CN115851569B - 利用非粮生物质联产乳酸和乙醇的运动发酵单胞菌及应用 - Google Patents

利用非粮生物质联产乳酸和乙醇的运动发酵单胞菌及应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及运动发酵单胞菌技术领域，具体涉及利用利用非粮生物质联产乳酸和乙醇的运动发酵单胞菌及应用。以运动发酵单胞菌野生型菌株ZM4为出发菌株，通过内源CRISPR‑Cas基因编辑系统实现编码乳酸脱氢酶外源基因的引入和拷贝数增加，并通过改变启动子强度的方法降低运动发酵单胞菌中乙醇代谢途径基因pdc的表达强度，得到高效生产乳酸的工程菌株。本申请得到的运动发酵单胞菌基因工程菌株不仅提高了乳酸生产能力，同时也能够利用非粮生物质实现几乎所有生物质到乳酸和乙醇产品的转化。

Description

利用非粮生物质联产乳酸和乙醇的运动发酵单胞菌及应用
技术领域
本申请涉及运动发酵单胞菌技术领域，具体涉及利用非粮生物质联产乳酸和乙醇的运动发酵单胞菌及应用。
背景技术
广义的非粮生物质为用于食用及其储备以外的植物或动物生产的有机物质(“论我国非粮生物质原料的非粮属性[J]中国农业大学学报,2013,18(6):1～5”)，生物质原料“非粮”原则的本质是不影响粮食安全。国际通用粮食统计口径只包括谷物类，不包括豆类和薯类，以此口径衡量我国粮食自给率处于较高水平。非粮生物质原料是不属于粮食自给率统计范围内的动植物产品，而不是不能食用的生物质。狭义定义的非粮生物质是指谷物籽粒以外的生物质，谷物类以外农林有机产品属于非粮生物质原料。由于食用豆类、薯类、油料类和糖料类是重要的副食品或其原料，属于受限制发展的非粮生物质原料种类，非食用的动植物产品包括其有机废弃物属于鼓励发展的非粮生物质原料种类。
随着人类社会的快速发展，能源及资源危机日益凸现，利用非粮生物质原料转化燃料乙醇是缓解能源危机，实现双碳目标的重要途径，是世界高技术研究和产业化竞争的领域热点。乳酸，也称为2-羟基丙酸，其在食品，制药，化学和医疗工业中有广泛应用，通常用作食品添加剂，化妆品，保湿剂和有机溶剂等。乳酸的聚合物聚乳酸(PLA)，因具有生物相容性、生物降解性、弹性等特点，使得其取代传统石油衍生塑料的需求不断增加，同时乳酸的市场需求不断增加。为满足市场需求，90％的乳酸是由微生物发酵制得，如乳杆菌，乳球菌，芽孢杆菌和根瘤菌等。然而，这些微生物的发酵底物主要是粮食作物，如玉米，甘蔗等。这些粮食作物除了自身产量绝大部分用于食物，并非“非粮生物质”，即使将这些粮食作物全部用于生物制造也无法满足生物经济发展对大规模碳源的需求。因此，开发能够利用非粮生物质进行乳酸等平台化合物生产的基因工程菌迫在眉睫。
发明内容
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，是天然的乙醇工业生产菌株，具有许多优异的工业生产特性，如较高的糖吸收率、副产物少、不受噬菌体侵染、发酵过程中不需要氧气。除了利用纯糖发酵，运动发酵单胞菌可利用木质纤维素水解液生产燃料乙醇。同时，内源性和外源性的基因编辑工具已经应用在运动发酵单胞菌中进行内源和外源代谢途径的改造，实现了聚-β-羟丁酸(PHB)、2-3丁二醇、异丁醇和乳酸等产品的生产发酵。
尽管运动发酵单胞菌具有2个编码乳酸脱氢酶的内源基因，但野生型运动发酵单胞菌乳酸产量比较低。为此，本申请发明人以运动发酵单胞菌ZM4为出发菌株，通过内源CRISPR-Cas基因编辑系统实现编码乳酸脱氢酶外源基因的引入和拷贝数增加，并通过改变启动子强度的方法降低运动发酵单胞菌中乙醇代谢途径基因pdc的表达强度，得到高效生产乳酸的菌株ZML-pdc-ldh。并且发现，该菌株ZML-pdc-ldh能够利用如糖蜜和废弃玉米芯残渣等非粮生物质高效生产乳酸和乙醇。通过本申请方法得到的运动发酵单胞菌基因工程菌株不仅提高了乳酸生产能力，同时也能够利用非粮生物质实现几乎所有生物质到乳酸和乙醇产品的转化。
为此，本申请至少公开了如下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株是将ZM4菌株基因组上ZMO0038，ZMO1650及ZMO1360位点进行基因编辑得到的菌株；其中，所述ZM4菌株为Z mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821，所述ZMO0038位点和所述ZMO1360位点均经基因编辑替换为LmldhA基因，所述ZMO1650位点经基因编辑替换为pdc基因；ZMO0038和ZMO1360位点上的LmldhA基因均具有一个PadhB启动子，ZMO1650位点上的pdc基因具有一个Ptet启动子。
第二方面，本申请实施公开了一种利用非粮生物质联产乳酸和乙醇的方法，包括：
将运动发酵单胞菌的基因工程菌株接种至含有非粮生物质的培养基中，进行发酵，收获发酵液，所述发酵液中含有乳酸和乙醇；
其中，所述基因工程菌株是将ZM4菌株基因组上ZMO0038位点、ZMO1650位点及ZMO1360位点进行基因编辑得到的菌株；所述ZM4菌株为Z mobilis subsp.mobilis ZM4ATCC 31821，所述ZMO0038位点和所述ZMO1360位点均经基因编辑替换为LmldhA基因，所述ZMO1650位点经基因编辑替换为pdc基因；ZMO0038和ZMO1360位点上的LmldhA基因均具有一个PadhB启动子，ZMO1650位点上的pdc基因具有一个Ptet启动子。
