CN105950493B - 一种工程菌及其构建方法与在制备藏红花酸中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种工程菌及其构建方法与在制备藏红花酸中的应用。本发明提供的工程菌中过表达CrtZ基因和CCD基因。相对于现有技术中的通过组织培养等方法进行藏红花酸的生物合成具有更为环保、成本低廉的优势，为藏红花酸的生产提供了一种可行的方法。且本发明提供的工程菌产藏红花酸的效率较高，发酵108h，藏红花酸的浓度可达1.17mg/L。

Description

一种工程菌及其构建方法与在制备藏红花酸中的应用
本申请要求于2016年05月25日提交中国专利局、申请号为201610355116.6、发明名称为“一种工程菌及其构建方法与在制备藏红花酸中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种工程菌及其构建方法与在制备藏红花酸中的应用。
背景技术
类胡萝卜素是一类广泛存在于生物体内具有重要生物活性及生理功能的异戊二烯类化合物，其特征碳骨架结构经过特定的裂解双加氧酶的催化可形成脱落酸、芳香类化合物、维生素A及脱辅基类胡萝卜素色素。在高等植物中，这些代谢过程普遍发生在开花期和果实成熟期。藏红花粉(Saffron)，主要来自于藏红花(Crocus sativus L.)的干燥柱头及栀子(Gardenia jasminoides)的果实中，其主要有效活性成分藏红花酸(Crocetin)、藏红花素(Crocin)和苦藏红花素(Picrocrocin)即是玉米黄质经裂解双加氧酶催化后的裂解产物。
藏红花酸(Crocetin)，又名藏花酸、西红花酸或番红花酸，是具有多不饱和共轭烯酸结构的类胡萝卜素物质，是西红花提取物的有效成分之一，其纯品为砖红色粉末，分子式为C20H24O4，相对分子质量为328.40。藏红花酸作为天然的活性化合物，藏红花酸是一个非常有前景的并且几乎没有副作用的有效药物。在我国的古典医书中记载，藏红花可以活血化瘀、安神解郁、凉血解毒，用于精神忧郁、心悸、闭经、湿毒发斑、产后瘀阻等疾病的治疗。自然界中可以合成天然藏红花酸的植物极少，目前发现的有藏红花、栀子及醉鱼草属植物花。藏红花酸的主要来源是藏红花的柱头，但是藏红花在自然界中的资源非常有限，而其柱头产量更是极低，平均25万朵藏红花，耗费40个小时的人工提取才能获得足够的柱头生产1kg的藏红花粉(saffron)，含量97％的藏红花酸市场售价高达13.6万元/g，因此藏红花享有“植物黄金”的美誉。
藏红花酸由于其出色的药理药效及独特的芳香味道越来越被人们所熟知，被广泛用于医药、化工、食品加工及化妆品行业，但是藏红花酸的产量极低，导致了供不应求，造成了市场短缺的现象。目前，藏红花酸的主要生产方法有天然提取、化学合成以及生物合成。在自然界中，藏红花酸的主要来源为藏红花的柱头，但是室内栽培的藏红花在开花期间会突然发生萎花，继而腐烂，造成藏红花的繁殖速度慢，产量极低，同时高昂的分离提纯方法造成天然提取较低的收益率。
藏红花酸的化学合成主要通过水解藏红花酸二甲酯得到，周忠等以2-溴丙酸甲酯和3，7-二甲基辛三烯二醛等为原料，经三步反应先合成藏红花酸二甲酯粗品，再经水解、脱色和重结晶处理，并通过有效的分离纯化，得到精制的藏红花酸。张俊国等以藏红花酸二甲酯为反应底物，使用KOH(50％)为碱，THF/CH3OH(3：2)为溶剂进行水解反应，从而得到藏红花酸。但是，化学合成的藏红花酸由于其较低的品质只能作为颜料而不能用作食品添加剂或药物。因此，微生物合成则以低成本、高产量和产品安全性被认为是最有前途的生产方法。
目前，藏红花酸的生物合成多集中在藏红花组织培养或悬浮细胞培养，清华大学郭志刚等通过先在固体培养基中获得藏红花的愈伤组织，随后转移至液体培养基中生物合成，采用固液两步培养的方法促进了藏红花的生长。Mir等通过调节培养基成分实现藏红花的体外繁殖。但是这些手段并不能显著的提高藏红花的产量。
随着对藏红花酸的生物合成途径及关键酶的发现，使得藏红花酸在工程菌株的异源表达成为可能，但是关于异源合成藏红花酸的报道很少。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种工程菌及其构建方法与在制备藏红花酸中的应用。本发明提供的菌株能够发酵产生藏红花酸，产生藏红花酸的最高浓度可达1.17mg/L。
本发明提供的工程菌过表达CrtZ基因和CCD基因。
根据藏红花酸的生物合成途径(附图1)，β-胡萝卜素在依次经过CrtZ基因、CCD基因和ALD基因的作用后，生成藏红花酸。本发明通过过表达CrtZ基因和CCD基因，从而实现了在工程菌中高表达藏红花酸，使以微生物为生物反应器的藏红花酸制备得以实现。本发明所述的工程菌选自酵母菌、霉菌或细菌。优选是能够产生β-胡萝卜素的酵母菌、霉菌或细菌。其中，酵母菌优选酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维属酵母；霉菌优选链霉菌；细菌优选大肠杆菌或枯草芽孢杆菌，
本发明中，采用的CrtZ基因来自不同的物种，而CCD基因则皆来自藏红花，研究表明，仅有导入CCD2基因的工程菌中大量产生了藏红花酸。因此，本发明提供的工程菌中，所述CrtZ基因为Aa crtZ、As crtZ、Eu crtZ、Pa crtZ、Ps crtZ、Ss crtZ、B.SD212 crtZ、B.DC263crtZ或Hp crtZ；所述CCD基因为CCD2。其中，表达量较高的菌种中，导入的CrtZ基因为Eu crtZ、Pa crtZ、Ps crtZ、Ss crtZ、B.SD212 crtZ或B.DC263 crtZ。表达量最高的菌种中，导入的Crt Z基因为Ps crtZ。
本发明中，Crt Z基因序列和CCD基因序列皆经密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点，作为优选，CrtZ基因序列和CCD基因的核苷酸序列为：
Aa crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
As crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
Eu crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
Pa crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
Ps crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
Ss crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
