CN115448827B - 一种含末端双键的松香烷型二萜化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种含末端双键的松香烷型二萜化合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种含末端双键的松香烷型二萜化合物及其制备方法和应用。本发明提供如式I所示结构的含末端双键的松香烷型二萜化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物。本发明还提供了所述含末端双键的松香烷型二萜化合物的制备方法，以及这些化合物对人肺癌细胞A549细胞和人原髓细胞白血病细胞HL‑60细胞的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤化合物技术领域，具体涉及一种含末端双键的松香烷型二萜化合物及其制备方法和应用。
背景技术
米团花，又名渍糖花、蜜蜂树花。灌木或小乔木，幼枝被浓密的绒毛。叶片椭圆状披针形，长10～23cm，宽5～9cm，顶端渐尖，基部楔形，边缘具浅锯齿或锯齿，背面密被浓密灰白或淡黄色的星状绒毛及丛卷毛。轮伞花序多花，排列成顶生长圆柱形穗状花序；苞片肾形，全缘或具不规则的齿，外被星状绒毛；小苞片线形，长约1mm，密被星状绒毛；花萼钟形，外面被淡黄色星状绒毛及粉囊状小突起，内面无毛，萼齿三角形，长约1.5mm或稍短；花冠白色或粉红至紫红色，冠筒内藏或微外伸，内无毛环，唇檐二唇形，上唇顶端微缺，下唇3裂，中裂片较大。小坚果长圆状三棱形，顶端截平，果脐小，位于基部。花期11月至翌年3月，果期3～5月。性味：苦，凉。该植物具有清热解毒，利湿消肿，止血等功效。
目前从米团花属植物中共分离出60种化学成分，包括二倍半萜类、黄酮类、苯乙醇苷类、酰基糖苷类和酚类等，其中以二倍半萜和黄酮类为主要结构类型。但将米团花枝条化学成分应用于抗肿瘤活性的研究还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种含末端双键的松香烷型二萜化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物。该化合物从米团花中提取得到，对人肺癌细胞和人原髓细胞白血病细胞具有抑制作用；
一种含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A，化学名称为11,14–二羟基-8,11,13,15-松香烷四烯-7-酮，结构如下式I所示：
本发明的第二个目的为提供上述含末端双键的松香烷型二萜化合物的制备方法，采用如下技术方案：
步骤(1)、以米团花的风干枝条为原料，粉碎后有机溶剂浸提，低温减压浓缩得到浸膏；
步骤(2)、将浸膏和水混合得悬浊液，加入乙酸乙酯萃取，低温减压浓缩得到乙酸乙酯萃取相；
步骤(3)、采用硅胶柱层析分离乙酸乙酯萃取相，以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚和乙酸乙酯体积比依次为9.8～10.2:1、4.8～5.2:1、2.8～3.2:1，收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为2.8～3.2:1时对应的洗脱液，然后经薄层层析分析，合并相似组分得到初组分；
步骤(4)、将初组分经制备液相色谱分离，以乙腈和水作为洗脱剂等度洗脱，得到式I所示的含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A。
作为优选，步骤(1)中有机溶剂为体积分数≥90％的乙醇，与米团花枝条的体积质量比为10～20mL：1g；浸提温度为65～75℃，浸提2～3次，每次4～6h。
作为优选，步骤(1)和步骤(2)中低温减压浓缩的温度为40～50℃，真空度为0.07～0.09MPa。
作为优选，步骤(2)中浸膏和水的质量比为1:1～3，乙酸乙酯与悬浊液体积比0.8～1:1，萃取2～4次。
作为优选，步骤(4)洗脱剂中乙腈的体积分数为40～50％，其余为水。
本发明的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A以米团花的枝条为原料，经破碎、浸提、减压浓缩、萃取和多次分离纯化得到。制备时，选用干燥的米团花枝条或者将米团花枝条干燥后使用，这样方便枝条破碎。以石油醚和乙酸乙酯等体积的洗脱液为目标分离体系，同时由于米团花中杂质成分较多，单一浓度洗脱无法得到松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A；而浓度梯度设置不合理，过大或者过小都可能会导致松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A无法充分洗脱出来。在缺少可借鉴材料提供可提取得到松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A的指示的情况下，处理米团花枝条并从中得到Leucosceptrum A具有很大的不确定性。
本发明的第三个目的是提供含有上述含末端双键的松香烷型二萜化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物在制备抗肿瘤药物上的应用。
