CN114642171B

CN114642171B - 一种高活性雷公藤代谢产物的诱导方法及雷公藤活性代谢组合物

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Publication number: CN114642171B
Application number: CN202210326956.5A
Authority: CN
Inventors: 张景红; 王金海; 叶龙飞; 何秀枝; 戴培委; 欧阳静茹; 杨素心
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2022-03-30
Filing date: 2022-03-30
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2042-03-30
Also published as: CN114642171A

Abstract

本发明提供了一种高活性雷公藤代谢产物的诱导方法及雷公藤活性代谢组合物，属于雷公藤代谢产物制备技术领域。本发明通过对培养基和诱导子种类和剂量进行了改进，显著提升了三种高附加值成分雷公藤甲素、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的含量，且组合物成分多达122种，有了实质性的提升。本发明各种培养体系所得组合物抑制肿瘤的效果均优于雷公藤甲素，其中诱导子加雷公藤甲素优化培养基和不定根培养基组合物效果最好，72小时的IC₅₀达到2.563nM，比雷公藤甲素72小时的抑制效应提升了6.89倍，而且本发明各种培养体系所得的组合物具有抑制肿瘤耐药细胞增殖的药物效应，且强于雷公藤甲素。

Description

一种高活性雷公藤代谢产物的诱导方法及雷公藤活性代谢组合物

技术领域

本发明属于雷公藤代谢产物制备技术领域，尤其涉及一种高活性雷公藤代谢产物的诱导方法及雷公藤活性代谢组合物。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.)属卫矛科植物，主产于浙江、江苏、安徽、台湾、福建等地，其中以福建泰宁地区所产的原药材质量为最优，被列为福建省道地药材，雷公藤具有抗炎、抗肿瘤、抑制免疫等药理作用，临床上主要用于治疗类风湿性关节炎(RA)及强直性脊柱炎、肾脏疾病、系统性红斑狼疮、自身免疫性疾病和皮肤病等疾病。目前已从雷公藤中分离出380多种成分，主要是二萜类、三萜类和倍半萜类生碱等。虽然，化学提取法、化学合成法、人工栽培及半合成法已经成功提取或合成得到多种雷公藤类成分单体，但是与目前对雷公藤类活性成分的需求相比，仍显得远远不足。

为解决这一问题，国内外学者建立了雷公藤植物悬浮细胞、发状根和不定根的离体培养体系，而且通过诱导子调控作用，成功的提高了雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤次碱、雷公藤吉碱等活性成分的含量，但是对雷公藤甲素的含量提升比较有限。虽然也有报道采用非生物诱导子(稀土元素等金属离子LaCl₃、一些无机化合物(水杨酸、烟酸、Ag+、β-CD)和物理胁迫因子(如紫外线)或者生物诱导子(如真菌(酵母)、细菌(苹果炭疽和柿子炭疽)、病毒、细胞壁等化学成分如(多糖(F4-30、F4-3、F4-20)、低聚糖、蛋白质(精氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、大豆蛋白)、多肽、茉莉酸甲酯(MeJA)、离子交换树脂XAD-7等对悬浮细胞体系进行调控，其中水杨酸对雷公藤甲素的诱导效应较为显著，诱导后其含量从2.81mg/L提高到5.53mg/L，提高了3.54倍；而异亮氨酸能够同时提高雷公藤次碱和吉碱的含量至4.6倍，诱导后雷公藤次碱的含量从0.21mg/L提高到0.97mg/L，而雷公藤吉碱的含量从0.29mg/L提高到1.34mg/L。(李琰.雷公藤组织培养生产次生代谢产物及其代谢调控研究[D].陕西：西北农林科技大学,2008，薛璐莎.前体和真菌诱导子对雷公藤悬浮细胞次生代谢产物合成的影响[D].陕西：西北农林科技大学,2013,朱留刚.雷公藤愈伤细胞悬浮培养生产雷公藤甲素研究[D].福建：福建农林大学,2012)。但是上述发明和研究涉及的产物包括雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤吉碱、雷公藤次碱和雷公藤总碱方面，这些产物的活性涉及到抗肿瘤、杀虫和免疫抑制等方面，并不涉及对肿瘤耐药方面的研究。而且申请人在先发明专利CN103159822 B中产物的总数虽有提升到七种，包括雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱、雷公藤定碱和羟基雷公藤甲素，但是其抑制肿瘤的活性局限于普通细胞，对肿瘤耐药的抑制作用较弱。

发明内容

有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种高活性雷公藤代谢产物的诱导方法，能够显著提升雷公藤甲素、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的含量和代谢产物的种类，提高代谢产物抑制肿瘤耐药的活性。

另一个目的在于提供一种制备雷公藤活性代谢组合物的方法，能够制备获得高含量、成分种类多的雷公藤活性代谢组合物，提高雷公藤活性代谢组合物抑制肿瘤耐药的活性。

再一个目的在于提供一种雷公藤活性代谢组合物及其在制备抑制肿瘤耐药活性产品中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种高活性雷公藤代谢产物的诱导方法，包括如下步骤：将雷公藤体外体系置于含有诱导子的培养基中培养；

所述诱导子包括A：2，6-二甲基-β-环糊精，B∶酵母抽提物，C∶茉莉酸甲酯和D∶硝酸银中的任意三种或四种组合；

所述培养基为雷公藤甲素优化培养基、生物碱优化培养基、生长素优化培养基和不定根培养基中的任意一种；

所述雷公藤甲素优化培养基包括如下成分：大量元素：NH₄NO₃ 825mg/L、KNO₃950mg/L、MgSO₄·7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 1360mg/L；肌醇：200mg/L；钙盐：CaCl₂·2H₂O147mg/L；铁盐：FeSO₄·7H₂O 9.28mg/L、Na-EDTA·2H₂O 13.9mg/L；微量元素：MnSO₄·7H₂O67.6mg/L、ZnSO₄·2H₂O 17.2mg/L、KI3.32mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.05mg/L；有机物：肌醇200mg/L、甘氨酸5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸0.5mg/L、生物素0.5mg/L；激素：NAA 5mg/L、6-BA 1.5mg/L、蔗糖40g/L；

所述生物碱优化培养基包括如下成分：大量元素：(NH₄)₂SO₄ 3960mg/L、KCl745mg/L、MgSO₄·7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 680mg/L；肌醇：200mg/L；钙盐：CaCl₂·2H₂O220mg/L；铁盐：包括硫酸铁FeSO₄·7H₂O 9.28mg/L、Na-EDTA·2H₂O 12.42mg/L；微量元素：MnSO₄·7H₂O 67.6mg/L、ZnSO₄·2H₂O 34.4mg/L、CoSO₄·7H₂O 0.05mg/L、CuSO₄·5H₂O0.05mg/L；有机物：肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、生物素1mg/L；激素：2,4-D 1mg/L、KT 0.5mg/L、蔗糖40g/L；

所述生长素优化培养基包括如下成分：大量元素NH₄NO₃ 1650mg/L、KNO₃ 1900mg/L、MgSO₄·7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 1360mg/L；肌醇：200mg/L；钙盐：CaCl₂·2H₂O 440mg/L；铁盐：包括FeSO₄·7H₂O 27.85mg/L、Na-EDTA·2H₂O 37.25mg/L；微量元素：MnSO₄·7H₂O33.8mg/L、ZnSO₄·2H₂O 8.6mg/L、H₂BO₃ 6.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 1mg/L、CuSO₄·5H₂O0.025mg/L；有机物：肌醇100mg/L、甘氨酸5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L；激素：2,4-D 1mg/L、KT 0.5mg/L、蔗糖40g/L；

所述不定根培养基包括生长培养基和继代培养基，所述生长培养基包括如下成分：大量元素：NH₄NO₃ 7200mg/L、KNO₃ 9500mg/L、MgSO4·7H₂O 1850mg/L、KH₂PO₄ 6800mg/L，钙盐：CaCl₂·2H₂O 1660mg/L，铁盐FeSO₄·7H₂O1390mg/L，Na-EDTA·2H₂O 1865mg/L；微量元素H₂BO₃ 2500mg/L、MnSO₄·7H₂O 6250mg/L、ZnSO₄·2H₂O 250mg/L、CuSO₄·5H₂O 6.25mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 62.5mg/L，肌醇1250mg/L，有机物：甘氨酸500mg/L、盐酸硫胺素125mg/L、盐酸吡哆醇125mg/L、烟酸1250mg/L；激素：NAA 640μL/L、2.4-D 80μL/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L；

；所述继代培养基包括如下成分：大量元素KNO₃ 800mg/L、MgSO₄·7H₂O 7380mg/L、KH₂PO₄ 191mg/L、Na₂SO₄ 530mg/L；钙盐Ca(NO₃)₂2870mg/L，微量元素H₂BO₃ 357mg/L、MnSO₄·7H₂O 1650mg/L、ZnSO₄·2H₂O 680.4mg/L、KI 187.5mg/L；有机物：甘氨酸750mg/L、盐酸硫胺素25mg/L、盐酸吡哆醇25mg/L、烟酸125mg/L；激素：NAA 640μL/L、2.4-D 80μL/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L。

优选的，所述培养期间使pH值保持为5.6。

优选的，所述雷公藤体外体系包括雷公藤愈伤组织细胞和雷公藤植物体外诱导的不定根。

优选的，所述诱导子各成分的浓度为：A：1mM-100mM，B：1g/L-100g/L，C：1mM-100mM，D：0.01mg/L-1mg/L，所述诱导子各成分之间的体积比具体为：A∶B∶C＝1-5∶1-5∶1-4、A∶B∶D＝1-5∶1-6∶1、A∶C∶D＝2-3∶1-5∶1、B∶C∶D＝1-3∶1-5∶1-4、A∶B∶C∶D＝1-4∶1-4∶1-4∶1。

