CN110283806B

CN110283806B - 一种紫色红曲霉酯合成酶lip05-50、编码基因及其应用

Info

Publication number: CN110283806B
Application number: CN201910635277.4A
Authority: CN
Inventors: 徐友强; 孙宝国; 李秀婷; 王晓程
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2019-07-15
Filing date: 2019-07-15
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2039-07-15
Also published as: CN110283806A

Abstract

本发明提供了一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05‑50、编码基因及其应用，属于基因工程技术领域。一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05‑50的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。紫色红曲霉酯合成酶LIP05‑50的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所提供的酯合成酶LIP05‑50经蛋白质工程改造，与原始蛋白相比，去掉了N‑端的两个α‑螺旋。经大肠杆菌重组表达，得到的粗酶液在水相体系高效催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的能力进一步提高。因此，本发明提供的酯合成酶LIP05‑50，可用于在白酒酿造的水相体系催化合成重要风味酯己酸乙酯和辛酸乙酯。

Description

一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50、编码基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50、编码基因及其应用。

背景技术

浓香型白酒的主体物质是水和乙醇，以及少量风味物质如酯、酸、酮类化合物等，虽然其含量仅占酒体总量的1％～3％，却是白酒的灵魂所在，决定产品的感官和风味。其中，己酸乙酯和辛酸乙酯是决定浓香型白酒品质的重要酯类物质。实际生产中，将酒体中己酸乙酯等重要酯类含量的高低作为产品品质的重要衡量参数已成为业内共识。然而，由于酿造过程产酯生香慢，即己酸乙酯、辛酸乙酯和其他酯类的合成效率低，导致酿造生香周期长且优质酒出酒率低，而己酸乙酯等重要酯类含量偏低历来是浓香型白酒品质差和优质酒出酒率低的关键原因之一。虽然通过勾调过程外，加化学香精己酸乙酯等可以提高酯含量，但此类产品感官上往往呈现“浮香”，刺激性强，香味不协调且缺乏优质酒的“窖香”和“糟香”，失去“窖香浓郁、香味协调”的特点，严重影响产品品质。探究己酸乙酯等重要酯类的合成机制，对于从根本上保障浓香型白酒的产品品质和生产的稳定性，具有重要作用。

研究表明，微生物所产酯合成酶对浓香型白酒己酸乙酯和辛酸乙酯的合成具有显著贡献。中国传统浓香型白酒酿造过程具有复杂而独特的微生物区系，且不同种属的多种微生物均可以产生酯合成酶。然而，仅有部分菌种具有己酸乙酯的催化合成能力，包括细菌属的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)、血红鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassanguinis)，以及霉菌属的根霉(Rhizopus sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、毛霉(Mucorsp.)、多枝横梗霉(Lichtheimia ramosa)和红曲霉(Monascus sp.)。其中，红曲霉具有高效的己酸乙酯等关键风味酯的催化合成能力，然而到目前为止，尚无报道红曲霉来源高效催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的酯合成酶。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50、编码基因及其应用，所述酯合成酶具有高效催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的特性。

本发明提供了一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50，所述紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供了一种所述紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了用于扩增所述编码基因的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQID No.4所示。

本发明提供了一种含有所述编码基因的重组载体。

优选的，所述重组载体的基础质粒为pET-28a(+)。

本发明提供了一种重组细胞，包含所述编码基因或所述重组载体。

本发明提供了所述紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50、所述编码基因、所述引物对、所述重组载体或所述重组细胞在合成己酸乙酯和辛酸乙酯中的应用。

优选的，所述合成己酸乙酯和辛酸乙酯的方法包括以下步骤：

1)以所述编码基因为模板，用所述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；

2)将所述扩增产物插入质粒表达载体中，得到重组载体；

3)将所述重组载体转入原核表达系统中，得到重组细胞；

4)将所述重组细胞进行酯合成酶LIP05-50的诱导表达，收集菌体，破碎，收集上清液，得到含有紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的粗酶液；

5)将所述含有紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的粗酶液与底物混合，催化反应，萃取，得到己酸乙酯和辛酸乙酯。

优选的，所述合成己酸乙酯和辛酸乙酯的反应体系为每10mL反应体系中包含1mL所述粗酶液和9mL原料液；所述原料液以pH值4.0柠檬酸缓冲液为基础缓冲液，还包含0.5～1.5mol/L乙醇、8～12mmol/L己酸和8～12mmol/L辛酸。

