BR112015032968B1

BR112015032968B1 - Processo de fermentação em duas fases para produzir isoprenoide

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Publication number: BR112015032968B1
Application number: BR112015032968-3A
Authority: BR
Inventors: Antonius Cornelis Johannes Matheus Janssen; Joannes Gerardus Theodorus Kierkels; Georg Friedrich Lentzen
Original assignee: Isobionics B.V.
Priority date: 2013-07-04
Filing date: 2014-07-04
Publication date: 2022-01-25
Also published as: EP3017050A1; EP3017050B1; US11072805B2; ES2834978T3; HUE051864T2; US20190225994A1; SI3017050T1; BR112015032968A2; WO2015002528A1; US20160168595A1

Abstract

biorreator e processo de fermentação em duas fases para produzir composto orgânico. a invenção refere-se a um processo de fermentação em duas fases para a produção de um composto orgânico, em particular, um isoprenoide e a um biorreator que compreende um sistema de fermentação de duas fases para a produção de um composto orgânico.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO

[0001] A invenção refere-se a um processo de fermentação em duas fases para a produção de um composto orgânico, em particular, um isoprenoide e a um biorreator que compreende um sistema de fermentação de duas fases para a produção de um composto orgânico.

[0002] Isoprenoides (também conhecidos como terpenoides ou terpenos) são uma classe grande e diversificada de compostos orgânicos de ocorrência natural que encontram utilidade potencial, inter alia, na produção de produtos farmacêuticos, cosméticos, perfumes, flavorizantes, suplementos de ração animal e nutracêuticos.

[0003] Métodos de produção convencionais envolvem, por exemplo, a extração destes compostos de plantas, micróbios e animais. No entanto, estes métodos sofrem de numerosos limitações de extração, tais como baixo rendimento da extração, a falta de receptividade dos organismos de origem para o cultivo em grande escala e os métodos de produção complicados. Além disso, métodos de síntese química para a produção de isoprenoides não são lucrativos, devido ao elevado custo das matérias primas e da exigência de extensas etapas de purificação do produto. Abordagens enzimáticas in vitro também têm sido exploradas, mas a exploração desta abordagem é, por exemplo, restringida pela disponibilidade limitada de precursores.

[0004] Acredita-se que a engenharia metabólica de microorganismos para a produção de isoprenoides mais mais promissora para a produção de grandes quantidades de isoprenoides de fontes de carbono baratas em processos de fermentação, embora alguns obstáculos ainda tenham de ser enfretados (revisto em Ajikumar et al., Mol. Pharmaceutics, 2008, 5 (2), 167-190). A produção de isoprenoide através da fermentação de micro-organismos é considerada mais desejável do que os métodos tradicionais, uma vez que atende a exigência da produção sustentável de uma maneira mais econômica, industrialmente escalável e produtiva. A produção de isoprenoides via métodos de fermentação representa uma tecnologia de processo alternativo que se utiliza de menores custos de matéria-prima e maior produtividade, fornecendo um potencial para redução dos custos de fabricação.

[0005] Um dos problemas mais frequentemente encontrados em processos de fermentação é a inibição do produto final, isto é, os micro-organismos responsáveis pela fermentação podem ser prejudicados pelo produto da fermentação, por exemplo, porque o produto da fermentação é citotóxico. A acumulação do produto além de uma concentração crítica inativa o micro-organismo e diminui substancialmente a taxa de produtividade. Este fenômeno é particularmente relevante na produção de isoprenoides já que a maioria dos micróbios são destruídos ou inativados na presença destes compostos citotóxicos que representam uma grave limitação para se obter linhagens altamente produtivas. Devido a estes compostos não serem obtidos além de uma concentração crítica, etapas adicionais de purificação e concentração podem ser necessárias tornando processo complicado e caro.

[0006] Outro inconveniente principal é que os isoprenoides, sendo compostos orgânicos altamente voláteis, são pouco solúveis em soluções aquosas. Assim, a perda de produto durante a fermentação por meio do gás de exaustão é um problema importante no desenvolvimento de um processo economicamente viável (Asadollahi et al, Biotech Bioengin, 2007, 99 (3): 666-677). Em estudos anteriores, os terpenoides sintetizados em E. coli foram parcialmente perdidos por evaporação, devido ao seu caráter altamente volátil (Newman et al., Biotechnol Bioeng (2006) 95: 684-691).

[0007] Para superar os inconvenientes acima mencionados,tentativas têm sido feitas para remover o produto a partir do meio de fermentação à medida que a fermentação avança de tal forma que a concentração do produto não se eleva a um ponto em que a biossíntese do produto é inibida, garantindo, assim, um período sustentado de elevada taxa de produtividade . Essa tentativa utiliza um líquido que é imiscível com o meio de fermentação aquoso, mas é um extrator para o produto desejado. Os produtos alvos dividem entre o extrator e o meio de fermentação aquosa, quando os dois são colocados em contato, reduzindo, assim, a concentração do produto no meio aquoso. A separação in situ do produto liberado sendo realizada em uma fermentação em duas fases, utilizando um solvente orgânico como fase secundária tem sido tentada para atenuar as desvantagens dos métodos de fermentação convencionais. (Malinowski, Biotech Advances 2001, 19: 525-538).

[0008] Na prática, os sistemas de fermentação extrativa de duas fases são complexos devido à natureza imprevisível destes sistemas, particularmente para a produção em grande escala. Um dos desafios mais importantes é a seleção do sistema de solventes adequado para uma dada combinação de produto/micro-organismo. Uma dificuldade frequentemente encontrada, por exemplo, é que a maioria dos solventes imiscíveis em água comuns são tóxicos e/ou perigosos para os microorganismos tornando-os inadequados para a produção em escala comercial de produtos, tais como isoprenoides através de fermentação. Também foi verificado que certos solventes formam emulsões estáveis com o meio de fermentação aquosa causando dificuldades de separação, bloqueio do equipamento etc. A seleção de um solvente carreador orgânico biocompatível com coeficientes de partição favoráveis é, portanto, crucial para a aplicação de uma bioconversão eficaz em um sistema bifásico aquoso - orgânicos (Cruz et al.2004; Leon et al., 1998). De preferência, o solvente tem outras características de solvente carreador desejáveis, tais como a reduzida tendência de formação de emulsão, estabilidade química, térmica e biológica.

[0009] Tipicamente, a adição de solventes durante o processo de fermentação envolve a adição de grandes volumes de um solvente orgânico dentro de um curto intervalo de tempo que, por exemplo, envolve o risco de introduzir contaminantes potenciais para o meio. A perda de esterilidade de fermentação tem consequências graves que impactam os custos de produção, horários e que afetam a qualidade e a quantidade do produto. Além do risco de introdução de contaminação, os extratores afetam seriamente a estabilidade dos sinais de sondas cruciais, como por exemplo, sonda de pH- eletrodo e dissolvida em oxigênio, interferindo com a medição precisa dos parâmetros importantes como pH e teor de oxigênio dissolvido do meio. Isto é mais comum durante o emprego de solventes orgânicos como extratores uma vez que geralmente o oxigênio tem uma maior solubilidade em solventes orgânicos. Portanto, a adição de solventes orgânicos durante a fermentação tem um sério impacto sobre a medição precisa dos parâmetros cruciais, tais como pH e oxigênio dissolvido que são necessários para controlar a fermentação.

[0010] Estas limitações têm impedido as possibilidades de uso de solventes imiscíveis água durante a fermentação para a produção em escala industrial dos produtos alvos. Existe, portanto, uma necessidade de um processo de fermentação industrialmente escalável para a produção de compostos orgânicos, em particular, de isoprenoides, na presença de um solvente imiscível em água. Além disso, há uma necessidade de produzir estes compostos com um bom rendimento e produtividade com uma baixa tendência para acumular níveis tóxicos de intermediários metabólicos.