本发明还提供了一种制备雷公藤活性代谢组合物的方法，包括如下步骤：

分离上述诱导方法所得的悬浮细胞和培养液；

将培养液进行萃取干燥得萃取物；

悬浮细胞用硅胶层析分离，用不同比例的石油醚和乙酸乙酯洗脱液进行梯度洗脱，洗脱液回收溶剂后，得残渣；

将所述残渣和所述萃取物用色谱纯甲醇溶解，过滤除菌，即得。

优选的，所述洗脱液中石油醚和乙酸乙酯的体积比包括：9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10。

优选的，当所述雷公藤体外体系为雷公藤愈伤组织细胞时，所述组合物包括PubinernoidA、5-hydroxymethylmellein、3,9-dihydroxymegastigman-5-ene、(+)-dehydro vomi foliol、(3S,5R,8R)-3,5-dihydro xymegastigma-6,7-dien-9-one、(3S,5R,6S,7E)-3,5,6trihydroxy-7-megastigmen-9-one、4(15)-eudesmen-1β,7,11-triol、雷公藤甲素衍生物4、Catchin、Hypoglicin E、Hypoglicin F、Triptobenzene R、雷酚萜、Triptobenzene B、isopimara-8(14)，15-diene-11b，19-dio、Hypoglicin H、14-oxo-19-(4→3)-abeo-abieta-3,8,12-triene-19,18-olide、(3S,4S,5R,10S)-3,19-dihy droxy-7-oxoabieta-8,11,13-triene、Neotripterifordin、Tripterlide A、Tripterlide D、3-oxo-1 4,15-dihydroxyabiet a-8,1 1,1 3-t rien-19-ol、Tripterinin、Triptonoditerpenicacid、Triptonoditerpenic acid、Hypoglicin D、Tricosanoic acid、Tricosanoic acid、14，15-二羟-8，13-环氧树脂-14-烯-19-酸酯、雷公藤甲素、南蛇藤糠酰胺碱、南蛇藤糠酰胺碱、2α-hydroxytriptonide、雷公藤乙素、Triptergulide A、Wilfordiol A、苯代南蛇碱、Triptergulide B、Triptergulide J、Celacinnine、南蛇藤肉桂酰胺碱、Triptergulide F、B-谷甾醇、B-谷甾醇、(+)-lyoniresinol、3-oxo-olean-9(11),12-diene、Icariol A2e、Tripteryol B、Canophyllal、11a-羟基-β-香树精、2S,2′S-aurantiamideacetate、雷公藤红素、Wilforlide B、雷公藤内酯甲、Dulcioic acid、Triptotin H、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、Triregelolide A、2α，3β，-dihydroxy-olean-12-ene-22，29-la ct one、Tripterygic acid A、Demethy lzey lasteral、雷公藤酮、Cangoronine、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-5-methoxy-lariciresinol、Leptolepisol C、2α,3α,23-trihydro xyu rs-12,20(30)-dien-28-oicacid、雷酚新内酯苷、Triptregelol A、4,4'-dimethoxy-3'-hy droxy-7,9':7',9-die po xylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、(-)-isolariciresinol 2α-O-β-D-glucopyranoside、Triptersinine Z3、Triptersinine T、Triptregeline C、原花青素B1、Triptersinine Z1、Triptersinine Y、Triptregelol B、Triptregeline I、Wilforsinine F、bis-8,8’-catechinylmethane、Triptersinine A、Tripterygiumine H、Triptregeline G、reserpine、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷、Triptregeline F、Triptregeline F、Triptregeline v、Triptersinine Z4、Triptersinine Z4、Triptersinine L、Triptersinine K、Triptersinine C、Triptersinine F、Montahomobisflflavan B、Triptregeline B、Triptregeline J、dehydroxy aguay amycin B、TriptregelineE、Triptregeline A、Macroregeline D、Triptersinine E、Triptersinine P、Tripterygiumine T、Triptersinine P、Triptersinine H、Tripterygiumine Q、Tripterygiumine P、Tripterygiumine U、Tripterygiumine J、Tripfordine A、Wilforsinine C、翅卫矛辛宁、Hypoglaunune E、Peritassine A、1－去乙酰基雷公藤定碱、雷公藤康碱、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、9'-hydroxy-2-nico tinoylwilforin、Wilfornine HTriptery giumine F、Tripterygiumine E、Tripterygiumine G、Tripterygiumine C、雷公藤素A、Triptonine A和雷公藤素B。

优选的，当雷公藤体外体系为雷公藤植物体外诱导的不定根时，所述组合物包括雷公藤甲素、雷公藤甲素衍生物6、雷公藤甲素衍生物7、雷公藤甲素衍生物9、雷公藤甲素衍生物1、雷公藤甲素衍生物3、雷公藤甲素衍生物4、Catchin、雷酚萜、Triptobenzene B、isopimara-8(14),15-diene-11b,19-diol、雷酚内酯、triptobenzene Y、kaurane-16,19-20-triol、雷酚酮内酯、Tripohairic acid、雷酚萜甲醚、Triptonoterpenen methlether、3-oxo-14,15-dihudeoxy-abieta-8,11,13-trien-19-ol、triptobenzene H、雷酚新内酯、triptonoditerpenic acid、triptonodiol、14，15-二羟-8,13-环氧树脂-14-烯-19-酸酯、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、B-谷甾醇、Tingenone、雷公藤红素衍生物1、α-香树精、Sulphated conjugated triptolide、11α-羟基-β-香树精、雷公藤红素、Wilorlide B、齐墩果酸、methylkatonoate、Wilforic acidF、22β-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸、22α-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸甲酯、regelin C、原花青素B1、reserpine、槲皮素-3-O-新橙皮糖甘、wilforisinine B、wilforisinine A、dehydroxyaquayamycin B、celangulatinF、wilforisinine D、7b-triacetoxy-isobutyryloxy-8a-(3-furancarbonyloxy)-4a-hydroxy-1b-nicotinoxy-dihydroagaro furn、Evonine、Wilfornine E、Tripfordine A、Wilforsinine C、Euonymine、1-desacetylwilforgine、alatusinine、Wilfornine F、雷公藤次碱、Hyponine D、Wilfordinine I。

本发明还提供了一种利用上述方法制备所得的雷公藤活性代谢组合物，所述组合物为以下组合物中的任意一种；

组合物1为雷公藤甲素、雷公藤内酯A、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol>(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、Tripterinin、雷酚内酯、Tripterygiumine C、雷公藤乙素、雷公藤红素、雷酚内酯、Tripterygiu mine E、去甲基泽拉木醛、Hypoglicin D、南蛇碱、Triptregeline F、雷酚萜、雷公藤内酯B、雷公藤酯甲、Triptergulide F、Triptersinine Z3、雷公藤吉碱、Triptersinine A、Triptersinine T、雷公藤甲素衍生物3和Triptobenzene B；

组合物2为Wilforsinine C、去甲基泽拉木醛、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol、雷公藤内酯A、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、雷公藤红素、Triptersinine Z3、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、Tripterygiumine、雷公藤内酯B、雷公藤酯甲、Triptergulide F、Triptobenzene B、雷公藤甲素、Triptersinine T和雷酚萜；

组合物3为雷公藤乙素、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol、Triptergulide B、Celacinnine、3S,4S,5R,10S)-3,19-dihydroxy-7-oxoabieta-8,11,13-triene、去甲基泽拉木醛、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、Triptergulide A、雷公藤红素、3-oxo-olean-9(11),12-diene、雷公藤次碱、Tripterygiumine E、Tripterygiumine C、Triptersinine Z3、雷公藤酯甲、雷公藤甲素、雷酚萜、Triptersinine T、Triptergulide F、雷公藤吉碱和Triptobenzene B；

组合物4为雷公藤甲素、雷公藤甲素衍生物6、雷公藤甲素衍生物7、雷公藤甲素衍生物9、雷公藤甲素衍生物1、雷公藤甲素衍生物3、雷公藤甲素衍生物4、Catchin、雷酚萜、Triptobenzene B、isopimara-8(14),15-diene-11b,19-diol、雷酚内酯、triptobenzeneY、kaurane-16,19-20-triol、雷酚酮内酯、Tripohairic acid、雷酚萜甲醚、Triptonoterpenen methlether、3-oxo-14,15-dihudeoxy-abieta-8,11,13-trien-19-ol、triptobenzene H、雷酚新内酯、triptonoditerpenic acid、triptonodiol、14，15-二羟-8,13-环氧树脂-14-烯-19-酸酯、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、B-谷甾醇、Tingenone、雷公藤红素衍生物1、α-香树精、Sulphated conjugated triptolide、11α-羟基-β-香树精、雷公藤红素、Wilorlide B、齐墩果酸、methylkatonoate、Wilforic acid F、22β-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸、22α-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸甲酯、regelin C、原花青素B1、reserpine、槲皮素-3-O-新橙皮糖甘、wilforisinine B、wilforisinine A、dehydroxyaquayamycin B、celangulatin F、wilforisinine D、7b-triacetoxy-isobutyryloxy-8a-(3-furancarbonyloxy)-4a-hydroxy-1b-nicotinoxy-dihydroagarofurn、Evonine、Wilfornine E、Tripfordine A、Wilforsinine C、Euonymine、1-desacetylwilforgine、alatusinine、Wilfornine F、雷公藤次碱、Hyponine D、Wilfordinine I。