第三方面，本申请实施例公开了一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建方法，其中，所述基因工程菌是将ZM4菌株基因组上ZMO0038，ZMO1650及ZMO1360位点进行基因编辑得到的菌株；其中，所述ZM4菌株为Z mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821，所述ZMO0038位点和所述ZMO1360位点均经基因编辑替换为LmldhA基因，所述ZMO1650位点经基因编辑替换为pdc基因；ZMO0038和ZMO1360位点上的LmldhA基因均具有一个PadhB启动子，ZMO1650位点上的pdc基因具有一个Ptet启动子。
所述构建方法包括：
构建分别靶向ZMO0038、ZMO1650及ZMO1360的第一编辑质粒、第二编辑质粒和第三编辑质粒；
将所述第一编辑质粒转入ZM4菌株中，得到ZMO0038位点被编辑的菌株；
将所述第二编辑质粒转入所述ZMO0038位点被编辑的菌株中，得到ZMO0038、ZMO1650位点被编辑的菌株；
将所述第三编辑质粒转入所述ZMO0038、ZMO1650位点被编辑的菌株，得到ZMO0038、ZMO1650及ZMO1360位点均被编辑的菌株。
本申请提供的运动发酵单胞菌的基因工程菌株、利用非粮生物质联产乳酸和乙醇的方法及构建方法的有益效果将在具体实施例中详细阐述。
附图说明
图1为本申请实施例提供的ZML-pdc-ldh菌株构建流程示意图。
图2为本申请实施例提供的ZML-pdc-ldh菌株的菌落PCR的电泳验证结果图。
图3为本申请实施例提供的ZML-pdc-ldh菌株分别对糖蜜和玉米芯残渣水解液的发酵效果图。
图4为本申请实施例提供的ZML-pdc-ldh的生长曲线图4a，图4b为pH变化图，图4c为乳酸和乙醇生成代谢结果图。
图5为本申请实施例提供的ZML-pdc-ldh乳酸发酵条件的优化结果图，图4a为pH变化图；图4b为乳酸和乙醇生成代谢变化图；图4c为ZML-pdc-ldh在不同时间点下的葡萄糖消耗，乳酸和乙醇生成代谢结果图。
图6为本申请实施例提供的ZML-pdc-ldh利用糖蜜时，蔗糖、葡萄糖和果糖的消耗，乳酸和乙醇生成结果图。
图7为本申请实施例提供的ZML-pdc-ldh利用玉米芯残渣水解液时，蔗糖、葡萄糖和果糖的消耗，乳酸和乙醇生成结果图。
图8为本申请实施例提供的ZMO0038(图8a)，ZMO1650(图8b)，ZMO1360(图8c)基因编辑原理图。
图9为本申请实施例提供的第一编辑质粒、第二编辑质粒和第三编辑质粒的构建示意图，图中，带箭头的粗线代表构建方向。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
本申请实施例提供的运动发酵单胞菌的基因工程菌株是以运动发酵单胞菌ZM4为出发菌株，通过基因工程的手段对菌株的ZMO0038(Gene ID:58025945)、ZMO1650位点(GeneID:58027365)及ZMO1360(pdc)位点(Gene ID:58027105)进行基因编辑得到的菌株。其中，所述ZM4菌株为Z.mobilis subsp.mobilis ZM4 ATCC 31821，所述ZMO0038位点和所述ZMO1360位点均经基因编辑替换为LmldhA基因，所述ZMO1650位点经基因编辑替换为pdc基因。利用ZM4的内源型CRISPR-ⅠF编辑系统的基因编辑技术对菌株基因组多个位点进行编辑，并引入能够对非粮生物质进行代谢的基因LmldhA(AB233384.1)，将二者整合至ZM4基因组的ZMO0038、ZMO1650位点及ZMO1360位点，不仅对ZM4的其他遗传学性状无实质性影响，而且还能使所得菌株能够利用非粮生物质发酵，并能实现同时生产乳酸和乙醇，产量显著高于一般的微生物发酵方法所得(如图3)。
在一些实施例中，在所得的基因工程菌株基因组中，ZMO0038和ZMO1360位点上的LmldhA基因均具有一个PadhB启动子，如SEQ ID NO.1所示；ZMO1650位点上的pdc基因具有一个Ptet启动子，如SEQ ID NO.2所示。
在该实施例中，以运动发酵单胞菌ZM4为出发菌株，通过内源性基因编辑系统的手段对引入外源乳酸脱氢酶并增加其拷贝数，得到了高效生产乳酸的菌株ZML-pdc-ldh。菌株ZML-pdc-ldh可以高效利用如糖蜜和废弃玉米芯残渣的非粮生物质，生产乳酸。
为此，本申请实施例还公开了此种运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建方法。该构建方法包括：
构建分别靶向ZMO0038、ZMO1650及ZMO1360的第一编辑质粒、第二编辑质粒和第三编辑质粒；
将所述第一编辑质粒转入ZM4菌株中，得到ZMO0038位点被编辑的菌株；
将所述第二编辑质粒转入所述ZMO0038位点被编辑的菌株中，得到ZMO0038、ZMO1650位点被编辑的菌株；
将所述第三编辑质粒转入所述ZMO0038、ZMO1650位点被编辑的菌株，得到ZMO0038、ZMO1650及ZMO1360位点均被编辑的菌株。
