CN113201463B - 一种快速筛选藏红花酸高产菌株的方法及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种快速筛选藏红花酸高产菌株的方法及其构建方法。本发明所述方法将待筛选菌株采用两相发酵法发酵培养，其中发酵培养基的体积不高于有机相的体积；发酵完成后，测定有机相吸光度，吸光度越高则表示藏红花酸产量越高，通过吸光度高低快速筛选出藏红花酸高产菌株。本发明发现了优化两相发酵中有机相的比例，从而可以使得菌株细胞内的藏红花酸完全排到胞外有机相中，而前体类胡萝卜素底物无外排，从而可通过有机相的吸光度变化判断菌株藏红花酸产量的变化，而不必使用复杂的HPLC法，能够实现快速简便的筛选高产藏红花酸菌株。

Description

一种快速筛选藏红花酸高产菌株的方法及其构建方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体的说是涉及一种快速筛选藏红花酸高产菌株的方法及其构建方法。

背景技术

藏红花酸(Crocetin)是藏红花中能够透过血脑屏障的药用活性成分，对神经系统疾病有很好的效果。目前，已实现在大肠杆菌和酿酒酵母中从头合成藏红花酸，但产量很低。此外，有研究者通过生物转化的方式，利用大肠杆菌表达糖基转移酶，将体外添加的底物藏红花酸在大肠杆菌中通过糖基转移酶的作用转化成藏红花素。同时也有研究者通过两相发酵，将酵母细胞中氧化裂解β-胡萝卜素合成的脱辅基类胡萝卜素维生素A排到胞外提高产量。这些研究表明，虽然藏红花酸在常规发酵条件下大部分存留在细胞内，但通过两相发酵为藏红花酸外排提供动力，有可能实现藏红花酸在酿酒酵母中的外排。

针对微生物细胞工厂中合成藏红花酸产量低的问题，可通过定向进化的方式对路径限速酶和工程菌株进行驯化。虽然藏红花酸是有颜色的脱辅基类胡萝卜素，但其前体番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质分别呈现深红色、橙色和黄色，并且这些类胡萝卜素底物在产量上占很大比例，因此这些颜色混在一起，使得无法根据菌株颜色变化快速筛选藏红花酸产量提高的菌株，只能通过HPLC检测分析而无法通过简便的吸光度法测定，这使得菌株的筛选工作较为繁琐。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速筛选藏红花酸高产菌株的方法，使得所述方法通过优化两相发酵条件，将产物藏红花酸完全单独外排，使得胞内的藏红花酸完全转移到胞外有机相中，而前体类胡萝卜素底物无外排，进而可通过吸光度法测定有机相吸光度来快速、简便的筛选高产菌株；

本发明的另外一个目的在于提供构建上述方案的方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种快速筛选藏红花酸高产菌株的方法，将待筛选菌株采用两相发酵法发酵培养，其中发酵培养基的体积不高于有机相的体积；发酵完成后，测定有机相吸光度，吸光度越高则表示藏红花酸产量越高，通过吸光度高低快速筛选出藏红花酸高产菌株。

在本发明具体实施方式中，本发明以十四酸异丙酯(IPM)为有机相，和生产藏红花酸的酵母菌株发酵培养基进行两相发酵，通过调整有机相和发酵培养基之间的体积比发现，不同比例下可引起不同程度的藏红花酸外排到胞外有机相中，而前体类胡萝卜素底物无外排，通过优化后发现发酵培养基和有机相的体积比为1:1时，藏红花酸可几乎完全外排到胞外有机相中，如此便可以通过吸光度法快速检测藏红花酸含量，为快速筛选高产酵母菌株提供了基础，上述现象是本发明首次发现。

作为优选，所述发酵培养基为含有诱导底物的YPD培养基，所述诱导底物根据待筛选菌株中的诱导表达系统确定。例如，本发明在具体实施方式中使用的是能够生产藏红花酸的酿酒酵母菌株yLN338，其体内存在半乳糖诱导表达系统，故发酵培养基中的诱导底物对应选择半乳糖，浓度优选为10g/L。