本发明还提供了一种上述任意一项方法制备所得的组合物或上述组合物在制备抑制肿瘤耐药活性产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明在发明专利CN 103159822 B的基础上对诱导子种类和剂量进行了改进，而且对培养基进行了改进，能够显著提升雷公藤代谢产物中雷公藤甲素、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的含量。在雷公藤甲素优化培养基中，雷公藤甲素含量提升为10.34mg/L，雷公藤次碱含量为29.78mg/L，雷公藤吉碱的含量为3.61mg/L；在生物碱优化培养基中雷公藤甲素含量为8.16mg/L，雷公藤次碱含量为51.58mg/L和雷公藤吉碱的含量为46.56mg/L；在生长素优化培养基中雷公藤甲素含量为7.04mg/L，雷公藤次碱含量为19.68mg/L和雷公藤吉碱的含量为8.34mg/L；在不定根培养基中雷公藤甲素含量为24.93mg/L，雷公藤次碱含量为16.36mg/L和雷公藤吉碱的含量为30.27mg/L。

另外，采用本发明诱导方法能够使雷公藤代谢产物由在先专利(CN 103159822 B)中的7种成分增加到一百多种，有了实质性的提升。而且采用本发明的方法制备所得的雷公藤活性代谢组合物，均具有优于雷公藤甲素的抑制肿瘤效果，其中诱导子加雷公藤甲素优化培养基和不定根培养基诱导制备所得的组合物效果最好，72小时的IC₅₀达到2.563nM，比雷公藤甲素72小时的抑制效应(72小时的IC₅₀为17.67nM)提升了6.89倍。进一步的，本发明各种培养体系所得的组合物具有抑制肿瘤耐药细胞增殖的药物效应，且效果强于雷公藤甲素。

附图说明

图1为HPLC联合UPLC-MS/MS建立不同培养体系组合物成分的指纹图谱；

图2为基于UPLC-MS/MS的不同培养体系的组合产物共有模式指纹图谱；

图3为UPLC-MS/MS分析不同培养体系中次生代谢产物的中的相关系数，其中a为单样品相似度分析，b为体系相似度分析；

图4为UPLC-Q-TOF-MS/MS检测雷公藤不定根和不同培养悬浮细胞体系中的组合物总离子流色谱叠加图；

图5为UPLC-Q-TOFMS/MS检测雷公藤不定根和不同悬浮细胞培养体系中的总离子流共有模式色谱图；

图6为UPLC-Q-TOF-MS/MS检测雷公藤不定根和不同培养液培养体系中的组合物总离子流色谱叠加图；

图7为UPLC-Q-TOFMS/MS检测雷公藤不定根和不同培养液培养体系中的总离子流共有模式色谱图；

图8为UPLC-Q-TOF-MS/MS检测雷公藤不定根与四种培养体系中的悬浮细胞、培养液组合物的总离子流相似度分析图，其中左图为不定根与悬浮细胞的相似度分析图，图中符号含义如下：1:雷公藤次碱、2:雷公藤吉碱、3:雷公藤甲素、4:BDG不定根体系中组合物、5:6,7-V悬浮细胞体系中组合物、6:SWJ悬浮细胞体系中组合物7:SZ悬浮细胞体系中组合物、8:TP悬浮细胞体系中组合物；右图为培养液相似度分析图，图中符号含义如下：1:雷公藤次碱、2:雷公藤吉碱、3:雷公藤甲素、4:6,7-V培养液体系中组合物、5:BDG不定根体系中组合物、6:SWJ培养液中组合物、7:SZ培养液体系中组合物8:TP培养液中组合物；

图9为HPLC检测诱导前后不同培养体系组合物中雷公藤甲素、雷公藤次碱、雷公藤吉碱的含量变化，其中图A为HPLC检测诱导前后组合物产物的含量变化情况；图B为HPLC检测各组合物中jj:雷公藤吉碱、cj:雷公藤次碱、tp:雷公藤甲素的含量变化情况；图中符号含义如下：tp-xf:诱导后TP培养体系中的组合物、sz-xf:诱导后SZ培养体系中的组合物、swj-xf:诱导后SWJ培养体系中的组合物、6,7-V-xf:诱导后6,7-V培养体系中的组合物、tp-0-xf:TP培养体系中未诱导的组合物、sz-0-xf:SZ培养体系未诱导的组合物、swj-0-xf:SWJ培养体系中未诱导的组合物、bdg-0-bdg：诱导后bdg培养体系中的组合物。

具体实施方式

本发明提供了一种高活性雷公藤代谢产物的诱导方法，包括如下步骤：将雷公藤体外体系置于含有诱导子的培养基中培养；所述诱导子包括A：2，6-二甲基-β-环糊精，B∶酵母抽提物，C∶茉莉酸甲酯和D∶硝酸银中的任意三种或四种组合；所述培养基为雷公藤甲素优化培养基(TP)、生物碱优化培养基(SWJ)、生长素优化培养基(SZ)和不定根培养基(bdg)中的任意一种；所述TP包括如下成分：大量元素：NH₄NO₃ 825mg/L、KNO₃ 950mg/L、MgSO₄·7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 1360mg/L；肌醇：200mg/L；钙盐：CaCl₂·2H₂O 147mg/L；铁盐：FeSO₄·7H₂O 9.28mg/L、Na-EDTA·2H₂O 13.9mg/L；微量元素：MnSO₄·7H₂O 67.6mg/L、ZnSO₄·2H₂O 17.2mg/L、KI3.32mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.05mg/L；有机物：肌醇200mg/L、甘氨酸5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸0.5mg/L、生物素0.5mg/L；激素：NAA 5mg/L、6-BA 1.5mg/L、蔗糖40g/L；所述SWJ包括如下成分：大量元素：(NH₄)₂SO₄ 3960mg/L、KCl745mg/L、MgSO₄·7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 680mg/L；肌醇：200mg/L；钙盐：CaCl₂·2H₂O220mg/L；铁盐：包括硫酸铁FeSO₄·7H₂O 9.28mg/L、Na-EDTA·2H₂O 12.42mg/L；微量元素：MnSO₄·7H₂O 67.6mg/L、ZnSO₄·2H₂O 34.4mg/L、CoSO₄·7H₂O 0.05mg/L、CuSO₄·5H₂O0.05mg/L；有机物：肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、生物素1mg/L；激素：2,4-D 1mg/L、KT 0.5mg/L、蔗糖40g/L；所述SZ包括如下成分：大量元素NH₄NO₃ 1650mg/L、KNO₃ 1900mg/L、MgSO₄·7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 1360mg/L；肌醇：200mg/L；钙盐：CaCl₂·2H₂O 440mg/L；铁盐：包括FeSO₄·7H₂O 27.85mg/L、Na-EDTA·2H₂O37.25mg/L；微量元素：MnSO₄·7H₂O 33.8mg/L、ZnSO₄·2H₂O 8.6mg/L、H₂BO₃ 6.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 1mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L；有机物：肌醇100mg/L、甘氨酸5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L；激素：2,4-D 1mg/L、KT 0.5mg/L、蔗糖40g/L；所述bdg包括生长培养基和继代培养基，所述生长培养基包括如下成分：大量元素：NH₄NO₃7200mg/L、KNO₃ 9500mg/L、MgSO4·7H₂O 1850mg/L、KH₂PO₄ 6800mg/L，钙盐：CaCl₂·2H₂O1660mg/L，铁盐FeSO₄·7H₂O 1390mg/L，Na-EDTA·2H₂O 1865mg/L；微量元素H₂BO₃ 2500mg/L、MnSO₄·7H₂O 6250mg/L、ZnSO₄·2H₂O 250mg/L、CuSO₄·5H₂O 6.25mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O62.5mg/L，肌醇1250mg/L，有机物：甘氨酸500mg/L、盐酸硫胺素125mg/L、盐酸吡哆醇125mg/L、烟酸1250mg/L；激素：NAA640μL/L、2.4-D80μ/LL、蔗糖30/L，琼脂4.5g/L；所述继代培养基包括如下成分：大量元素KNO₃ 800mg/L、MgSO₄·7H₂O 7380mg/L、KH₂PO₄ 191mg/L、Na₂SO₄530mg/L；钙盐Ca(NO₃)₂2870mg/L，微量元素H₂BO₃ 357mg/L、MnSO₄·7H₂O 1650mg/L、ZnSO₄·2H₂O 680.4mg/L、KI 187.5mg/L；有机物：甘氨酸750mg/L、盐酸硫胺素25mg/L、盐酸吡哆醇25mg/L、烟酸125mg/L；激素：NAA 640μL/L、2.4-D 80μL/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L。