[0011] É portanto um objetivo da presente invenção fornecer um método de fermentação para a produção de compostos orgânicos, em especial isoprenoides, que atenda a essa necessidade. É um objetivo da presente invenção tratar especificamente os desafios associados ao uso de solventes imiscíveis em água no processo de fermentação em escala industrial.

[0012] É um objetivo particular da presente invenção fornecer um método industrialmente escalável e confiável para a produção de compostos orgânicos que permita o uso de solventes orgânicos como um extrator.

[0013] É ainda outro objetivo da presente invenção fornecer um processo de fermentação eficiente para a produção em escala industrial de um composto orgânico, de preferência, um isoprenoide empregando um sistema de duas fases líquido-líquido por período sustentável de alta produtividade.

[0014] Foi agora verificado que este objetivo pode ser realizado por adição de um solvente orgânico imiscível em água a um meio aquoso para a cultura de células para formar um sistema de duas fases. Uma razão otimizada do solvente orgânico imiscível em água para meio aquoso facilita a extração seletiva do composto alvo em extratores orgânicos específicos durante a fermentação.

[0015] Tal como descrito, o processo de fermentação em escala industrial é, em particular, adequado para ser usado para a produção de um isoprenoide, uma vez que tem por objetivo resolver os problemas geralmente associados com estes compostos altamente voláteis e citotóxicos. No entanto, o processo é igualmente adequado para ser usado para a produção de outros compostos orgânicos que possuem desafios de processo semelhante.

[0016] Como consequência, a presente invenção fornece um processo de fermentação de duas fases para a produção de um composto orgânico que compreende as etapas de: a) adicionar um solvente orgânico imiscível em água a um meio aquoso para a cultura de células para formar um sistema de duas fases, a razão de solvente orgânico imiscível em água a meio aquoso sendo otimizada e o volume total de solvente e meio é pelo menos que 10L; b) fornecer o sistema de duas fases com uma sonda de oxigênio; então, c) realizar uma calibração da referida sonda de oxigênio; então d) otimizar a tensão de oxigênio no referido sistema de duas fases; em seguida, e) inocular o referido sistema de duas fases com um micro-organismo capaz de produzir o referido composto orgânico no referido sistema de duas fases otimizado com oxigênio; então f) medir e otimizar a tensão de oxigênio; e g) permitir que o referido micro-organismo produza o referido composto orgânico.

[0017] Aqui, o termo “imiscível em água” refere-se à natureza de um solvente orgânico ou mistura de solventes orgânicos sendo incapaz ou substancialmente incapaz de se misturar com o meio de fermentação aquoso. Para os fins da presente invenção, imiscível em água refere-se a solventes onde uma proporção significativa do solvente não formam uma solução em água. Um solvente imiscível em água adequado é caracterizado por um alto valor de logP (Schewe et al., Appl Microbiol Biotechnol (2009) 83: 849-857). O solvente imiscível em água tem, de preferência, um valor de log P > 3, de preferência, um valor de log P > 4, com mais preferência, um valor de log P > 4,5, com mais preferência, um valor de log P > 5.

[0018] Para o propósito da invenção, o termo “meio de fermentação bifásica” ou “meio de fermentação em duas fases” destina-se a incluir um meio de duas fases que compreende um meio de fermentação com o meio aquoso que forma uma fase aquosa e uma quantidade adequada de um solvente orgânico imiscível em água com a formação de uma fase orgânica.

[0019] Em uma modalidade particular, a calibração do eletrodo de oxigênio dissolvido referido no ponto abaixo c), é realizada como segue: em uma primeira etapa, uma medição de corrente zero é realizada usando gel de truncatura ou gases de calibração nitrogênio (N2) ou de dióxido de carbono (CO2), em alternativa, um meio da amostra saturado com um destes gases. A sonda é então montada no fermentador e autoclavado, dodecano é adicionado e o valor de 100% é determinado (segunda etapa de calibração), após saturação com ar. Nesta modalidade particular, a sonda de oxigênio é, assim, fornecida ao fermentador, antes da adição do solvente. Após a adição do solvente e saturação do sistema de duas fases com o ar, a calibração a 100% de oxigênio dissolvido é realizada.

[0020] Em uma outra modalidade particular, uma calibração de dois pontos é realizada no sistema de duas fases. Uma primeira etapa de calibração é realizada no sistema de duas fases, que é desprovido de oxigênio (calibração com 0% de oxigênio dissolvido). Após a saturação do sistema de duas fases com o ar, a segunda etapa de calibração a 100% de oxigênio dissolvido é realizada.

[0021] O termo “fase aquosa” tipicamente refere-se à fase de um sistema bifásico compreendendo o meio de fermentação aquosa, que é formado pelo seu contato com a fase orgânica. Um sistema é considerado aquoso se a água é o único solvente ou o solvente predominante (> 50 % em peso, De preferência > 80 % em peso, com mais preferência, > 90 % em peso, com base no total de líquidos), em que por exemplo, uma quantidade menor de álcool ou outro solvente (<50 % em peso, de preferência <20 % em peso, com mais preferência, <10 % em peso, baseado no total de líquidos) pode ser dissolvido (por exemplo, como uma fonte de carbono, no caso de uma abordagem fermentativa completa), em uma concentração em que os micro-organismos que estão presentes permanecem ativos.

[0022] O termo “fase orgânica”, geralmente refere-se à fase de uma mistura bifásica que compreende o solvente orgânico imiscível em água que é formado mediante o seu contato com um meio de fermentação aquoso. O solvente orgânico imiscível em água pode ser qualquer solvente. Os solventes orgânicos imiscíveis em água preferenciais são selecionados a partir do grupo de dodecano, ácido láurico, ácido oleico, n-decano, estearato de butila, óleo de oliva, óleo de milho, ftalato de di- isononila (DINP), ou qualquer combinação dos mesmos. Estes solventes são particularmente preferenciais uma vez que são substancialmente não tóxicos para os micro-organismos mais empregues industrialmente nas condições do processo, não tendem a formar emulsões estáveis, tem bons coeficientes de partição dos produtos de fermentação comuns, e pode ser separado a partir destes compostos relativamente baratos. Assim, eles possuem todas as características imperativas para tornar a fermentação viável em escala industrial. Em uma modalidade particularmente preferencial, o solvente orgânico imiscível em água é dodecano.

[0023] Em princípio, a produção do isoprenoide pode ser realizada de um modo com base na metodologia conhecida per se, por exemplo, tal como descrito na técnica anterior aqui mencionada acima. A célula hospedeira pode ser usada numa produção fermentativa da isoprenoide, ou pode ser usada para produzir uma sintase de monoterpeno ou sesquiterpeno sintase, que podem, em seguida, ser então usados para a síntese do terpenoide desejado.

[0024] Vantajosamente, a isoprenoide é produzido em um processo de fermentação, ou seja, em um método que compreende o cultivo de uma célula hospedeira em um meio de cultura sob condições em que tipicamente uma monoterpeno sintase ou sesquiterpeno sintase é expressa. A reação real catalisada pela monoterpeno sintase ou sesquiterpeno sintase ocorre tipicamente intracelular.

