JP5951491B2 - トリプトリドの製造方法 - Google Patents
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Description
(i) 例えば、バイオマス成長条件下にて増殖するための1または数種類の栄養培地における、例えばカルスから誘導されるトリプテリジウム(Tripterygium)種の脱分化細胞のバイオマスの生産期、
(ii) オーキシンを実質的に含まない除去培地において段階(i)で得られた細胞培養物のホルモン除去期、
(iii) 除去培地で段階(ii)の細胞に誘発カクテル(elicitation cocktail)の添加による誘発期、
(iv) 段階(iii)の終了時における培地からのトリプトリド冨化抽出物の調製
の段階を含んでなる、トリプテリジウム(Tripterygium)種の細胞培養物から培地中でトリプトリドを生産する方法に関する。
a) 植物細胞の少なくとも1種類の細胞分化因子、例えば、ベンジルアミノプリン(BAP)、アブシシン酸、カイネチン、チジアズロン、6−γ−γ−ジメチルアリルアミノプリン、ゼアチンまたはイソペンテニルアデニンなどから選択されるサイトカイニン、またはジベレリン、
b) 少なくとも1種類のストレッシング剤(stressing agent)、例えば非生物的誘発剤、および
c) 少なくとも1種類のテルペン合成経路、例えばトリプトリド合成経路の前駆体、例えばゲラニオール、ファルネソールおよびそれらのピロリン酸形態、酢酸ナトリウム、ピルビン酸またはメバロン酸
を含んでなる。
(α) 細胞脱分化インデューサーを含んでなる寒天培地で培養することによってトリプテリジウム・ウィルフォルディ(Tripterygium wilfordii)の気部由来の組織の外植片からカルスを誘導し、
(β) 段階(i)で得られたカルス細胞を増殖培地に懸濁して、懸濁細胞を増殖させる
段階によって先行する。
例えば、6000mg/lまでの濃度で、NH4NO3、KNO3、CaCl2・2H2O、MgSO4・7H2O、KH2PO4などから選択した少なくとも1種類の多量栄養素、
例えば、前記培地に培地の200mg/lまでの総微量栄養素濃度で、KI、H3BO3、MnSO4・4H2O、ZnSO4・H2O、Na2MoO4・2H2O、CuSO4・5H2O、CoCl2・6H2O、FeSO4・7H2O、Na2EDTA・2H2Oなどの少なくとも1種類の微量栄養素、
例えば、3g/lまでの培地中の濃度で、ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン−HClまたはチアミン−HClなどの少なくとも1種類のビタミン、
例えば、培地の3g/lまでの濃度で、少なくとも1種類のアミノ酸、例えばグリシン、
例えば、培地の20〜70g/l、例えば30g/lの濃度で、スクロースなどの少なくとも1種類の炭素源、
例えば、培地の0.001〜10mg/l、例えば培地の0.1〜3mg/lの濃度で、少なくとも1種類のホルモン、好ましくは植物ホルモンまたは成長因子、好ましくは植物成長因子または成長調節因子、好ましくは植物成長調節因子、例えば、カイネチン、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)またはナフタレン酢酸(NAA)
を含んでなる培地である。
例えば、6000mg/lまでの濃度で、NH4NO3、KNO3、CaCl2・2H2O、MgSO4・7H2O、KH2PO4などから選択した少なくとも1種類の多量栄養素、
例えば、培地の200mg/lまでの前記培地中の総微量栄養素濃度で、KI、H3BO3、MnSO4・4H2O、ZnSO4・H2O、Na2MoO4・2H2O、CuSO4・5H2O、CoCl2・6H2O、FeSO4・7H2O、Na2EDTA・2H2Oなどの少なくとも1種類の微量栄養素、
