataca ccttctcttt ctcatttaga tgtaagagaa 600

cagaaacagg aatcggagga aactactcaa gaatcacgcg cttctatttt tttagtcgac 660

catttaaaac agctggcttc tttaccttct tacatccaca agcttggtta tcaagcagcg 720

gagcgttaca tgctagaaag aattgaaaaa gacggaacac tctacagcta cgccacctct 780

acttttttta tgatttacgg tcttttggct cttggctata aaaaagattc atttgtgatc 840

caaaaagcaa ttgacggtat ttgttcacta cttagtacat gcagcggcca cgtgcacgta 900

gaaaactcca cgtcaaccgt ttgggatacc gcgctgctat cttacgctct acaggaagca 960

ggtgtaccgc agcaagatcc tatgattaaa ggcacaactc gctacttaaa gaaaagacag 1020

catacaaagc ttggagattg gcagtttcat aacccaaata cagcacctgg aggctggggg 1080

ttttccgata ttaatacgaa taaccctgac ttagacgata cgtctgctgc tatcagagct 1140

ctttctagaa gagcacaaac cgatacagat tatttggagt cttggcaaag aggcattaac 1200

tggctgctgt ccatgcaaaa caaagacggg ggttttgctg catttgaaaa aaatactgac 1260

tctattttat ttacttatct cccgcttgaa aatgcaaaag atgcagcgac ggatccggct 1320

actgccgatt taaccggtcg agtgcttgag tgcctcggaa actttgctgg tatgaataaa 1380

tcccaccctt cgattaaagc tgcagtaaaa tggctgtttg atcatcagtt ggataacggg 1440

agctggtacg gccggtgggg agtttgctac atttacggaa cgtgggccgc tattacagga 1500

cttcgtgctg taggggtttc tgcttctgat ccgcgtatca tcaaagctat caactggctc 1560

aaaagcattc aacaagaaga cggtggattc ggagaatcat gctatagcgc ttctttaaaa 1620

aaatatgtgc cactatcgtt tagcacccct tctcaaacgg cttgggctct cgatgcttta 1680

atgacaatat gtccattaaa agatcgatcc gttgaaaaag gaattaaatt tttactgaat 1740

ccaaatctta cagagcagca aactcattac cccacgggaa ttggtcttcc tggacaattt 1800

tatattcagt accacagcta caatgatatt tttcctcttc ttgcacttgc ccactacgca 1860

aaaaaacatt cttcgggtag cacaagtagt ggcagcggca tggcagaaca attagttgaa 1920

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gatgaaggtt actggtgggg tccattgttg tcaaacgtta caatggaagc tgaatacgtt 2040

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ttgttgcatg aacaaagaga agatggtact tgggctttat acccaggtgg tccaccagat 2160

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ttgagattac cagatgaaag aagaagaaga gatgctatga ctaaaggttt tagatggatt 3120

gttggtatgc aatcttcaaa tggtggttgg ggtgcttatg atgttgataa cacatctgat 3180

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attagaagag ctgttgaata cttgaagaga gaacaaaaac cagatggttc ttggtttggt 3360

agatggggtg ttaattattt gtacggtact ggtgctgttg tttcagcatt gaaagctgtt 3420

ggtatcgata caagagaacc atacatccaa aaagcattgg attgggttga acaacatcaa 3480

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agagcagaat cagaagctgc aagaagaggt gttcaatatt tggttgaaac acaaagacca 3660

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attgaaagaa gataa 3795

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctggggaatg aatcaggcca 20

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacaccaggt ctcactgatt cattccccag actagtatta tacctaggac tgagc 55

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cacaccaggt ctcatcaggc cagttttaga gctagaaata gcaagttaa 49

<210> 8

<211> 2107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aataggcgta tcacgaggct tgacagctag ctcagtccta ggtataatac tagttgccct 60

gactactctg ccgagtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct agtccgttat 120

caacttgaaa aagtggcacc cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 180

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 240

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 300

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 360

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 420

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 480

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 540

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 600

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 660

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 720

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 780

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 840

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 900

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 960

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taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 1380

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cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 1500

ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 1560

tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 1620

tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 1680

cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 1740

tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 1800

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tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 2040

cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 2100

ctataaa 2107

<210> 9

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtataatgct agcacgaaat cttaatctag cgggggattt tttatgggaa agctattaca 60

attgg 65

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatggaccat ttcggctcac tcttcttctt gttgggt 37

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat cccc 34

<210> 12

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gattaagatt tcgtgctagc attataccta ggactgagct agctgtcaat ttctccggcg 60

cgtaaaatg 69

<210> 13

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cccaacaaga agaagagtga gccgaaatgg tccatcaaa 39

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caactgttta ccttgtggag cgacatc 27

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttcacacag aattcgagct caaagaggag aaattaatgg cagaacaatt agttgaagc 59

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caggtcgact ctagaggatc cttatcttct ttcaatagct tgtttg 46

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgggtaccaa agaggagaaa ttaatgatca tattgctaaa ggaag 45

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcggtacctt acgaagaatg tttttttgcg 30

<210> 19

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taacaatttc acacagaatt caaagaggag aaattaatgg cagaacaatt agttgaagc 59

<210> 20

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gatcatatgt atatctcctt cttatcttct ttcaatagct tgtttg 46