[0025] Deve-se notar que o termo “fermentação” é usado na presente invenção em sentido amplo para processos em que é feito uso de uma cultura de um organismo para sintetizar um composto a partir de uma matéria-prima apropriada (por exemplo, um carboidrato, uma fonte de aminoácido, uma fonte de ácido graxo). Assim, os processos fermentativos, tal como destinados aqui não estão limitadas às condições anaeróbicas, e são estendidos para processos em condições aeróbicas. Matérias-primas apropriadas são geralmente conhecidas pelas células hospedeiras. As condições adequadas podem ser facilmente encontradas usando experimentação de rotina, com o uso do conhecimento geral, do presente pedido de patente e, opcionalmente, outra metodologia conhecida como, por exemplo, para as células hospedeiras de Rhodobacter descritas no documento WO 2011/074954 (em particular, página 68, Exemplos, parte geral , procedimento do frasco agitado), que é aqui incorporado por referência.

[0026] Em princípio, o pH do meio reacional (meio de cultura) usado em um método de acordo com a invenção pode ser escolhido dentro de limites amplos, desde que seja compatível com a célula hospedeira e a isoprenoide sintase (na célula hospedeira) é ativa e exibe uma especificidade desejada nas condições de pH. O pH é, de preferência, selecionado de tal modo que as células são capazes de realizar a sua função ou funções pretendidas. O pH pode ser escolhido, em particular, dentro da faixa de quatro unidades de pH abaixo do pH neutro e de duas unidades de pH acima do pH neutro, isto é, entre pH 3 e pH 9, em caso de um sistema essencialmente aquoso a 25°C. Bons resultados, por exemplo, foram obtidos em um meio reacional aquosa com um pH na faixa de 6,8 a 7,5.

[0027] Em particular, no caso de uma levedura e/ou um fungo ser usado, as condições ácidas podem ser preferenciais, em particular, o pH pode estar na faixa de pH 3 a pH 8, com base em um sistema essencialmente aquoso a 25°C. Se desejado, o pH pode ser ajustado utilizando um ácido e/ou uma base ou tamponado com uma combinação adequada de um ácido e uma base.

[0028] Os micro-organismos muitas vezes precisam de altos níveis de oxigênio para o crescimento aeróbico eficaz. Por outro lado, a exposição a níveis elevados de oxigênio pode representar estresse oxidativo sobre os micro-organismos, levando a uma baixa produtividade e crescimento. Como consequência, é muitas vezes necessário controlar cuidadosamente o nível de oxigênio dissolvido no caldo de fermentação. Para Rhodobacter spaeroides, por exemplo, uma cepa que pode ser usada para a produção de isoprenoides, é vantajoso o uso de elevados níveis de saturação de oxigênio numa fase inicial de um processo de fermentação para gerar biomassa e baixa saturação de oxigênio em estágios posteriores para promover a produção do isoprenoide. Portanto, a tensão de oxigênio no caldo deve ser mantida em níveis distintos em todos os momentos, tipicamente entre 10% e 100% de saturação, de preferência, 20% -60% na fase inicial de fermentação e de 0% e 50%, de preferência, de 0% a 25 % na fase posterior de fermentação.

[0029] Em uma modalidade preferencial, portanto, a tensão de oxigênio (oxigênio dissolvido (OD)), situa-se entre 50 - 100%, de preferência, entre 80 - 100%, com mais preferência, cerca de 100% no momento da inoculação. De preferência, a tensão de oxigênio é deixada diminuir entre 10 - 60%, de preferência, entre 20 - 50%, com mais preferência, entre 30 - 40%, com mais preferência, cerca de 35% logo após a inoculação, e mantida a este nível durante a produção de biomassa. Durante a produção do composto orgânico de interesse, a tensão de oxigênio dissolvido é, de preferência, mantida entre 0 - 50%, com mais preferência, entre 5 - 25%, com mais preferência, entre 10 - 15%, com mais preferência, cerca de 12,5%.

[0030] Em um exemplo de trabalho, os inventores demonstraram que estas condições são alcançadas quando se realiza um processo de acordo com a invenção. Um exemplo comparável em que foi adicionado dodecano após a inoculação demonstra que estas condições não foram alcançadas e que a adição de dodecano após a inoculação tem um efeito negativo sobre o processo de fermentação. Condições anaeróbicas são aqui definidas como condições sem qualquer oxigênio ou em que substancialmente nenhum oxigênio é consumido pelas células cultivadas, em particular, um micro-organismo e geralmente corresponde a um consumo de oxigênio de menos que 5 mmol/l.h, de preferência, a um consumo de oxigênio de menos que 2,5 mmol/l.h, ou com mais preferência, menos que 1 mmol/l.h. As condições aeróbicas são condições em que um nível suficiente de oxigênio para o crescimento ilimitado é dissolvido no meio, capaz de suportar uma taxa de consumo de oxigênio de pelo menos 10 mmol/l.h, com mais preferência, mais que 20 mmol/l.h, mesmo com mais preferência, mais que 50 mmol/l.h, e com máxima preferência, mais que 100 mmol/l.h

[0031] Condições limitadas por oxigênio são definidas como condições em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O limite inferior para as condições de limitação de oxigênio é determinado pelo limite superior para condições anaeróbicas, isto é, normalmente pelo menos 1 mmol/l.h, e em particular pelo menos 2,5 mmol/l.h, ou pelo menos 5 mmol/l.h O limite superior para as condições de limitação de oxigênio é determinado pelo limite inferior para as condições aeróbicas, isto é, menos que 100 mmol/l.h, menos que 50 mmol/l.h, menos que 20 mmol/l.h, ou menos que 10 mmol/l.h

[0032] Se as condições são aeróbicas, anaeróbicas ou limitadas por oxigênio vai depender das condições sob as quais o método é realizado, em particular, da quantidade e composição do fluxo de gás que passa, das propriedades de transferência de mistura/massa real do equipamento usado, do tipo de micro-organismo usado e da densidade de micro-organismo.

[0033] Em princípio, a temperatura usada não é crítica, desde que a isoprenoide-sintase (nas células), mostre uma atividade substancial. Geralmente, a temperatura é de pelo menos 0°C, em particular, de pelo menos 15°C, mais particularmente, de pelo menos 20°C. Uma temperatura máxima desejada depende da isoprenoide sintase e da célula hospedeira usada. Dependendo das células e/ou da isoprenoide-sintase usada, a temperatura é de 70°C ou menos, de preferência, 50°C ou menos, com mais preferência, 40°C ou menos, em particular, de 37°C ou menos. Os organismos Thermus thermophilus têm uma temperatura ótima para o crescimento, entre 49°C e 72°C, a Escherichia coli de cerca de 37°C, e muitos micro-organismos fúngoicos como leveduras e microorganismos bacterianos como Rhodobacter spaeroides têm temperatura ótima de cerca de 30°C. No caso de um processo fermentativo, as condições de incubação podem ser escolhidas dentro de amplos limites, desde que as células apresentem uma atividade e/ou crescimento suficiente. Isso inclui faixas de pH, faixas de temperatura e condições aeróbicas, limitadas por oxigênio e/ou anaeróbicas.

[0034] Em uma modalidade da invenção, o solvente orgânico imiscível em água é introduzido no meio aquoso numa quantidade eficaz para facilitar a extração in-situ do composto orgânico produzido na fase orgânica e para aumentar a taxa e/ou o rendimento de sua produção pelo micro-organismo na fase aquosa. De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, a razão do solvente orgânico imiscível em água para meio aquoso situa-se entre 0,5% (v/v) e 60% (v/v), de preferência, entre 2% (v/v) e 40% (v/v) e com mais preferência, entre 5% (v/v) e 20% (v/v).

[0035] Um solvente que pode ser usado como um extrator no processo de acordo com a invenção, de preferência, deve satisfazer os seguintes requisitos para uso em um processo de fermentação extrativa de duas fases comercial: baixa solubilidade em água, não tóxico para o micro-organismo produtor, grande coeficiente de partição para o produto, baixo coeficiente de partição para nutrientes, alta seletividade, baixa tendência de formação de emulsão, alta estabilidade química e térmica, não biodegradabilidade, não perigosos e/ou de baixo custo.