例えば、培地の3g/lまでの濃度で、ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン−HCl、チアミン−HClなどの少なくとも1種類のビタミン、
例えば、3g/lまでの培地中の濃度で、少なくとも1種類のアミノ酸、例えばグリシン、
例えば、30g/lの濃度で、スクロースなどの少なくとも1種類の炭素源、
例えば、培地の0.001〜10mg/l、例えば0.1〜3mg/lの濃度で、少なくとも1種類のホルモン、好ましくは植物ホルモンまたは成長因子、好ましくは植物成長因子または成長調節因子、好ましくは植物成長調節因子、例えばカイネチン、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)、ナフタレン酢酸(NAA)
を含んでなる培地である。
例えば、7000mg/lまでの濃度で、NH4NO3、KNO3、CaCl2・2H2O、MgSO4・7H2O、KH2PO4またはピルビン酸ナトリウムなどから選択した少なくとも1種類の多量栄養素、
例えば、培地の200mg/lまでの前記培地中の総微量栄養素濃度で、KI、H3BO3、MnSO4・4H2O、ZnSO4・H2O、Na2MoO4・2H2O、CuSO4・5H2O、CoCl2・6H2O、FeSO4・7H2O、Na2EDTA・2H2Oなどの少なくとも1種類の微量栄養素、
例えば、培地の60mg/lまでの濃度で、ミオイノシトール、ニコチン酸、ピリドキシン−HCl、チアミン−HClまたはグリシンなどの少なくとも1種類のビタミン、
例えば、20〜70g/l、例えば30g/lの濃度で、スクロースなどの少なくとも1種類の炭素源、
例えば、培地の0.001〜10mg/l、例えば1〜3mg/lの濃度で、少なくとも1種類のホルモン、好ましくは植物ホルモンまたは成長因子、好ましくは植物成長因子または成長調節因子、好ましくは植物成長調節因子、例えばカイネチンまたはインドール−酪酸(IBA)
を有する。
1) 少なくとも1種類の植物細胞の細胞分化因子、例えばサイトカイニンまたはジベレリン、例えばベンジルアミノプリン(BAP)、
2) 化学的または「無生物」起源などの少なくとも1種類のストレッシング剤(stressing agent)または「誘発剤」、例えば5−クロロサリチル酸(5−クロロSA)、サリチル酸、アセチルサリチル酸(ASA)および/またはジャスモン酸メチル(MeJA)、
3) テルペン合成の少なくとも1種類の前駆体、例えば、ファルネソール、ゲラニオール、酢酸ナトリウム、ピルビン酸またはメバロン酸
を含んでなる。
培養物生産性が、1日1L当たり2.75mgを上回り、
段階(iii)の後の培養物上清のトリプトリド濃度が、50mg/lを上回り、かつ
乾燥バイオマスの百分率(w/w)でのトリプトリド濃度が、約0.385%である
ので、特に有利である。
カルスは、トリプテリジウム・ウィルフォルディ(Tripterygium wilfordii)の葉の外植片から得られる。
数ヶ月間再接種を行い、脆いカルスを得た後、細胞懸濁液の増殖のために最適化した液体培地に移す。
三角フラスコでの産生は、
1. 増殖培地での15日間の細胞培養、
2. 7日間のホルモン除去、
3. 約20日間の誘発によるトリプトリド産生
の3つの期に分けられる。
バイオリアクターにおけるトリプトリド産生は、
1. 増殖培地での15日間の細胞培養、
2. 7日間のホルモン除去、
3. 誘発による21日間のトリプトリド産生
の3期に分けられる。
前記のように、三角フラスコでのバイオマスの15日間の増殖培養が終了したならば、これを接種物として用いて10Lバイオリアクター(リアクターA)にて培養する。図1のバイナリー装置を参照。
