CN118006476A - 一株产CCD酶的酿酒酵母及其在合成β-紫罗兰酮上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程和生物工程领域，具体涉及一株产CCD酶的酿酒酵母及其在合成β‑紫罗兰酮上的应用。在半乳糖培养基中，本发明的产CCD酶的酿酒酵母菌株可以生产CCD酶；研究发现CCD酶主要分泌至胞外，培养时间为24h时上清液酶活力高；不同环境因素对酶促反应有影响，当pH7.0、温度40℃时，β‑紫罗兰酮产量达到最大值；本菌株可直接酶解植物基类胡萝卜素，合成β‑紫罗兰酮。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和生物工程领域，具体涉及一株产CCD酶的酿酒酵母及其在合成β-紫罗兰酮上的应用。
背景技术
类胡萝卜素裂解双加氧酶（Carotenoid cleavage dioxygenase，CCD）催化类胡萝卜素裂解生成降异戊二烯化合物，在葡萄中发现并鉴定了3个参与类胡萝卜素裂解的基因VvCCD1、VvCCD4a和VvCCD4b，能将类胡萝卜素裂解生成C9、C10、C11、C13降异戊二烯类物质。葡萄中VvCCD1主要在叶片和果实中表达，催化β-胡萝卜素在9，10（9’，10’）位置双键断裂生成β-紫罗兰酮。
β-紫罗兰酮作为一类环化异戊二烯，广泛用于化工合成视黄酸、视黄醇、β-胡萝卜素和维生素A等化合物。同时，β-紫罗兰酮是一种医药原料，具有抗癌、抗菌抗炎、抗微生物和降血脂等有益人体健康的功效，有研究表明β-紫罗兰酮可能通过激活Caspase-3信号通路，抑制乳腺癌细胞增殖与生长，促进其凋亡，发挥抑癌作用。通过酿酒酵母产CCD酶催化植物基类胡萝卜素合成β-紫罗兰酮具有较高的安全性。
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是公认安全（GRAS）的模式微生物，遗传背景清楚，生长周期短，生物安全性好。此外，与酿酒酵母相关的基因操作手段和载体工具也比较丰富，常被作为一种理想的宿主。
发明内容
目前主要用于β-紫罗兰酮合成的化学合成和植物提取法都存在一定的弊端，针对现阶段β-紫罗兰酮的合成中存在的问题，本发明提供了一株产CCD酶的酿酒酵母菌株，所构建的酿酒酵母QGXH1可以代谢生产CCD酶从而催化β-胡萝卜素合成β-紫罗兰酮；同时还提供了上述菌株在酶解β-胡萝卜素合成β-紫罗兰酮上的应用。
本发明的技术方案如下：
一株产CCD酶的酿酒酵母菌株，产CCD酶的酿酒酵母菌株QGXH1，于2024年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 29805；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。
本发明的另一个目的保护，上述产CCD酶的酿酒酵母菌株在生产类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD上的应用。
本发明的另一个目的保护，上述产CCD酶的酿酒酵母菌株在合成β-紫罗兰酮上的应用。
本发明的另一个目的保护，上述产CCD酶的酿酒酵母菌株的构建方法，选用强启动子GAL1表达外源葡萄VvCCD1基因并整合至基因组LPP1位点，获得了产CCD酶酿酒酵母工程菌QGXH1。
本发明的另一个目的保护，上述产CCD酶的酿酒酵母菌株的鉴定方法，方法包括基因序列，所述的基因序列是以LPP1-UP-F和LPP1-DOWN-R为引物，以所述产CCD酶的酿酒酵母菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列UP-Marker-GCC-DOWN；
LPP1-UP-F的核苷酸序列，如SEQ ID No.5所示，具体为5’- GTCCATATTCCTCGATCCAC -3’；
LPP1-DOWN-R的核苷酸序列，如SEQ ID No.8所示，具体为5’- CCTCAAGACGACAGATGACT -3’；
UP-Marker-GCC-DOWN的核苷酸序列，如SEQ ID No.13所示。
本发明的有益效果：
本发明选用强启动子GAL1表达外源葡萄VvCCD1基因，获得了产CCD酶酿酒酵母工程菌QGXH1，保藏号为CGMCC No. 29805。
在半乳糖培养基（YPG）中，工程菌QGXH1可以生产CCD酶；研究发现CCD酶主要分泌至胞外，培养时间为24h时上清液酶活力高；不同环境因素对酶促反应有影响，当pH7.0、温度40℃时，β-紫罗兰酮产量达到最大值；本菌株可直接酶解植物基类胡萝卜素，合成β-紫罗兰酮；本菌株可用作出发菌株，构建引入类胡萝卜素合成途径，从而直接以葡萄糖为底物，高产β-紫罗兰酮。