在本发明具体实施方式中，YPD培养基成分可参考如下：

40g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物；

在微生物发酵领域，一般都会在发酵前制备菌株的种子液，本发明所述方法也可包括制备种子液的过程，根据情况可确定是一级种子液还是二级种子液，种子液的种子培养基为不加诱导底物的发酵培养基。

在本发明具体实施方式中，种子培养基即为YPD培养基；种子液制备过程可参考如下：

一级种子液：菌种接种至3mL YPD种子培养基，作为一级种子220rpm30℃培养17h；

二级种子液：将一级种子按初始OD₆₀₀＝0.2转接至10mL新鲜YPD种子培养基，作为二级种子220rpm 30℃培养7h；

如更换种子培养基和菌种，可根据上述种子液制备方式进行适应性调整。

基于本发明发现的在两相发酵过程中有机相及其添加比例会影响藏红花酸产物分布的核心原理，本发明同时提供了一种构建通过吸光度法快速筛选藏红花酸高产菌株方案的方法，可以最大程度的扩大快速筛选藏红花酸高产菌株方案范围，而不必仅局限于前述提供的筛选方法，该构建方法包括：

步骤1、将能够产藏红花酸的菌株采用两相发酵法发酵培养，发酵过程中设置不同有机相、不同有机相和发酵培养基的体积比的多种发酵处理组；

步骤2、通过HPLC检测方法检测各发酵处理组中菌体、水相和有机相中藏红花酸的含量，统计菌体藏红花含量A、水相藏红花含量B以及有机相藏红花酸C，选择C/(A+B+C)百分比大于等于95％的发酵处理组中的有机相以及有机相和发酵培养基的体积比作为通过吸光度筛选藏红花酸高产菌株方案中的参数；

步骤3、将步骤2确定的参数运用到两相发酵法中并通过测定有机相的吸光度筛选藏红花酸高产菌株。

由以上技术方案可知，本发明发现了优化两相发酵中有机相的比例，从而可以使得菌株细胞内的藏红花酸完全排到胞外有机相中，而前体类胡萝卜素底物无外排，从而可通过有机相的吸光度变化判断菌株藏红花酸产量的变化，而不必使用复杂的HPLC法，能够实现快速简便的筛选高产藏红花酸菌株。

附图说明

图1所示为单相发酵菌体/水相中的提取样品的HPLC检测结果；

图2所示为两相发酵中(1:1)有机相/水相/菌体样品HPLC检测结果；

图3所示为两相发酵中(5:1)有机相/水相/菌体样品HPLC检测结果；

图4所示为三种发酵条件下菌体、水相和有机相中藏红花酸产量分布结果；

图5所示为三种发酵条件下菌体、水相和有机相中类胡萝卜素前体分布结果。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种快速筛选藏红花酸高产菌株的方法及其构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述方法及其构建方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法及其构建方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明在具体实施例中对比实验，除去各组设置的应有区别外，其他未明确提及的实验条件、原料、试剂等均保持一致，确保对比试验的可对比性。

本发明所述两相发酵法是指在发酵培养基中添加生物相容性比较好(不损伤细胞生长和代谢)的有机试剂如十四酸异丙酯、正十二烷等，用于萃取和储存异源合成产物。

以下就本发明所提供的一种快速筛选藏红花酸高产菌株的方法及其构建方法做进一步说明。

实施例1：藏红花酸生产菌株两相发酵条件探索与优化

实验菌株：

yLN338：Cz14,HO::GAL10p-CCD2_mut19-TEF2t-GAL7p-SynALD-PGI1t-URA3；菌株原件相关信息详见专利201910243448.9实施例4，整合在Cz14的HO位点；

种子培养基YPD：40g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物；

发酵培养基YPDG：40g/L葡萄糖，20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，10g/L半乳糖；