本发明对于上述诱导子各成分以及上述培养基各成分的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述诱导子A：2，6-二甲基-β-环糊精(DIMEB)的浓度优选为1mM-100mM，更优选为5mM-50mM，所述诱导子B∶酵母抽提物(YE)的浓度优选为1g/L-100g/L，更优选为5g/L-50g/L，所述诱导子C∶茉莉酸甲酯(MeJA)的浓度优选为1mM-100mM，更优选为5mM-50mM，所述诱导子D∶硝酸银(Ag)的浓度优选为0.01mg/L-1mg/L，更优选为0.04mg/L-0.5mg/L。在本发明中，上述各诱导子的具体制备方法优选为：YE：在酵母中加入无菌水和氯化钠，搅拌均匀后将溶液温度升温至55℃，保温30h并不断搅拌，然后，离心、分离即得用的酵母液，然后将其pH调节至5.8，121℃，15min灭菌，即制得酵母抽提物；MeJA：用95％乙醇溶解茉莉酸甲酯，配制成一定浓度溶液，过0.22μm滤膜除菌；Ag：AgNO₃加入无菌水，现用现配一定浓度溶液，过0.22μm滤膜除菌；DIMEB：取2,6-二甲基-β-环糊精加无菌水溶解后，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌既得。在本发明中，所述诱导子各成分之间的体积比优选为：A∶B∶C＝1-5∶1-5∶1-4、A∶B∶D＝1-5∶1-6∶1、A∶C∶D＝2-3∶1-5∶1、B∶C∶D＝1-3∶1-5∶1-4、A∶B∶C∶D＝1-4∶1-4∶1-4∶1，更优选为A∶B∶C∶D＝1∶2∶1∶1、A∶B∶C∶D＝1∶3∶2∶1、A∶B∶C∶D＝1∶4∶3∶1和A∶B∶C∶D＝2∶3∶4∶1。

在本发明中，所述雷公藤体外体系优选的包括雷公藤愈伤组织细胞和雷公藤植物体外诱导的不定根。本发明对于雷公藤愈伤组织细胞和雷公藤植物体外诱导的不定根的具体获得方法没有特殊限定，采用本领域常规获得雷公藤愈伤组织细胞和体外诱导不定根的方法均可。在本发明中，优选的先用上述培养基培养雷公藤愈伤组织细胞或雷公藤植物体外诱导的不定根一段时间，然后再添加诱导子。本发明对于在培养基中添加诱导子的间隔时间没有特殊限定，在具体实施例中为9天。在本发明中，优选的需调控反应体系的pH值，优选的需使整个培养期间pH值保持为5.6。在本发明中，当所述雷公藤体外体系为雷公藤愈伤组织细胞时，所述培养基优选的为雷公藤甲素优化培养基、生物碱优化培养基和生长素优化培养基中的任意一种；当所述雷公藤体外体系为雷公藤植物体外诱导的不定根时，所述培养基优选的为不定根培养基。

本发明还提供了一种制备雷公藤活性代谢组合物的方法，包括如下步骤：分离上述诱导方法所得的悬浮细胞和培养液；将培养液进行萃取干燥得萃取物；悬浮细胞用硅胶层析分离，用不同比例的石油醚和乙酸乙酯洗脱液进行梯度洗脱，洗脱液回收溶剂后，得残渣；将所述残渣和所述萃取物用色谱纯甲醇溶解，过滤除菌，即得。

本发明对于将上述诱导方法所得的悬浮细胞和培养液进行分离的方法没有特殊限定，采用本领域常规分离方法即可。在本发明中，所述分离的时间优选为待培养基中雷公藤代谢产物的含量达到指纹图谱的含量标准后，停止培养，进行分离。

在本发明中，所述对培养液进行萃取时，优选的用乙酸乙酯进行萃取，得萃取物。在本发明中，分离获得悬浮细胞后，优选的用乙酸乙酯进行索氏回流提取，回收溶剂，残渣蒸干后用甲醇溶解，重复萃取。在本发明中，用硅胶层析分离时，优选的先用石油醚淋洗液进行淋洗，然后再用不同比例的石油醚和乙酸乙酯洗脱液进行梯度洗脱，所述洗脱液中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为：9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10，更优选为8:2、7:3、6:4、5:5、4:6。收集上述不同洗脱梯度的洗脱液，回收溶剂，得残渣。将所述残渣和上述萃取物用色谱纯甲醇溶解，过滤除菌，即得。本发明对于过滤除菌的具体方式没有特殊限定，在本发明具体实施例中，采用0.22μm微孔滤膜进行过滤，即得雷公藤活性代谢组合物。

在本发明中，当所述雷公藤体外体系为雷公藤愈伤组织细胞时，根据上述制备方法制备所得的雷公藤活性代谢组合物优选的包括如表1所示的成分：

表1基于UPLC-MS/MS鉴定各种次生代谢产物

在本发明中，当所述雷公藤体外体系为雷公藤植物体外诱导的不定根时，根据上述制备方法制备所得的雷公藤活性代谢组合物优选的包括如下成分：雷公藤甲素、雷公藤甲素衍生物6、雷公藤甲素衍生物7、雷公藤甲素衍生物9、雷公藤甲素衍生物1、雷公藤甲素衍生物3、雷公藤甲素衍生物4、Catchin、雷酚萜、Triptobenzene B、isopimara-8(14),15-diene-11b,19-diol、雷酚内酯、triptobenzene Y、kaurane-16,19-20-triol、雷酚酮内酯、Tripohairic acid、雷酚萜甲醚、Triptonoterpenen methlether、3-oxo-14,15-dihudeoxy-abieta-8,11,13-trien-19-ol、triptobenzene H、雷酚新内酯、triptonoditerpenic acid、triptonodiol、14，15-二羟-8,13-环氧树脂-14-烯-19-酸酯、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、B-谷甾醇、Tingenone、雷公藤红素衍生物1、α-香树精、Sulphated conjugated triptolide、11α-羟基-β-香树精、雷公藤红素、Wilorlide B、齐墩果酸、methylkatonoate、Wilforic acid F、22β-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸、22α-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸甲酯、regelin C、原花青素B1、reserpine、槲皮素-3-O-新橙皮糖甘、wilforisinine B、wilforisinine A、dehydroxyaquayamycin B、celangulatinF、wilforisinine D、7b-triacetoxy-isobutyryloxy-8a-(3-furancarbonyloxy)-4a-hydroxy-1b-nicotinoxy-dihydroagaro furn、Evonine、Wilfornine E、Tripfordine A、Wilforsinine C、Euonymine、1-desacetylwilforgine、alatusinine、Wilfornine F、雷公藤次碱、Hyponine D、Wilfordinine I。

本发明还提供了一种利用上述方法制备所得的雷公藤活性代谢组合物，所述组合物优选为组合物1-组合物4中的任意一种，其中组合物1、组合物2、组合物3和组合物4的具体成分见发明内容部分，此处不再赘述。

本发明还提供了一种上述任意一项方法制备所得的组合物或上述组合物在制备抑制肿瘤耐药活性产品中的应用。本发明对于肿瘤的具体类型没有特殊限定，优选的包括肝癌、胃癌、白血病和肺癌，与雷公藤甲素相比，本发明组合物的抗癌作用显著增强。本发明对于所述产品的具体种类没有特殊限定，优选的包括药品。本发明对于所述药品的具体剂型没有特殊限定，本发明制得的雷公藤活性代谢组合物可以按中国药典2020版的标准制成各种制剂，包括栓剂、片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、微囊剂、滴丸剂、气雾剂、酒剂、糖浆剂、口服液、注射液或注射粉针剂。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

步骤1：以福建泰宁地区的野生两年雷公藤幼苗经室温二次栽培以后的新生根系为外植体，置于自来水下，流水冲洗3个小时，然后置于含有少量表面活性剂的蒸馏水中，于磁力搅拌器上低速搅拌2个小时。取出后，用蒸馏水冲洗2遍后，分别用5％次氯酸钠溶液，浸泡振荡8分钟。弃去次氯酸钠溶液，灭菌水冲洗一遍后，再用75％乙醇，振荡20秒。弃去75％乙醇后，用灭菌水冲洗3遍，取出外植体放置于无菌吸水纸上，充分洗去外植体表面水分，即获得无菌外植体；

将无菌外植体的幼根切成小段，放置在培养室进行愈伤组织的诱导，培养基为激素改良MS培养基(硝酸钾1900mg/L；硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L；硫酸镁MgSO₄·7H₂O 370mg/L；氯化钙CaCl₂·2H₂O 440mg/L；碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；硫酸锰MnSO₄·4H₂O₂ 2.3mg/L；硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L，硫酸铜CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L；氯化钴CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L；乙二胺四乙酸二钠Na₂·EDTA37.3mg/L；硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L；肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素2mg/L，VB₁ 0.1mg/L，盐酸吡哆醇VB₆ 0.5mg/L，烟酸VB₅或VPP0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂8g/L；生长素：2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.6mg/L，萘乙酸(NAA)0.6mg/L；细胞分裂素：6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.9mg/L；激动素：6-糖基氨基嘌呤(KT)2.4mg/L；溶液的pH为6.3-6.8)，将上述各组分充分溶解后，按照比例，溶解于1L的超纯水中，加入蔗糖40g，琼脂4.5g，搅拌均匀，调pH＝5.8，116℃高压灭菌30min，即得MS培养基。培养温度为25±1℃，保持每天10小时的光照，光照强度为1500lx-2500lx，18-25天形成愈伤组织。

将上述愈伤组织作为初始材料，每20天继代一次，经过10-20代继代，即可获得质地疏松、生长旺盛、浅黄色的成熟愈伤组织；其中，继代培养基为：穆拉希吉克(Murashige，T.)和斯科克(Skoog，F.)培养基、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.8mg/L、NAA(萘乙酸)1.2mg/L、KT(6-糖基氨基嘌呤)2.4mg/L、蔗糖45g/L、琼脂4.5g/L。

步骤2：将成熟质地疏松的愈伤组织投入6，7-V培养基中，接种量为5g，置于转速为120r/min摇床上，振荡培养18天，18天继代一次，连续，继代5-8代，即得雷公藤悬浮细胞液；