菌株保藏信息：
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏编号：CGMCC No. 29805；
保藏日期：2024年1月29日；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
分类学命名：酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae。
附图说明
图1 VvCCD1基因扩增片段凝胶电泳检测图；M:DL 2000 DNA marker
图2 重组线性化片段UP-Marker-GCC-DOWN凝胶电泳检测图；M:DL 10000 DNAmarker
图3 菌落PCR阳性转化验证图；M:DL 10000 DNA marker
图4 产酶菌株QGXH1菌落形态示意图；
图5 产酶菌株QGXH1不同阶段酶活力示意图；
图6 不同pH下β-紫罗兰酮产量示意图；
图7 不同温度下β-紫罗兰酮产量示意图；
图8 产酶菌株QGXH1酶解β-胡萝卜素产物色谱图；
图9 产CCD酶酿酒酵母工程菌构建路线图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
下述实施例中涉及的培养基和实验材料概述：
1.培养基
YPD培养基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，固体培养基添加20g/L琼脂粉，115℃灭菌15min。用作筛选培养基时，可以加入终浓度为200 μg/mL的遗传霉素（G418）。
YPG培养基：20g/L半乳糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉，115℃灭菌15min。
LB培养基：10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠、5g/L酵母浸粉，固体培养基添加20g/L琼脂粉，115℃灭菌15min。用作筛选培养基时，可以加入终浓度为100 μg/mL的氨苄抗生素。
2.酶与试剂
PCR扩增所用DNA聚合酶为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（P515-01），其它所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径获得。
实施例1：产CCD酶酿酒酵母基因工程菌的构建
1.葡萄总RNA的提取
将新鲜赤霞珠葡萄叶片于液氮中研磨，提取总RNA，置于-80 ℃冰箱保存备用。
2.反转录cDNA第一条链的合成
以提取的总RNA为模板，使用试剂盒反转录合成cDNA。
3.目的基因的获取与连接载体
以cDNA为模板，利用引物VvCCD1-F (如SEQ ID No.1所示，5’-ATGCCGAAGAAGATGGCGG-3’) 与VvCCD1-R (如SEQ ID No.2所示，5’-TCAAAGTTTTGCTTGTTCTTTGAGT-3’)扩增出VvCCD1片段，如图1所示，长度为1641bp，纯化后的片段与载体pMD18-T连接，反应体系为，VvCCD1片段 3 μL、pMD18-T载体1 μL、Solution I 6 μL，16℃连接30 min，获得重组质粒pMD18-T-VvCCD1，连接产物转化至大肠杆菌后提取质粒。
4. pYES2-VvCCD1真核表达载体的构建
以pMD18-T-VvCCD1为模板，利用引物pVvCCD1-F，（如SEQ ID No.3所示，5’- GGGA ATATTAAGCTTGGTACCATGCCGAAGAAGATGGCGG-3’，下划线部分为表达载体pYES2同源片段）与pVvCCD1-R（如SEQ ID No.4所示，5’- AGTGGATCCGAGCTCGGTACCTCAAAGTTTTGCTTGTTCTTTGAGT-3’， 下划线部分为表达载体pYES2同源片段）扩增出带有表达载体同源臂的VvCCD1基因，Knpl酶切pYES2，按照无缝克隆预混液说明书将带有同源臂的VvCCD1基因与pYES2载体过夜连接，随后转化大肠杆菌、菌落PCR验证，提取质粒。获得的质粒命名为pYES2-VvCCD1。
5.酿酒酵母基因组的提取
将酿酒酵母BY4741（北京酷来搏科技有限公司购买的CC301 BY4741感受态细胞）单菌落于YPD培养基过夜培养，离心收集菌体，提取基因组DNA。
6.重组片段的扩增