同時に、産生バイオリアクターBに除去培地を、容積が10Lおよび細胞密度が170g/lとなるように補足する。産生バイオリアクターの培養物を4〜6日間この状態に保持して、バイオマスを増殖培地に含まれる微量の成長ホルモン、すなわち2,4−Dのようなオーキシンから完全に分離する。次いで、誘発カクテルを産生バイオリアクターBに導入する。トリプトリド産生を、この状態で15〜21日間行う。図2に、タンクBにおける誘発後(t=0)のトリプトリド産生の動態追跡の一例を示す。培養が終了したならば、培養物上清を、前濾過段階(15〜20μm)に続いて0.2μmでの濾過によって回収する。透明な溶液が得られる。得られたトリプトリド濃度は、細胞外培地では20〜35mg/lである。
極めて単純かつ廉価な装置を有利に用いるもう一つの方法により、前記の装置、すなわち伝統的なステンレススチール製発酵槽の場合におけるような大規模なメンテナンスおよびクリーニングを必要としないディスポーザブルリアクターに匹敵する収率を得ることができる。撹拌リアクターは、一般に懸濁哺乳類細胞の培養に用いられる。図解例には、例えば、10Lまたは20Lの容積のGE Healthcare Biosciencesから発売されているWAVEリアクターについて記載されているが、この方法は一層大きな容積および他の製造業者製の装置に適合させかつ応用することができる。
支持体上に置かれたWAVEバイオリアクターA(10L)に、インライン滅菌濾過によって栄養培地を満たし、空気で膨張させる。次いで、それを、撹拌インキュベーター中で、15日間撹拌した三角フラスコ中で調製した前培養物を増殖培地に接種する。
ロッキング角度:6〜8°、
ロッキング速度:16〜20rpm、
曝気速度:50%純酸素冨化空気0.1〜0.15L/分、
T=27℃、
期間=14日間。
バッグAからの培養物約500mlの容積を、トレイ上にバッグAと並べて置かれているバッグB(10L)に移す。バッグAの残り(約2L)を、2X除去培地2Lで希釈する。撹拌を、T=27℃で継続する。誘発期の培養物を、一定のパラメーターを測定することによって観察する(図4参照)。最高トリプトリド濃度は、19日間のインキュベーション後には、培養上清1L当たり55mgである。トリプトリド産生速度は、培養1日当たり、無細胞上清1L当たり約2.87mgである。トリプトリド産生動態は、ほとんど総ての利用可能なスクロースが消費された直後に低下し始める。培養が終了したならば、培養物上清を回収した後、前濾過段階(15〜20μm)および0.2μmでの第二の濾過段階を行う。透明な着色した(黄色または藤紫〜桃色)溶液が得られる。
インキュベーション温度:総ての期(フラスコおよびバイオリアクターでの細胞増殖および誘発)について+27℃。
前培養物を、約15日間培養したもの100mlを接種した増殖培地TW2H6 400mlを含む撹拌1Lフラスコで調製する。
接種物500mlを、滅菌連結を介してディスポーザブルバイオリアクターセットアップに移し、滅菌した栄養培地を満たす。それを、下記の条件に準じてロッカー上でインキュベーションする:
ロッキング角度:6〜8°、
ロッキング速度:16〜18rpm、
曝気速度:50%純酸素冨化空気0.1〜0.15L/分、
培養期間=14日間。
この培養物の2Lの容積を、2X濃縮誘発カクテルを含む除去培地2Lで希釈することによって誘発させ、インキュベーションを下記の条件下で継続する:
ロッキング角度:6〜7°、
ロッキング速度:17〜21rpm、
曝気速度:50%純酸素冨化空気0.1〜0.15L/分。
誘発による細胞増殖および代謝物産生は、ディスポーザブルバイオリアクター、例えばWAVEバッグで行った。
例6で得られたトリプトリドを含む培養上清約30Lを、酢酸イソプロピル1容で抽出する(連続2回)。有機相を濃縮し、ロータリーエバポレーターで乾燥する。ベージュ〜黄色の乾燥物質650mgが得られる。HPLCアッセイを用いて、抽出物中のトリプトリド濃度を測定する:回収粉末0.65gに含まれるトリプトリド195mg、または乾燥抽出物1g当たりトリプトリド0.3g(図5参照)。