<210> 21

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaaagaagat aagaaggaga tatacatatg atcatattgc taaaggaag 49

<210> 22

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tctagaggat ccccgggtac cttacgaaga atgttttttt gcg 43

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggtagcacaa gtagtggcag cggc 24

<210> 24

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

taacaatttc acacagaatt caaagaggag aaattaatga tcatattgct aaaggaagtt 60

c 61

<210> 25

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctgccatgcc gctgccacta cttgtgctac ccgaagaatg tttttttgcg tag 53

<210> 26

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cttcgggtag cacaagtagt ggcagcggca tggcagaaca attagttgaa gctc 54

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tctagaggat ccccgggtac cttatcttct ttcaatagct tgtttg 46

<210> 28

<211> 2299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa 60

gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcttt 120

gcctggtttc cggcaccaga agcggtgccg gaaagctggc tggagtgcga tcttcctgag 180

gccgatactg tcgtcgtccc ctcaaactgg cagatgcacg gttacgatgc gcccatctac 240

accaacgtga cctatcccat tacggtcaat ccgccgtttg ttcccacgga gaatccgacg 300

ggttgttact cgctcacatt taatgttgat gaaagctggc tacaggaagg ccagacgcga 360

attatttttg atggcgttaa ctcggcgttt catctgtggt gcaacgggcg ctgggtcggt 420

tacggccagg acagtcgttt gccgtctgaa tttgacctga gcgcattttt acgcgccgga 480

gaaattgaca gctagctcag tcctaggtat aatgctagca cgaaatctta atctagcggg 540

ggatttttta tgggaaagct attacaattg gcattgcatc cggtcgagat gaaggcagct 600

ttgaagctga agttttgcag aacaccgcta ttctccatct atgatcagtc cacgtctcca 660

tatctcttgc actgtttcga actgttgaac ttgacctcca gatcgtttgc tgctgtgatc 720

agagagctgc atccagaatt gagaaactgt gttactctct tttatttgat tttaagggct 780

ttggatacca tcgaagacga tatgtccatc gaacacgatt tgaaaattga cttgttgcgt 840

cacttccacg agaaattgtt gttaactaaa tggagtttcg acggaaatgc ccccgatgtg 900

aaggacagag ccgttttgac agatttcgaa tcgattctta ttgaattcca caaattgaaa 960

ccagaatatc aagaagtcat caaggagatc accgagaaaa tgggtaatgg tatggccgac 1020

tacatcttag atgaaaatta caacttgaat gggttgcaaa ccgtccacga ctacgacgtg 1080

tactgtcact acgtagctgg tttggtcggt gatggtttga cccgtttgat tgtcattgcc 1140

aagtttgcca acgaatcttt gtattctaat gagcaattgt atgaaagcat gggtcttttc 1200

ctacaaaaaa ccaacatcat cagagattac aatgaagatt tggtcgatgg tagatccttc 1260

tggcccaagg aaatctggtc acaatacgct cctcagttga aggacttcat gaaacctgaa 1320

aacgaacaac tggggttgga ctgtataaac cacctcgtct taaacgcatt gagtcatgtt 1380

atcgatgtgt tgacttattt ggccggtatc cacgagcaat ccactttcca attttgtgcc 1440

attccccaag ttatggccat tgcaaccttg gctttggtat tcaacaaccg tgaagtgcta 1500

catggcaatg taaagattcg taagggtact acctgctatt taattttgaa atcaaggact 1560

ttgcgtggct gtgtcgagat ttttgactat tacttacgtg atatcaaatc taaattggct 1620

gtgcaagatc caaatttctt aaaattgaac attcaaatct ccaagatcga acagtttatg 1680

gaagaaatgt accaggataa attacctcct aacgtgaagc caaatgaaac tccaattttc 1740

ttgaaagtta aagaaagatc cagatacgat gatgaattgg ttccaaccca acaagaagaa 1800

gagtgagccg aaatggtcca tcaaaaaatg gctttcgcta cctggagaga cgcgcccgct 1860

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc gcgcgcgaag gcgaagcggc atgcatttac 60

gttgacacca tcgaatggtg caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag 120

agtcaattca gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc agagtatgcc 180

ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa 240

acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca 300

caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggccctg 360

cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact gggtgccagc 420

gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc ggtgcacaat 480

cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga ccaggatgcc 540

attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt ctctgaccag 600

acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta cgcgactggg cgtggagcat 660

ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag ttctgtctcg 720

gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat tcagccgata 780

gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat gcaaatgctg 840

aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc gctgggcgca 900

atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac 960

gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgttaa ccaccatcaa acaggatttt 1020

cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg 1080

aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgcccaat 1140

acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 1200

tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc gcgaattgat 1260

ctggtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc 1320

atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa 1380

ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata 1440

ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc 1500

ggataacaat ttcacacaga attcaaagag gagaaattaa tggcagaaca attagttgaa 1560

gctccagcat acgctagaac tttggataga gctgttgaat atttgttgtc ttgtcaaaag 1620

gatgaaggtt actggtgggg tccattgttg tcaaacgtta caatggaagc tgaatacgtt 1680

ttgttgtgtc atatcttgga tagagttgat agagatagaa tggaaaagat tagaagatat 1740

ttgttgcatg aacaaagaga agatggtact tgggctttat acccaggtgg tccaccagat 1800

ttggatacta caatcgaagc atacgttgct ttgaagtaca tcggcatgtc tagagatgaa 1860

gaaccaatgc aaaaagcttt gagattcatt caatcacaag gtggtatcga atcttcaaga 1920

gtttttacaa gaatgtggtt ggctttagtt ggtgaatatc catgggaaaa agttccaatg 1980

gttccaccag aaatcatgtt cttgggtaaa agaatgccat tgaacatcta tgaattcggt 2040

tcttgggcaa gagctactgt tgttgcattg tctattgtta tgtcaagaca accagttttt 2100

ccattaccag aaagagctag agttccagaa ttgtatgaaa cagatgttcc accaagaaga 2160

agaggtgcaa aaggtggtgg tggttggatt tttgatgcat tagatagagc tttgcatggt 2220

taccaaaagt tgtctgttca tccttttaga agagctgcag aaattagagc attggattgg 2280

ttgttagaaa gacaagctgg tgacggttca tggggtggta ttcaaccacc atggttctac 2340

gcattgatcg ctttgaagat cttggatatg actcaacatc cagcttttat taaaggttgg 2400

gaaggtttgg aattatacgg tgttgaatta gattatggtg gttggatgtt tcaagcttct 2460

atttcaccag tttgggatac tggtttggca gttttggctt taagagctgc aggtttacca 2520

gcagatcatg atagattggt taaagctggt gaatggttgt tagatagaca aattacagtt 2580

ccaggtgact gggcagttaa aagaccaaat ttgaaaccag gtggtttcgc tttccaattc 2640

gataacgttt actacccaga tgttgattgt actgcagttg ttgtttgggc tttgaataca 2700

ttgagattac cagatgaaag aagaagaaga gatgctatga ctaaaggttt tagatggatt 2760

gttggtatgc aatcttcaaa tggtggttgg ggtgcttatg atgttgataa cacatctgat 2820

ttgccaaacc atatcccatt ctgtgatttc ggtgaagtta ctgatccacc atctgaagat 2880

gttacagctc atgttttaga atgtttcggt tcattcggtt atgatgatgc atggaaagtt 2940

attagaagag ctgttgaata cttgaagaga gaacaaaaac cagatggttc ttggtttggt 3000

agatggggtg ttaattattt gtacggtact ggtgctgttg tttcagcatt gaaagctgtt 3060

ggtatcgata caagagaacc atacatccaa aaagcattgg attgggttga acaacatcaa 3120

aatccagatg gtggttgggg tgaagattgt agatcttacg aagatccagc ttatgctggt 3180

aaaggtgctt ctactccatc acaaacagca tgggctttaa tggcattgat tgctggtggt 3240

agagcagaat cagaagctgc aagaagaggt gttcaatatt tggttgaaac acaaagacca 3300

gatggtggtt gggatgaacc atattacact ggtacaggtt ttccaggtga cttctatttg 3360

ggttacacta tgtacagaca tgtttttcca acattggcat taggtagata caaacaagct 3420

attgaaagaa gataagaagg agatatacat atgatcatat tgctaaagga agttcagcta 3480

gagattcagc gaagaatcgc ctatctgcgc ccaacacaaa aaaatgacgg gtcatttcgc 3540

tactgttttg aaacaggcgt tatgcctgat gcgtttttaa ttatgcttct tcgcaccttt 3600

gatttagata aagaagggtt gattaaacaa ttaaccgaac ggatcatttc ccttcaaaat 3660

gaagatggtc tttggacgtt gtttgatgat gaaaaacata acttatccgc cactattcaa 3720

gcttatacag ctcttttata ttcagggtat taccaaaaaa acgaccggat tttgcgaaaa 3780

gcagaaagat atattataga ttcgggaggc atttcgcgcg ctcattttct tacaagatgg 3840

atgctttctg ttaacggttt atacgagtgg ccaaagctat tttacctccc gctttctctt 3900

ttgctcgtgc ctacctatgt accgcttaac ttttatgaat taagcaccta tgccagaatt 3960

cacttcgttc cgatgatggt agcaggaaac aaaaaatttt cacttacttc taggcataca 4020

ccttctcttt ctcatttaga tgtaagagaa cagaatcagg aatcggagga aactactcaa 4080

gaatcacgcg cttctatttt tttagtcgac catttaaaac agctggcttc tttaccttct 4140

tacatccaca agcttggtta tcaagcagcg gagcgttaca tgctagaaag aattgaaaaa 4200

gacggaacac tctacagcta cgccacctct acttttttta tgatttacgg tcttttggct 4260

cttggctata aaaaagattc atttgtgatc caaaaagcaa ttgacggtat ttgttcacta 4320

cttagtacat gcagcggcca cgtgcacgta gaaaactcca cgtcaaccgt ttgggatacc 4380

gcgctgctat cttacgctct acaggaagca ggtgtaccgc agcaagatcc tatgattaaa 4440

ggctcaactc gctacttaaa gaaaagacag catacaaagc ttggagattg gcagtttcat 4500

aacccaaata cagcacctgg aggctggggg ttttccgata ttaatacgaa taaccctgac 4560

ttagacgata cgtctgctgc tatcagagct ctttctagaa gagcacaaac cgatacagat 4620

tatttggagt cttggcaaag aggcattaac tggctgctgt ccatgcaaaa caaagacggg 4680

ggttttgctg catttgaaaa aaatactgac tctattttat ttacttatct cccgcttgaa 4740

aatgcaaaag atgcagcgac ggatccggct actgccgatt taaccggtcg agtgcttgag 4800

tgcctcggaa actttgctgg tatgaataaa tcccaccctt cgattaaagc tgcagtaaaa 4860

tggctgtttg atcatcagtt ggataacggg agctggtacg gccggtgggg agtttgctac 4920