（1）LPP1上游同源臂和下游同源臂的扩增：以酿酒酵母BY4741基因组DNA为模板，利用引物LPP1-UP-F（如SEQ ID No.5所示，5’- GTCCATATTCCTCGATCCAC -3’）与LPP1-UP-R（如SEQ ID No.6所示，5’- CCAGGGATATCTCCGAATAGA -3’）、LPP1-DOWN-F（如SEQ ID No.7所示，5’- CGATGTTGTCTCTGGAGCTG -3’）与LPP1-DOWN-R（如SEQ ID No.8所示，5’-CCTCAAGACGACAGATGACT -3’）分别进行PCR扩增获得500bp左右的上下游同源臂，命名为片段1与片段4，PCR扩增条件为，95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，72℃彻底延伸5min。
（2）G418筛选标记片段loxp-KanMX-loxp的扩增：以pUG6质粒为模板，利用引物loxp-F（如SEQ ID No.9所示，5’- TATTCCTCTATTCGGAGATATCCCTGGAGGTCGACAACCCTTAATATA-3’）（下划线部分为LPP1-UP下游同源的序列）与loxp-R（如SEQ ID No.10所示，5’- GGCTT CTAATCCGTACTAGTGGATCATCTAGTGGATCTGATATCACCT -3’）（下划线部分为VvCCD1表达盒GCC的上游同源序列）进行PCR扩增，获得1600bp左右带有loxp位点与G418抗性的loxp-KanMX-loxp片段，命名为片段2，PCR条件为95℃预变性3min，95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环，72℃彻底延伸5min。
（3）VvCCD1表达盒GCC的扩增：以质粒pYES2-VvCCD1为模板，利用引物CCD-F（如SEQID No.11所示，5’- ATGATCCACTAGTACGGATTAG -3’）与CCD-R（如SEQ ID No.12所示，5’- G CTAGAACAGCTCCAGAGACAACATCGGCAAATTAAAGCCTTCGAGC -3’）（下划线部分为LPP1-DOWN的上游同源序列）扩增出VvCCD1表达盒GCC，命名为片段3，PCR扩增条件为95℃预变性3min，95℃变性15s，66℃退火15s，72℃延伸2min，35个循环，72℃彻底延伸5min。
（4）重组线性化片段的连接
利用重叠延伸PCR将片段1与片段2连接得到片段12，片段3与片段4连接得到片段34，再将片段12与片段34连接得到重组线性化片段，如图2所示，片段长度为5185bp，命名为UP-Marker-GCC-DOWN（如SEQ ID No.13所示），该片段含有整合位点LPP1上下游同源臂、G418筛选标记、VvCCD1表达盒。
7.重组线性化片段转化酿酒酵母
利用LiAc/ss DNA/PEG法将线性化片段UP-Marker-VvCCD1-DOWN转化至酿酒酵母BY4741感受态细胞。在含有200 μg/mL G418的YPD平板上进行筛选，初步获得阳性转化子。
8.转化子的PCR验证
从筛选平板上挑取单菌落，在含有200μg/mL G418的YPD液体培养基中28℃，200rpm过夜培养，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用引物LPP1-UP-F与LPP1-DOWN-R进行PCR验证，PCR条件为95℃预变性3min，95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸6min，35个循环，72℃彻底延伸5min。
如图3所示，可看到5185bp左右的条带，与线性化片段UP-Marker-GCC-DOWN的长度一致，表明片段已成功整合至目标位点，重组菌株为QGXH1。
菌悬液稀释涂布至固体培养基，48h后长出单菌落，如图4所示，菌落形态呈圆形且边缘光滑，颜色为乳白色。
实施例2：产CCD酶菌株QGXH1不同生长阶段与部位酶活力测定
将菌株QGXH1接种于YPG培养基，分别取不同培养阶段的菌悬液进行离心（4℃，12000 rpm，3 min，下同），得到上清液及菌体，上清液直接进行酶活力测定，反应时间20min；用0.85% NaCl溶液洗涤菌体细胞，悬浮于3 mL洗涤液中进行酶活力测定；按照同样方法收集、洗涤菌体，洗涤后悬浮于10 mL 1×PBS缓冲液中，冰浴200W破碎10 min，得到细胞破碎液，将破碎液离心，得到破碎上清液及细胞残体，破碎上清液直接进行酶活力测定，细胞残体用质量分数0.85%的NaCl溶液洗涤后悬浮于3 mL 1×PBS缓冲液中测定酶活。