在一个实施例中，如图1、2所示，以运动发酵单胞菌ZM4为出发菌株，通过内源型CRISPR-IF编辑系统，靶向ZM4基因组ZMO0038基因进行基因编辑，得到ZMO0038替换成PadhB-LmldhA的重组菌株ZML。在ZML菌株基础上，靶向基因组ZMO1650基因进行基因编辑，得到ZMO1650替换成Ptet-pdc的重组菌株ZML-pdc。在ZML-pdc菌株基础上，靶向基因组ZMO1360基因进行基因编辑，得到ZMO1360替换成PadhB-LmldhA的重组菌株ZML-pdc-ldh。ZML-pdc-ldh菌株流程图如图1所示，菌落PCR验证结果如图2所示。
在一个实施例中，对ZML-pdc-ldh菌株进行生长和乳酸发酵性能的测试，并优化了包括pH调节和不同葡萄糖浓度下的工艺放大在内的乳酸发酵条件。最后测试了ZML-pdc-ldh在糖蜜和玉米芯残渣水解液中的发酵性能。如图4所示，将基因工程重组菌株ZML-pdc-ldh于30℃条件，接种至装瓶量为80％的RMG5培养基于50mL三角瓶中，100rpm培养条件下进行测试。在发酵过程中每隔一定时间取样测试OD600nm和pH值，同时取1mL样品暂储存于-80℃，待发酵液葡萄糖耗完，收集菌体测量发酵过程中葡萄糖的消耗，乳酸和乙醇的生产的变化情况，得到ZML-pdc-ldh的生长曲线图4a和pH变化图4b，以及不同时间点下的葡萄糖消耗，乳酸和乙醇生成代谢结果如图4c。如图4所示，ZML-pdc-ldh在30℃，RMG5中的生长速率为0.18h-1，pH降低速度快，能生成乳酸和乙醇。
在一个实施例中，对基因工程重组菌株ZML-pdc-ldh包括pH控制和工艺放大在内的乳酸发酵条件进行优化，并进行发酵测试。pH控制过程具体为：将ZML-pdc-ldh于30℃，接种至装瓶量为80％的添加10g/L CaCO3的RMG5培养基于50mL三角瓶中，100rpm培养条件下进行测试。在发酵过程中每隔一定时间取样测试OD600nm和pH值，同时取1mL样品暂储存于-80℃，待发酵液葡萄糖耗完，收集菌体测量发酵过程中葡萄糖的消耗，乳酸和乙醇的生产的变化情况。如图5所示，得到ZML-pdc-ldh的pH变化图5a和不同时间点下的葡萄糖消耗，乳酸和乙醇生成代谢结果图5b。工艺放大过程具体为ZML-pdc-ldh在30℃，装瓶量为60％的RMG5/RMG12培养基于1-L发酵罐，pH控制为5.8±0.1，100rpm培养条件下进行测试。在发酵过程中每隔一定时间取1mL样品暂储存于-80℃，待发酵液葡萄糖耗完，收集菌体测量发酵过程中葡萄糖的消耗，乳酸和乙醇的生产的变化情况。得到ZML-pdc-ldh在不同时间点下的葡萄糖消耗，乳酸和乙醇生成代谢结果图5c。如图5所示，ZML-pdc-ldh添加CaCO3做为中和剂后，发酵液pH得到控制，乳酸产量提高，发酵时间缩短。在放大工艺后，乳酸产量进一步提高，并且高浓度初始葡萄糖对乳酸发酵无太大影响。
在一个实施例中，利用基因工程重组菌株ZML-pdc-ldh对非粮生物质如糖蜜进行发酵制得乳酸。在此使用的20％糖蜜培养基的具体配置方法为：120mL的糖蜜和480mL的水。主要成分包括蔗糖(77.1g/L)、葡萄糖(4.8g/L)、果糖(6.8g/L)、乳酸(6.3g/L)。在1L的发酵罐中放入600mL的20％糖蜜培养基，初始接种量为0.5OD600nm，控制培养温度为30℃，转速为100rpm，用4M氢氧化钾控制pH。在不同时间点取样用于检测蔗糖，葡萄糖，果糖，乳酸和乙醇含量。ZML-pdc-ldh利用糖蜜时蔗糖，葡萄糖和果糖的消耗，生成乳酸和乙醇。如图3和6所示，该菌株ZML-pdc-ldh能够对包含77.1g/L蔗糖、4.8g/L葡萄糖、6.8g/L果糖和6.3g/L乳酸的20％甜菜糖蜜进行发酵，并且实现了乳酸超30g/L、乙醇接近30g/L的产量，总碳转化率达到97％。其中，总碳转化率为产物乙醇和乳酸消耗的碳含量占发酵过程总消耗的碳含量的百分比，总碳转化率＝(g乙醇/0.511+g乳酸/1)/(g蔗糖×0.526+g葡萄糖+g蔗糖×0.526+g果糖)。其中，“0.511”和“1”分别代表葡萄糖转化为乙醇和乳酸的理论转化率，“0.526”代表蔗糖转化成葡萄糖和果糖的理论转化率，“g乙醇”和“g乳酸”代表发酵过程中生产的乙醇和乳酸量，“g蔗糖”、“g葡萄糖”和“g果糖”分别代表是发酵过程中消耗的蔗糖、葡萄糖和果糖量。
在一个实施例中，利用基因工程重组菌株ZML-pdc-ldh对非粮生物质玉米芯残渣水解液进行发酵制得乳酸。玉米芯残渣水解液来自浙江华康公司，在此使用的玉米芯残渣水解液培养基具体配置方法为：600mL的玉米芯残渣水解液，6g酵母提取物，0.6g磷酸二氢钾，0.6g磷酸氢二钾和6g CaCO3。主要成分包括葡萄糖(150g/L)、木糖(19.5g/L)、乙酸(2.1g/L)。在1L的发酵罐中放入600mL的玉米芯残渣水解液培养基，初始接种量为0.5OD600nm，控制培养温度为30℃，转速为100rpm。在不同时间点取样用于检测葡萄糖，乳酸和乙醇含量。ZML-pdc-ldh葡萄糖消耗，生成乳酸和乙醇。结果如图3、7所示，该菌株ZML-pdc-ldh还能够对包含150.0g/L葡萄糖、19.5g/L木糖和2.1g/L乙酸的玉米芯残渣水解液进行发酵，并且实现了乳酸超40g/L、乙醇超50g/L的产量，总碳转化率达到99％。其中，总碳转化率为产物乙醇和乳酸消耗的碳含量占发酵过程总消耗的碳含量的百分比，总碳转化率＝(g乙醇/0.511+g乳酸/1)/g葡萄糖；其中，“0.511”和“1”分别代表葡萄糖转化为乙醇和乳酸的理论转化率，“g乙醇”和“g乳酸”代表发酵过程中生产的乙醇和乳酸的含量，“g葡萄糖”代表是发酵过程中消耗的葡萄糖量。