[0036] Em particular, adequada (para extração a partir de um meio reacional aquoso) é a extração com um solvente orgânico líquido, tal como um hidrocarboneto líquido. A partir dos resultados iniciais, é evidente que este método é também adequado para extrair isoprenoide (ou mais produtos) a partir de um meio reacional compreendendo células de acordo com a inveção usadas para a sua produção, sem a necessidade de realizar a lise das células para a recuperação da isoprenoide (ou mais produto). Em particular, o solvente orgânico pode ser selecionado a partir de alcanos líquidos, álcoois de cadeia longa líquidos (álcoois com pelo menos 12 átomos de carbono), e ésteres líquidos de ácidos graxos de cadeia longa (ácidos que possuem pelo menos 12 átomos de carbono). Alcanos líquidos adequados incluem, em particular, alcanos C6-C16, tais como hexano, octano, decano, dodecano, isododecano e hexadecano. Álcool alifático de cadeia longa adequado, em particular, inclui álcoois alifáticos C12-C18, como o álcool oleílico e álcool palmitoleílico. Os ésteres adequados de ácidos graxos de cadeia longa, em particular, incluem os ésteres de álcoois C1-C4 de ácidos graxos C12-C18, como o miristato de isopropila e oleato de etila.

[0037] Em uma modalidade vantajosa, os isoprenoides (ou um outro produto) é produzido num reator que compreende uma primeira fase líquida (a fase de reação), a referida primeira fase líquida contendo as células de acordo com a invenção, em que o isoprenoide (ou um outro produto) é produzido, e uma segunda fase líquida (fase orgânica que permanece essencialmente separada por fase com a primeira fase quando contatada), a referida segunda fase líquida sendo a fase de extração, para que o produto formado tenha uma afinidade mais elevada. Este método é vantajoso na medida em que permite a recuperação do produto in situ. Além disso, contribui para a prevenção ou pelo menos redução dos potenciais efeitos tóxicos do isoprenoide (ou um outro produto) para as células, porque, devido à presença da segunda fase, a concentração de isoprenoide (ou um outro produto) na fase de reação pode ser mantida relativamente baixa durante todo o processo. Finalmente, a fase de extração contribui para extrair o isoprenoide (ou mais produtos) para fora da fase de reação.

[0038] Em um método preferencial da invenção, a fase de extração forma uma camada em cima da fase de reação ou é misturada com a fase de reação para formar uma dispersão da fase de reação na fase de extração ou uma dispersão da fase de extração na fase de reação. Assim, a fase de extração não só extrai produtos a partir da fase de reação, mas também ajuda a reduzir ou evitar completamente as perdas do produto formado a partir do reator através dos gases liberados, que pode ocorrer se o isoprenoide for produzido na fase de reação (aquosa) ou excretado para a fase de reação (aquosa). O isoprenoide é fracamente solúvel em água e, portanto, facilmente se volatiliza a partir de água. É contemplado que o isoprenoide solvatado na fase orgânica (como uma camada ou dispersão) é pelo menos substancialmente impedido de volatilização.

[0039] Os líquidos adequados para uso como fase de extração combinam uma densidade mais baixa do que a fase de reação com uma boa biocompatibilidade (sem interferência com a viabilidade das células vivas), baixa volatilidade, e imiscibilidade absoluta próxima com a fase aquosa de reação. Exemplos de líquidos adequados para esta aplicação são alcanos líquidos como decano, dodecano, isododecano, tetradecano, hexadecano ou álcoois alifáticos de cadeia longa, como álcool oleílico, e álcool palmitoleílico, ou ésteres de ácidos graxos de cadeia longa tais como miristato de isopropila, e oleato de etila (ver, por exemplo Asadollahi et al. (Biotechnol Bioeng (2008) 99: 666-677), Newman et al. (Biotechnol Bioeng (2006)95: 684-691) e WO 2009/042070). Em uma modalidade preferencial, um processo de acordo com a invenção é fornecido, em que o solvente orgânico imiscível em água é um alcano líquido ou um álcool alifático de cadeia longa, ou um éster de um ácido graxo de cadeia longa ou um isoprenoide. Em uma modalidade preferencial, o solvente orgânico é dodecano, ácido láurico, ácido oleico, n-decano, estearato de butila, óleo de oliva, óleo de milho ou DINP, com mais preferência, dodecano.

[0040] Em um processo da invenção, o solvente orgânico imiscível em água é adicionado antes do início da fermentação, ou seja, antes de inocular o sistema de duas fases com um micro-organismo capaz de produzir o composto orgânico. É uma vantagem adicionar o solvente, antes do início de fermentação uma vez que a introdução do solvente durante a fermentação acarreta o risco de introdução de contaminantes para o meio, o que pode ser prejudicial para o resultado do processo de fermentação. Além disso, o oxigênio tem uma maior solubilidade em solventes orgânicos o que complica a precisão da medição se os solventes são adicionados posteriormente. Portanto, a adição de solventes orgânicos durante a fermentação é responsável por um impacto importante sobre a medição precisa dos parâmetros operacionais, tais como o pH e o oxigênio dissolvido necessário para controlar a fermentação. Uma vantagem adicional é que o momento de introduzir o solvente em um método convencional é ditado pelo processo de fermentação.

[0041] Se desejado, os isoprenoides produzidos em um método de acordo com a invenção, ou um outro composto em que o isoprenoide foi convertido após a sua preparação (como nootkatone), é recuperado a partir do meio reacional, em que foi feito. Um método adequado é a extração líquido-líquido com um líquido de extração que não é miscível com o meio reacional.

[0042] Uma estratégia particular de realização da fermentação é através da adição do solvente orgânico antes do início da fermentação, permitindo a esterilização in situ do meio e solvente na ausência do micro-organismo produtor. A esterilização concomitante das duas fases evita ainda a necessidade de múltiplas etapas de esterilização das fases individuais. Além disso, a calibração das sondas cruciais, tais como a sonda de oxigênio, deve ser realizada na presença do solvente orgânico. Portanto, a sonda de oxigênio tem que ser adequada para a medição da tensão de oxigênio no sistema de duas fases, assim, na presença do solvente orgânico. Ao adicionar o solvente de antemão e otimizar a tensão de oxigênio no sistema de duas fases, as desvantagens associadas com a adição intercalar do solvente durante a fermentação são contornadas. Em uma modalidade preferencial, a invenção fornece um processo de acordo com a invenção, em que o processo compreende ainda a esterilização do sistema de duas fases preparado na etapa a), de preferência, por esterilização do sistema de duas fases em pelo menos 1 bar de sobrepressão por pelo menos 20 minutos a pelo menos 120°C, de preferência, entre 20 - 40 minutos a cerca de 121°C a pelo menos 1 bar de sobrepressão. De preferência, a etapa de esterilização ocorre antes da etapa e), com mais preferência, antes da etapa c). Em uma modalidade particular, em vez da esterilização do sistema de duas fases, o meio estéril é usado como a fase aquosa, tipicamente esterilizado antes ou após a adição do meio para o biorreator, e o solvente estéril é adicionado a este. É possível adicionar ao solvente estéril, por exemplo, fazendo passar o solvente através de um filtro de esterilização (por exemplo, um filtro de 0,22 μm) ou através do uso de solvente pré-esterilizado. Os métodos para a adição de um solvente para uma fase aquosa, de tal modo que o sistema de duas fases resultante permaneça estéril são conhecidos na técnica.