B.SD212crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
B.DC263crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
Hp crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；
CCD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO13所示。
本发明提供的工程菌在制备藏红花酸中的应用。
为了方便质粒的构建，在CrtZ基因和CCD基因的5’端添加SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；在CrtZ基因和CCD基因的3’端添加SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
为了能够获得更高产量的藏红花酸，优选采用高产β-胡萝卜素的菌种，在本发明中，采用的起始菌株为酵母菌SyBE_Sc0014CY06。酵母菌SyBE_Sc0014CY06能够高产β-胡萝卜素，来自天津大学，其构建方法参照申请号为201510435606.2的专利。
本发明构建的产藏红花的工程菌中，Crt Z基因的启动子为GAL启动子，终止子为HIS5t终止子；优选采用GAL1为启动子。
本发明构建的产藏红花的工程菌中，CCD基因的启动子为GAL启动子，终止子为TEF2t终止子；优选采用GAL10为启动子。
本发明中，CrtZ基因采用整合质粒导入，CCD基因采用着丝粒质粒导入。
本发明构建的产藏红花的工程菌的基因型为：
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Aa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-As CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Eu CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Pa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ps CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ss CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.SD212 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.DC263 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
或，SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Hp CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2。
其中，产藏红花量较高的工程菌的基因型为：
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Eu CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Pa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ps CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ss CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.SD212CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.DC263CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
其中，产藏红花量最高的工程菌的基因型为：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-PsCrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
本发明提供的工程菌中，通过ho左、右同源序列与酵母基因组上ho位点发生重组而将CrtZ基因整合到基因组上，CCD基因则以着丝粒质粒的形式稳定存在于酿酒酵母细胞中，
本发明的工程菌相对于现有技术中的通过组织培养等方法进行藏红花酸的生物合成具有更为环保、成本低廉的优势，为藏红花酸的生产提供了一种可行的方法。且本发明提供的工程菌产藏红花酸的效率较高，发酵96h，藏红花酸的浓度可达1.17mg/L。
本发明对CrtZ基因和CCD基因进行了密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点，故而，本发明还提供了一种CrtZ基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1～9中任一项所示。以及，本发明还提供了一种CCD基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
作为优选，本发明提供的CrtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3～8任一项所示。
优选的，本发明提供的CrtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
为了构建本发明提供的产藏红花酸的工程菌，本发明还提供了一种整合质粒，包括顺序连接的：ho左同源臂、GAL启动子、His5t终止子、DRURADR和ho右同源臂。
作为优选，其骨架为pJET1.2质粒。
本发明提供的整合质粒的构建过程及质粒图谱如图2。
其中，ho左同源臂的与GAL启动子之间的酶切位点为Xba I；
GAL启动子与His5t终止子之间的酶切位点为BsmBI；BsmB I酶切位点的个数为2个；
His5t终止子与DRURADR之间的酶切位点为Sma I。
在顺序连接的ho左同源臂、GAL启动子、His5t终止子、DRURADR和ho右同源臂两端，分别连接酶切位点Pme I。
本发明中，ho左右同源臂序列来自酵母基因组，所述酵母为SyBE_Sc0014CY06；其中，ho左同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO 16；ho右同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