atttacggaa cgtgggccgc tattacagga cttcgtgctg taggggtttc tgcttctgat 4980

ccgcgtatca tcaaagctat caactggctc aaaagcattc aacaagaaga cggtggattc 5040

ggagaatcat gctatagcgc ttctttaaaa aaatatgtgc cactatcgtt tagcacccct 5100

tctcaaacgg cttgggctct cgatgcttta atgacaatat gtccattaaa agatcgagcc 5160

gttgaaaaag gaattaaatt tttactgaat ccaaatctta cagagcagca aactcattac 5220

cccacgggaa ttggtcttcc tggacaattt tatattcagt accacagcta caatgatatt 5280

tttcctcttc ttgcacttgc ccactacgca aaaaaacatt cttcgtaagg tacccgggga 5340

tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttggctgtt ttggcggatg agagaagatt 5400

ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct 5460

ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt 5520

agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat 5580

aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa 5640

cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc 5700

cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc 5760

catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct acaaactctt tttgtttatt tttctaaata 5820

cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 5880

aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 5940

ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 6000

cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 6060

agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 6120

gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 6180

cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 6240

gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 6300

ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 6360

gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 6420

gacaccacga tgcctacagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 6480

cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 6540

ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 6600

gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 6660

gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 6720

gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 6780

ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt 6840

gataatctca tgaccaaaat ctaagcctgt tgatgatacc gctgccttac tgggtgcatt 6900

agccagtctg aatgacctgt cacgggataa tccgaagtgg tcagactgga aaatcagagg 6960

gcaggaactg ctgaacagca aaaagtcaga tagcaccaca tagcagaccc gccataaaac 7020

gccctgagaa gcccgtgacg ggcttttctt gtattatggg tagtttcctt gcatgaatcc 7080

ataaaaggcg cctgtagtgc catttacccc cattcactgc cagagccgtg agcgcagcga 7140

actgaatgtc acgaaaaaga cagcgactca ggtgcctgat ggtcggagac aaaaggaata 7200

ttcagcgatt tgcccgagct tgcgagggtg ctacttaagc ctttagggtt ttaaggtctg 7260

ttttgtagag gagcaaacag cgtttgcgac atccttttgt aatactgcgg aactgactaa 7320

agtagtgagt tatacacagg gctgggatct attcttttta tcttttttta ttctttcttt 7380

attctataaa ttataaccac ttgaatataa acaaaaaaaa cacacaaagg tctagcggaa 7440

tttacagagg gtctagcaga atttacaagt tttccagcaa aggtctagca gaatttacag 7500

atacccacaa ctcaaaggaa aaggactagt aattatcatt gactagccca tctcaattgg 7560

tatagtgatt aaaatcacct agaccaattg agatgtatgt ctgaattagt tgttttcaaa 7620

gcaaatgaac tagcgattag tcgctatgac ttaacggagc atgaaaccaa gctaatttta 7680

tgctgtgtgg cactactcaa ccccacgatt gaaaacccta caaggaaaga acggacggta 7740

tcgttcactt ataaccaata cgctcagatg atgaacatca gtagggaaaa tgcttatggt 7800

gtattagcta aagcaaccag agagctgatg acgagaactg tggaaatcag gaatcctttg 7860

gttaaaggct ttgagatttt ccagtggaca aactatgcca agttctcaag cgaaaaatta 7920

gaattagttt ttagtgaaga gatattgcct tatcttttcc agttaaaaaa attcataaaa 7980

tataatctgg aacatgttaa gtcttttgaa aacaaatact ctatgaggat ttatgagtgg 8040

ttattaaaag aactaacaca aaagaaaact cacaaggcaa atatagagat tagccttgat 8100

gaatttaagt tcatgttaat gcttgaaaat aactaccatg agtttaaaag gcttaaccaa 8160

tgggttttga aaccaataag taaagattta aacacttaca gcaatatgaa attggtggtt 8220

gataagcgag gccgcccgac tgatacgttg attttccaag ttgaactaga tagacaaatg 8280

gatctcgtaa ccgaacttga gaacaaccag ataaaaatga atggtgacaa aataccaaca 8340

accattacat cagattccta cctacataac ggactaagaa aaacactaca cgatgcttta 8400

actgcaaaaa ttcagctcac cagttttgag gcaaaatttt tgagtgacat gcaaagtaag 8460

tatgatctca atggttcgtt ctcatggctc acgcaaaaac aacgaaccac actagagaac 8520

atactggcta aatacggaag gatctgaggt tcttatggct cttgtatcta tcagtgaagc 8580

atcaagacta acaaacaaaa gtagaacaac tgttcaccgt tacatatcaa agggaaaact 8640

gtccatatgc acagatgaaa acggtgtaaa aaagatagat acatcagagc ttttacgagt 8700

ttttggtgca ttcaaagctg ttcaccatga acagatcgac aatgtaac 8748

<210> 32

<211> 8754

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc gcgcgcgaag gcgaagcggc atgcatttac 60

gttgacacca tcgaatggtg caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag 120

agtcaattca gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc agagtatgcc 180

ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa 240

acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca 300

caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggccctg 360

cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact gggtgccagc 420

gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc ggtgcacaat 480

cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga ccaggatgcc 540

attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt ctctgaccag 600

acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta cgcgactggg cgtggagcat 660

ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag ttctgtctcg 720

gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat tcagccgata 780

gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat gcaaatgctg 840

aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc gctgggcgca 900

atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac 960

gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgttaa ccaccatcaa acaggatttt 1020

cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg 1080

aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgcccaat 1140

acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 1200

tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc gcgaattgat 1260

ctggtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc 1320

atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa 1380

ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata 1440

ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc 1500

ggataacaat ttcacacaga attcaaagag gagaaattaa tgatcatatt gctaaaggaa 1560

gttcagctag agattcagcg aagaatcgcc tatctgcgcc caacacaaaa aaatgacggg 1620

tcatttcgct actgttttga aacaggcgtt atgcctgatg cgtttttaat tatgcttctt 1680

cgcacctttg atttagataa agaagggttg attaaacaat taaccgaacg gatcatttcc 1740

cttcaaaatg aagatggtct ttggacgttg tttgatgatg aaaaacataa cttatccgcc 1800

actattcaag cttatacagc tcttttatat tcagggtatt accaaaaaaa cgaccggatt 1860

ttgcgaaaag cagaaagata tattatagat tcgggaggca tttcgcgcgc tcattttctt 1920

acaagatgga tgctttctgt taacggttta tacgagtggc caaagctatt ttacctcccg 1980

ctttctcttt tgctcgtgcc tacctatgta ccgcttaact tttatgaatt aagcacctat 2040

gccagaattc acttcgttcc gatgatggta gcaggaaaca aaaaattttc acttacttct 2100

aggcatacac cttctctttc tcatttagat gtaagagaac agaatcagga atcggaggaa 2160

actactcaag aatcacgcgc ttctattttt ttagtcgacc atttaaaaca gctggcttct 2220

ttaccttctt acatccacaa gcttggttat caagcagcgg agcgttacat gctagaaaga 2280

attgaaaaag acggaacact ctacagctac gccacctcta ctttttttat gatttacggt 2340

cttttggctc ttggctataa aaaagattca tttgtgatcc aaaaagcaat tgacggtatt 2400

tgttcactac ttagtacatg cagcggccac gtgcacgtag aaaactccac gtcaaccgtt 2460

tgggataccg cgctgctatc ttacgctcta caggaagcag gtgtaccgca gcaagatcct 2520

atgattaaag gctcaactcg ctacttaaag aaaagacagc atacaaagct tggagattgg 2580

cagtttcata acccaaatac agcacctgga ggctgggggt tttccgatat taatacgaat 2640

aaccctgact tagacgatac gtctgctgct atcagagctc tttctagaag agcacaaacc 2700

gatacagatt atttggagtc ttggcaaaga ggcattaact ggctgctgtc catgcaaaac 2760

aaagacgggg gttttgctgc atttgaaaaa aatactgact ctattttatt tacttatctc 2820

ccgcttgaaa atgcaaaaga tgcagcgacg gatccggcta ctgccgattt aaccggtcga 2880

gtgcttgagt gcctcggaaa ctttgctggt atgaataaat cccacccttc gattaaagct 2940

gcagtaaaat ggctgtttga tcatcagttg gataacggga gctggtacgg ccggtgggga 3000

gtttgctaca tttacggaac gtgggccgct attacaggac ttcgtgctgt aggggtttct 3060

gcttctgatc cgcgtatcat caaagctatc aactggctca aaagcattca acaagaagac 3120

ggtggattcg gagaatcatg ctatagcgct tctttaaaaa aatatgtgcc actatcgttt 3180

agcacccctt ctcaaacggc ttgggctctc gatgctttaa tgacaatatg tccattaaaa 3240

gatcgagccg ttgaaaaagg aattaaattt ttactgaatc caaatcttac agagcagcaa 3300

actcattacc ccacgggaat tggtcttcct ggacaatttt atattcagta ccacagctac 3360

aatgatattt ttcctcttct tgcacttgcc cactacgcaa aaaaacattc ttcgggtagc 3420

acaagtagtg gcagcggcat ggcagaacaa ttagttgaag ctccagcata cgctagaact 3480

ttggatagag ctgttgaata tttgttgtct tgtcaaaagg atgaaggtta ctggtggggt 3540

ccattgttgt caaacgttac aatggaagct gaatacgttt tgttgtgtca tatcttggat 3600

agagttgata gagatagaat ggaaaagatt agaagatatt tgttgcatga acaaagagaa 3660

gatggtactt gggctttata cccaggtggt ccaccagatt tggatactac aatcgaagca 3720

tacgttgctt tgaagtacat cggcatgtct agagatgaag aaccaatgca aaaagctttg 3780

agattcattc aatcacaagg tggtatcgaa tcttcaagag tttttacaag aatgtggttg 3840