[0043] Para o propósito da invenção, os termos “meio de fermentação” e “meio” destinam-se a incluir o meio líquido no qual os micro-organismos são cultivados. Em uma modalidade particular, prefere-se utilizar um meio semissólido. Um meio de fermentação típico inclui geralmente um substrato e nutrientes. O meio de fermentação contém, adicionalmente, o micro-organismo, o produto produzido pelo micro-organismo, intermediários metabólicos e outros componentes tais como sais, vitaminas, aminoácidos, cofatores e antibióticos. Os substratos são geralmente açúcares ou carboidratos mais complexos, que são metabolizados pelo micro-organismo para obter energia e componentes estruturais básicos, mas também podem ser lipídeos e/ou proteínas.

[0044] O processo de fermentação em duas fases da presente invenção é particularmente adequado para a produção em escala industrial de um composto orgânico, de preferência, um isoprenoide. Como consequência, em uma modalidade preferencial da invenção, o volume total de solvente e meio é pelo menos que 30L, de preferência, pelo menos 100 L, com mais preferência, pelo menos 1.000L, com mais preferência, pelo menos 10.000L, com máxima preferência, pelo menos, 30.000 L ou Mais.

[0045] Em uma modalidade preferencial, um processo de acordo com a invenção é fornecido, em que o composto orgânico é um isoprenoide. Aqui, o termo “isoprenoide” refere-se a uma classe grande e diversa de compostos orgânicos que ocorrem naturalmente normalmente compostos por duas ou mais unidades de hidrocarbonetos, com cada unidade consistindo em cinco átomos de carbono dispostos em um padrão específico. Os isoprenoides são construídos a partir de unidades de isopreno (2-metil-1,3-butadieno) e o precursor biológico para todos os isoprenoides naturais é o difosfato de isopentenila (IPP). O isopreno (2- metil-1,3-butadieno é um hidrocarboneto insaturado de cadeia ramificada. Exemplos não limitativos de isoprenoides adequados incluem hemiterpenos (derivados de uma única unidade de isopreno), tais como isopreno, monoterpenos (derivados a partir de duas unidades de isopreno), tais como micreno, sesquiterpenos (derivados a partir de três unidades de isopreno), tais como amorfa-4,11-dieno, diterpenos (derivados a partir de quatro unidades de isopreno), tais como taxadieno, triterpenos (derivados a partir de seis unidades de isopreno), tais como esqualeno, tetraterpenos (derivados a partir de oito unidades de isopreno) tal como 3-caroteno e politerpenos (derivados a partir de mais que oito unidades de isopreno), tais como poli-isopreno ou um misturas destes. Os terpenoides também estão incluídos como terpenos para os fins da presente invenção. Em uma modalidade particularmente preferencial, o isoprenoide é um monoterpeno ou um sesquiterpeno, diterpeno ou triterpeno, com mais preferência, um monoterpeno ou iridoide selecionado a partir do grupo que consiste em Ascaridole, Bornano, Borneol, Canfeno, Cânfora, Cantaridina, Carene, Carvacrol, Carveol, Carvona, Ácido Carvonic, Ácido crisantémico, Crisantenona, Citral, Citronelal, Citronelol, Cuminaldeído, P-cimeno, Cimenos, Epomediol, Eucaliptol, Fenchol, Fenchona, Ácido Gerânico, Geraniol, Acetato de geranila, Mercaptano de Toranja, Halomon, Hinoquitiol, (S)-Ipsdienol, Levoverbenona, Limoneno, Linalol, Acetato de linalila, Lineatin, P- mentano-3,8-diol, Mentofurano, Mentol, Mentona, Mentoxipropanodiol, Acetato de mentila, 2-metil Isoborneol, Mirceno, Mircenol, Nerol, Ocimeno, Perila Cetona, Perilaldeído, Perilartina, Felandreno, Picrocrocin, Pineno, Alfa-Pineno, beta-Pineno, Piperitona, Pulegona, Rodinol, Óxido de rosa, Sabineno, Safranal, Sobrerol, Terpinen-4-ol, Terpineno, Terpineol, Tujaplicin, Tujeno, Tujona, Timol, Timoquinona, Umbelulona, e Verbenona, e/ou

[0046] um sesquiterpeno ou uma sesquiterpeno lactona selecionado a partir do grupo que consiste em Ácido abscísico, Amorfa-4,1-dieno 1, Andrografolida, Aristoloqueno, Artemeter, Artemotil, Artesunato, Bisaboleno, Bisabolol, Botridial, Cadaleno, Cadineno, Alfa-Cadinol, Delta-Cadinol, Capneleno, Capsidiol, Carotol, Cariofileno, Cedreno, Cedrol, Copaeno, Cubebol, Elemeno, Farneseno, Farnesol, Furanolactona, Germacreno, Guaiazuleno, Guaieno, Guaiol, Girinal, Hernandulcina, humuleno, lludina, Indometacina farnesil, Isocomeno, Juvabiona, Longifoleno, Mutisiantol, nerolidol, Nootkatone, Norpatchoulenol, Onchidal, Patchoulol, Periplanona B, Petasin, Ácido Faseico, Poligodial, A-Santalol, B-Santalol, Ácido Santonico, Selineno, Ácido esterpúrico, Tujopseno, Valenceno, Veleral, Verrucarina A, Vetivazuleno, A-Vetivona, e Zingibereno e/ou

[0047] um diterpeno, uma pleuromutilina ou um taxano selecionado a partir do grupo que consiste em Abietano, Ácido abiético, Agelasina, Afidicolina, Beta-Araneoseno, Bipinnatin J, Cafestol, Ácido Carnósico, Cembreno A, 10-Desacetil bacatina, Ferruginol, Fichtelite, Forskolin, Galanolactona, Geranilgeraniol, Giberelina, Ginkgolídeo, Graianotoxina, Guanacastepeno A, Ingenol mebutato, Ácido Isocupressico, Ácido Isopimárico, kahweol, Labdano, Lagochilina, Leelamina, Ácido Levopimárico, Menatetrenona, Momilactona B, 18- Norabietano, Panicudina, Forbol, Forbol 12,13-dibutirato, Fitano, Ácido fitânico, Fitol, Ácido pimárico, Pristano, Ácido Pristânico, Prostratina, Pseudopterosina A, Quassin, Retinol, Esclareno, Esclareol, Simonelite, Estemareno, Estemodeno, Esteviol, Glicosídeo de Esteviol, Taxodona, 12- O-tetradecanoilforbol-13-acetato, Tetra-hidrocanabinol-C4, ácido tetra- hidrocanabinólico, Totarol, e Triptólido e/ou

[0048] um triterpeno selecionado a partir do grupo que consiste em Absintina, Acetoxolona, Aescina, Ambreína, Amirina, Balsaminapentaol, Balsaminol A, Balsaminol B, Betulina, Ácido betulínico, Bevirimat, Ãcido Boswellic, Brioamarida, Carbenoxolona, Celastrol, Ácido corosólico, Cucurbalsaminol A, Cucurbalsaminol B, Cucurbitano, Cicloartenol, Cicloastragenol, Damarano, Endecafilacina, Ácido ganodérico, Ginsenosídeo, Ácido glicirretínico, Glicirizina, Hederagenina, Hemslecin, Hopano, Hopanoides, Caravilagenina E, Lanostano, Lanosterol, Lepidolida, Lupeol, Malabaricana, Ácido maslínico, Momordicilina, Momordicina I, Momordicin-28, Momordicinina, Ãcido Morônico, Neokuguaglucosídeo, Oleanano, Ácido oleanólico, 2,3-Oxidoesqualeno, Panaxatriol, Perseapicrosídeo, Protopanaxadiol, Protopanaxatriol, Sapogenina, Esqualano, Esqualeno, Tetranortriterpenoide, Saponina Triterpenoide, Ácido ursólico, e Yamogenina.