所述6，7-V培养基包括下述各成分：大量元素，氯化钾200mg/L，硝酸钾800mg/L，硫酸铵100mg/L，硫酸镁MgSO₄·7H₂O 250mg/L；磷酸二氢纳150mg/L，磷酸氢二钠20mg/L，氯化钙200mg/L；微量元素：硫酸锰MnSO₄·4H₂O 4mg/L，硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 1.5mg/L，碘化钾KI0.055mg/L，硼酸H₃BO₃ 5mg/L；氯化钴CoCl₂·6H₂O 0.25mg/L，钼酸钠Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg/L；铁盐(母液III)：FeSO4·7H₂O 27.85mg/L，乙二胺四乙酸二钠盐Na₂-EDTA·2H₂O37.25mg/L；有机成分：肌醇100mg/L，烟酸1.5mg/L；盐酸硫胺素(维生素B1)0.5mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L，将上述各组分充分溶解后，按照比例，溶解于1L的超纯水中，加入蔗糖40g，搅拌均匀，调pH＝5.8，121℃高压灭菌20min，即得6，7-V培养基。

步骤3：取30g3代悬浮细胞，加入含有300mLTP优化培养基的500mL的三角瓶中，置于120r/min的摇床振荡培养，在培养的第9天，按照A(DIMEB，100mM)∶B(YE，100g/L)∶C(MeJA，100mM)∶D(Ag⁺，1mg/L)＝1∶2∶1∶1加入四联诱导子，在25℃、振荡速度为120r/min的摇瓶振荡培养9天；此后每隔3天检测反应体系的pH值使pH保持在5.6，期间检测代谢产物的含量变化，待其含量达到指纹图谱的含量标准后，停止震荡培养，真空抽滤方法分离悬浮细胞和培养液。

所述TP优化培养基包括下述各成分：大量元素：NH₄NO₃825mg/L、KNO₃ 950mg/L、MgSO₄·7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 1360mg/L；肌醇：200mg/L；钙盐：CaCl₂·2H₂O 147mg/L；铁盐：FeSO₄·7H₂O 9.28mg/L、Na-EDTA·2H₂O 13.9mg/L；微量元素：MnSO₄·7H₂O 67.6mg/L、ZnSO₄·2H₂O 17.2mg/L、KI 3.32mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.05mg/L；有机物：肌醇200mg/L、甘氨酸5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸0.5mg/L、生物素0.5mg/L；激素：NAA5mg/L、6-BA 1.5mg/L；将上述各组分充分溶解后，按照比例，溶解于1L的超纯水中，加入蔗糖40g，搅拌均匀，调pH＝5.8，121℃高压灭菌20min，即得TP优化培养基。

所述诱导子的制备方法如下：

YE：在酵母中加入无菌水和氯化钠，搅拌均匀后将溶液温度升温至55℃，保温30h并不断搅拌，然后，离心、分离即得用的酵母液，然后将其pH调节至5.8，121℃，15min灭菌；即制得酵母抽提物。

MeJA：用95％乙醇溶解茉莉酸甲酯，配制成一定浓度溶液，过0.22μm滤膜除菌；

Ag溶液：AgNO₃加入无菌水，现用现配一定浓度溶液，过0.22μm滤膜除菌；

DIMEB：取2,6-二甲基-β-环糊精加无菌水溶解后，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌既得。

步骤4：将经过步骤3处理所得的培养液，用1/2体积的乙酸乙酯对培养液进行萃取，乳化层拌入适当的硅胶搅拌至干燥，用乙酸乙酯进行索氏回流提取，将提取液与萃取液合并，用旋转蒸发仪将洗脱液蒸干，加3ml色谱纯甲醇溶解，过0.22μm微孔滤膜，即得雷公藤活性代谢组合物a；

将经过步骤3处理所得的悬浮细胞烘干后，用乙酸乙酯的进行索氏回流提取后回收溶剂，残渣蒸干后用甲醇溶解，上清液与等体积石油醚充分混合，于分液漏斗中静置至分层，弃去石油醚层，再用相对于所述上清液1/2体积的乙酸乙酯萃取3次，将适量上述甲醇溶解液和硅胶粉末混合拌样，上样，硅胶填料量为20g。先用200mL石油醚淋洗液淋洗，弃去淋洗液。然后依次用200mL的不同比例的石油醚：乙酸乙酯洗脱液(8:2、7:3、6:4、5:5、4:6)进行洗脱，收集5个馏分洗脱液。使用旋转蒸发仪，回收溶剂，残渣蒸干后加适量的色谱纯甲醇溶解配成100ug/mL的溶液，过0.22μm微孔滤膜，过0.22μm微孔滤膜，即得雷公藤活性代谢组合物b，将雷公藤活性代谢组合物a和b合并，即得雷公藤活性代谢组合物；

步骤5：将所得到的组合物按以下方法进行HPLC检测：

HPLC条件为：色谱柱Hypersil ODS2-C18 250mm、吸收波长：210nm、流动相：乙腈：水梯度洗脱(洗脱条件见表2)、流速：0.5-1.0ml/min、进样量：20μL。

表2 HPLC梯度洗脱条件

采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对诱导前后提取液的化学成分进行分析，色谱柱为Acqμity

BEH C18，1.7μm、柱温：25℃、流动相：乙腈：水梯度洗脱(洗脱条件见表3)、流速：0.25ml/min、进样量：10μl。

表3流动相梯度洗脱条件

色谱分析的数据由安捷伦液相工作站分析，UPLC-Q-MS/MS的数据由Analyst软件处理分析。最终所得雷公藤代谢活性组合物为：雷公藤甲素、雷公藤内酯A、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、Tripterinin、雷酚内酯、Triptery giumine C、雷公藤乙素、雷公藤红素、雷酚内酯、Tripterygiumine E、去甲基泽拉木醛、Hypoglicin D、南蛇碱、Triptregeline F、雷酚萜、雷公藤内酯B、雷公藤酯甲、Triptergulide F、Triptersinine Z3、雷公藤吉碱、Triptersinine A、Triptersinine T、雷公藤甲素衍生物3、Triptobenzene B、南蛇藤糠酰胺碱、南蛇藤糠酰胺碱、Triptergulide A、Wilfordiol A、苯代南蛇碱、B-谷甾醇、雷公藤内酯甲、雷公藤酮、雷酚新内酯苷、原花青素B1、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷B、、Wilforsinine C、1－去乙酰基雷公藤定碱、雷公藤康碱、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、Wilfornine H和雷公藤素。

实施例2

与实施例1的区别在于步骤3中，优化培养基为SWJ，生物诱导子为A(50mM)∶B(50g/L)∶C(50mM)∶D(0.5mg/L)＝1∶3∶2∶1，其余均同实施例1。所述SWJ包括下述各成分：((NH₄)₂SO₄ 3960mg/L、KCl 745mg/L、MgSO₄·7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 680mg/L；肌醇：200mg/L；钙盐：CaCl₂·2H₂O 220mg/L；铁盐：包括硫酸铁FeSO₄·7H₂O 9.28mg/L和Na-EDTA·2H₂O12.42mg/L；微量元素：MnSO₄·7H₂O 67.6mg/L、ZnSO₄·2H₂O 34.4mg/L、硫酸钴(CoSO₄·7H₂O)0.05mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.05mg/L；有机物：肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、生物素1mg/L；激素：2,4-D 1mg/L、KT 0.5mg/L，将上述各组分充分溶解后，按照比例，溶解于1L的超纯水中，加入蔗糖40g，搅拌均匀，调pH＝6.4，121℃高压灭菌20min，即得生物碱筛选培养基。

最终所得雷公藤代谢活性组合物为：Wilforsinine C、去甲基泽拉木醛、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol、雷公藤内酯A、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、雷公藤红素、Triptersinine Z3、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、Tripterygiumine、雷公藤内酯B、雷公藤酯甲、Triptergulide F、Triptobenzene B、雷公藤甲素、Triptersinine T、雷酚萜、南蛇藤糠酰胺碱、南蛇藤糠酰胺碱、Triptergulide A、Wilfordiol A苯代南蛇碱、B-谷甾醇、雷公藤内酯甲、雷公藤酮、雷酚新内酯苷、原花青素B1、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷B、、Wilforsinine C、1－去乙酰基雷公藤定碱、雷公藤康碱、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、Wilfornine H和雷公藤素。

实施例3

与实施例1的区别在于步骤3中，优化培养基为SZ，生物诱导子为A(1mM)∶B(1g/L)∶C(1mM)∶D(0.01mg/L)＝1∶4∶3∶1，其余均同实施例1。所述SZ包括下述各成分：大量元素NH₄NO₃ 1650mg/L、KNO₃ 1900mg/L、MgSO₄·7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 1360mg/L；肌醇：200mg/L；钙盐：CaCl₂·2H₂O 440mg/L；铁盐：包括FeSO₄·7H₂O 27.85mg/L、Na-EDTA·2H₂O37.25mg/L；微量元素：MnSO₄·7H₂O 33.8mg/L、ZnSO₄·2H₂O 8.6mg/L、H₂BO₃ 6.2mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 1mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L；有机物：肌醇100mg/L、甘氨酸5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L；激素：2,4-D1mg/L、KT0.5mg/L，将上述各组分充分溶解后，按照比例，溶解于1L的超纯水中，加入蔗糖40g，搅拌均匀，调pH＝5.8，121℃高压灭菌20min，即得生长筛选培养基。