优选的，所述合成己酸乙酯和辛酸乙酯的反应条件为在29～31℃、转速150～170rpm的条件下振荡培养11～13h。

本发明提供了一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50，本发明所提供的酯合成酶来源于紫色红曲霉，是首次报道具有在水相体系同时催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯特性的脂肪酶。实验证实：经大肠杆菌工程菌诱导表达的酯合成酶LIP05-50粗酶液，酶活力为21.32U/mL，在含有乙醇、己酸和辛酸的水相体系，具有同时催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的能力，产量分别为184.4mg/L和321.0mg/L/L。本发明的酯合成酶LIP05-50，可用于在白酒酿造的水相体系催化合成重要风味酯己酸乙酯和辛酸乙酯。

附图说明

图1为酯合成酶LIP05-50编码基因PCR扩增结果；

图2为酯合成酶LIP05-50编码基因融合表达结果；

图3为酯合成酶LIP05-50催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯气相色谱原始图谱；

图4为酯合成酶LIP05-50催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯定量计算结果；

图5为对比例1中酯合成酶LIP05编码基因PCR扩增结果；

图6为对比例1中酯合成酶LIP05编码基因融合表达结果；1，空白对照；2，与pCold-TF原核核糖体相关的分子伴侣蛋白触发因子(40kDa)融合表达的LIP05(22kDa)融合蛋白，大小约为62kDa；

图7为对比例1中酯合成酶LIP05催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯气相色谱原始图谱；

图8为对比例1中酯合成酶LIP05催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯定量计算结果。

具体实施方式

本发明提供了一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50，所述紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明提供的酯合成酶LIP05-50来源于紫色红曲霉，经蛋白质工程改造，与原始蛋白相比，去掉了N-端的两个α-螺旋，在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的能力有进一步提高，为首次报道的具有在水相体系同时催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯特性的脂肪酶。所述酯合成酶LIP05-50在原核表达载体中经过重组表达，提取粗酶液检测，酶活力为21.32U/mL，在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的产量分别为184.4mg/L和321.0mg/L/L。

本发明提供了一种所述紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。所述编码基因以紫色红曲霉的cDNA为模板，利用SEQ IDNo.3～4所示引物对进行PCR扩增得到，长度为561bp。

本发明提供了用于扩增所述编码基因的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示(5'-gcctggtgccaagaggaagtatgcagacaacatacaacgag-3')；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示(5'-tgttagcagccggatctcagtcacgatgaagcagcagac-3')。所述引物对对酯合成酶LIP05-50的编码基因具有较强的扩增特异性，同时该引物对的5’端包含用于后续连接入载体的位点。

本发明提供了一种含有所述编码基因的重组载体。所述重组载体的基础质粒优选为pET-28a(+)。所述重组载体的构建方法，优选采用Clon

II进行质粒的构建。

本发明提供了一种重组细胞，包含所述编码基因或所述重组载体。本发明对所述重组细胞的基础表达载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的原核和真核表达载体均可。为了说明重组表达的情况，本发明实施例中，以原核表达载体大肠杆菌Rosetta(DE3)为例说明重组表达紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50。

在本发明中，所述合成己酸乙酯和辛酸乙酯的方法，优选包括以下步骤：

2)将所述扩增产物插入质粒表达载体中，得到重组载体；

3)将所述重组载体转入原核表达系统中，得到重组细胞；

在本发明中，所述合成己酸乙酯和辛酸乙酯的反应体系优选为每10mL反应体系中包含1mL所述粗酶液和9mL原料液；所述原料液以pH值4.0柠檬酸缓冲液为基础缓冲液，还包含0.5～1.5mol/L乙醇、8～12mmol/L己酸和8～12mmol/L辛酸。

在本发明中，所述合成己酸乙酯和辛酸乙酯的反应条件优选为在29～31℃、转速150～170rpm的条件下振荡培养11～13h。

在本发明中，所述萃取用溶剂优选为正己烷。

在本发明中，催化反应结束后，通过气相色谱定量检测己酸乙酯和辛酸乙酯的合成量。经检测己酸乙酯和辛酸乙酯的产量分别为184.4mg/L和321.0mg/L/L。

下面结合实施例对本发明提供的一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50、编码基因及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