下方将对上述实施例中使用的第一编辑质粒、第二编辑质粒和第三编辑质粒的构建过程，以及采用这些质粒对ZM4进行基因编辑得到ZML-pdc-ldh菌株的编辑过程，以及所得基因工程菌株的应用进行详细说明。
1、第一编辑质粒、第二编辑质粒和第三编辑质粒的构建
针对ZM4基因组上ZMO0038，ZMO1650，ZMO1360作为靶位点，依次靶向这三个基因，对其进行替换，其编辑原理如图8所示。
在一些实施例中，第一编辑质粒、第二编辑质粒和第三编辑质粒的结构如图9所示。第一编辑质粒携带有第一CRISPR表达单元，第一CRISPR表达单元包含如SEQ ID NO.3所示的先导区、如SEQ ID NO.4所述的重复区、位于先导区上游的第一供体区以及位于所述重复区之间的第一向导区。第二编辑质粒携带有第二CRISPR表达单元，第二CRISPR表达单元包含如SEQ ID NO.3所示的先导区、如SEQ ID NO.4所述的重复区、位于先导区上游的第二供体区以及位于所述重复区之间的第二向导区。第三编辑质粒携带有第三CRISPR表达单元，第三CRISPR表达单元包含如SEQ ID NO.3所示的先导区、如SEQ ID NO.4所述的重复区、位于先导区上游的第三供体区以及位于所复区之间的第三向导区；其中，第一向导区靶向结合ZMO0038基因，第二向导区靶向结合ZMO1650基因，第三向导区靶向结合ZMO1360基因。
在一些实施例中，第一编辑质粒、第二编辑质粒和第三编辑质粒还分别携带有标记基因，标记基因选自氨苄青霉素基因、四环素基因、氯霉素基因、链霉素基因、潮霉素基因、壮观霉素基因、卡那霉素基因、杀稻瘟菌素基因、遗传霉素基因、潮霉素基因、霉酚酸基因、嘌呤霉素基因、博莱霉素基因、新霉素基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因或绿色荧光蛋白基因中的一种。
(1)第一向导区、第二向导区和第三向导区
选择ZM4基因组中ZMO0038，ZMO1650，ZMO1360基因从ZMO0038，ZMO1650基因内部和ZMO1360基因的启动子中选择PAM位点CCC位点下游32bp的序列分别作为第一向导区、第二向导区和第三向导区。
第一向导区的核苷酸序列：5’-caaatgcctaagcgcctctgtcactttcggta-3’,SEQ IDNO.5所示，
第二向导区的核苷酸序列：5’-ttcaaaagaagtattggtaagcgagaccacgg-3’,SEQ IDNO.6所示，
第三向导区的核苷酸序列：5’-tatagctaaatccggaacgacactttagaggt-3’,SEQ IDNO.7所示，
(2)构建靶质粒
分别根据SEQ ID NO.5～7所示序列，设计靶质粒中向导RNA的靶向引物序列，引导核酸酶对靶位点的切割。具体的引物序列如下(每条引物前4个碱基设置为接头，与酶切后的载体互补配对)：
gRNA-0038-F:5’-gaaacaaatgcctaagcgcctctgtcactttcggta-3’，SEQ ID NO.8所示，
gRNA-0038-R:5’-gaactaccgaaagtgacagaggcgcttaggcatttg-3’，SEQ ID NO.9所示，
gRNA-1650-F:5’-gaaattcaaaagaagtattggtaagcgagaccacgg-3’，SEQ ID NO.10所示，
gRNA-1650-R:5’-gaacccgtggtctcgcttaccaatacttcttttgaa-3’，SEQ ID NO.11所示，
gRNA-1360-F:5’-gaaatatagctaaatccggaacgacactttagaggt-3’，SEQ ID NO.12所示，
gRNA-1360-R:5’-gaacacctctaaagtgtcgttccggatttagctata-3’，SEQ ID NO.13所示。
靶向基因(ZMO0038，ZMO1650，ZMO1360)向导RNA引物序列连接到专利CN110408642A中含有CRISPR-ⅠF表达单元(如图中的初始CRISPR)的壮观霉素编辑质粒载体(pEZ15Asp)上：首先利用限制性内切酶BsaⅠ将载体进行线性化处理，然后将向导RNA引物对进行退火(10μM的引物各取1μL加水补足至10μL，95℃变性5min，然后冷却至室温备用)。退火的产物(即为第一\二\三向导RNA)与线性化载体使用T4DNA连接酶进行连接，然后通过本领域通用化学转化法转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。如此得到的靶质粒上携带了向导RNA。