最终所得雷公藤代谢活性组合物为：雷公藤乙素、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol、Triptergulide B、Celacinnine、3S,4S,5R,10S)-3,19-dihydroxy-7-oxoabieta-8,11,13-triene、去甲基泽拉木醛、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、Triptergulide A、雷公藤红素、3-oxo-olean-9(11),12-diene、雷公藤次碱、Tripterygiumine E、Tripterygiumine C、Triptersinine Z3、雷公藤酯甲、雷公藤甲素、雷酚萜、Triptersinine T、riptergulide F、雷公藤吉碱、Triptobenzene B，南蛇藤糠酰胺碱、南蛇藤糠酰胺碱、Triptergulide A、Wilfordiol A、苯代南蛇碱、B-谷甾醇、雷公藤内酯甲、雷公藤酮、雷酚新内酯苷、原花青素B1、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷B、WilforsinineC、1－去乙酰基雷公藤定碱、雷公藤康碱、、雷公藤吉碱、Wilfornine H和雷公藤甲素。

实施例4

选取雷公藤嫩叶或者幼茎，分别用75％的酒精冲洗30s，无菌水清洗3次后，再用0.1％的HgCl₂浸泡8min后，无菌水清洗3遍，切成0.5×0.5cm左右的方块，接种于含有40mL的接种于pH值为5.8生长培养基中，28天后出现白色的根须状组织，进行继代培养不定根。每25天传代一次。培养9天后加入诱导子，此后每隔3天检测反应体系的pH值使pH保持在5.6，期间检测代谢产物的含量变化，待其含量达到指纹图谱的含量标准后，停止培养，真空抽滤方法分离悬浮细胞和培养液。

所述bdg包括生长培养基和继代培养基，所述的生长培养基为：大量元素NH₄NO₃7200mg、KNO₃ 9500mg、MgSO4·7H₂O 1850mg、KH₂PO₄ 6800mg，钙盐CaCl₂·2H₂O1660mg，铁盐FeSO₄·7H₂O1390mg，Na-EDTA·2H₂O 1865mg，微量元素H₂BO₃ 2500mg、MnSO₄·7H₂O6250mg、ZnSO₄·2H₂O 250mg、CuSO₄·5H₂O 6.25mg、Na₂MoO₄·2H₂O 62.5mg，肌醇1250mg，有机物(甘氨酸500mg、盐酸硫胺素125mg、盐酸吡哆醇125mg、烟酸1250mg)分别配置大量、微量、有机物和激素，各组分充分溶解后，按照比例，溶解于1L的超纯水中，NAA 640μL、2.4-D80μL和蔗糖30g，琼脂4.5g，搅拌均匀后调pH为5.6，定容至1L，116℃高压灭菌30min；等培养基冷却后加入生物素100μL即得。

所述继代培养基：大量元素KNO₃ 800mg、MgSO₄·7H₂O 7380mg、KH₂PO₄ 191mg、Na₂SO₄530mg；钙盐Ca(NO₃)₂2870mg，微量元素H₂BO₃357mg、MnSO₄·7H₂O1650mg、ZnSO₄·2H₂O680.4mg、KI 187.5mg；有机物甘氨酸750mg、盐酸硫胺素25mg、盐酸吡哆醇25mg、烟酸125mg；、NAA 640μL、2.4-D 80μL、蔗糖30g和琼脂4.5g，搅拌均匀后调pH为5.6，定容至1L，116℃高压灭菌30min。等培养基冷却后加入柠檬酸100μL。

生物诱导子为A(5mM)∶B(5g/L)∶C(100mM)∶D(0.04mg/L)＝2∶3∶4∶1。后续步骤同实施例1的步骤4和步骤5。

最终所得雷公藤代谢活性组合物为：雷公藤甲素、雷公藤甲素衍生物6、雷公藤甲素衍生物7、雷公藤甲素衍生物9、雷公藤甲素衍生物1、雷公藤甲素衍生物3、雷公藤甲素衍生物4、Catchin、雷酚萜、Triptobenzene B、isopimara-8(14),15-diene-11b,19-diol、雷酚内酯、triptobenzene Y、kaurane-16,19-20-triol、雷酚酮内酯、Tripohairic acid、雷酚萜甲醚、Triptonoterpenen methlether、3-oxo-14,15-dihudeoxy-abieta-8,11,13-trien-19-ol、triptobenzene H、雷酚新内酯、triptonoditerpenic acid、triptonodiol、14，15-二羟-8,13-环氧树脂-14-烯-19-酸酯、雷公藤内酯酮、B-谷甾醇、Tingenone、雷公藤红素衍生物1、α-香树精、Sulphated conjugated triptolide、11α-羟基-β-香树精、雷公藤红素、Wilorlide B、齐墩果酸、methylkatonoate、Wilforic acid F、22β-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸、22α-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸甲酯、regelin C、原花青素B1、reserpine、槲皮素-3-O-新橙皮糖甘、wilforisinine B、wilforisinine A、dehydroxyaquayamycin B、celangulatin F、wilforisinine D、7b-triacetoxy-isobutyryloxy-8a-(3-furancarbonyloxy)-4a-hydroxy-1b-nicotinoxy-dihydroagarofurn、Evonine、Wilfornine E、Tripfordine A、Wilforsinine C、Euonymine、1-desacetylwilforgine、alatusinine、Wilfornine F、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、HyponineD、Wilfordinine I。

实施例5

分别重复实施例1-实施例3的试验，设定步骤3中诱导子诱导的天数以及步骤4中石油醚和乙酸乙酯洗脱液的比例为变量，基于HPLC联合UPLC-MS/MS分析对不同体系组合物成分进行分析(分析方法同实施例1步骤5)，试验组别见表4，表4中样品名称tp 4-6 0d代表的是实施例1中雷公藤甲素优化培养基(TP)添加诱导子诱导0天，石油醚：乙酸乙酯为4：6的洗脱液洗脱所得的组合物，以此类推。

表4试验组别信息

上述各组合物指纹图谱分析如下；

将雷公藤甲素、生物碱、生长素优化培养基诱导体系所得的组合物产物UPLC-MS/MS谱图导入ChemPattern软件进行相关参数分析，建立各种不同体系的UPLC-MS/MS指纹图谱。结果如图1和图2所示。由图1可以看出，本发明各种组合物不论从含量和种类方面都有很大的变化。由图2可以看出，本发明体系中存在823个共有峰，表明本发明组合物成分从在先发明CN 103159822 B的雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱、雷公藤定碱和羟基雷公藤甲素7种成分增加到122种，有了实质性的进步。

上述各组合物相似度分析：

通过Chempattern软件夹角余弦计算法分析，结果如图3所示。其结果表明1号和4号的相似度最为接近，其相似度达到0.6上，与共有模式相似度较高，而其他样品相似度较低，在0值附近，说明本发明不同培养体系组合物相似性差异大，活性成分的种类和含量都存在显著的差异。组合物成分从在先发明CN 103159822 B的雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱、雷公藤定碱和羟基雷公藤甲素7种成分增加到122种，有了实质性的进步。

上述各组合物成分鉴定分析如下；

通过Chempattern软件，进行活性化合物质谱信息提取，并通过文献对比和图谱解析，发现本发明组合物有122种活性成分组成，结果如表1所示，据此说明本发明组合物成分从在先发明CN 103159822 B的雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱、雷公藤定碱和羟基雷公藤甲素7种成分增加到122种，有了实质性的进步。

实施例6

分别收集实施例1-4步骤3所得的悬浮细胞组合物以及实施例1步骤2的雷公藤悬浮细胞液，基于HPLC联合UPLC-MS/MS分析对不同体系组合物成分进行分析(分析方法同实施例1步骤5)，试验组别见表5，其中雷公藤次碱对照品、雷公藤吉碱对照品和雷公藤甲素对照品均购自于中国药品生物制品检定所。

表5雷公藤不定根与四种不同培养基中的悬浮细胞组合物样品编号及对应样品信息

将所得的组合物产物UPLC-MS/MS谱图导入ChemPattern软件进行相关参数分析，建立各种不同体系的UPLC-MS/MS指纹图谱。结果如图4和图5所示。由图4和图5可以看出，本发明组合物中存在633共有峰，采用本发明方法所得组合物成分从在先发明CN 103159822B的雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱、雷公藤定碱和羟基雷公藤甲素7种成分增加到260种，有了实质性的进步。

实施例7

分别收集实施例1-4步骤3中最终所得的培养液以及实施例1步骤2的雷公藤培养液，基于HPLC联合UPLC-MS/MS分析对不同体系组合物成分进行分析(分析方法同实施例1步骤5)，试验组别见表6。

表6不同培养液样品组合物编号及对应样品信息

将所得的组合物产物UPLC-MS/MS谱图导入ChemPattern软件进行相关参数分析，建立各种不同体系的UPLC-MS/MS指纹图谱。结果如图6和图7所示。

将实施例6和实施例7的各组合物进行相似度分析：

通过Chempattern软件夹角余弦计算法分析，结果如图8所示。由图8可以看出，不定根和悬浮细胞样品以及相应的培养液样品中与雷公藤次碱、雷公藤吉碱、雷公藤甲素的共有模式相似度低，活性成分的种类和含量都存在显著的差异。组合物成分从原发明的雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤次碱、雷公藤定碱和羟基雷公藤甲素7种成分增加到185种，有了实质性的进步。

实施例8

分别重复实施例1-4，以不添加相应诱导子为对照组，HPLC检测诱导前、后不同培养体系组合物以及组合物中雷公藤甲素、雷公藤次碱、雷公藤吉碱的含量变化，HPLC试验方法同实施例1步骤5。结果如图9所示。