作为优选，所述肿瘤对应的肿瘤细胞至少为人肺癌细胞A549细胞和人原髓细胞白血病细胞HL-60细胞中的一种。
本发明的第四个目的是提供一种抗肿瘤药物，包括安全有效量的上述含末端双键的松香烷型二萜化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药。
作为优选，所述抗肿瘤药物还可以包括药学上可以接受的载体。
本发明的有益效果如下：
本发明的含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A为从米团花枝条中提取的天然抗肿瘤化合物，具有抑制肿瘤细胞的生物活性，如人肺癌细胞A549细胞和人原髓细胞白血病细胞HL-60，尤其对人原髓细胞白血病细胞HL-60细胞抑制作用明显，半数抑制浓度IC50值比市场上的广谱抗肿瘤药物顺铂小，表明其具有很强的抗肿瘤活性，在制备抗肿瘤药物上具有非常大的应用前景，对提升米团花的医学和经济价值具有重要作用。
附图说明
图1是含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A的制备流程图。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的材料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
实施例1：含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A的理化性能测试
1.1分子结构式确定
所用核磁共振仪为Bruker公司制造的Bruker AVANCE III 500型核磁共振仪，核磁共振使用氘代CDCl3(氘代氯仿)试剂，所得松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A的氢谱和碳谱数据见下表1所示。
表1 Leucosceptrum A的氢谱1H-NMR(500MHz)和碳谱13C-NMR(125MHz)数据
注：化学位移用δ表示；s表示单峰；br s表示宽单峰；m表示多重峰；dd表示双二重峰。
1.2分子量测试
采用高分辨质谱HR-ESI-MS对化合物的精确分子量进行测定，HR-ESI-MS[M-H]-m/z为313.1804。根据表1中的核磁NMR数据以及质谱数据确定，松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A的分子式为C20H26O3，分子量为314，不饱和度为8，化学名称为11,14–二羟基-8,11,13,15-松香烷四烯-7-酮，结构如式I所示。
1.3熔点测试
所用熔点仪为上海物光制作的WRS-1C型熔点仪；经测试，含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A的熔点为m.p.245-246℃。
实施例2：制备含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A
运用本发明所述方法制备化合物Leucosceptrum A，包括以下步骤：
(1)将5kg米团花的枝条风干、粉碎，加入到体积分数95％的乙醇中浸提，按米团花质量与乙醇体积1g：10mL的比例加入乙醇，浸提温度70℃，浸提3次，每次5小时；过滤不溶物并合并滤液，然后在真空度为0.08MPa、温度为45℃下低温减压蒸干得到浸膏；
(2)将所得浸膏与水按质量比为1:2混合均匀制成悬浊液，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，在真空度为0.08MPa、温度为45℃下低温减压蒸干得到乙酸乙酯萃取相；
(3)将得到的乙酸乙酯萃取相与等质量的硅胶拌匀，然后置于硅胶柱中层析，采用石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的各梯度洗脱体积比为10:1、5:1、3:1，收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为3:1时的洗脱液，经薄层层析分析并合并相似组份，得到初组份；
(4)将收集的初组份经制备液相色谱分离，以乙腈：水按体积比为45:55作为洗脱剂等度洗脱，得到式I所示的具有抗肿瘤作用的二萜化合物A(16.0mg)。
该过程如图1所示。
实施例3：制备含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A
运用本发明所述方法制备化合物Leucosceptrum A，包括以下步骤：
(1)将5kg米团花的枝条风干、粉碎，加入到体积分数90％的乙醇中浸提，加入量为乙醇20mL/g米团花，浸提温度为65℃，浸提3次，每次4小时；过滤不溶物并合并滤液，然后在真空度为0.07MPa、温度为50℃下低温减压蒸干得到浸膏；
(2)将所得浸膏与水按质量比为1:1混合均匀制成悬浊液，等体积乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，在真空度为0.07MPa、温度为50℃下低温减压蒸干得到乙酸乙酯萃取相；