在该实施方式的一些实施例中，该基础质粒是在pEZ15A上插入一个初始CRISPR簇，并且替换成为具有不同的第二复制起始区得到的。其中，pEZ15A(核苷酸序列如SEQ IDNO.29所示)参照“Yang S,Mohagheghi A,Franden M A,et al.Metabolic engineering ofZymomonas mobilis for2,3-butanediol production from lignocellulosic biomasssugars[J].Biotechnol Biofuels,2016,9:189.”方法获得。为获得不同编码基因(例如抗性基因)的pEZ15A，可以参照“质粒pUC19-CM-D的构建及应用[J].安徽农业科学，2010年，公开的方法，第19期”在其中插入不同标记基因，例如插入了壮观霉素抗性基因的pEZ15Asp，其具有如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列的第一复制起始区、如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的第二复制起始区和位于第一复制起始区的复制起始端与第二复制起始区的复制终端之间的标记基因区(Spe基因)，第一复制起始区为156-1069bp之间，第二复制起始区位于2142～3015bp之间。
(3)构建编辑质粒
在本步骤中涉及的引物序列如下：
利用up-0038-F:5’-tcaccagctcaccgtctgtatcgcgccccaatatgaccg-3’，SEQ IDNO.16所示。
up-0038-R:5’-cttgactccctccatgcacttaaaaaatc-3’，SEQ ID NO.17所示。扩增出ZMO0038基因上游序列；
利用down-0038-F:5’-tcgttaaatattcagatagacggagataataaacggga-3’，SEQ IDNO.18所示。
down-0038-R:5’-gagagatctgatatcactttaggcgagaagggaaagggca-3’，SEQ IDNO.19所示。扩增出ZMO0038基因下游序列；
利用up-1650-F:5’-gtcaccagctcaccgtctccgatccgccctatggtct-3’，SEQ IDNO.20所示。
up-1650-R:5’-ggaggatattccagagaagaaagtaagcaatc-3’，SEQ ID NO.21所示。扩增出ZMO1650基因上游序列；
利用down-1650-F:5’-ggtgcggtcttgattagccttgaa-3’，SEQ ID NO.22所示。
down-1650-R:5’-tcgagatctgatatcactgtgctatccgcttggctctc-3’，SEQ ID NO.23所示。扩增出ZMO1650基因下游序列；
利用up-1360-F：5’-gtcaccagctcaccgtctattgtaggcggctggattgt-3’，SEQ IDNO.24所示。
up-1360-R：5’-gcaaattatgaaggaatcagaaccagatgtagaaacgtagc-3’，SEQ IDNO.25所示。扩增出ZMO1360基因上游序列；
利用down-1360-F：5’-ccagctattgctgttgaatattaatttttaaataaacttagagcttaaggcgaa-3’，SEQ ID NO.26所示。
down-1360-R：5’-tcgagatctgatatcacttacctgattacgacaaatcaagcag-3’，SEQ IDNO.27所示。扩增出ZMO1360基因下游序列。
利用PadhB-F:5’-ttcataatttgcataagtcttgatgtaaaaaatac-3’，SEQ ID NO.28所示。
PadhB-R:5’-agctataacctcaccctacatactag-3’，SEQ ID NO.29所示。扩增出PadhB序列；
利用LmldhA-F:5’-ggtgaggttatagctatgaagatttttgcttacggcattc-3’，SEQ IDNO.30所示。
LmldhA-R:5’-taatattcaacagcaatagctggcttctcac-3’，SEQ ID NO.31所示。扩增出LmldhA序列；
利用Ptet-F:5’-acggtctcccgtttaagaccc-3’，SEQ ID NO.32所示。
Ptet-R:5’-gggagatcctttctcctctttagatcatttgaatacttttct-3’，SEQ ID NO.33所示。扩增出Ptet序列；
利用pdc-F:5’-gaggagaaaggatctcccatgagttatactgtcggtacctatttagcg-3’，SEQID NO.34所示；
pdc-R:5’-gctaatcaagaccgcaccctagaggagcttgttaacaggcttacg-3’，SEQ IDNO.35所示，扩增出pdc序列。
再通过Overlap PCR将获得ZMO0038基因上游序列和ZMO0038基因下游序列连成一体，作为第一供体片段(SEQ ID NO.36所示)。通过Overlap PCR将获得ZMO1650基因上游序列和ZMO1650基因下游序列连成一体，作为第二供体片段(SEQ ID NO.37所示)。通过Overlap PCR将获得ZMO1360基因上游序列和ZMO1360基因下游序列连成一体，作为第三供体片段(SEQ ID NO.38所示)。