DRURADR序列来自质粒LDL06(来自天津大学)，其核苷酸序列如SEQ ID NO18所示。
本发明整合质粒采用的GAL启动子为GAL1启动子，该序列来自酵母基因组；所述酵母为SyBE_Sc0014CY06其核苷酸序列如SEQ ID NO19所示。
His5t终止子的序列来自酵母基因组；所述酵母为SyBE_Sc0014CY06；其核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
本发明提供的整合质粒的构建方法包括：
步骤:1：将ho左同源臂、DRURADR、ho右同源通过OE-PCR的方法顺次拼接，得到两端包含PmeI酶切位点、且在ho左同源臂与DRURADR、ho右同源臂之间包含XbaI和SmaI酶切位点的片段；
步骤2：平末端载体pJET1.2连接得到pJET1.2-ho leftarm-DRURADR-horightarm；
步骤3：将GAL1启动子、HIS5t终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含XbaI和SmaI酶切位点，且在GAL1启动子和HIS5t终止子之间包含两个BsmBI酶切位点的片段PGAL1-THIS5t；
步骤4：将片段PGAL1-THIS5t通过XbaI和SmaI酶切位点与pJET1.2-ho leftarm-DRURADR-ho rightarm进行连接，得到整合质粒。
本发明提供的整合质粒在构建产藏红花工程菌中的应用。
本发明提供的整合质粒为CrtZ基因的表达提供了合适的启动子和终止子，其中的ho左右同源臂能够使CrtZ基因顺利整合入起始菌株的整合位点，DRURADR标签能够用于转化子的筛选，从而保证了工程菌构建工作的顺利进行。
本发明还提供了一种含有CrtZ基因的整合质粒，其在本发明提供的整合质粒中插入CrtZ基因，CrtZ基因的插入位点为BsmBI。其构建方法和质粒图谱如图3所示。具体的，本发明提供的含有CrtZ基因整合质粒，以pJET1.2质粒为骨架，包括顺序链接的ho左同源臂、GAL启动子、CrtZ基因、His5t终止子、DRURADR和ho右同源臂。
本发明对CrtZ基因的获取方式不做限定，在CrtZ基因的5’端添加SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；3’端添加SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
本发明提供的用于构建产藏红花酸的整合质粒中CrtZ基因的插入位点为BsmBI酶切位点。
本发明提供的含有CrtZ基因的整合质粒在构建产藏红花工程菌中的应用。
本发明还提供了一种含有CCD基因的着丝粒质粒，其构建方法和质粒图谱如图4所示。该着丝粒质粒以pRS416质粒为骨架，包括顺序连接的His5t终止子、GAL启动子、CCD基因、TEF2t终止子。
作为优选，其中CCD基因为CCD2基因。
His5t终止子、GAL启动子、TEF2t终止子的序列来自酵母菌SyBE_Sc0014CY06；皆通过PCR扩增获得。
其中，扩增His5t终止子的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示；
扩增GAL启动子的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示；扩增获得的为GAL10启动子；
扩增TEF2t终止子的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示。
本发明提供的含有CCD基因的整合质粒在构建产藏红花工程菌中的应用。
本发明提供的着丝粒质粒的构建方法包括：
步骤1：以酿酒酵母SyBE_Sc0014CY06的基因组DNA为模板，分别以SEQ ID NO:21～22所示引物对、SEQ ID NO:23～24所示引物对、SEQ ID NO:25～26所示引物对扩增得到HIS5t终止子、GAL10启动子、TEF2t终止子；
步骤2：制备CCD基因片段后，将HIS5t终止子、GAL10启动子、CCD基因片段、TEF2t终止子通过OE-PCR拼接得到两端包含NotI酶切位点的片段THIS5t-PGAL1-CCD-TTEF2t；
步骤3：将片段THIS5t-PGAL1-CCD-TTEF2t与pRS416质粒通过NotI酶切位点进行连接，得到本发明提供的着丝粒质粒。
本发明对CCD基因片段的制备方法不做限定，在CCD基因的5’端添加SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；3’端添加SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
本发明还提供了产藏红花酸工程菌的构建方法，该方法将CrtZ基因和CCD基因转化入起始菌。
本发明中，起始菌为酵母菌，优选的酵母菌为SyBE_Sc0014CY06。
作为优选，转化所述CrtZ基因采用的整合质粒以pJET1.2质粒为骨架，包括顺序链接的ho左同源臂、GAL启动子、CrtZ基因、His5t终止子、DRURADR和ho右同源臂；
转化所述CCD基因采用的着丝粒质粒以pRS416质粒为骨架，包括顺序连接的His5t终止子、GAL启动子、CCD基因、TEF2t终止子。
本发明构建产藏红花酸工程菌采用的CrtZ基因为Aa crtZ、As crtZ、Eu crtZ、PacrtZ、Ps crtZ、Ss crtZ、B.SD212 crtZ、B.DC263 crtZ或Hp crtZ；所述CCD基因为CsCCD2。
转化方法采用醋酸锂法。先转化含CrtZ基因的整合质粒再转化含CCD基因的着丝粒质粒。
转化含CrtZ基因的整合质粒后采用缺陷型培养基和抗性培养基对转化子进行筛选，再以PCR进行验证。
缺陷型培养基中包括：合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，质量分数为2％的琼脂粉。
抗性培养基中包括5-氟乳清酸。
转化含CCD基因的着丝粒质粒后采用缺陷型培养基对转化子进行筛选，再以PCR进行验证。
缺陷型培养基中包括：合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，质量分数为2％的琼脂粉。
以本发明提供的含CrtZ基因的整合质粒和含CCD基因的着丝粒质粒，能够将CrtZ基因和CCD基因顺利转化入SyBE_Sc0014CY06酵母菌，获得的工程菌能够产生产藏红花酸，最高产量可达1.17mg/L。
本发明提供的产藏红花酸的工程菌的保存采用YPD培养基。
本发明提供的藏红花酸的制备方法为发酵本发明提供的产藏红花酸的工程菌。
作为优选，发酵的温度为20℃～25℃。
优选的，发酵温度为20℃。
作为优选，发酵采用的培养基为含有D-半乳糖的YPD培养基。