トリプテリジウム・ウィルフォルディ(Tripterygium wilfordii)の根の樹皮を剥いで、乾燥し、粉砕する。次いで、それらを90%エタノールで抽出する。濃縮後、抽出物に1,2−ジクロロエタンで液/液抽出を行う。塩素化相(chlorinated phase)を塩基性溶液(NaOH)で洗浄し、濃縮して、シリカ上に吸着させる。このシリカ上の粗製抽出物を、−20℃で保管する。
NFκB転写の阻害(炎症誘発性および炎症性応答の阻害)、
亜硝酸塩(NO2)産生の阻害、
PAR−2阻害。
炎症性遺伝子の阻害(アトピー性皮膚炎モデル)、
炎症性遺伝子の阻害(乾癬モデル)。
転写因子NFκBは、炎症性応答調節に関与する多数の遺伝子の発現を制御する。ある種の炎症誘発性刺激、例えば腫瘍壊死因子−α(TNFα)は、NFκB活性化すなわちその核転座を生じる。従って、NFκBは、サイトカイン、ケモカイン、接着分子、成長因子およびシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)および一酸化窒素合成酵素(iNOS)のような誘導酵素をコードする炎症誘発性遺伝子の転写を誘導する。NFκBは、炎症性応答の開始および増幅に重要な役割を果たす。皮膚のある種の慢性炎症性疾患、例えばアトピー性皮膚炎または乾癬は、ケラチン生成細胞によって発現される炎症メディエーターのディレギュレーションを特徴とする。同等量のトリプトリド(TRP)を有する植物細胞培養抽出物(IBO.18.134)に対する純粋なトリプトリド(TRP)の抗炎症活性を評価する。
図6は、HaCaTケラチン生成細胞におけるTNFα刺激に続くNFκB活性化に対する様々な抽出物の阻害を表す。ポジティブコントロールとして、NFκB活性化を36%だけ阻害するデキサメタゾン(2μΜ)を用いた。純粋なトリプトリドは、8nM〜83nMまで用量依存的に阻害する。
この研究の目的は、PCC抽出物(IB−134)と純粋なトリプトリドの抗炎症活性を比較することであった。
プロテアーゼ活性化受容体−2(PAR−2)は、炎症性応答を含む様々な疾患の生理病理学と関連している。
根抽出物から得たトリプトリド(IBO.18.130)の抗炎症および鎮静活性を、PCC抽出物(IBO.18.134)の活性と比較する。
ポリ(I:C)+Th1サイトカイン(TNFα)とTh2サイトカイン(IL4+IL13)との組み合わせ物による刺激後にアトピー性皮膚炎の表現型を示すケラチン生成細胞、および
サイトカイン(IL17+OSM+TNFα)の組み合わせ物による刺激後に乾癬表現型を示すケラチン生成細胞
で検討した。
1. 抽出物
抽出物をDMSOに可溶化して、純粋なトリプトリドの濃度で表した200mg/ml保存溶液を調製した。この濃度は、根抽出物の溶解度によって賦課されたものであり、特に注意を要するものである(緩やかに撹拌しながら室温で分離)。
用いた細胞は、正常なヒト表皮のケラチン生成細胞(NHEK)であり、標準的培養条件下で増幅させる。
3.1 方法
NHEK細胞を、ケラチン生成細胞−SFM培地に播種して、培養する。培地を、試験を行う抽出物を含むまたは含まない(コントロール)培地に換える。炎症インデューサー混合物を1時間プレインキュベーションした後、アトピー性皮膚炎の場合には、ポリ(I:C)、IL4、IL13およびTNFを含む混合物を加え、乾癬の場合には、IL17、オンコスタチンMおよびTNFを含む混合物を加える。
総RNAの抽出およびcDNAの合成の後、32個の特異的アトピー性皮膚炎遺伝子および32個の特異的乾癬遺伝子を定量的PCRによって分析する。
アトピー性皮膚炎の表現型および乾癬の表現型に特徴的な定量化遺伝子を、それぞれ表1および2に示す。
1. アトピー性皮膚炎表現型を示すケラチン生成細胞に対する化合物の効果
1.1 実験の検証