酯合成酶LIP05-50编码基因的克隆

1紫色红曲霉培养

在无菌操作条件下，将紫色红曲霉接种含有100mL发酵培养基的300mL三角瓶，摇床30±1℃，150±10r/min培养4～8d。所述发酵培养基，其组成为葡萄糖70g/L、黄豆饼粉10g/L、MgSO₄ 0.20g/L、NaNO₃ 2.0g/L、NaH₂PO₄ 1.0g/L，调节pH为4.5，115℃灭菌20min。

2紫色红曲霉总RNA的提取

对上述培养6天的紫色红曲霉取样，采用BIOMIGA真菌RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：

(1)称取100mg真菌培养物到1.5mL或者2.0mL离心管中，液氮冷冻，用研磨小杵将真菌研磨成粉末(如果有条件，将组织置于研钵中，液氮研磨成粉末，迅速转移100mg研磨粉末到离心管中，效果更好)。样品的破碎程度将影响组织细胞裂解效果和RNA得率。

(2)加入10倍体积(1mL)Buffer RLY和1倍体积(100μl)Plantaid(使用前请摇匀)到离心管中，瞬时涡旋，充分打散研磨物。

确保β-巯基乙醇已加入到Buffer RLY中。

(3)转移上述裂解液到DNA清除柱中，13,000rpm离心2min，弃掉DNA清除柱，保留下面收集管中的裂解液。

(4)向裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇(如500μl上清液应加入250μl无水乙醇)，颠倒混合均匀。

(5)转移以上混合液至一个带有收集管的吸附柱中(包括可能生成的任何沉淀)，室温下，13,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新转移至收集管中。

(6)加入500μl Buffer RB，室温下，13,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。

(7)加入500μl RNA Wash Buffer，室温下，13,000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。

确保无水乙醇已加入到RNA Wash Buffer中。

(8)再次加入500μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，室温下，13,000rpm离心30s，弃废液和收集管，将吸附柱转移至一个新的收集管中。

(9)室温下，13,000rpm离心2min(可选操作，开盖离心将更有助于乙醇的去除)，去除残留的乙醇。

注意：乙醇的残留将会降低洗脱效果和影响下游实验，开盖离心或者适当延长离心时间，将有助于乙醇的去除。

(10)将吸附柱放入一个RNase-Free的1.5mL收集管中，加入50～100μl的DEPC-treated ddH₂O，室温放置2min，13,000rpm离心1分钟洗脱RNA。提取到的RNA可直接用于后续实验或者-20℃存放。

3cDNA模板的制备

采用TIANGEN反转录试剂盒FastQuant RT Kit(with gDNase)制备cDNA模板，具体步骤如下：50ng～2μg总RNA可建立20μl反应体系。

(1)将提取的RNA样品在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×FastRT Buffer、RNase-Free ddH₂O在室温(15～25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。

以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。

(2)按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。

表1 gDNA去除反应体系

组成成分	使用量(μl)
		5*gDNA Buffer	2
Total RNA	-
		RNase-Free ddH<sub>2</sub>O	补足到10

(3)按照表2的反转录反应体系配制混合液。

表2反转录反应体系

组成成分	使用量(μl)
		10*Fast RT Buffer	2
RT Enzyme Mix	1
		FQ-RT Primer Mix	2
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O	补足到10

(4)将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。

(5)42℃，孵育15min。

(6)95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。

4PCR扩增酯合成酶LIP05-50编码基因

通过PCR扩增紫色红曲霉来源的酯合成酶LIP05-50的编码基因。引物设计如下：

正向引物：5'-gcctggtgccaagaggaagtatgcagacaacatacaacgag-3'(SEQ ID No.3)

反向引物：5'-tgttagcagccggatctcagtcacgatgaagcagcagac-3'(SEQ ID No.4)

PCR反应体系见下表3。

表3 PCR反应体系扩增LIP05-50的编码基因

试剂组成	使用量(μl)
		ddH<sub>2</sub>O	21.0
dNTP Mixture(2.5mM each)	3.0
		10×Ex Taq Buffer	3.0
正向引物(10μM)	0.6
		反向引物(10μM)	0.6
模板cDNA	0.8
		Ex Taq(5U/μl)	1.0
总计	30.0