如图9所示，将上一步构建好的靶质粒利用引物FK-F:5’-agtgatatcagatctcgagctcggtacccgg-3’，SEQ ID NO.39所示；FK-R:5’-agacggtgagctggtgacct-3’，SEQ ID NO.40所示。进行反向PCR扩增。PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(根据片段长度按照10s/kb进行设置，共30个循环；循环反应结束后72℃保持5min，然后通过Gibson装配的方法将片段和载体进行连接，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。
2、质粒的转化
①感受态制备：
将冻存菌从-80℃冰箱中取出，取100μL接种在装有1mL RMG5的冻存管中，于30℃培养箱静置培养以活化菌株。待培养至浑浊后，转接至装有200mL RMG5液体培养基的250mL蓝盖瓶中，使初始OD600nm在0.025～0.3范围内，于30℃培养箱静置培养，待OD600nm超过0.3时，常温100rpm收集菌体，随后用无菌水洗1次，10％甘油洗两次，最终用1～2mL10％甘油缓慢重悬菌体，分装55μL感受态到1.5mL EP管中。
②质粒电转方法：
将1mg靶向ZMO0038，ZMO1650，ZMO1360的编辑质粒加入到装有55μL感受态的1.5mLEP管中，轻轻混匀后转移到1mm电转杯中。电转仪程序设置：200Ω，电容：25μF，电压：1.6KV。将电转杯放入电转仪中进行电转，电转后立即加入1mL RMG5液体培养基，混匀后转移到无菌EP管中，用封口膜封好后于30℃恒温培养箱中孵育4-6h。取100μL菌液，均匀涂布到RMG5+Spe平板(100μg mL-1壮观霉素)上。用封口膜将平板封好后放在30℃培养箱中倒置培养。
③菌落PCR验证方法：
平板上长出单菌落后，用验证转入的编辑质粒的引物pEZ15A-F:5’-ggcaaagccaccctatttttag-3’,SEQ ID NO.41所示。pEZ15A-R:5’-cacttcactgacaccctcat-3’,SEQ ID NO.42所示。对单菌落进行PCR验证。PCR体系和PCR程序如下。将获得的正确阳性克隆在所带RMG5+Spe培养基中活化后，甘油保菌。菌落PCR反应体系以10μL计包含：F-primer(10μM)0.4μL，R-primer(10μM)0.4μL，2×T5 Super PCR Mix(Tsingke)5μL，Template(单菌落溶于10μLddH2O)1μL，ddH2O 3.2μL。菌落PCR反应程序包括：98℃，3min，(98℃ 10s，55℃ 10s，72℃ 10s)29个循环，72℃3min，16℃保持。
3、基因替换具体实例：
在一个实施例中，如图8所示，
①将靶向ZMO0038的编辑质粒电转入ZM4中，涂布在RMG5+Spe平板上。得到的转化子用引物Chk-0038-F:5’-aggatggtcgatcttcagctattgtg-3’,SEQ ID NO.43所示。Chk-0038-R:5’-gtgaaccgccaaaaactcgg-3’,SEQ ID NO.44所示。进行验证。菌落PCR以ZM4的PCR结果作为对照。菌落PCR以引物pEZ-15A-F/R的PCR扩增结果观察其它内源质粒是否存在单菌落在RMG5液体培养基中连续传代后得到编辑质粒丢失的得到ZML菌株。将此菌株制备感受态以供后续使用。
②将靶向ZMO1650的编辑质粒电转入ZML中，涂布在RMG5+Spe平板上。得到的转化子用引物Chk-1650-F:5’-ccgatggcaaaatctgggttg-3’,SEQ ID NO.45所示；Chk-1650-R:5’-taccgagacgggaaagacag-3’,SEQ ID NO.46所示进行验证。菌落PCR以ZML的PCR结果作为对照。菌落PCR以引物pEZ-15A-F/R的PCR扩增结果观察其它内源质粒是否存在单菌落在RMG5液体培养基中连续传代后得到编辑质粒丢失的得到ZML-pdc菌株。将此菌株制备感受态以供后续使用。
③将靶向ZMO1360的编辑质粒电转入ZML-pdc中，涂布在RMG5+Spe平板上。得到的转化子用引物Chk-1360-F:5’-tgctgacaaaaggggacatga-3’,SEQ ID NO.47所示。Chk-1360-R:5’-acttgaataaaccgccacaga-3’,SEQ ID NO.48所示进行验证。菌落PCR以ZML-pdc的PCR结果作为对照。菌落PCR以引物pEZ-15A-F/R的PCR扩增结果观察其它内源质粒是否存在单菌落在RMG5液体培养基中连续传代后得到编辑质粒丢失的得到ZML-pdc-ldh菌株。
④在一个实施例中，将转入了第一编辑质粒、第二编辑质粒和/或第三编辑质粒的基因工程菌接种在没有抗性的RMG5液体培养基中，待长到浑浊后转接100μL菌液到1mL新鲜的RMG5液体培养基中，如此连续传代4～5代后，取100μL菌液稀释涂在RMG5平板上。待平板上长出单菌落后，用验证编辑质粒的引物对单菌落进行PCR验证，若PCR没有条带，则编辑质粒可能丢失。将菌落PCR没有条带的单菌落分别接种在RMG5液体培养基和RMG5+Spe液体培养基中，放置在30℃静置培养。第二天对两种培养基下的培养结果进行观察，若在RMG5液体培养基可以生长变浑浊，而在RMG5+Spe液体培养基中无法生长呈澄清状态，则可以确认编辑质粒已被消除。