ポリ(I:C)とTh1/Th2サイトカイン(IL4、IL13、TNF)との組み合わせ物によるケラチン生成細胞の処理は、この病理に関与する様々な特徴的遺伝子の発現を誘導することによってアトピー性皮膚炎表現型を明確に誘導した。
2種類の化合物を、2.5ng/ml(純粋なトリプトリド当量)の濃度で試験した。
根抽出物は、炎症誘発性混合物の効果を逆にすることによって、このモデルに対して適度の抗炎症効果を有する。実際に、先天性免疫マーカーS100A7、ケモカイン(CCL3、CCL5およびIL8)および酸化的ストレスマーカー(HMOX1)の発現は抑制されるのに対して、ケラチン生成細胞分化に関与するマーカーKRT10の発現は、刺激された(表1)。
植物細胞培養(PCC)抽出物は、先天性免疫マーカーS100A7およびRNASE7、サイトカインTSLPおよびIL1A、ケモカイン(CCL3、CCL5およびIL8)、および酸化的ストレスマーカー(HMOX1)の発現を抑制することによって根抽出物より一層顕著な抗炎症効果を有する(図9)。
2.1 実験の検証
サイトカイン混合物(オンコスタチンM+IL17+TNF)によるケラチン生成細胞の処理は、この病理に関与する様々な特徴的遺伝子の発現を誘導することによって乾癬表現型を明確に誘導した。
両化合物を、2.5ng/ml(純粋なトリプトリド濃度当量)の濃度で試験した。
根抽出物は、このモデルに対して抗炎症効果を有する。実際に、サイトカインカクテルによって誘導される10個の遺伝子は、この抽出物によって抑制される。ある種の遺伝子に対する用量依存性効果も観察することができる(図10)。
植物細胞培養(PCC)抽出物は、このモデルに対して抗炎症効果も有する。実際に、サイトカインカクテルによって誘導される13個の遺伝子は、抽出物によって2より大きなファクターだけ抑制される。乾癬モデルに対する抗炎症効果は、根抽出物よりも植物培養抽出物で一層顕著である(図10)。
この試験の実験条件下で、抽出物IBO.18.130(根抽出物)およびIBO.18.134(植物培養抽出物)は、ケラチン生成細胞で誘導したアトピー性皮膚炎および乾癬のイン・ビトロモデルで抗炎症効果を有した。この効果は、純粋なトリプトリド当量での根抽出物と比較して植物培養抽出物で一層顕著である。
同一TRP濃度で3種類の化合物TRP(MP0001128)、根抽出物(IBO.18.130)およびPCC抽出物(IBO.18.134)の細胞毒性比較。
ライシス緩衝液50μlを黒色マイクロプレートに加え、撹拌した後、基質50μlを加え、ルミネッセンスをTopCountカウンターで読み取る。
上清100μlを黒色マイクロプレートから採取し、透明なマイクロプレートに入れる。LDHアッセイ溶液100μlを加えた後、プレートを遮光して室温にて30分間インキュベーションする。LDHアッセイの比色反応を、1NHCl 50μlで停止する。細胞溶解を、EnVisionリーダー上で485nmの吸光度を読み取ることによって分析する。
Claims (18)
- トリプテリジウム(Tripterygium)種の細胞培養物から培地中でトリプトリドを生産する方法であって、
(i) バイオマス成長条件下にて栄養培地におけるカルスから誘導されるトリプテリジウム種の脱分化細胞のバイオマスの生産期、
(ii) オーキシンを実質的に含まない除去培地において段階(i)で得られた細胞培養物のホルモン除去期、
(iii) 除去培地で段階(ii)の細胞に、
a) サイトカイニンおよびジベレリンから選択される植物細胞の少なくとも1種類の細胞分化因子、
b) 5−クロロサリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸、およびジャスモン酸メチルからなる群から選択される少なくとも1種類のストレッシング剤、および
c) ファルネソール、ゲラニオール、酢酸ナトリウム、ピルビン酸およびメバロン酸からなる群から選択される少なくとも1種類のテルペン合成経路の前駆体、
を含んでなる誘発カクテルの添加による誘発期、ならびに