[0049] De acordo com uma modalidade preferencial da invenção, o referido micro-organismo, quando cultivado na referida fase aquosa é capaz de produzir o referido isoprenoide em uma quantidade suficiente para atingir uma concentração saturada na referida fase aquosa.

[0050] Os processos de fermentação atuais são úteis com quase qualquer tipo de micro-organismo usado para a fermentação. O micro-organismo pode ser qualquer micro-organismo que é capaz de produzir um composto orgânico, de preferência, um isoprenoide. A título de exemplo, o micro-organismo pode ser uma levedura, bactérias, fungos, ou uma mistura de qualquer um destes. Em uma modalidade particularmente preferencial, o micro-organismo é otimizado para a produção do referido composto orgânico, por exemplo, por modificação genética.

[0051] Em uma modalidade particularmente preferencial, o micro organismo é uma bactéria ou uma célula fúngica ou uma planta. Em uma modalidade preferencial, o micro-organismo é uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo de bactérias gram-negativas, tais como a Rhodobacter, Agrobacterium, Paracoccus, ou Escherichia;

[0052] uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo de bactérias Gram positivas, tais como Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium;

[0053] uma célula de fungo selecionada a partir do grupo de Aspergillus, Blakeslea, Peniciliium, Phaffia (Xanthophyllomyces), Pichia, Saccharamoyces, Yarrowia e Hansenula;

[0054] uma planta ou cultura transgênica compreendendo células de plantas transgênicas, em que o micro-organismo é de uma planta transgênica selecionada de Nicotiana spp, Cichorum intybus, lacuca sativa, Mentha spp, Artemisia annua, plantas formadoras de tubérculo, culturas de oleaginosas e árvores; ou

[0055] um cogumelo transgênico compreendendo células ou cultura de cogumelos transgênicos, em que o micro-organismo é selecionado a partir de Schizophyllum, Agaricus e Pleurotisi. Em uma modalidade de maior preferência, o micro-organismo é uma bactéria Rhodobacter sphaeroides.

[0056] Em uma modalidade, um processo de acordo com a invenção é fornecido, em que o processo compreende ainda o isolamento do composto orgânico a partir do sistema de duas fases. Como composto orgânico de preferência se acumula no solvente orgânico imiscível em água, o composto orgânico é, de preferência, isolado a partir do referido solvente orgânico. Métodos de extração de compostos orgânicos são conhecidos pelo versado na técnica e incluem, mas, sem limitação, extração líquido-líquido, destilação, pervaporação, etc. Em uma modalidade preferencial, o composto orgânico é extraído por pervaporação. A pervaporação é um método de técnica de membrana para a separação de misturas de líquidos por vaporização parcial através de uma membrana não porosa ou porosa. É preferencial que, antes do composto orgânico ser isolado, o micro-organismo possa produzir o referido composto biológico por um período de tempo suficiente, de preferência, durante pelo menos 2 dias e não mais que 7 dias.

[0057] O processo pode ser realizado em um modo de batelada, de um modo de batelada alimentada ou de um modo contínuo. Os termos “modo de batelada”, “modo de batelada alimentada” e “modo contínuo” são conhecidos por um versado na técnica. Um processo de acordo com a invenção pode ser facilmente realizado de tal modo que ele é executado em um modo de batelada, modo de batelada alimentada ou modo contínuo.

[0058] A invenção fornece ainda um biorreator, que é um recipient ou um dispositivo para conter o meio e para a realização de um processo de fermentação. O biorreator é capaz de realizar um processo de fermentação em duas fases da presente invenção e, de preferência, é capaz de fornecer as condições ótimas para o crescimento do microorganismo.

[0059] Em uma modalidade, a invenção fornece um biorreator que compreende, pelo menos, 10 L de um sistema de duas fases, compreendendo um solvente orgânico imiscível em água e um meio aquoso para a cultura de células, em que a razão do solvente orgânico imiscível em água para o meio aquoso situa-se entre 0,5% (v/v) e 60%, de preferência, entre 2% (v/v) e 40% (v/v), com mais preferência, entre 5% (v/v) e 20% (v/v), com máxima preferência, entre 10 % (v/v) e 20% (v/v). O biorreator pode ser de qualquer forma, geralmente tubular, adequadamente pode ser um recipiente de forma cilíndrica. É desejável que o biorreator seja feito de um material que é inerte ao meio de duas fases, por exemplo, aço inoxidável ou um recipiente metálico adequadamente alinhado, ou opcionalmente, um material plástico inerte.

[0060] O modelo do biorreator pode ser de tipo batelada ou do tipo batelada alimentada. O biorreator da invenção compreende, de preferência, as partes principais que incluem um recipiente que compreende uma porta de reação e uma porta de coleta.

[0061] Em uma modalidade preferencial, o biorreator compreende pelo menos 30 L, com mais preferência, pelo menos 100 L, com mais preferência, pelo menos 1.000 L, com mais preferência, pelo menos 10.000 L de um sistema de duas fases, compreendendo um solvente orgânico imiscível em água e um meio aquoso para a cultura de células.

[0062] O biorreator compreende, de preferência, um meio para aintrodução do meio aquoso dentro do recipiente e meios para introduzir o solvente orgânico imiscível em água para o contato com o meio aquoso de modo a formar um sistema de duas fases. Tais solventes orgânicos imiscíveis em água são selecionados do grupo que consiste em dodecano, ácido láurico, ácido oleico, n-decano, estearato de butila, óleo de oliva, óleo de milho, e DINP, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0063] Devido ao biorreator, de acordo com a inveção, ser destinado para a produção de um composto orgânico, de preferência, um isoprenoide, o uso de um processo de acordo com a invenção, em uma modalidade preferencial, o biorreator de acordo com a invenção, compreende ainda um micro-organismo capaz de produzir um composto orgânico. De preferência, o referido composto orgânico é um isoprenoide.

[0064] A fim de medir a tensão de oxigênio, pH e temperatura no sistema de duas fases presentes no referido biorreator, em uma modalidade preferencial, um biorreator de acordo com a invenção compreende ainda uma ou mais sondas capazes de medir estes parâmetros no sistema de duas fases. O biorreator de acordo com a invenção compreende, de preferência, pelo menos uma sonda capaz de medir oxigênio (sonda de oxigênio).

[0065] Em uma modalidade particular, um solvente orgânico está presente no referido biorreator. De preferência, o solvente orgânico é um alcano líquido ou um álcool alifático de cadeia longa, ou um éster de um ácido graxo de cadeia longa ou um isoprenoide, de preferência, selecionado a partir do grupo que consiste em dodecano, ácido láurico, ácido oleico, n-decano, estearato de butila, óleo de oliva, óleo de milho e DINP. Em uma modalidade de maior preferência, o solvente orgânico é dodecano.

[0066] De preferência o micro-organismo presente no referido biorreator é:

[0067] uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo de bactérias gram-negativas, tais como a Rhodobacter, Agrobacterium, Paracoccus, ou Escherichia;

[0068] uma célula bacteriana selecionada a partir do grupo de bactérias Gram positivas, tais como Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium ou;

[0069] uma célula de fungo selecionada a partir do grupo de Aspergillus, Blakeslea, Penicillium, Phaffia (Xanthophyllomyces), Pichia, Saccharamoyces, Yarrowia e Hansenula;

[0070] uma planta ou cultura transgênica compreendendo células de plantas transgênicas, em que o micro-organismo é de uma planta transgênica selecionada de Nicotiana spp, Cichorum intybus, lacuca sativa, Mentha spp, Artemisia annua, plantas formadoras de tubérculos, culturas de oleaginosas e árvores; ou

[0071] um cogumelo transgênico ou cultura de cogumelos transgênicos compreendendo células em que o micro-organismo é selecionado a partir de Schizophyllum, Agaricus e Pleurotisi. Em uma modalidade de maior preferência, o micro-organismo é uma bactéria Rhodobacter sphaeroides. Em uma modalidade particularmente preferencial, o micro-organismo é otimizado para a produção do referido composto orgânico, por exemplo, por modificação genética. Os exemplos seguintes descrevem modalidades específicas da presente invenção e não se destinam a limitar a invenção de qualquer maneira.