4、基因工程菌ZML-pdc-ldh生长和乳酸发酵性能的测试
将所得到的ZML-pdc-ldh在RMG5中进行发酵测试。首先取一定量甘油菌接种到含有1mL RMG5的冻存管中，于30℃培养箱静置活化至浑浊后，转接入装有80mL RMG5培养基的100mL的三角瓶中作为发酵种子液，于30℃培养箱静置培养至对数中后期。进一步转接到装有40mL RMG5培养基的50mL三角瓶中发酵。在OD600nm处控制初始OD为0.1。在发酵过程中，用紫外分光光度计测量600nm处的光密度OD值以测定不同时间点的细胞生长，同时用pH计测量pH值，并将不同时间点取得的发酵液收集，后用于HPLC(高效液相色谱仪)中检测葡萄糖，乙醇和乳酸的含量。采用岛津商贸有限公司Agilent 1100系列高效液相色谱仪(LC-20AD)；检测器为示差折光检测器(RID-10A)；色谱柱为有机酸色谱柱(Bio-Rad Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm)；池温度为40℃，柱温箱温度为60℃；流动相为5mM的硫酸，流速为0.5mL/min，仪器运行时初始流速设置为0.2mL/min，待柱压稳定后以0.1mL/min的流速逐渐增加至0.5mL/min；进样量为20μL。待检测结束后，导出数据并做图。
流动相的配置：取1.41mL浓硫酸至5L的蓝盖瓶中，用超纯水定容至5L后混合均匀，使用0.45μm孔径的水相滤膜进行过滤。将过滤后的流动相分装至1L流动相蓝盖瓶中进行超声脱气20～30min。等恢复至室温后即可使用。
5、基因工程菌菌株ZML-pdc-ldh乳酸发酵条件的优化
①ZML-pdc-ldh发酵过程中pH的控制。
将所得到的ZML-pdc-ldh在RMG5发酵过程中的pH通过中和剂进行控制。首先是菌株的活化，方法如上。待发酵种子液培养至对数中后期。进一步转接到装40mL添加10g/LCaCO3的RMG5培养基的50mL三角瓶，OD600nm处控制初始OD为0.1。在30℃，100rpm培养条件下进行测试。在发酵过程中每隔一定时间取样测试OD600nm和pH值，将不同时间点取得的发酵液收集，后用于HPLC(高效液相色谱仪)中检测葡萄糖，乙醇和乳酸的含量。检测方法同上。
②ZML-pdc-ldh发酵过程中工艺放大。
将所得到的ZML-pdc-ldh在发酵罐中进行工艺放大。菌株的活化，方法如上。待发酵种子液培养至对数中后期，进一步转接到装600mL RMG5和RMG12的培养基的1-L发酵罐中，OD600nm处控制初始OD为0.1。30℃，pH控制为5.8±0.1，100rpm培养条件下进行测试。在发酵过程中将不同时间点取得的发酵液收集，后用于HPLC(高效液相色谱仪)中检测葡萄糖，乙醇和乳酸的含量。
6、基因工程菌株ZML-pdc-ldh在不同碳源下乳酸发酵测试
①在非粮生物质如糖蜜下的乳酸发酵
ZML-pdc-ldh的活化过程如上，待发酵种子液培养至对数中后期。进一步转接到装有600mL20％糖蜜培养基的1-L发酵罐中发酵。在OD600nm处控制初始OD为0.5。通过流加4M氢氧化钾控制pH保持初始pH值5.8±0.1。发酵罐设置为30℃，100rpm。在发酵过程中，将不同时间点取得的发酵液收集，后用于HPLC中检测蔗糖，葡萄糖，果糖，乙醇和乳酸的含量。检测方法同上。
②废弃物如玉米芯残渣水解液下的乳酸发酵
ZML-pdc-ldh的活化过程如上，待发酵种子液培养至对数中后期。进一步转接到装有添加10g/L CaCO3的600mL玉米芯残渣水解液培养基的1-L发酵罐中发酵。在OD600nm处控制初始OD为0.5。发酵罐设置为30℃，100rpm。在发酵过程中，将不同时间点取得的发酵液收集，后用于HPLC中检测葡萄糖，乙醇和乳酸的含量。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株，所述基因工程菌株是将ZM4菌株基因组上ZMO0038位点、ZMO1650位点及ZMO1360位点进行基因编辑得到的菌株；
其中，所述ZM4菌株为Z mobilis subsp. mobilis ZM4 ATCC31821，所述ZMO0038位点和所述ZMO1360位点均经基因编辑替换为LmldhA基因，所述ZMO1650位点经基因编辑替换为pdc基因；所述ZM4菌株的ZMO0038和ZMO1360位点上的LmldhA基因均具有一个PadhB启动子，所述ZM4菌株的ZMO1650位点上的pdc基因具有一个Ptet启动子；所述LmldhA基因的基因编号为AB233384.1，所述pdc基因Gene ID: 58027105。
2.一种利用非粮生物质联产D-乳酸和乙醇的方法，所述非粮生物质选自糖蜜或玉米芯残渣水解液，所述方法包括：
将运动发酵单胞菌的基因工程菌株接种至含有非粮生物质的培养基中，进行发酵，收获发酵液，所述发酵液中含有D-乳酸和乙醇；