(iv) 段階(iii)の終了時における培地からのトリプトリド冨化抽出物の調製
段階を含んでなる、方法。 - 植物細胞の細胞分化因子が、サイトカイニンから選択される、請求項1に記載の方法。
- ストレッシング剤が、5−クロロサリチル酸、アセチルサリチル酸またはサリチル酸、およびジャスモン酸メチルからなる、請求項1または2に記載の方法。
- 除去培地が、オーキシンを含まない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 除去培地が、2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)またはナフタレン酢酸(NAA)を含まない、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ホルモン除去段階(ii)が、5〜15日間継続する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- ホルモン除去段階(ii)が、7日間継続する、請求項6に記載の方法。
- 誘発期(iii)が、15〜35日間継続する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 誘発期(iii)が、20〜25日間継続する、請求項8に記載の方法。
- バイオマス産生期(i)が27〜28℃にて10〜30日間撹拌しながら進行する、請求項1〜9のいずれか一項に記載のトリプトリド産生の方法。
- 誘発カクテルが、ベンジルアミノプリン、5−クロロサリチル酸、アセチルサリチル酸またはサリチル酸、ジャスモン酸メチル、ファルネソールおよびゲラニオールを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載のトリプトリド産生の方法。
- 段階(iii)の後の培養物上清のトリプトリド濃度が培地1L当たり50mgを上回る、請求項1〜11のいずれか一項に記載のトリプトリド産生の方法。
- 段階(iv)が液/液抽出である、請求項1〜12のいずれか一項に記載のトリプトリド産生の方法。
- トリプテリジウム種の細胞培養のための誘発カクテルの使用であって、誘発カクテルが
a) サイトカイニンおよびジベレリンから選択される植物細胞の少なくとも1種類の細胞分化因子、
b) 5−クロロサリチル酸、アセチルサリチル酸、サリチル酸、およびジャスモン酸メチルからなる群から選択される少なくとも1種類のストレッシング剤、および
c) ファルネソール、ゲラニオール、酢酸ナトリウム、ピルビン酸およびメバロン酸からなる少なくとも1種類のテルペン合成経路の前駆体
を含んでなる、使用。 - 誘発カクテルが、ベンジルアミノプリン(BAP)0.7〜3mg/l、5−クロロサリチル酸(5−クロロSA)3〜5mg/l、アセチルサリチル酸(ASA)33〜45mg/l、ジャスモン酸メチル(MeJA)22.4〜24mg/l、ゲラニオール20〜30mg/lおよびファルネソール(F−OH)19〜30mg/lを含んでなり、mg/lは、培地1L当たりのmgを表す、請求項14に記載の使用。
- 活性成分としてのトリプトリドまたはトリプトリド冨化抽出物と、1種類以上の皮膚美容上および/または皮膚科学上許容可能な賦形剤とを含んでなる、掻痒症の治療に使用するための皮膚美容または皮膚科学組成物。
- トリプトリド冨化抽出物が、トリプテリジウム種の脱分化細胞のイン・ビトロ培養物の培地から抽出することによって得られる、請求項16に記載の皮膚美容または皮膚科学用組成物の製造方法。
- トリプトリド冨化抽出物が、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法によって得られる、請求項17に記載の製造方法。
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