PCR扩增循环：

基因扩增结果通过凝胶电泳检测，结果如图1所示。

实施例2

构建表达酯合成酶LIP05-50的大肠杆菌工程菌株

1pET-28a(+)载体的线性化

设计引物通过PCR进行pET-28a(+)载体的线性化。引物设计如下：

正向引物：5'-ctgagatccggctgctaa-3'(SEQ ID No.5)

反向引物：5'-acttcctcttggcaccaggccgctgct-3'(SEQ ID No.6)

PCR反应体系见表4。

表4线性化载体pET-28a(+)的PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		ddH<sub>2</sub>O	21.0
dNTP Mixture(2.5mM each)	3.0
		10×Ex Taq Buffer	3.0
正向引物(10μM)	0.6
		反向引物(10μM)	0.6
pET-28a(+)载体	0.8
		Q5 DNA Polymerase(5U/μl)	1.0
总计	30.0

PCR扩增循环

扩增DNA条带通过DNA纯化后，用于质粒的构建。

2质粒构建

通过Clon

II进行质粒的构建。引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15～20bp)。基于此原则设计基因扩增的引物进行重组反应，于冰水浴中配制如下反应体系。反应体系组成见表5。

表5质粒连接反应体系

组成成分	使用量
		5*CE II Buffer	4μl
线性化克隆载体	50～200ng
		基因扩增产物	20～200ng
Exnase II	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	补足到10μl

体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分。置于37±1℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

3质粒的转化

取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45～90s，冰水浴孵育2min。加入600μl的LB培养基，37±1℃摇菌60min充分复苏。取100μl菌液均匀涂布在含有适当氨苄抗生素的LB培养基平板上。将平板倒置，于37±1℃过夜培养。所述LB培养基配方：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，固体添加2％的琼脂粉，调节pH为7.0，121℃灭菌20min。

实施例3

酯合成酶LIP05-50粗酶液水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯

1酯合成酶LIP05-50的诱导表达

挑取经验证正确的转化子，转接含有适当氨苄抗生素的LB液体试管，37±1℃过夜培养，然后以1％(v/v)的接种量接种含有100mL LB培养基的300mL三角瓶，摇床37±1℃、200rpm培养3h，然后加入终浓度0.5mM的诱导剂IPTG，20±1℃、200±10rpm培养20h。

2酯合成酶LIP05-50粗酶液的制备

大肠杆菌诱导表达后13,000rpm离心5min收集菌体，用pH值7.5的0.05M Tris-HCl缓冲液悬浮洗涤菌体2次，然后悬浮菌体。超声波细胞破碎仪破细胞，13,000rpm离心5min，上清液作为粗酶液，首先进行SDS-PAGE电泳，确定目标蛋白表达(图2)，然后进行酯化酶LIP05-50的酯合成特性检测。

3LIP05-50粗酶液的酯合成催化

水相体系催化酯的合成，LIP05-50-50酶活力定义为：30℃条件下，每分钟转化生成1μmol的己酸乙酯所需的酶量定义为1个酶活力单位。

10mL反应体系如下：

粗酶液，1mL；柠檬酸缓冲液(pH 4.0)，9mL(加乙醇至1M)；己酸和辛酸，终浓度均为10mM。30±1℃，150±10rpm水浴摇床反应12h。3mL正己烷萃取，通过气相色谱定量检测酯的合成量。

4气相色谱定量检测

色谱柱：Agilent 19091N-213I

检测条件：40℃，保持5min；以8℃/min的速度升至170℃，保持10min；以8℃/min的速度升至240℃，保持5min。进样量1μl，不分流。载气为氮气，流速为1mL/min，FID检测器。

结果证实，本发明构建的表达酯合成酶LIP05-50的大肠杆菌工程菌的粗酶液酶活力为21.32U/mL，具有在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的能力(图3)，产量分别为184.4mg/L和321.0mg/L(图4)。

对比例1

1PCR扩增酯合成酶LIP05编码基因

通过PCR扩增紫色红曲霉来源的酯合成酶LIP05的编码基因(SEQ ID No.7)。引物设计如下：

正向引物：5'-tgccacgaggtagtggtggtatgtccctccccctaacaccc-3'(SEQ ID No.8)