有机相IPM：十四酸异丙酯。

为了探讨两相发酵条件下藏红花酸的外排情况和产量变化，本发明以可合成藏红花酸的酿酒酵母菌株yLN338为例进行发酵优化。

菌株发酵：

Step1.yLN338甘油菌接种至3mL YPD种子培养基，作为一级种子220rpm 30℃培养17h；

Step2.将yLN338一级种子按初始OD₆₀₀＝0.2转接至10mL新鲜YPD种子培养基，作为二级种子220rpm 30℃培养7h；

Step3.将yLN338二级种子按初始OD₆₀₀＝0.1按如下三种条件接YPDG发酵，250rpm，20℃发酵136h。

发酵条件：

单相发酵：50mL YPDG发酵培养基；

两相发酵5:1(60mL)：50mL YPDG发酵培养基+10mL IPM；

两相发酵1:1(60mL)：30mL YPDG发酵培养基+30mL IPM。

藏红花酸产物和类胡萝卜素前体的菌体提取方法：

酸热法：发酵液离心后去上清，用无菌水洗菌体，之后加入3M盐酸，沸水煮3min之后冰浴3min，重复2～3次至菌体碎片呈细沙状。离心后去上清，用无菌水洗破碎后的菌体。之后加丙酮反复震荡萃取至菌体无色。合并萃取液，用真空离心浓缩仪蒸干溶剂，备测。

玻璃珠破壁法：发酵液离心后去上清，加丙酮和玻璃珠反复震荡萃取至菌体无色。合并萃取液，用真空离心浓缩仪蒸干溶剂，备测。

由于类胡萝卜素前体和藏红花酸HPLC检测时的溶剂和方法均不同，因此菌体，发酵液水相上清，有机相样品均需制备两份用于单独检测。

单相发酵：

取400μL发酵液(两份)，一份用酸热法提藏红花酸，一份用玻璃珠破壁法提取，用以检验酸热法提取过程中对藏红花酸的破坏。另外取离心后的发酵液上清用乙酸乙酯萃取浓缩后用DMF:甲醇＝1:7的溶剂溶解HPLC检测藏红花酸。

两相发酵5:1：

上层有机相用甲醇稀释5倍HPLC检测；

下层发酵液取400μL离心后菌体用丙酮加玻璃珠震荡提取(玻璃珠破壁法)；发酵液水相上清用乙酸乙酯萃取浓缩后用DMF:甲醇＝1:7的溶剂溶解，HPLC检测藏红花酸。

两相发酵1:1：

上层有机相用甲醇稀释5倍检测；

下层发酵液取400μL离心后菌体用丙酮加玻璃珠震荡提取(玻璃珠破壁法)；发酵液水相上清用乙酸乙酯萃取浓缩后用DMF:甲醇＝1:7的溶剂溶解，HPLC检测藏红花酸。

实施例2：单相发酵和两相发酵中菌体、水相、有机相中产物的分布

将实施例1中的发酵提取样品用HPLC检测，单相发酵菌体/水相中的提取样品、两相发酵中有机相/水相/菌体样品HPLC检测结果如图1-3所示；

图1的HPLC色谱图中色谱峰II代表藏红花酸，色谱峰III经质谱鉴定为藏红花酸半醛(藏红花酸二醛的一个醛基变为羧基)，色谱峰I未知。本发明发现在两相发酵中色谱峰III在产物中所占的比例相较于单相发酵变高；色谱峰I和色谱峰II的比例在1:1的两相发酵中和单相发酵相当，而在5:1的两相发酵中提高至接近1:1。色谱峰III的变化可能是由于产物外排，脱氢酶对藏红花酸二醛的脱氢不完全导致。