优选的，发酵培养基中包括：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/LD-半乳糖。
作为优选，发酵在震荡条件下进行，转速为250rpm。
作为优选，发酵的起始菌体浓度为OD600＝0.1。
作为优选，发酵的时间为96h～108h。
优选的，发酵的时间为108h。
发酵培养基中D-半乳糖为诱导剂，负责开启GAL1和GAL10启动子的转录。初始培养基中因有葡萄糖存在，GAL启动子的转录受到葡萄糖抑制；随着发酵的进行，葡萄糖迅速被消耗，直至葡萄糖抑制效应解除，D-半乳糖开启GAL启动子的转录，从而逐渐积累藏红花酸。
本发明提供的藏红花酸的制备方法在发酵后，还包括提取的步骤。
所述提取的方法为：收集发酵后的菌体，用3N HCl重悬，反复冻融破碎的细胞后，12000rpm、4℃离心4min，取沉淀经水洗2次后加入丙酮，并涡旋5min；离心收集丙酮相，挥去丙酮制得藏红花酸，
本发明提供了一种工程菌及其构建方法与在生产藏红花酸中的应用，本发明提供的工程菌中过表达CrtZ基因和CCD基因。相对于现有技术中的通过组织培养等方法进行藏红花酸的生物合成具有更为环保、成本低廉的优势，为藏红花酸的生产提供了一种可行的方法。且本发明提供的工程菌产藏红花酸的效率较高，发酵96h，藏红花酸的浓度可达1.17mg/L。
附图说明
图1示利用重组酿酒酵母合成藏红花酸的路径图；
图2示整合质粒构建过程图；
图3示CrtZ基因表达盒构建过程图；
图4示CCD基因表达盒构建过程图；
图5示重组菌株SyBE_Sc0014C001-SyBE_Sc0014C036的藏红花酸摇瓶产量比较图；
图6示不同发酵温度的摇瓶产量比较图；
图7示优化发酵条件后菌株SyBE_Sc0123C0017的藏红花酸产量。
具体实施方式
本发明提供了一种工程菌及其构建方法与在生产藏红花酸中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明中，CrtZ基因为β-胡萝卜素羟化酶基因，CrtZ以β胡萝卜素为底物，将其转化为玉米黄质。本发明采用的CrtZ基因来源及序列如表1：
表1：CrtZ基因来源及序列
来源 序列
Aa crtZ 水生副球菌(Agrobacterium aurantiacum) SEQ ID NO:1
As crtZ 产碱杆菌(Alcaligenes sp.strain PC-1) SEQ ID NO:2
Eu crtZ 欧文氏菌(Erwinia uredovora) SEQ ID NO:3
Pa crtZ 成团泛菌(Pantoea agglomerans) SEQ ID NO:4
Ps crtZ 玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii) SEQ ID NO:5
Ss crtZ 硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus P2) SEQ ID NO:6
B.SD212 crtZ 短波单胞菌(Brevundimonas sp.SD212) SEQ ID NO:7
B.DC263 crtZ 短波单胞菌(Brevundimonas vesicularis DC263) SEQ ID NO:8
Hp crtZ 雨生红球藻(Haematococcus pluvialis) SEQ ID NO:9
CCD基因为玉米黄质裂解酶基因，CCD以玉米黄质为底物将其转化成为crocetindialdehyde(藏红花醛)；本发明采用的CCD基因来源及序列如表2：
表2：CCD基因来源及序列
来源 序列
CCD2 藏红花(Crocus sativus) SEQ ID NO:10
CCD3 藏红花(Crocus sativus) SEQ ID NO:11
ZCD 藏红花(Crocus sativus) SEQ ID NO:12
ZCD1 藏红花(Crocus sativus) SEQ ID NO:13
根据现有技术，CCD2、ZCD和ZCD1均被报道过具备在C7,8(7’,8’)裂解玉米黄质的功能，CCD3则是通过NCBI同源序列比对发现的一种来源于藏红花的与CCD2有97％同源性的序列，
本发明中，英文缩写表示的含义如下：
CCD 玉米黄质裂解酶
ZCD 玉米黄质裂解酶
CrtZ β-胡萝卜素羟化酶基因
DRURADR 营养标签
ho leftarm ho左臂，也标记为L-arm
ho rightarm Ho右臂，也标记为R-arm
PGAL1 GAL1启动子
THIS5t His5t终止子
PGAL10 GAL10启动子
TTEF2t TEF2t终止子
△ho:: ho被敲除后，被：：后面的序列取代
Glucose 葡萄糖
Acetyl-CoA 乙酰辅酶A
HMG-CoA 3-羟基-3甲基戊二酰辅酶
mevalonate 甲羟戊酸
GGPP 香叶基焦磷酸
β-carotene β-胡萝卜素
zeaxanthin 玉米黄质
Crocetin dialdehyde 藏红花醛
crocetin 藏红花酸
ALD基因 醛脱氢酶基因
Ampr 氨苄霉素抗性标记
OE-PCR 重叠延伸PCR
T4ligase T4连接酶
Digested 酶切
本发明提供的酿酒酵母工程菌株及其构建方法、应用中所用质粒等生物材料均可由市场购得，引物序列均可由生物公司合成。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本发明的生产藏红花酸的重组酿酒酵母菌株的构建方法如下：
高产β-胡萝卜素酿酒酵母SyBE_Sc0014CY06，由元英进课题组提供，其构建方法为参照申请号为201510435606.2的专利。
1、外源功能基因元件的获得
根据表1和表2。上述基因均为经过酿酒酵母密码子优化并适当规避常用限制性酶切位点后，在基因两端额外添加5’端gcggccgcggtctcca(SEQ ID NO 14)；3’taaaggagaccgcggccgc(SEQ ID NO 15)；本发明所使用的CCD和CrtZ基因片段皆通过人工合成得到，具体为由金斯瑞公司制备质粒，使用过程中CrtZ通过BsaI酶切，CCD则使用相应引物(表3所示)经PCR获得。
2、含有CrtZ基因的整合质粒的构建
整合质粒的构建：将GAL1启动子、HIS5t终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含XbaI和SmaI酶切位点，且在GAL1启动子和HIS5t终止子之间包含两个BsmBI酶切位点的片段PGAL1-THIS5t；同时，构建含DRURADR营养标签的ho左、右同源臂的ho整合质粒，PCR扩增ho左同源臂、DRURADR、ho右同源臂，并通过OE-PCR的方法顺次拼接，得到两端包含PmeI酶切位点、且在ho左同源臂与DRURADR、ho右同源臂之间包含XbaI和SmaI酶切位点的片段，然后与平末端载体pJET1.2连接得到ho整合质粒pJET1.2-ho leftarm-DRURADR-ho rightarm。之后将片段PGAL1-THIS5t通过XbaI和SmaI酶切位点进行连接，得到整合质粒pJET1.2-holeftarm-PGAL1-THIS5t-DRURADR-ho rightarm。