反向引物：5'-gattacctatctagactgcagtcacgatgaagcagcaga-3'(SEQ ID No.9)

PCR反应体系见下表6。

表6 PCR反应体系扩增LIP05的编码基因

PCR扩增循环：

基因扩增结果通过凝胶电泳检测，结果如图5所示。

2、构建表达酯合成酶LIP05的大肠杆菌工程菌株

1pCold-TF载体的线性化

设计引物通过PCR进行pCold-TF载体的线性化。引物设计如下：

正向引物：5'-ctgcagtctagataggtaatc-3'(SEQ ID No.10)

反向引物：5'-accaccactacctcgtggca-3'(SEQ ID No.11)

PCR反应体系见表7。

表7线性化载体pCold-TF的PCR反应体系

PCR扩增反应程序如下：

扩增DNA条带通过DNA纯化后，用于质粒的构建。

3质粒构建

通过Clon

II进行质粒的构建。引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15～20bp)。基于此原则设计基因扩增的引物进行重组反应，于冰水浴中配制如下反应体系。反应体系组成见表8。

表8质粒连接反应体系

4质粒的转化

5酯合成酶LIP05粗酶液水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯

(1)酯合成酶LIP05的诱导表达

(2)酯合成酶LIP05粗酶液的制备

大肠杆菌诱导表达后13,000rpm离心5min收集菌体，用pH 7.5的0.05M Tris-HCl缓冲液悬浮洗涤菌体2次，然后悬浮菌体。超声波细胞破碎仪破细胞，13,000rpm离心5min，上清液作为粗酶液，首先进行SDS-PAGE电泳，确定目标蛋白表达(图6)，然后进行酯化酶LIP05的酯合成特性检测。

(3)LIP05粗酶液的酯合成催化

水相体系催化酯的合成，LIP05-50酶活力定义为：30℃条件下，每1min转化生成1μmol的己酸乙酯所需的酶量定义为1个酶活力单位。

10mL反应体系如下：

(4)气相色谱定量检测

色谱柱：Agilent 19091N-213I

结果证实，表达酯合成酶LIP05的大肠杆菌工程菌的粗酶液酶活力为11.43U/mL，具有在水相体系催化合成己酸乙酯和辛酸乙酯的能力(图7)，产量分别为99.0mg/L和317.9mg/L(图8)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京工商大学

<120> 一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50、编码基因及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 186

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Gln Thr Thr Tyr Asn Glu Val Asp Asp Ser Lys Pro Cys Thr Glu

1 5 10 15

Tyr Thr Leu Ile Phe Ala Arg Gly Thr Thr Glu Pro Gly Asn Val Gly

20 25 30

Ile Leu Val Gly Pro Pro Leu Ile Asn Ala Leu Ile Glu Lys Val Gly

35 40 45

Ser Asp Ala Leu Thr Val Gln Gly Val Asn Asn Tyr Pro Ala Thr Ile

50 55 60

Gly Gly Tyr Thr Ala Gly Gly Asp Pro Gln Gly Ser Glu Glu Met Ala

65 70 75 80

Ser Glu Ile Glu Lys Val His Ser Thr Cys Pro Asp Thr His Leu Ile

85 90 95

Ala Ser Gly Tyr Ser Gln Gly Ser Gln Leu Val His Asn Ser Ile Ala

100 105 110

Lys Leu Pro Ala Ala Thr Ala Glu Trp Ile Ser Ser Val Leu Val Phe

115 120 125

Gly Asp Pro Asp Asp Asn Asp Pro Ile Pro Asn Val Asp Ser Ser Arg

130 135 140

Val Phe Thr Ala Cys His Asp Gly Asp Asn Ile Cys Gln Asp Gly Asp

145 150 155 160

Leu Ile Leu Pro Ala His Leu Thr Tyr Ala Glu Asn Val Arg Asp Ala

165 170 175

Ala Ala Phe Ala Val Ser Ala Ala Ser Ser

180 185

<210> 2

<211> 561

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgcagacaa catacaacga ggtcgacgac tccaagccct gcacagagta caccctcatt 60