酶活力＝（C0－Ct）×（2.8＋0.2）/2.8×t
式中，C0为初始β-胡萝卜素的浓度（μmol·L-1），Ct为t min后β-胡萝卜素的浓度（μmol·L-1），2.8为粗酶液的体积（mL），0.2为加入β-胡萝卜素储备液的体积（mL）。
如图5所示，菌液上清液酶活力最高，从24 h开始，酶活力随培养时间的延长呈下降趋势，培养24 h时酶活力最高，此时对应对数生长期，所以本研究选取此时的粗酶液（菌液上清）进行后续实验。
实施例3：CCD酶学性质研究
HS-SPME-GC-MS条件：
前处理条件：萃取纤维230 ℃老化5 min，样品50 ℃孵育15min，将萃取纤维插入样品吸附30 min，萃取结束后，230 ℃进样口解析5 min。
GC条件：InertCap Pure-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气为He；流速1.0 mL·min-1；不分流；程序升温：初温为50 ℃，保持2 min；以4℃·min-1升至170 ℃，保持5 min；再以8 ℃·min-1升到280 ℃，保持10 min。
MS条件：离子源EI，离子源温度230 ℃；电离能70 eV；扫描质量范围m/z 30～550；质谱扫描方式：全扫描（SCAN）；溶剂延迟4 min。
从pH、温度两个方面进行酶学性质分析，以β-紫罗兰酮的生成量为评价指标，结果如图6、7所示：
a. pH对β-紫罗兰酮产量的影响：将反应体系中pH值分别设为3、4、5、6、7、8、9，发现当pH为7.0时，β-紫罗兰酮产量达到最大值。
b. 温度对β-紫罗兰酮产量的影响：将反应体系中温度分别设为20、30、40、50、60、70、80℃，结果表明，在20~40℃范围内β-紫罗兰酮的产量随温度的升高而升高，随后又下降，40℃时，产量达到最大值。
实施例4：产CCD酶菌株QGXH1体外裂解β-胡萝卜素
将450 μl β-胡萝卜素储备液和7.5 ml粗酶液置于顶空瓶中，在40 ℃、pH 7.0条件下避光反应30 min，期间摇晃1-2次，GC-MS检测裂解产物，图8为裂解产物色谱图。在此条件下，β-紫罗兰酮产量达到最大值1.6mg/kg。β-紫罗兰酮的产量也与β-胡萝卜素储备液的纯度和用量有关。该实施说明引入VvCCD1基因的重组菌株QGXH1可有效合成CCD酶，该酶可有效降解β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮。
QGXH1整体构建路线如图9所示，包括提取葡萄RNA、扩增VvCCD1基因片段、构建表达载体获得重组线性化片段，利用LiAc/ss DNA/PEG法转化至酿酒酵母，实现基因组定点整合，结合G418抗生素阳性菌筛选与凝胶电泳验证得到重组菌株QGXH1，并扩大培养，将该菌株应用到β-紫罗兰酮的生产。
Claims (5)
1. 一株产CCD酶的酿酒酵母菌株，其特征在于，产CCD酶的酿酒酵母菌株QGXH1，于2024年1月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.29805；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。
2.权利要求1所述的产CCD酶的酿酒酵母菌株在生产类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD上的应用。
3.权利要求1所述的产CCD酶的酿酒酵母菌株在合成β-紫罗兰酮上的应用。
4.一种权利要求1所述的产CCD酶的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，选用强启动子GAL1表达外源葡萄VvCCD1基因并整合至基因组LPP1位点，获得了产CCD酶酿酒酵母工程菌QGXH1。
5.一种权利要求1所述的产CCD酶的酿酒酵母菌株的鉴定方法，其特征在于，方法包括基因序列，所述的基因序列是以LPP1-UP-F和LPP1-DOWN-R为引物，以所述产CCD酶的酿酒酵母菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列UP-Marker-GCC-DOWN；
LPP1-UP-F的核苷酸序列，如SEQ ID No.5所示；
LPP1-DOWN-R的核苷酸序列，如SEQ ID No.8所示；
UP-Marker-GCC-DOWN的核苷酸序列，如SEQ ID No.13所示。
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