然后将9种不同来源的人工合成的crtz与整合质粒pJET1.2-ho-PGAL1-THIS5t-DRURADR通过BsmBI酶切位点进行连接，得到9种整合质粒，统计为pJET1.2-ho leftarm-PGAL1-CrtZ-THIS5t-DRURADR-ho rightarm。
3、含有CCD基因的着丝粒质粒的构建
以酿酒酵母SyBE_Sc0014CY06的基因组为模板扩增得到HIS5t终止子、GAL10启动子、TEF2t终止子，以由公司合成的基因质粒为模板，分别扩增出CCD2、CCD3、ZCD、ZCD1片段(扩增引物对序列如表3所示)。将HIS5t终止子、GAL10启动子、CCD基因、TEF2t终止子通过OE-PCR方法拼接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段THIS5t-PGAL10-CCD-TTEF2t。之后将片段THIS5t-PGAL1-CCD-TTEF2t与pRS416通过NotI酶切位点进行连接，得到基因表达盒pRS416-THIS5t-PGAL10-CCD-TTEF2t。
上述构建的模块一整合质粒和模块二基因表达盒质粒分别转化入大肠杆菌感受态DH5α中，菌落PCR筛选，提质粒进行单、双酶切验证以及测序验证，以确保目的片段连接正确且碱基序列未发生突变。
构建整合质粒和着丝粒质粒过程中采用的引物如表3：
表3：构建质粒过程中采用的引物
4、模块化整合构建生产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株
首先，将9种含有CrtZ基因的整合质粒用PmeI酶切位点切割，获得9种整合质粒的片段ho leftarm-PGAL1-crtz-THIS5t-DRURADR-ho rightarm，然后采用醋酸锂法将9种片段单独转化如高产β-胡萝卜素酵母菌株SyBE_Sc0014CY06，通过ho左、右同源序列与酵母基因组上ho位点发生重组而整合到基因组上。转化后采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母基因组进行PCR验证(序列如SEQ ID NO:47～48)，用YPD液体培养基对验证正确的重组菌株进行过夜培养后取少许菌液涂布5-氟乳清酸(5-FOA)固体板，挑取单菌落分纯培养后提取基因组进行PCR验证筛选通过DR序列间自发重组而删除URA基因的正确菌株，将该正确菌株命名为SyBE_Sc0123Cz01、SyBE_Sc0123Cz02、SyBE_Sc0123Cz03、SyBE_Sc0123Cz04、SyBE_Sc0123Cz05、SyBE_Sc0123Cz06、SyBE_Sc0123Cz07、SyBE_Sc0123Cz08和SyBE_Sc0123Cz09。其中，
SyBE_Sc0123Cz01:SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Aa CrtZ-THIS5t、
SyBE_Sc0123Cz02:SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-As CrtZ-THIS5t、
SyBE_Sc0123Cz03:SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Eu CrtZ-THIS5t、
SyBE_Sc0123Cz04:SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Pa CrtZ-THIS5t、
SyBE_Sc0123Cz05:SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ps CrtZ-THIS5t、
SyBE_Sc0123Cz06:SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ss CrtZ-THIS5t、
SyBE_Sc0123Cz07:SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.SD212CrtZ-THIS5t、
SyBE_Sc0123Cz08:SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.DC263CrtZ-THIS5t、
SyBE_Sc0123Cz09:SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Hp CrtZ-THIS5t。
5、模块化整合构建生产玉米黄质的重组酿酒酵母菌株
采用醋酸锂法将4种含有CCD基因的着丝粒质粒分别单独转化yBE_Sc0123Cz01、SyBE_Sc0123Cz02、SyBE_Sc0123Cz03、SyBE_Sc0123Cz04、SyBE_Sc0123Cz05、SyBE_Sc0123Cz06、SyBE_Sc0123Cz07、SyBE_Sc0123Cz08和SyBE_Sc0123Cz09，使基因CCD以着丝粒质粒的形式稳定存在于酿酒酵母细胞中，转化后采用SD-TRP-LEU-HIS-URA固体板(合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺色氨酸、亮氨酸、组氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的琼脂粉)进行筛选，得到的转化子进行划线分纯培养后提取酵母质粒进行PCR验证，将共计36种组合的正确菌株命名为：
SyBE_Sc0123C001：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Aa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2、
SyBE_Sc0123C002：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Aa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD3、
SyBE_Sc0123C003：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Aa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD、