tttgcacggg ggaccaccga acctggcaat gtcggcatcc tcgttggacc cccgctgatc 120

aacgctttga ttgagaaggt ggggagcgac gctttgactg tgcagggggt taataactat 180

cctgccacta ttggggggta tacggctggc ggagatcctc aggggagtga ggagatggca 240

tctgaaatcg aaaaagtaca ctccacctgc cccgacaccc atctcatcgc atcaggatac 300

tcgcagggtt cgcagctcgt tcataattcc atcgccaagc tgcctgccgc cacggcagag 360

tggattagca gtgttcttgt cttcggggat ccagatgaca acgacccaat tcccaacgtc 420

gattcgtcca gggtcttcac ggcttgccat gatggcgata atatctgcca ggatggggat 480

ctgatcttgc ctgcacattt gacatatgcg gagaatgtga gggatgcggc tgcgttcgcg 540

gtgtctgctg cttcatcgtg a 561

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gcctggtgcc aagaggaagt atgcagacaa catacaacga g 41

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tgttagcagc cggatctcag tcacgatgaa gcagcagac 39

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctgagatccg gctgctaa 18

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

acttcctctt ggcaccaggc cgctgct 27

<210> 7

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtccctcc ccctaacacc ccggaatcaa accccgctca atagcctaat aacagccgtc 60

cttgagcacg tccccgccat aaacggcacc atcaatgctg tcgtcggcat cctaaccgat 120

ttcgagacac tcgtcgccgg catcaccaag gcgcagacaa catacaacga ggtcgacgac 180

tccaagccct gcacagagta caccctcatt tttgcacggg ggaccaccga acctggcaat 240

gtcggcatcc tcgttggacc cccgctgatc aacgctttga ttgagaaggt ggggagcgac 300

gctttgactg tgcagggggt taataactat cctgccacta ttggggggta tacggctggc 360

ggagatcctc aggggagtga ggagatggca tctgaaatcg aaaaagtaca ctccacctgc 420

cccgacaccc atctcatcgc atcaggatac tcgcagggtt cgcagctcgt tcataattcc 480

atcgccaagc tgcctgccgc cacggcagag tggattagca gtgttcttgt cttcggggat 540

ccagatgaca acgacccaat tcccaacgtc gattcgtcca gggtcttcac ggcttgccat 600

gatggcgata atatctgcca ggatggggat ctgatcttgc ctgcacattt gacatatgcg 660

gagaatgtga gggatgcggc tgcgttcgcg gtgtctgctg cttcatcgtg a 711

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgccacgagg tagtggtggt atgtccctcc ccctaacacc c 41

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gattacctat ctagactgca gtcacgatga agcagcaga 39

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgcagtcta gataggtaat c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accaccacta cctcgtggca 20

Claims

1.一种紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50，其特征在于，所述紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.用于扩增权利要求2所述编码基因的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

4.一种含有权利要求2所述编码基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础质粒为pET-28a(+)。

6.一种重组细胞，其特征在于，包含权利要求2所述编码基因或权利要求4或5所述重组载体。

7.权利要求1所述紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50、权利要求2所述编码基因、权利要求3所述引物对、权利要求4或5所述重组载体或权利要求6所述重组细胞在合成己酸乙酯和辛酸乙酯中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述合成己酸乙酯和辛酸乙酯的方法包括以下步骤：

1)以权利要求2所述编码基因为模板，用权利要求3所述引物对进行PCR扩增，得到扩增产物；

2)将所述扩增产物插入质粒表达载体中，得到重组载体；

3)将所述重组载体转入原核表达系统中，得到重组细胞；

4)将所述重组细胞进行酯合成酶LIP05-50的诱导表达，收集菌体，破碎，收集上清液，得到含有紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的粗酶液；5)将所述含有紫色红曲霉酯合成酶LIP05-50的粗酶液与底物混合，催化反应，萃取，得到己酸乙酯和辛酸乙酯。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述合成己酸乙酯和辛酸乙酯的反应体系为每10mL反应体系中包含1mL所述粗酶液和9mL原料液；所述原料液以pH值4.0柠檬酸缓冲液为基础缓冲液，还包含0.5～1.5mol/L乙醇、8～12mmol/L己酸和8～12mmol/L辛酸。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述合成己酸乙酯和辛酸乙酯的反应条件为在29～31℃、转速150～170rpm的条件下振荡培养11～13h。