Legenda das FIG.s

[0072] A FIG. 1: Perfil de Oxigênio durante a fermentação de valenceno em um fermentador de 40 L adicionando n-dodecano antes da inoculação. Antes da adição da cultura de semeadura, o eletrodo de oxigênio foi cuidadosamente calibrado a 0% e 100% de saturação de oxigênio. Após a inoculação, o oxigênio dissolvido (OD) foi deixado diminuir até 35% e manteve-se constante daí em diante. Em 70h o OD foi ajustado para 12,5% e mantido constante até o final da fermentação.

[0073] A FIG. 2: Perfil de oxigênio durante a fermentação de valenceno em um fermentador de 40 L adicionando n-dodecano após a inoculação. Antes da adição da cultura de semeadura, o eletrodo de oxigênio foi cuidadosamente calibrado a 0% e 100% de saturação de oxigênio. Após a inoculação, o oxigênio dissolvido (OD) foi deixado diminuir até 35% e manteve-se constante daí em diante. Às 10 horas após a inoculação n-dodecano foi adicionado lentamente, provocando um rápido aumento de oxigênio dissolvido. Exemplos Exemplo 1: Meio de Semeadura Tabela 1

pH é ajustado para 7,0 com NaOH 5N

[0074] Os componentes (com exceção de glicose) são dissolvidos em água, ajustados a pH 7 e autoclavados. Exemplo 2: Meio de fermentação principal: Tabela 2

Exemplo 3: Calibração de dois pontos do eletrodo de oxigênio

[0075] O meio de fermentação é preparado de acordo com a receita (Tabela 2) e autoclavado no interior do fermentador. Solução de glicose estéril é adicionada a uma concentração final de 30 g/L e neomicina (100 mg/ml) é adicionada. Em seguida, é adicionado 20 vol% de n-dodecano estéril. O agitador é agitado à velocidade máxima aplicada durante a execução da fermentação e o fluxo de ar é definido para menos que 1 vvm (volume/volume por minuto). A sobrepressão é mantida tão baixa quanto possível e constante ao longo da execução da fermentação. O pH e a temperatura são ajustados para valores de fermentação. O gás nitrogênio é aspergido para o fermentador a 1 vvm até que o reator é totalmente desprovido de oxigênio. Quando o valor lido no eletrodo é estável, esse valor de eletrodo é fixado como 0%.

[0076] Alternativamente, para grandes fermentadores com um volume > 100 I, a calibração para 0% de oxigênio é realizada fora do fermentador principal em um pequeno recipiente e o eletrodo calibrado é então transferido para o fermentador principal.

[0077] O fermentador principal é então aspergido com ar a fluxo de gás máximo aplicado durante a execução da fermentação. Quando o valor lido no eletrodo é estável, esse valor de eletrodo é fixado como 100%. Outros parâmetros de fermentação (pressão, fluxo de ar, rpm) são definidos como ponto de partida de fermentação e o fermentador é inoculado com uma pré-cultura de Rhodobacter sphaeroides com uma densidade celular correspondente a cerca de 40 unidades OD 620nm com uma razão de inoculação de 5%.

Exemplo 4: Exemplo Comparativo adicionando n-dodecano durante a fermentação

[0078] A fermentação principal foi realizada em um recipiente de 35 m3, que é carregado com 10.000 kg de meio contendo 22 g/L de glicose inicial a uma temperatura de 30°C, um pH de 7,0 (controlada com uma solução de NH3 a 28% em peso), uma aeração de 2 Nm3/min e uma sobrepressão de 0,5 bar. Às 0 horas a fermentação principal foi inoculada com 1 m3 cultura de semeadura (ver exemplo 7). O oxigênio dissolvido (OD) é mantido constante a 35% ajustando a velocidade do agitador entre 60 e 90 rpm e ajustando a aeração entre 0,2 e 1,8 vvm. Após 12 horas de fermentação de batelada o valor de pO2 diminuiu fortemente para um valor de 15% e começou a aumentar rapidamente depois disso. Além disso, o pH aumentou rapidamente de pH 7,0 para pH 7,7. A análise mostra que toda a glicose foi consumida e a alimentação de glicose foi iniciada, mantendo o pH a 7,0. Depois de 26, horas 2000 L de n-dodecano foram lentamente adicionados ao fermentador através de um filtro estéril, com uma taxa de dosagem de 500 L/hora. Durante a adição de n- dodecano, observou-se que o sinal de pO2 era muito instável e difícil de controlar. Finalmente, após todo o n-dodecano ter sido adicionado, o valor de pO2 tinha aumentado de 35% para cerca de 80%. Regularmente as verificações de glicose residual demonstraram que o processo foi prosseguindo com limitação de glicose. Após cerca de 60 horas, a taxa de respiração começou a diminuir e a acumulação de glicose começou a ocorrer. Depois de 78 horas, a glicose não foi mais consumida e a concentração aumentou rapidamente. A análise da concentração de valenceno indicou que a biomassa não era mais ativo.

Exemplo 5: Fermentação valenceno em um fermentador de 40 L com adição de n- dodecano antes da inoculação

[0079] Um frasco de estoque congelado contendo 1 mL de cepa de produção de valenceno Rhodobacter sphaeroides contendo os genes que codificam a via do mevalonato de Paracoccus denitrificans e um gene da Valenceno sintase (ver Exemplo 9) foi cultivado em um frasco de agitação de 2000 mL contendo 500 mL de meio como descrito no Exemplo 1 e 100 mg/L de neomicina adicional. O frasco de agitação foi incubado em um agitador orbital a 180 rpm e uma amplitude de 4 cm durante 46 horas a 30°C. A cultura foi transferida para um fermentador Techfors-S de 40 L de aço inoxidável de Infors contendo 9 kg de meio com a seguinte composição: 21 g/l de extrato de levedura, 1,73 g/l de MgSO4-7H2O, 0,104 g/l de ZnSO4-7H2O, 0,035 g/l de MnSO4 H2O, 1,3 g/l de CaCl2- 2H2O, 1,73 g/l de KH2PO4, 1,73 g/l de K2HPO4, 33 g/L de dextrose, 1,2 g/L (NH4)2Fe(SO4)2-6H2O, 0,17 g/l de FeCl3-6H2O, 2,76 g/l de (NH4)2SO4, 0,94 g/l de (NH)H2PO4, 1,6 g/l de MgCl-6H2O e 125 g/l de n-dodecano. Antes da adição da cultura de semeadura, o meio foi esterilizado, ajustado para pH 7 com NH4OH a 25% em peso e o eletrodo de oxigênio foi cuidadosamente calibrado a 0% e 100% de saturação de oxigênio, de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2. Após a inoculação, a fermentação ocorre no modo de batelada, a 30°C e o pH a 7,0 por 16,5 horas, permitindo que o OD diminua inicialmente a 35%, mantendo-se constante daí em diante. Após esta fase de batelada a alimentação de glicose é iniciada por adição de 17,2 kg de uma solução contendo 55% em peso de glicose. Durante esta fase, o pH foi mantido constante a 7,0 e a OD a 35%. Em 70 horas o ponto de ajuste pO2 foi colocado em 12,5% e mantido constante até o final da fermentação por ajuste da velocidade do agitador. O perfil de oxigênio durante a fermentação foi gravado é é apresentado na Figura 1.