SyBE_Sc0123C004：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Aa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD1、
SyBE_Sc0123C005：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-As CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2、
SyBE_Sc0123C006：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-As CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD3、
SyBE_Sc0123C007：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-As CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD、
SyBE_Sc0123C008：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-As CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD1、
SyBE_Sc0123C009：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Eu CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2、
SyBE_Sc0123C010：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Eu CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD3、
SyBE_Sc0123C011：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Eu CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD、
SyBE_Sc0123C012：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Eu CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD1、
SyBE_Sc0123C013：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Pa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2、
SyBE_Sc0123C014：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Pa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD3、
SyBE_Sc0123C015：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Pa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD、
SyBE_Sc0123C016：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Pa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD1、
SyBE_Sc0123C017：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ps CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2、
SyBE_Sc0123C018：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ps CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD3、
SyBE_Sc0123C019：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ps CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD、
SyBE_Sc0123C020：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ps CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD1、
SyBE_Sc0123C021：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ss CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2、
SyBE_Sc0123C022：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ss CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD3、
SyBE_Sc0123C023：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ss CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD、
SyBE_Sc0123C024：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ss CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD1、
SyBE_Sc0123C025：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.SD212 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2、
SyBE_Sc0123C026：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.SD212 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD3、
SyBE_Sc0123C027：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.SD212 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD、
SyBE_Sc0123C028：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.SD212 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD1、
SyBE_Sc0123C029：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.DC263 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2、
SyBE_Sc0123C030：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.DC263 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD3、
SyBE_Sc0123C031：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.DC263 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD、
SyBE_Sc0123C032：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.DC263 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD1、
SyBE_Sc0123C033：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Hp CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2、
SyBE_Sc0123C034：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Hp CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD3、
SyBE_Sc0123C035：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Hp CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD、
SyBE_Sc0123C036：SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Hp CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-ZCD1。
本发明制得的36株菌株敲除了SyBE_Sc0014CY06的基因组中的ho基因，并在其基因组中添加了GAL1启动子、CrtZ基因和His5终止子；另外包括含有CCD基因的着丝粒质粒。
实施例2
比较实施例1制备的36种基因组合设计菌株的藏红花酸的摇瓶产量
试验材料：菌株SyBE_Sc0123C001、SyBE_Sc0123C002、SyBE_Sc0123C003、SyBE_Sc0123C004、SyBE_Sc0123C005、SyBE_Sc0123C006、SyBE_Sc0123C007、SyBE_Sc0123C008、SyBE_Sc0123C009、SyBE_Sc0123C010、SyBE_Sc0123C011、SyBE_Sc0123C012、SyBE_Sc0123C013、SyBE_Sc0123C014、SyBE_Sc0123C015、SyBE_Sc0123C016、SyBE_Sc0123C017、SyBE_Sc0123C018、SyBE_Sc0123C019、SyBE_Sc0123C020、SyBE_Sc0123C021、SyBE_Sc0123C022、SyBE_Sc0123C023、SyBE_Sc0123C024、SyBE_Sc0123C025、SyBE_Sc0123C026、SyBE_Sc0123C027、SyBE_Sc0123C028、SyBE_Sc0123C029、SyBE_Sc0123C030、SyBE_Sc0123C031、SyBE_Sc0123C032、SyBE_Sc0123C033、SyBE_Sc0123C034、SyBE_Sc0123C035和SyBE_Sc0123C036
试验方法：
种子培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；
发酵培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
将实施例1制备的菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.1分别接种于50mL发酵培养基中，于25℃、250rpm条件下培养，监测发酵96h时藏红花酸产量。
藏红花酸定量方法：每个发酵瓶均取等量的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次后用以产物提取，具体方法为：用3N HCl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并涡旋5min；最后离心收集丙酮相，并用氮吹仪将丙酮挥发干净，加入200μL的DMF：甲醇＝1:7，并用2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，藏红花酸检测波长为430nm。
试验结果：发酵培养基中D-半乳糖为诱导剂，负责开启GAL1和GAL10启动子的转录。初始培养基中因有葡萄糖存在，GAL启动子的转录受到葡萄糖抑制；随着发酵的进行，葡萄糖迅速被消耗，直至葡萄糖抑制效应解除，D-半乳糖开启GAL启动子的转录，从而逐渐积累藏红花酸。由图5所示的藏红花酸产量来看，发酵96h，由基因CCD3、ZCD、ZCD1所形成的组合均没有检测到藏红花酸，只有基因CCD2所形成的组合检测到了藏红花酸，其中Ps crtZ和CCD2的组合藏红花酸产量最高。检测数据如表4：
表4藏红花酸浓度
藏红花酸浓度(μg/L)
SyBE_Sc0123C001 5.2
SyBE_Sc0123C005 2.1
SyBE_Sc0123C009 231.5
SyBE_Sc0123C0013 176.3