gctttagttg gtgaatatcc atgggaaaaa gttccaatgg ttccaccaga aatcatgttc 3900

ttgggtaaaa gaatgccatt gaacatctat gaattcggtt cttgggcaag agctactgtt 3960

gttgcattgt ctattgttat gtcaagacaa ccagtttttc cattaccaga aagagctaga 4020

gttccagaat tgtatgaaac agatgttcca ccaagaagaa gaggtgcaaa aggtggtggt 4080

ggttggattt ttgatgcatt agatagagct ttgcatggtt accaaaagtt gtctgttcat 4140

ccttttagaa gagctgcaga aattagagca ttggattggt tgttagaaag acaagctggt 4200

gacggttcat ggggtggtat tcaaccacca tggttctacg cattgatcgc tttgaagatc 4260

ttggatatga ctcaacatcc agcttttatt aaaggttggg aaggtttgga attatacggt 4320

gttgaattag attatggtgg ttggatgttt caagcttcta tttcaccagt ttgggatact 4380

ggtttggcag ttttggcttt aagagctgca ggtttaccag cagatcatga tagattggtt 4440

aaagctggtg aatggttgtt agatagacaa attacagttc caggtgactg ggcagttaaa 4500

agaccaaatt tgaaaccagg tggtttcgct ttccaattcg ataacgttta ctacccagat 4560

gttgattgta ctgcagttgt tgtttgggct ttgaatacat tgagattacc agatgaaaga 4620

agaagaagag atgctatgac taaaggtttt agatggattg ttggtatgca atcttcaaat 4680

ggtggttggg gtgcttatga tgttgataac acatctgatt tgccaaacca tatcccattc 4740

tgtgatttcg gtgaagttac tgatccacca tctgaagatg ttacagctca tgttttagaa 4800

tgtttcggtt cattcggtta tgatgatgca tggaaagtta ttagaagagc tgttgaatac 4860

ttgaagagag aacaaaaacc agatggttct tggtttggta gatggggtgt taattatttg 4920

tacggtactg gtgctgttgt ttcagcattg aaagctgttg gtatcgatac aagagaacca 4980

tacatccaaa aagcattgga ttgggttgaa caacatcaaa atccagatgg tggttggggt 5040

gaagattgta gatcttacga agatccagct tatgctggta aaggtgcttc tactccatca 5100

caaacagcat gggctttaat ggcattgatt gctggtggta gagcagaatc agaagctgca 5160

agaagaggtg ttcaatattt ggttgaaaca caaagaccag atggtggttg ggatgaacca 5220

tattacactg gtacaggttt tccaggtgac ttctatttgg gttacactat gtacagacat 5280

gtttttccaa cattggcatt aggtagatac aaacaagcta ttgaaagaag ataaggtacc 5340

cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg gctgttttgg cggatgagag 5400

aagattttca gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat 5460

ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa 5520

cgccgtagcg ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca 5580

tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc 5640

ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca 5700

acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca 5760

gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actctttttg tttatttttc 5820

taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 5880

tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 5940

gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 6000

gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 6060

cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 6120

tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 6180

tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 6240

atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 6300

ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 6360

gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 6420

gagcgtgaca ccacgatgcc tacagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 6480

gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 6540

gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 6600

gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 6660

cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 6720

atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 6780

tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 6840

ctttttgata atctcatgac caaaatctaa gcctgttgat gataccgctg ccttactggg 6900

tgcattagcc agtctgaatg acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat 6960

cagagggcag gaactgctga acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca 7020

taaaacgccc tgagaagccc gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat 7080

gaatccataa aaggcgcctg tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg 7140

cagcgaactg aatgtcacga aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa 7200

ggaatattca gcgatttgcc cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa 7260

ggtctgtttt gtagaggagc aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact 7320

gactaaagta gtgagttata cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct 7380

ttctttattc tataaattat aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta 7440

gcggaattta cagagggtct agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat 7500