(3)将得到的乙酸乙酯萃取相与等质量的硅胶拌匀，然后置于硅胶柱中层析，采用石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的各梯度洗脱体积比为9.8:1、4.8:1、2.8:1，收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为2.8:1时的洗脱液，经薄层层析分析并合并相似组份，得到粗纯化组份；
(4)将收集的层析分离组份经制备液相色谱分离，以乙腈：水(体积比40:60)作为洗脱剂等度洗脱，得到式I所示的具有抗肿瘤作用的二萜化合物A(11.4mg)。
实施例4：制备含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A
运用本发明所述方法制备化合物Leucosceptrum A，包括以下步骤：
(1)将5kg米团花的枝条风干、粉碎，加入到体积分数95％的乙醇中浸提，加入量为乙醇15mL/g米团花，浸提温度为75℃，浸提2次，每次4小时；过滤不溶物并合并滤液，然后在真空度为0.09MPa、温度为40℃下低温减压蒸干得到浸膏；
(2)将所得浸膏与水按质量比为1:3混合均匀制成悬浊液，等体积乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，在真空度为0.09MPa、温度为40℃下低温减压蒸干得到乙酸乙酯萃取相；
(3)将得到的乙酸乙酯萃取相与等质量的硅胶拌匀，然后置于硅胶柱中层析，采用石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的各梯度洗脱体积比为10.2:1、5.2:1、3.2:1，收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为3.2:1时的洗脱液，经薄层层析分析并合并相似组份，得到粗纯化组份；
(4)将收集的层析分离组份经制备液相色谱分离，以乙腈：水(50:50)作为洗脱剂等度洗脱，得到式I所示的具有抗肿瘤作用的二萜化合物A(8.1mg)。
实施例5：含末端双键的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A的抗肿瘤性能测试
取实施例2制备的松香烷型二萜化合物Leucosceptrum A作抗肿瘤能力测试，过程如下：
体外肿瘤细胞增殖抑制试验：取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度(50000～100000个/毫升)，每孔100μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，接种24h后给药(100μl/孔)，分别设空白对照组、细胞对照组以及6个浓度(3.12，6.25，12.5，25，50，100μmol/L)受试药物组，细胞对照组中的药物为顺铂，继续培养72h后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培养液溶解)，37℃孵育4h，弃去各孔内液体后加入150μl酸化异丙醇(含0.04mol/LHCl)，避光放置30min，酶标仪测定570nm处吸光度，计算受试药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，计算受试物对肿瘤细胞增殖(72h)的半数抑制浓度(IC50)，为减小实验误差带来的影响，每次实验做三个平行，结果对应如下。
5.1人原髓细胞白血病细胞HL-60
(1)对照组顺铂对HL-60细胞的抑制作用，见表2、3和4。
表2顺铂对HL-60细胞的抑制作用平行测试一结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝14.36。
表3顺铂对HL-60细胞的抑制作用平行测试二结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝10.69。
表4顺铂对HL-60细胞的抑制作用平行测试三结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝13.16。
由以上数据可求得：顺铂的IC50＝12.74±1.87。
(2)化合物Leucosceptrum A对HL-60细胞的抑制作用，见表5、6和7。
表5化合物Leucosceptrum A对HL-60细胞的抑制作用平行测试一结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝9.58。
表6化合物Leucosceptrum A对HL-60细胞的抑制作用平行测试二结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝9.19。
表7化合物Leucosceptrum A对HL-60细胞的抑制作用平行测试三结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝8.42。
由以上数据可求得：Leucosceptrum A的IC50＝9.06±0.59。
5.2人肺癌细胞A549细胞
(1)顺铂对人肺癌细胞A549细胞的抑制作用，见表8、9和10。