其中，所述基因工程菌株是将ZM4菌株基因组上ZMO0038位点、ZMO1650位点及ZMO1360位点进行基因编辑得到的菌株；所述ZM4菌株为Z. mobilis subsp. mobilis ZM4ATCC31821，所述ZMO0038位点和所述ZMO1360位点均经基因编辑替换为LmldhA基因，所述ZMO1650位点经基因编辑替换为pdc基因；所述ZM4菌株的ZMO0038和ZMO1360位点上的LmldhA基因均具有一个PadhB启动子，该ZM4的ZMO1650位点上的pdc基因具有一个Ptet启动子；所述LmldhA基因的基因编号为AB233384.1，所述pdc基因Gene ID: 58027105。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，基因工程菌的接种至所述培养基中后，初始OD600nm值为0.3~0.5。
4.一种运动发酵单胞菌的基因工程菌株的构建方法，其中，所述基因工程菌株是将ZM4菌株基因组上ZMO0038位点、ZMO1650位点及ZMO1360位点进行基因编辑得到的菌株；所述ZM4菌株为Z. mobilis subsp. mobilis ZM4 ATCC31821，所述ZMO0038位点和所述ZMO1360位点均经基因编辑替换为LmldhA基因，所述ZMO1650位点经基因编辑替换为pdc基因；所述ZM4菌株的ZMO0038和ZMO1360位点上的LmldhA基因均具有一个PadhB启动子，所述ZM4菌株的ZMO1650位点上的pdc基因具有一个Ptet启动子；所述LmldhA基因的基因编号为AB233384.1，所述pdc基因Gene ID: 58027105；
所述构建方法包括：
构建分别靶向ZMO0038、ZMO1650及ZMO1360的第一编辑质粒、第二编辑质粒和第三编辑质粒；
将所述第一编辑质粒转入ZM4菌株中，得到ZMO0038位点被编辑的菌株；
将所述第二编辑质粒转入所述ZMO0038位点被编辑的菌株中，得到ZMO0038、ZMO1650位点被编辑的菌株；
将所述第三编辑质粒转入所述ZMO0038、ZMO1650位点被编辑的菌株，得到ZMO0038、ZMO1650及ZMO1360位点均被编辑的菌株。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其中，所述第一编辑质粒携带有第一CRISPR表达单元，所述第一CRISPR表达单元包含如SEQ ID NO.3所示的先导区、如SEQ ID NO.4所示的重复区、位于所述先导区上游的第一供体区以及位于所述重复区之间的第一向导区，所述第一向导区靶向结合所述ZMO0038基因，所述第一向导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述第一供体区的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示；
所述第二编辑质粒携带有第二CRISPR表达单元，所述第二CRISPR表达单元包含如SEQID NO.3所示的先导区、如SEQ ID NO.4所述的重复区、位于所述先导区上游的第二供体区以及位于所述重复区之间的第二向导区，所述第二向导区靶向结合所述ZMO1650基因，所述第二向导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述第二供体区的核苷酸序列如SEQ IDNO.37所示；
所述第三编辑质粒携带有第三CRISPR表达单元，所述第三CRISPR表达单元包含如SEQID NO.3所示的先导区、如SEQ ID NO.4所述的重复区、位于所述先导区上游的第三供体区以及位于所述重复区之间的第三向导区，所述第三向导区靶向结合所述ZMO1360基因，所述第三向导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述第三供体区的核苷酸序列如SEQ IDNO.38所示。
6.根据权利要求5所述的构建方法，所述第一编辑质粒、所述第二编辑质粒和所述第三编辑质粒还分别携带有标记基因，所述标记基因选自氨苄青霉素基因、四环素基因、氯霉素基因、链霉素基因、潮霉素基因、壮观霉素基因、卡那霉素基因、杀稻瘟菌素基因、遗传霉素基因、潮霉素基因、霉酚酸基因、嘌呤霉素基因、博莱霉素基因、新霉素基因、氯霉素乙酰转移酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因或绿色荧光蛋白基因中的一种。
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CN101875912A (zh) * 2009-04-30 2010-11-03 中国农业科学院生物技术研究所 一种可降低发酵副产物的乙醇发酵工程菌
CN105907732A (zh) * 2016-01-27 2016-08-31 上海交通大学 一种d-乳酸脱氢酶、含有该酶的工程菌株及其构建和应用
CN110358767B (zh) * 2019-07-30 2021-06-08 湖北大学 一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用
CN115058374B (zh) * 2022-05-24 2023-08-01 天津大学前沿技术研究院有限公司 一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用

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