ttacagatac ccacaactca aaggaaaagg actagtaatt atcattgact agcccatctc 7560

aattggtata gtgattaaaa tcacctagac caattgagat gtatgtctga attagttgtt 7620

ttcaaagcaa atgaactagc gattagtcgc tatgacttaa cggagcatga aaccaagcta 7680

attttatgct gtgtggcact actcaacccc acgattgaaa accctacaag gaaagaacgg 7740

acggtatcgt tcacttataa ccaatacgct cagatgatga acatcagtag ggaaaatgct 7800

tatggtgtat tagctaaagc aaccagagag ctgatgacga gaactgtgga aatcaggaat 7860

cctttggtta aaggctttga gattttccag tggacaaact atgccaagtt ctcaagcgaa 7920

aaattagaat tagtttttag tgaagagata ttgccttatc ttttccagtt aaaaaaattc 7980

ataaaatata atctggaaca tgttaagtct tttgaaaaca aatactctat gaggatttat 8040

gagtggttat taaaagaact aacacaaaag aaaactcaca aggcaaatat agagattagc 8100

cttgatgaat ttaagttcat gttaatgctt gaaaataact accatgagtt taaaaggctt 8160

aaccaatggg ttttgaaacc aataagtaaa gatttaaaca cttacagcaa tatgaaattg 8220

gtggttgata agcgaggccg cccgactgat acgttgattt tccaagttga actagataga 8280

caaatggatc tcgtaaccga acttgagaac aaccagataa aaatgaatgg tgacaaaata 8340

ccaacaacca ttacatcaga ttcctaccta cataacggac taagaaaaac actacacgat 8400

gctttaactg caaaaattca gctcaccagt tttgaggcaa aatttttgag tgacatgcaa 8460

agtaagtatg atctcaatgg ttcgttctca tggctcacgc aaaaacaacg aaccacacta 8520

gagaacatac tggctaaata cggaaggatc tgaggttctt atggctcttg tatctatcag 8580

tgaagcatca agactaacaa acaaaagtag aacaactgtt caccgttaca tatcaaaggg 8640

aaaactgtcc atatgcacag atgaaaacgg tgtaaaaaag atagatacat cagagctttt 8700

acgagttttt ggtgcattca aagctgttca ccatgaacag atcgacaatg taac 8754

<210> 33

<211> 4950

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

accgaaacgc gcgaggcagc agatcaattc gcgcgcgaag gcgaagcggc atgcatttac 60

gttgacacca tcgaatggtg caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag 120

agtcaattca gggtggtgaa tgtgaaacca gtaacgttat acgatgtcgc agagtatgcc 180

ggtgtctctt atcagaccgt ttcccgcgtg gtgaaccagg ccagccacgt ttctgcgaaa 240

acgcgggaaa aagtggaagc ggcgatggcg gagctgaatt acattcccaa ccgcgtggca 300

caacaactgg cgggcaaaca gtcgttgctg attggcgttg ccacctccag tctggccctg 360

cacgcgccgt cgcaaattgt cgcggcgatt aaatctcgcg ccgatcaact gggtgccagc 420

gtggtggtgt cgatggtaga acgaagcggc gtcgaagcct gtaaagcggc ggtgcacaat 480

cttctcgcgc aacgcgtcag tgggctgatc attaactatc cgctggatga ccaggatgcc 540

attgctgtgg aagctgcctg cactaatgtt ccggcgttat ttcttgatgt ctctgaccag 600

acacccatca acagtattat tttctcccat gaagacggta cgcgactggg cgtggagcat 660

ctggtcgcat tgggtcacca gcaaatcgcg ctgttagcgg gcccattaag ttctgtctcg 720

gcgcgtctgc gtctggctgg ctggcataaa tatctcactc gcaatcaaat tcagccgata 780

gcggaacggg aaggcgactg gagtgccatg tccggttttc aacaaaccat gcaaatgctg 840

aatgagggca tcgttcccac tgcgatgctg gttgccaacg atcagatggc gctgggcgca 900

atgcgcgcca ttaccgagtc cgggctgcgc gttggtgcgg atatctcggt agtgggatac 960

gacgataccg aagacagctc atgttatatc ccgccgttaa ccaccatcaa acaggatttt 1020

cgcctgctgg ggcaaaccag cgtggaccgc ttgctgcaac tctctcaggg ccaggcggtg 1080

aagggcaatc agctgttgcc cgtctcactg gtgaaaagaa aaaccaccct ggcgcccaat 1140

acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt 1200

tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc gcgaattgat 1260

ctggtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc 1320

atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa 1380

ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata 1440

ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc 1500

ggataacaat ttcacacaga attcgagctc ggtacccggg gatcctctag agtcgacctg 1560

caggcatgca agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt 1620

aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg 1680

gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg 1740

gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 1800

gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac 1860

aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg 1920

acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct 1980

ttttgcgttt ctacaaactc tttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 2040

ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 2100

attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 2160

gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 2220

ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 2280

cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt 2340

gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 2400

tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 2460

gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 2520

ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 2580

tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctaca 2640

gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 2700

caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 2760

cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 2820

atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 2880

gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 2940

attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 3000

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3060

atctaagcct gttgatgata ccgctgcctt actgggtgca ttagccagtc tgaatgacct 3120

gtcacgggat aatccgaagt ggtcagactg gaaaatcaga gggcaggaac tgctgaacag 3180

caaaaagtca gatagcacca catagcagac ccgccataaa acgccctgag aagcccgtga 3240

cgggcttttc ttgtattatg ggtagtttcc ttgcatgaat ccataaaagg cgcctgtagt 3300

gccatttacc cccattcact gccagagccg tgagcgcagc gaactgaatg tcacgaaaaa 3360

gacagcgact caggtgcctg atggtcggag acaaaaggaa tattcagcga tttgcccgag 3420

cttgcgaggg tgctacttaa gcctttaggg ttttaaggtc tgttttgtag aggagcaaac 3480

agcgtttgcg acatcctttt gtaatactgc ggaactgact aaagtagtga gttatacaca 3540

gggctgggat ctattctttt tatctttttt tattctttct ttattctata aattataacc 3600

acttgaatat aaacaaaaaa aacacacaaa ggtctagcgg aatttacaga gggtctagca 3660

gaatttacaa gttttccagc aaaggtctag cagaatttac agatacccac aactcaaagg 3720

aaaaggacta gtaattatca ttgactagcc catctcaatt ggtatagtga ttaaaatcac 3780

ctagaccaat tgagatgtat gtctgaatta gttgttttca aagcaaatga actagcgatt 3840

agtcgctatg acttaacgga gcatgaaacc aagctaattt tatgctgtgt ggcactactc 3900

aaccccacga ttgaaaaccc tacaaggaaa gaacggacgg tatcgttcac ttataaccaa 3960

tacgctcaga tgatgaacat cagtagggaa aatgcttatg gtgtattagc taaagcaacc 4020

agagagctga tgacgagaac tgtggaaatc aggaatcctt tggttaaagg ctttgagatt 4080

ttccagtgga caaactatgc caagttctca agcgaaaaat tagaattagt ttttagtgaa 4140

gagatattgc cttatctttt ccagttaaaa aaattcataa aatataatct ggaacatgtt 4200

aagtcttttg aaaacaaata ctctatgagg atttatgagt ggttattaaa agaactaaca 4260

caaaagaaaa ctcacaaggc aaatatagag attagccttg atgaatttaa gttcatgtta 4320

atgcttgaaa ataactacca tgagtttaaa aggcttaacc aatgggtttt gaaaccaata 4380

agtaaagatt taaacactta cagcaatatg aaattggtgg ttgataagcg aggccgcccg 4440

actgatacgt tgattttcca agttgaacta gatagacaaa tggatctcgt aaccgaactt 4500

gagaacaacc agataaaaat gaatggtgac aaaataccaa caaccattac atcagattcc 4560

tacctacata acggactaag aaaaacacta cacgatgctt taactgcaaa aattcagctc 4620

accagttttg aggcaaaatt tttgagtgac atgcaaagta agtatgatct caatggttcg 4680

ttctcatggc tcacgcaaaa acaacgaacc acactagaga acatactggc taaatacgga 4740

aggatctgag gttcttatgg ctcttgtatc tatcagtgaa gcatcaagac taacaaacaa 4800

aagtagaaca actgttcacc gttacatatc aaagggaaaa ctgtccatat gcacagatga 4860

aaacggtgta aaaaagatag atacatcaga gcttttacga gtttttggtg cattcaaagc 4920

tgttcaccat gaacagatcg acaatgtaac 4950

<210> 34

<211> 2706

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

aataggcgta tcacgaggct tgacagctag ctcagtccta ggtataatac tagttgtttc 60

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 120

taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 180

cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg 240

tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc 300

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 360

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 420

cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga 480

tccccgggta ccgagctcga attcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 540

ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 600

tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 660

gggaaacctg tcagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 720

aacttgaaaa agtggcaccc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 780

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 840

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 900

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 960

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 1020

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 1080

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 1140

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 1200

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 1260

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 1320

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 1380

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 1440

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 1500

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 1560

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 1620

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 1680

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 1740

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 1800

gcaatgatac cgcgtgaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 1860

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 1920

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 1980

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 2040

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 2100

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 2160

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 2220

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 2280

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 2340

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 2400

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 2460

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 2520

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 2580

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 2640

acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 2700

tataaa 2706

Claims (6)

1.异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9与大肠杆菌的lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA；

构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1；

将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌中，通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9整合于大肠杆菌基因组上，以阿拉伯糖诱导质粒1的消除，得到合成鲨烯的重组大肠杆菌，命名为菌株1；

所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因ERG9的核苷酸序列以SEQ IDNO.1所示；

所述供体DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.28所示；

所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.8所示；

②将突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377C SHC和巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC通过融合PCR连接为一条片段后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点，得到质粒4；

所述突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377C SHC的核苷酸序列以SEQ ID NO.2所示；

所述巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC的核苷酸序列以SEQID NO.3所示；

所述质粒p5C的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.33所示；

③将质粒4转化入菌株1，得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌，命名为菌株4；

所述质粒4的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.31所示。

2.权利要求1的方法构建的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌。

3.权利要求2的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌发酵生产龙涎香醇的应用。

4.异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：

①将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因与大肠杆菌lacZ位点的上下游同源臂融合为供体DNA；

构建靶向lacZ位点的gRNA的表达质粒为质粒1；

将供体DNA与质粒1一同转化进入大肠杆菌中，通过CRISPR-Cas9介导的基因组编辑将截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因整合于大肠杆菌基因组上，以阿拉伯糖诱导质粒1的消除，得到合成鲨烯的重组大肠杆菌，命名为菌株1；

所述截短C端26个氨基酸残基的酿酒酵母鲨烯合酶基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.1所示；

所述供体DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.28所示；

所述质粒1的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.8所示；

②将巨大芽孢杆菌tetraprenyl-β-curcumene环化酶基因BmeTC和突变第377个氨基酸残基为半胱氨酸残基后的酸热脂环酸芽孢杆菌鲨烯-藿烯环化酶基因D377C SHC通过融合PCR连接为一条片段BmeTC -Linker1- D377C SHC后插入大肠杆菌表达质粒p5C的EcoRI和KpnI酶切位点，得到质粒5；

所述BmeTC -Linker1- D377C SHC基因的核苷酸序列以SEQ ID NO.4所示；

所述质粒p5C的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.33所示；

③将质粒5转化入菌株1，得到异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌，命名为菌株5；

所述质粒5的DNA的核苷酸序列以SEQ ID NO.32所示。

5.权利要求4的方法构建的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌菌株。

6.权利要求5的异源合成龙涎香醇的重组大肠杆菌发酵生产龙涎香醇的应用。

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