表8顺铂对A549细胞的抑制作用平行测试一结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝14.62。
表9顺铂对A549细胞的抑制作用平行测试二结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝17.85。
表10顺铂对A549细胞的抑制作用平行测试三结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝15.38。
由以上数据可求得：顺铂的IC50＝15.95±1.69。
(2)化合物Leucosceptrum A对A549细胞的抑制作用，见表11、12和13。
表11化合物Leucosceptrum A对A549细胞的抑制作用平行测试一结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝17.55。
表12化合物Leucosceptrum A对A549细胞的抑制作用平行测试二结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝18.38。
表13化合物Leucosceptrum A对A549细胞的抑制作用平行测试三结果
由Graphpad Prism 6.0求得IC50＝16.62。
由以上数据可求得：Leucosceptrum A的IC50＝17.52±0.88。
5.3Leucosceptrum A和顺铂对两种癌细胞72小时半数抑制浓度IC50(μmol/L)见表14所示。
表14Leucosceptrum A和顺铂对两种癌细胞的72小时半数抑制浓度IC50(μmol/L)
| 肿瘤细胞 | HL-60细胞 | A-549细胞 |
| LeucosceptrumA | 9.06±0.59 | 17.52±0.88 |
| 顺铂 | 12.74±1.87 | 15.95±1.69 |
从上述表5～7和表11～13中可以看出，不同浓度的化合物Leucosceptrum A对人肺癌细胞A549细胞和人原髓细胞白血病细胞HL-60均匀抑制作用，Leucosceptrum A在72h后的IC50值分别达到17.52±0.88和9.06±0.59μmol/L，表明对上述两种肿瘤细胞的生长具有较强的抑制作用，特别是对HL-60细胞的IC50值低于顺铂对照组，说明Leucosceptrum A对HL-60细胞有着极为显著的抑制作用。
Claims (8)
1.一种含末端双键的松香烷型二萜化合物，其特征在于，所述化合物的化学结构式见式I：
。
2.权利要求1中所述的含末端双键的松香烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1）、以米团花的风干枝条为原料，粉碎后有机溶剂浸提，低温减压浓缩得到浸膏；所述有机溶剂为体积分数95%的乙醇；
步骤（2）、将浸膏和水混合得悬浊液，加入乙酸乙酯萃取，低温减压浓缩得到乙酸乙酯萃取相；
步骤（3）、采用硅胶柱层析分离乙酸乙酯萃取相，以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚和乙酸乙酯体积比依次为9.8～10.2:1、4.8～5.2:1、2.8～3.2:1；收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为2.8~3.2:1时对应的洗脱液，然后经薄层层析分析，合并相似组分得到初组分；
步骤（4）、将初组分经制备液相色谱分离，以乙腈和水作为洗脱剂等度洗脱，得到所述含末端双键的松香烷型二萜化合物；所述洗脱剂中乙腈的体积分数为40～50%，其余为水。
3.根据权利要求2所述的含末端双键的松香烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述有机溶剂与米团花的风干枝条的体积质量比为10～20mL：1g；浸提温度为65～75℃，浸提2～3次，每次4～6h。
4.根据权利要求2所述的含末端双键的松香烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中低温减压浓缩的温度为40～50℃，真空度为0.07～0.09MPa。
5.根据权利要求2所述的含末端双键的松香烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中浸膏和水的质量比为1:1～3，乙酸乙酯与悬浊液体积比0.8～1:1，萃取2～4次。
6.权利要求1所述含末端双键的松香烷型二萜化合物在制备抑制肿瘤细胞生物活性的药物上的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人肺癌细胞和人原髓细胞白血病细胞中的一种。
7.一种抑制肿瘤细胞生物活性的药物，其特征在于，包括安全有效量的权利要求1所述含末端双键的松香烷型二萜化合物，所述肿瘤细胞为人肺癌细胞和人原髓细胞白血病细胞中的一种。
8.根据权利要求7所述的一种抑制肿瘤细胞生物活性的药物，其特征在于，还包括药学上可以接受的载体。
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