由图9可以看出，本发明方法可以显著提升三种高附加值成分雷公藤甲素、雷公藤吉碱和雷公藤次碱的含量。在TP培养体系中，雷公藤甲素含量提升为10.34mg/L，雷公藤次碱含量为29.78mg/L，雷公藤吉碱的含量为3.61mg/L；在SWJ体系中雷公藤甲素含量为8.16mg/L，雷公藤次碱含量为51.58mg/L和雷公藤吉碱的含量为46.56mg/L；而在SZ体系中为雷公藤甲素含量为7.04mg/L，雷公藤次碱含量为19.68mg/L和雷公藤吉碱的含量为8.34mg/L。本发明bdg培养体系雷公藤甲素含量为24.93mg/L，雷公藤次碱含量为16.36mg/L和雷公藤吉碱的含量为30.27mg/L。

实施例9

与实施例1的区别仅在于诱导子为A(5mM)∶B(5g/L)∶C(100mM)∶D(0.04mg/L)＝1∶2∶1∶1，其余均同实施例1。结果所得雷公藤代谢活性组合物为：雷公藤甲素、雷公藤内酯A、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol>(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、Tripterinin、雷酚内酯、Tripterygiumine C、雷公藤乙素、雷公藤红素、雷酚内酯、Tripterygiu mineE、去甲基泽拉木醛、Hypoglicin D、南蛇碱、Triptregeline F、雷酚萜、雷公藤内酯B、雷公藤酯甲、Triptergulide F、Triptersinine Z3、雷公藤吉碱、Triptersinine A、Triptersinine T、雷公藤甲素衍生物3和Triptobenzene B。

实施例10

与实施例2的区别仅在于诱导子为按照A(5mM)∶B(5g/L)∶C(100mM)∶D(0.04mg/L)＝1∶3∶2∶1，其余均同实施例2。结果所得雷公藤代谢活性组合物为：Wilforsinine C、去甲基泽拉木醛、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol、雷公藤内酯A、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、雷公藤红素、Triptersinine Z3、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、Tripterygiumine、雷公藤内酯B、雷公藤酯甲、Triptergulide F、Triptobenzene B、雷公藤甲素、Triptersinine T和雷酚萜。

实施例11

与实施例3的区别仅在于诱导子为按照A(5mM)∶B(5g/L)∶C(100mM)∶D(0.04mg/L)＝1∶2∶1∶1，其余均同实施例3。结果所得雷公藤代谢活性组合物为：雷公藤乙素、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol、Triptergulide B、Celacinnine、3S,4S,5R,10S)-3,19-dihydroxy-7-oxoabieta-8,11,13-triene、去甲基泽拉木醛、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、Triptergulide A、雷公藤红素、3-oxo-olean-9(11),12-diene、雷公藤次碱、Tripterygiumine E、Tripterygiumine C、Triptersinine Z3、雷公藤酯甲、雷公藤甲素、雷酚萜、Triptersinine T、Triptergulide F、雷公藤吉碱和Triptobenzene B。

实施例12

雷公藤代谢活性组合物抑制肺癌顺铂耐药细胞增殖药物效应

三株顺铂耐药细胞A549/DDP、H1299/DDP和H460/DDP，分别取对数生长期的细胞以5×10⁴个/mL的密度种于96孔板中。分别向每孔加入体积为10ul的药物(药物分别为实施例9、10、11和实施例4所得的雷公藤代谢活性组合物)，使终浓度为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml。培养72h后分别向每孔加入10μl的MTT溶液，孵育4h后将每孔的培养基吸出，加入为100μl的DMSO，放置于酶标仪内震荡5min，使得结晶溶解。在放入酶标仪检测，设置检测波长为OD＝490nm和参比波长OD＝630nm测量每孔的吸光值。计算相对细胞存活率或抑制率公式如下：

相对细胞存活率(％)＝((药物实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值))×100％

相对细胞抑制率(％)＝(1-相对细胞存活率)×100％

结果如表7所示(以雷公藤甲素为对照组)。

表7不同实施例雷公藤代谢活性组合物抑制肺癌顺铂耐药细胞增殖的抑制率

**表示与对照组相比，具有非常显著性差异，P<0.01；**表示与对照组相比，具有显著性差异，P<0.05

本发明生物碱和生长培养体系的组合物的药物效应，与对照雷公藤甲素组相近，而不定根体系培养组合物效果最好，72小时的IC₅₀达到2.563nM，而对于TP，72小时的IC₅₀则为11.975nM，其抑制效应提升了4.67倍，而甲素培养组合物72小时的IC₅₀达到5.089nM，而对于TP，其抑制效应提升了2.35倍，表明本发明雷公藤代谢活性组合物抑制肿瘤耐药细胞增殖的药物效应，要强于雷公藤甲素。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种高活性雷公藤代谢产物的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：将雷公藤体外体系置于含有诱导子的培养基中培养；

所述诱导子为A：2，6-二甲基-β-环糊精，B∶酵母抽提物，C∶茉莉酸甲酯和 D∶硝酸银四种组合；

所述诱导子各成分的浓度为：A：1mM-100mM，B：1g/L-100g/L，C：1mM-100mM，D：0.01mg/L-1mg/L，A∶B∶C∶D=1-4∶1-4∶1-4∶1；

所述雷公藤甲素优化培养基包括如下成分：大量元素：NH₄NO₃ 825mg/L、KNO₃ 950mg/L、MgSO₄•7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 1360mg/L；肌醇：200 mg/L；钙盐：CaCl₂•2H₂O 147mg/L；铁盐：FeSO₄•7H₂O 9.28mg/L、Na-EDTA•2H₂O 13.9mg/L；微量元素：MnSO₄•7H₂O 67.6mg/L、ZnSO₄•2H₂O 17.2mg/L、KI 3.32mg/L、CuSO₄•5H₂O 0.05mg/L；有机物：肌醇200mg/L、甘氨酸5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸0.5mg/L、生物素0.5mg/L；激素：NAA 5mg/L、6-BA1.5mg/L、蔗糖40g/L；

所述生物碱优化培养基包括如下成分：大量元素：(NH₄)₂SO₄ 3960mg/L、KCl 745mg/L、MgSO₄•7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 680mg/L；肌醇：200 mg/L；钙盐：CaCl₂•2H₂O 220mg/L；铁盐：包括硫酸铁FeSO₄•7H₂O 9.28mg/L、Na-EDTA•2H₂O 12.42mg/L；微量元素：MnSO₄•7H₂O67.6mg/L、ZnSO₄•2H₂O 34.4mg/L、CoSO₄•7H₂O 0.05mg/L、CuSO₄•5H₂O 0.05mg/L；有机物：肌醇100mg/L、甘氨酸1mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、生物素1mg/L；激素：2,4-D1mg/L、KT 0.5mg/L、蔗糖40g/L；

所述生长素优化培养基包括如下成分：大量元素NH₄NO₃ 1650mg/L、KNO₃ 1900mg/L、MgSO₄•7H₂O 1233mg/L、KH₂PO₄ 1360mg/L；肌醇：200 mg/L；钙盐：CaCl₂•2H₂O 440mg/L；铁盐：包括FeSO₄•7H₂O 27.85mg/L、Na-EDTA•2H₂O 37.25mg/L；微量元素：MnSO₄•7H₂O 33.8mg/L、ZnSO₄•2H₂O 8.6mg/L、H₂BO₃ 6.2mg/L、Na₂MoO₄•2H₂O 1mg/L、CuSO₄•5H₂O 0.0 25mg/L；有机物：肌醇 100mg/L、甘氨酸5mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、烟酸1mg/L；激素：2,4-D 1mg/L、KT 0.5mg/L、蔗糖40g/L；

所述不定根培养基包括生长培养基和继代培养基，所述生长培养基包括如下成分：大量元素：NH₄NO₃7200mg/L、KNO₃9500mg/L、MgSO4·7H₂O 1850mg/L、KH₂PO₄ 6800mg/L，钙盐：CaCl₂·2H₂O 1660mg/L，铁盐FeSO₄·7H₂O1390mg/L，Na-EDTA·2H₂O 1865mg/L；微量元素H₂BO₃ 2500mg/L、MnSO₄·7H₂O 6250mg/L、ZnSO₄·2H₂O 250mg/L、CuSO₄·5H₂O 6.25mg/L、Na₂MoO₄·2H₂O 62.5mg/L，肌醇1250mg/L，有机物：甘氨酸500mg/L、盐酸硫胺素125mg/L、盐酸吡哆醇125mg/L、烟酸1250mg/L；激素：NAA 640μL/L、2.4-D 80μL/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L；

所述继代培养基包括如下成分：大量元素KNO₃ 800mg/L、MgSO₄•7H₂O 7380mg/L、KH₂PO₄191mg/L、Na₂SO₄530mg/L；钙盐Ca（NO₃）₂2870mg/L，微量元素H₂BO₃357mg/L、MnSO₄•7H₂O1650mg/L、ZnSO₄•2H₂O 680.4mg/L、KI 187.5mg/L；有机物：甘氨酸750mg/L、盐酸硫胺素25mg/L、盐酸吡哆醇25mg/L、烟酸125mg/L；激素：NAA 640μL/L、2.4-D 80μL/L、蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L；

所述培养期间使pH值保持为5.6；

所述雷公藤体外体系包括雷公藤愈伤组织细胞和雷公藤植物体外诱导的不定根；

当所述雷公藤体外体系为雷公藤愈伤组织细胞时，所述培养基为雷公藤甲素优化培养基、生物碱优化培养基和生长素优化培养基中的任意一种；当所述雷公藤体外体系为雷公藤植物体外诱导的不定根时，所述培养基为不定根培养基。