SyBE_Sc0123C0017 274.7
SyBE_Sc0123C0021 212.8
SyBE_Sc0123C0025 130.2
SyBE_Sc0123C0029 149.6
SyBE_Sc0123C0033 0.9
实施例3
1、比较实施例1菌株SyBE_Sc0123C009和SyBE_Sc0123C013的藏红花酸在不同发酵温度时摇瓶产量
试验材料：菌株SyBE_Sc0123C009和SyBE_Sc0123C013
试验方法：
种子培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；
发酵培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
将上述菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.1分别接种于50mL发酵培养基中，分别于于30℃、250rpm；25℃、250rpm；20℃、250rpm条件下培养，监测发酵96h时藏红花酸产量。
藏红花酸定量方法：每个发酵瓶均取等量的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次后用以产物提取，具体方法为：用3N HCl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并涡旋5min；最后离心收集丙酮相，并用氮吹仪将丙酮挥发干净，加入200μL的DMF：甲醇＝1:7，并用2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，藏红花酸检测波长为430nm。
试验结果：发酵培养基中D-半乳糖为诱导剂，负责开启GAL1和GAL10启动子的转录。初始培养基中因有葡萄糖存在，GAL启动子的转录受到葡萄糖抑制；随着发酵的进行，葡萄糖迅速被消耗，直至葡萄糖抑制效应解除，D-半乳糖开启GAL启动子的转录，从而逐渐积累藏红花酸。由图6所示的藏红花酸产量来看，发酵96h，低温(20℃和25℃)发酵时可以检测到藏红花酸，随着温度的升高，藏红花酸的产量显著下降，25℃发酵检测到的藏红花含量显著低于20℃(p<0.05)；30℃发酵时检测不到藏红花酸的积累。由此可知，温度是影响裂解酶表达或催化的关键因素。
实施例4
根据实施例3的结论，对菌株SyBE_Sc0123C0017的发酵条件进行优化，优化后的发酵方法为：
种子培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；
发酵培养基：40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，10g/L D-半乳糖。
将实施例1制备的菌株接种于5mL种子培养基中，在30℃、250rpm培养14-16h，以初始菌体浓度OD600＝0.1分别接种于50mL发酵培养基中，于20℃、250rpm条件下培养，监测发酵108h时藏红花酸产量。
藏红花酸定量方法：每个发酵瓶均取等量的发酵液，4000g离心2min收集菌体，并水洗两次后用以产物提取，具体方法为：用3N HCl重悬细胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min；将破碎的细胞12000rpm、4℃离心4min弃上清，水洗2次后加入丙酮，并涡旋5min；最后离心收集丙酮相，并用氮吹仪将丙酮挥发干净，加入200μL的DMF：甲醇＝1:7，并用2μm滤膜过滤后上紫外液相检测，藏红花酸检测波长为430nm。
结果显示，在适宜条件下，SyBE_Sc0123C0017菌株藏红花酸的产量可达1.17mg/L。是条件未优化前的5倍。(图7)
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种工程菌，其特征在于，其基因型为：
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Eu CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Pa CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ps CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-Ss CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.SD212 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
或SyBE_Sc0014CY06,△ho::PGAL1-B.DC263 CrtZ-THIS5t，pRS416-PGAL10-CCD2；
其中，
Eu crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
Pa crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
Ps crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
Ss crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
B.SD212 crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
B.DC263 crtZ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
CCD2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
2.权利要求1所述的工程菌在制备藏红花酸中的应用。
3.权利要求1所述工程菌的构建方法，其特征在于，将CrtZ基因和CCD基因转化入起始菌。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，转化所述CrtZ基因采用的整合质粒以pJET1.2质粒为骨架，包括顺序链接的ho左同源臂、GAL启动子、CrtZ基因、His5t终止子、DRURADR和ho右同源臂；
转化所述CCD基因采用的着丝粒质粒以pRS416质粒为骨架，包括顺序连接的His5t终止子、GAL启动子、CCD基因、TEF2t终止子。
5.一种藏红花酸的制备方法，其特征在于，发酵权利要求1所述的工程菌。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为20℃～25℃。
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