三种发酵条件下，菌体、水相和有机相中藏红花酸产量分布见图4，菌体中的类胡萝卜素前体见图5。

图4结果表明，在单相发酵中，通过玻璃珠破壁的直接提取法和通过加盐酸煮沸的酸热法提取的藏红花酸产量一致，类胡萝卜素产量也相差不大。而经过酸热法处理后，更易提取，所以可用酸热法代替玻璃珠破壁法提取类胡萝卜素和藏红花酸。

对于产物藏红花酸而言，单相发酵藏红花酸几乎全部集中在菌体内，培养基上清中几乎不含藏红花酸。而在两相发酵中发现藏红花酸被排到胞外。在1:1的两相发酵中，藏红花酸几乎全部排到胞外被萃取收集在IPM有机相中(有机相中藏红花酸占菌体+水相+有机相总和的98.8％)，菌体中几乎无藏红花酸；而在5:1的两相发酵中，虽有大量藏红花酸外排到IPM中，但菌体中也残留很多藏红花酸。

而图5结果显示，对于类胡萝卜素前体番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质而言，在两相发酵的水相和有机相IPM中均未检测到任何类胡萝卜素，三个类胡萝卜素均出现在菌体中，这就将底物和产物进行了完全隔离。

根据上述结果可以看出，在5:1的两相发酵中，有机相和菌体细胞内均有大量的藏红花酸，而随着有机相IPM的比例提高，在1:1的两相发酵中，藏红花酸的产量略有损失，但实现了藏红花酸的完全外排，使得产物和类胡萝卜素前体产生了空间隔离，可以推测出发酵培养基的体积不高于有机相的体积时，可以让外排的藏红花酸产量高低代表该菌株的藏红花酸总产量高低，这样在采用吸光度法分析胞外有机相中藏红花酸含量时就不会受类胡萝卜素的干扰。

虽然有机相中还有I和III化合物，但这两种化合物都与藏红花酸相关，且在单相发酵时比例会降低，因此不影响通过测定有机相IPM在特定波长的吸光度来判断溶解在其中的藏红花酸含量，进而筛选出高产菌株。

此外，本发明核心发现是通过优化调整有机相及其比例来改变藏红花酸的外排程度，通过优化可以实现几乎全部的外排效果，并不仅局限于实施例1和实施例2的筛选方案，可以通过如下的方法进行摸索确定，因此本发明也提供了一种构建通过吸光度法快速筛选藏红花酸高产菌株方案的方法，可以最大程度的扩大快速筛选藏红花酸高产菌株方案范围，而不必仅局限于前述提供的筛选方法，该构建方法包括：

步骤1、将能够产藏红花酸的菌株采用两相发酵法发酵培养，发酵过程中设置不同有机相、不同有机相和发酵培养基的体积比的多种发酵处理组；

步骤2、通过HPLC检测方法检测各发酵处理组中菌体、水相和有机相中藏红花酸的含量，统计菌体藏红花含量A、水相藏红花含量B以及有机相藏红花酸C，选择C/(A+B+C)百分比大于等于95％(或优选大于等于96％、97％、98％或99％)的发酵处理组中的有机相以及有机相和发酵培养基的体积比作为通过吸光度筛选藏红花酸高产菌株方案中的参数；

步骤3、将步骤2确定的参数运用到两相发酵法中并通过测定有机相的吸光度筛选藏红花酸高产菌株。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

Claims (4)

1.一种快速筛选藏红花酸高产菌株的方法，其特征在于，将待筛选菌株采用两相发酵法发酵培养，发酵完成后，测定有机相吸光度，吸光度越高则表示藏红花酸产量越高，通过吸光度高低快速筛选出藏红花酸高产菌株；

其中，发酵培养基和有机相的体积比为1:1；所述发酵培养基为含有诱导底物的YPD培养基，所述有机相为十四酸异丙酯。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导底物根据待筛选菌株中的诱导表达系统确定。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，在发酵培养前还包括制备待筛选菌株的种子液。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述制备待筛选菌株的种子液的种子培养基为不加诱导底物的发酵培养基。

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