Exemplo 6: Exemplo comparativo de fermentação de valenceno em um fermentador de 40L

[0080] O experimento descrito no exemplo 5 foi repetido com a exceção de que o meio de fermentação principal não continha n- dodecano. Após a preparação, esterilização e resfriamento do meio, o eletrodo de oxigênio foi cuidadosamente calibrado em 0% e 100% de saturação de oxigênio. O fermentador foi então inoculado por adição de 500 ml de uma cultura de semeadura preparada de acordo com o procedimento descrito no exemplo 4 e executado no modo de batelada, a 30°C e pH 7,0 durante cerca de 10 horas, permitindo que o OD diminua a 35%. A 10 horas após a inoculação, a alimentação de glicose foi iniciada, seguindo-se de adição lenta de 1500 ml de n-dodecano através de um filtro estéril, com uma taxa de dosagem de 400 ml/hora. Depois de adicionar o n-dodecano o OD aumentou rapidamente, como mostrado na figura 2. A análise de glicose residual mostrou que após cerca de 20 horas de fermentação, a glicose começou a acumular-se. A análise da quantidade de biomassa indicou que tinha parado o crescimento das células.

Exemplo 7: Cultura de Semeadura

[0081] Um fermentador de 2500 L é carregado com 1.000 kg de meio de semeadura. A composição do meio é mostrado na Tabela 1. Após a esterilização a 121°C durante 30 minutos, a neomicina é adicionada através de um filtro estéril até uma concentração final de 100 mg/kg e 68 kg de 55% em peso de glicose. Em seguida, a sonda de oxigênio é calibrada seguido por inoculação do fermentador com 500 ml de uma cultura de células. A fermentação é operada no modo de batelada, durante 48 horas a 30°C, pH 7,0 utilizando uma solução a 25% em peso de NH3, uma aeração de 1 vvm, uma sobrepressão de 0,3-0,4 bar, e um OD de 35%. O OD é mantido constante por meio de agitação.

Exemplo 8: Fermentação principal com adição de n-dodecano antes da inoculação

[0082] A fermentação principal é executada em modo de batelada alimentada usando um recipiente de 35 m3 que está carregado com 10.000 kg de meio. A composição do meio é mostrada na Tabela 2. Para preparar 1.0000 kg de meio, os componentes do meio são dissolvidos em água, esterilizados por autoclave a 121°C durante 30 minutos no biorreator.

[0083] Após a esterilização e resfriamento do meio, o pH é ajustado para 7 com NH4OH a 25%. Após esterilização, 600 kg de 55% em peso de glicose são adicionados. A seguir, 2000 L (1666 kg) de n-dodecano são adicionados através de um filtro estéril. A sonda de oxigênio é calibrada (ver exemplo 3). A fermentação começa pela adição de 1.000 L de cultura obtida a partir de uma semeadura. Após a inoculação, a fermentação é executada no modo de batelada, a 30°C e o pH a 7,0, durante 20 horas, mantendo-se o OD a 35%. O OD é mantido constante a 35% ajustando a velocidade de agitação entre 60 e 90 rpm e ajustando a aeração entre 0,2 e 1,8 vvm. Após 20 horas, a alimentação de glicose é iniciada, mantendo o pH a 7,0 e o OD a 35%. Em 70 horas o valor nominal pO2 foi colocado em 2,5% e mantido constante até o final do fermentação por ajuste da velocidade do agitador. O modo de batelada alimentada funciona durante aproximadamente 120 horas a 30°C e o pH a 7,0.

[0084] Regularmente as verificações de glicose residual demonstraram que o processo foi prosseguindo com limitação de glicose. A taxa de respiração manteve-se elevada ao longo de todo o curso da fermentação e nenhuma acumulação de glicose foi observada. A análise da concentração de valenceno mostrou que a biomassa ainda estava produzindo valenceno 140h após a inoculação.

Exemplo 9: Cepa de Rhodobacter produtora de valenceno

[0085] A cepa de Rhodobacter sphaeroides Rs265-9c foi obtida a partir da cepa de Rhodobacter sphaeroides ATCC 35053 [adquirida a partir da American Type Culture Collection (ATCC - Manassas, VA, EUA - www.atcc.org); número 35053; Rhodobacter sphaeroides (van Niel) Imhoff et al., isoladas de um tanque decantador de águas residuais em Indiana e depositadas como Rhodopseudomonas sphaeroides van Niel] depois de dois ciclos de mutagênese e foi usada como hospedeiro de base para a construção de cepas recombinantes que têm produção melhorada de isoprenoides. Para obter detalhes sobre esta cepa, consulte WO20110749654, que é aqui incorporado por referência.

Claims

1. Processo de Fermentação em Duas Fases Para Produzir Isoprenoide, caracterizado por que compreende as etapas de: a) adicionar um solvente orgânico imiscível em água a um meio aquoso para a cultura de células para formar um sistema de duas fases, em que a razão do solvente orgânico imiscível em água para meio aquoso se situa entre 0,5% (v/v) e 60% (v/v) e o volume total de solvente e meio é pelo menos de 10 L; b) fornecer o sistema de duas fases com uma sonda de oxigênio; então c) executar uma calibração da referida sonda de oxigênio; então d) otimizar a tensão de oxigênio no referido sistema de duas fases, em que a tensão de oxigênio otimizada está entre 50 - 100%; então e) inocular o referido sistema de duas fases com um micro-organismo capaz de produzir o referido isoprenoide no referido sistema de duas fases otimizado por oxigênio para atingir uma concentração saturada do mesmo na fase aquosa; então f) medir e otimizar a tensão de oxigênio; e g) permitir que o referido micro-organismo produza o referido isoprenoide a uma tensão otimizada por oxigênio entre 0 - 50%.

2. Processo de Fermentação em Duas Fases Para Produzir Isoprenoide, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o volume total de solvente e meio é pelo menos 30 L.

3. Processo de Fermentação em Duas Fases Para Produzir Isoprenoide, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o processo compreende ainda a esterilização do sistema de duas fases preparado na etapa a), em que a esterilização ocorre antes da etapa e).

4. Processo de Fermentação em Duas Fases Para Produzir Isoprenoide, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o processo compreende ainda o isolamento do isoprenoide a partir do sistema de duas fases.

5. Processo de Fermentação em Duas Fases Para Produzir Isoprenoide, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o solvente orgânico imiscível em água é um alcano líquido ou um álcool alifático de cadeia longa ou um éster de um ácido graxo de cadeia longa ou um isoprenoide.

6. Processo de Fermentação em Duas Fases Para Produzir Isoprenoide, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o solvente orgânico imiscível em água é dodecano, ácido láurico, ácido oleico, n-decano, estearato de butila, óleo de oliva, óleo de milho ou ftalato de diisononila (DINP).

7. Processo de Fermentação em Duas Fases Para Produzir Isoprenoide, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o micro-organismo é uma célula bacteriana Gram positiva, uma célula bacteriana Gram negativa, uma célula de fungo, uma planta transgênica ou cultura compreendendo uma célula de planta transgênica ou um cogumelo transgênico ou cultura compreendendo uma célula de cogumelo transgênico.

8. Processo de Fermentação em Duas Fases Para Produzir Isoprenoide, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que a porcentagem de solvente orgânico imiscível em água no sistema de duas fases está entre 2% (v/v) e 40% (v/v).

9. Processo de Fermentação em Duas Fases Para Produzir Isoprenoide, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizado por que o oxigênio dissolvido durante a etapa de fase de produção (f) nunca excede 80%.