2.一种制备雷公藤活性代谢组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

分离权利要求1所述诱导方法所得的悬浮细胞和培养液；

将培养液进行萃取干燥得萃取物；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述洗脱液中石油醚和乙酸乙酯的体积比包括：9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当雷公藤体外体系为雷公藤愈伤组织细胞时，所述组合物包括Pubinernoid A 、5-hydroxymethylmellein 、3,9-dihydroxymegastigman-5-ene、(+) -dehydro vomi foliol、(3S,5R,8R)-3,5-dihydroxymegastigma -6,7-dien-9-one、(3S, 5R, 6S, 7E) -3,5,6trihydroxy-7-megastig men-9 -one、4(15)-eudesmen-1 β,7,11-triol、雷公藤甲素衍生物4、Catchin、Hypoglicin E、Hypoglicin F、Triptobenzene R、雷酚萜、Triptobenzene B、isopimara-8（14），15-diene-11b，19-dio、Hypoglicin H、14-oxo-19 -(4→3)-abeo-abieta-3,8,12-triene-19,18-olide、(3S,4S,5R,10S)-3,19-dihy droxy-7-oxoabieta-8,11,13-triene、Neotripterifordin、Tripterlide A、Tripterlide D、3-oxo-1 4,15-dihydroxyabiet a-8,1 1,1 3-t rien-19-ol、Tripterinin、Triptonoditerpenic acid、Triptonoditerpenicacid、Hypoglicin D、Tricosanoic acid、Tricosanoic acid、14，15-二羟-8，13-环氧树脂-14-烯-19-酸酯、雷公藤甲素、南蛇藤糠酰胺碱、南蛇藤糠酰胺碱、2α-hydroxytriptonide、雷公藤乙素、Triptergulide A、Wilfordiol A、苯代南蛇碱、Triptergulide B、Triptergulide J、Celacinnine、南蛇藤肉桂酰胺碱、Triptergulide F、B-谷甾醇、B-谷甾醇、(+)-lyoniresinol、3-oxo-olean-9 (11),12-diene、Icariol A2e、Tripteryol B、Canophyllal、11a-羟基-β-香树精、2S, 2′S-aurantiamideacetate、雷公藤红素、Wilforlide B、雷公藤内酯甲、Dulcioic acid、Triptotin H、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、Triregelolide A、2α，3β，-dihydroxy -olean-12-ene-22，29-la ct one、Tripterygic acid A、Demethy lzey lasteral、雷公藤酮、Cangoronine、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-5-methoxy-lariciresinol、Leptolepisol C、2α,3α,23-trih ydro xyu rs -12,20(30)-dien-28-oicacid、雷酚新内酯苷、Triptregelol A、4,4'-dime thoxy-3'-hy droxy-7, 9':7',9-die po xylignan-3-O-β-D-glucopyranoside、(-)-isolariciresinol 2α-O-β -D-glucopyranoside、Triptersinine Z3、TriptersinineT、Triptregeline C、原花青素B1、Triptersinine Z1、Triptersinine Y、Triptregelol B、Triptregeline I、Wilforsinine F、bis-8,8’-catechinylmethane、Triptersinine A、Tripterygiumine H、Triptregeline G、reserpine、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷、Triptregeline F、Triptregeline F、Triptregeline v、Triptersinine Z4、Triptersinine Z4、Triptersinine L、Triptersinine K、Triptersinine C、Triptersinine F、Montahomobisflflavan B、Triptregeline B、Triptregeline J、dehydroxy aguay amycin B、TriptregelineE、Triptregeline A、Macroregeline D、Triptersinine E、Triptersinine P、Tripterygiumine T、Triptersinine P、Triptersinine H、Tripterygiumine Q、Tripterygiumine P、Tripterygiumine U、Tripterygiumine J、Tripfordine A、Wilforsinine C、翅卫矛辛宁、Hypoglaunune E 、Peritassine A 、1－去乙酰基雷公藤定碱、雷公藤康碱、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、9'-hydro xy -2-nico tinoylwilforin、Wilfornine HTriptery giumine F、Tripterygiumine E、Tripterygiumine G、Tripterygiumine C、雷公藤素A、Triptonine A和雷公藤素B。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当雷公藤体外体系为雷公藤植物体外诱导的不定根时，所述组合物包括雷公藤甲素、雷公藤甲素衍生物6、雷公藤甲素衍生物7、雷公藤甲素衍生物9 、雷公藤甲素衍生物1、雷公藤甲素衍生物3、雷公藤甲素衍生物4、Catchin、雷酚萜、Triptobenzene B、isopimara-8(14),15-diene-11b,19-diol、雷酚内酯、triptobenzene Y、kaurane-16,19 -20-triol、雷酚酮内酯、Tripohairic acid、雷酚萜甲醚、Triptonoterpenen methlether、3-oxo-14,15-dihudeoxy-abieta-8,11,13 -trien-19-ol、triptobenzene H、雷酚新内酯、triptonoditerpenic acid、triptonodiol、14，15-二羟-8,13-环氧树脂-14-烯-19-酸酯、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、B-谷甾醇、Tingenone、雷公藤红素衍生物1、α-香树精、Sulphated conjugated triptolide、11α-羟基-β-香树精、雷公藤红素、Wilorlide B、齐墩果酸、methylkatonoate、Wilforic acid F、22β-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸、22α-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸甲酯、regelin C、原花青素B1、reserpine、槲皮素-3-O-新橙皮糖甘、wilforisinine B、wilforisinine A、dehydroxyaquayamycin B、celangulatin F、wilforisinine D、7b-triacetoxy-isobutyryloxy-8a-(3-furancarbonyloxy)-4a-hydroxy-1b-nicotinoxy-dihydroagarofurn、Evonine、Wilfornine E、Tripfordine A、Wilforsinine C 、Euonymine、1-desacetylwilforgine、alatusinine、Wilfornine F、雷公藤次碱、HyponineD、Wilfordinine I。

6.一种利用权利要求2-5任意一项所述方法制备所得的雷公藤活性代谢组合物，其特征在于，所述组合物为以下组合物中的任意一种；

组合物1为雷公藤甲素、雷公藤内酯A、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol >(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol 、 Tripterinin 、雷酚内酯、Tripterygiumine C、雷公藤乙素、雷公藤红素、雷酚内酯、 Tripterygiu mine E 、去甲基泽拉木醛、Hypoglicin D 、南蛇碱、 Triptregeline F 、雷酚萜、雷公藤内酯B、雷公藤酯甲、Triptergulide F 、 Triptersinine Z3、雷公藤吉碱、 Triptersinine A、Triptersinine T、雷公藤甲素衍生物3和 Triptobenzene B；

组合物2为Wilforsinine C、去甲基泽拉木醛、 Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol、雷公藤内酯A、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol 、雷公藤红素、Triptersinine Z3、雷公藤次碱、雷公藤吉碱、Tripterygiumine、雷公藤内酯B、雷公藤酯甲、Triptergulide F 、Triptobenzene B、雷公藤甲素、 Triptersinine T 和雷酚萜；

组合物3为雷公藤乙素、Isopimara-8(14),15-diene-12α,19-diol、Triptergulide B、Celacinnine、3S,4S,5R,10S)-3,19-dihydroxy-7-oxoabieta-8,11,13-triene、去甲基泽拉木醛、(+)-(7R,8S,8′S)-9-benzoyloxy-lariciresinol、 Triptergulide A、雷公藤红素、3-oxo-olean-9 (11),12-diene 、雷公藤次碱、 Tripterygiumine E 、Tripterygiumine C、Triptersinine Z3、雷公藤酯甲、雷公藤甲素、雷酚萜、Triptersinine T、Triptergulide F、雷公藤吉碱和 Triptobenzene B；

组合物4为雷公藤甲素、雷公藤甲素衍生物6、雷公藤甲素衍生物7、雷公藤甲素衍生物9、雷公藤甲素衍生物1、雷公藤甲素衍生物3、雷公藤甲素衍生物4、Catchin、雷酚萜、Triptobenzene B、isopimara-8(14),15-diene-11b,19-diol、雷酚内酯、triptobenzeneY、kaurane-16,19 -20-triol、雷酚酮内酯、Tripohairic acid、雷酚萜甲醚、Triptonoterpenen methlether、3-oxo-14,15-dihudeoxy-abieta-8,11,13 -trien-19-ol、triptobenzene H、雷酚新内酯、triptonoditerpenic acid、triptonodiol、14，15-二羟-8,13-环氧树脂-14-烯-19-酸酯、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素、B-谷甾醇、Tingenone、雷公藤红素衍生物1、α-香树精、Sulphated conjugated triptolide、11α-羟基-β-香树精、雷公藤红素、Wilorlide B、齐墩果酸、methylkatonoate、Wilforic acid F、22β-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸、22α-羟基-3-氧基齐墩果-12-烯-29-酸甲酯、regelin C、原花青素B1、reserpine、槲皮素-3-O-新橙皮糖甘、wilforisinine B、wilforisinine A、dehydroxyaquayamycin B、celangulatin F、wilforisinine D、7b-triacetoxy-isobutyryloxy-8a-(3-furancarbonyloxy)-4a-hydroxy-1b-nicotinoxy-dihydroagarofurn、Evonine、Wilfornine E、Tripfordine A、Wilforsinine C 、Euonymine、1-desacetylwilforgine、alatusinine、Wilfornine F、雷公藤次碱、HyponineD、Wilfordinine I。

7.权利要求2-5任意一项所述方法制备所得的组合物或权利要求6所述组合物在制备抑制肿瘤耐药活性产品中的应用。