CN104262126A - 兰香草酮的制备方法及其在抗白血病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种植物提取物的制备方法及应用，尤其涉及兰香草酮的制备方法及其在抗白血病药物中的应用。制备方法包括以下步骤：将兰香草粉碎，加生物酶酶解8-10小时，酶解原料加60-80%乙醇溶液微波或超声提取2-3次，提取液浓缩至浸膏，加适量水分散后加入大孔树脂柱中吸附，再通过制备型高效液相色谱分离等步骤得到兰香草酮。采用本发明制备方法，工艺操作简便、得率高，污染小，适合高纯度兰香草酮的生产。兰香草酮具有抗肿瘤作用，药理实验表明兰香草酮在抗肿瘤方面有很好的效果，尤其是对人淋巴细胞白血病(P388)效果更佳，可用于制备抗白血病药物。

Description

兰香草酮的制备方法及其在抗白血病药物中的应用
技术领域
本发明公开了一种植物提取物的制备方法及应用，特别涉及兰香草酮的制备方法及其在抗白血病药物中的应用。
背景技术
兰香草酮（Incanone），CAS号180282-91-1，分子式C20H28O5，分子量348.46，结构式为
 
兰香草酮来源于马鞭草科(Verbenaceae) 兰香草 Caryopteris incana(Thunb.)Miq.的全植物。研究表明，兰香草酮具有细胞毒活性，对人型白血病细胞HL60呈显著的细胞毒活性，IC50为6μM。
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官，同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。据报道，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。
发明内容
为满足临床需要，扩大用药品种，更好地治疗癌症，提供一种兰香草酮的制备方法及其在抗白血病药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
兰香草酮的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取兰香草粉碎，加生物酶酶解8-10小时，酶解原料加60-80%乙醇溶液微波或超声提取2-3次，提取液浓缩至浸膏；
（2）将提取浸膏加适量水分散后加入大孔树脂柱中吸附，先用水洗脱，再用50-70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；
（3）将洗脱液浓缩后采用制备型液相色谱分离，紫外在线检测，收集目标成分，低温干燥即得兰香草酮。
步骤（1）中所述生物酶可选果胶酶、纤维素酶和淀粉酶中的任一种，用量为原料重量的0.2-0.5%。
步骤（2）中所述大孔树脂可选NK-9、ADS-21和HPD417中的一种。
步骤（3）中所述制备型高效液相色谱中流动相为30-40%的乙腈溶液。
所述制备的兰香草酮，在制备抗白血病药物中的应用，尤其在制备防治淋巴性白血病和髓细胞白血病的应用。
所述制备的兰香草酮，在其口服配方中添加肠吸收促进剂，包含中链脂肪酸盐、胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、壳聚糖及其衍生物中的一种或几种。
采用本法制备兰香草酮，工艺简便易操作，制备量大，产品得率高，而且低污染；添加肠吸收促进剂，有利于提高生物利用度。
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式
实施例1：
兰香草酮的制备
将兰香草粉碎，过20目筛，称取1kg投入提取罐中，称取2.2g纤维素酶溶解在7LpH4.5的水溶液中加入提取罐，在50℃条件下酶解10小时，升温至80℃灭酶，过滤，将酶解原料加10倍量70%乙醇溶液，在50℃条件下微波提取3次，过滤得到提取液，减压浓缩至浸膏，加水分散，加入NK-9大孔吸附树脂柱吸附，先用水洗脱，再取3BV50%乙醇洗脱，收集洗脱液减压浓缩得浸膏。将浸膏用甲醇溶解，注入制备型高效液相色谱仪，乙腈-水（30：70）为流动相，紫外在线检测，收集高浓度流分，旋转蒸发浓缩、低温干燥即得1.1g兰香草酮，含量96.4%。
实施例2：
兰香草酮的制备
将兰香草粉碎，过20目筛，称取1kg投入提取罐中，称取2.8g果胶酶溶解在7LpH4.5的水溶液中加入提取罐，在50℃条件下酶解8小时，升温至80℃灭酶，过滤，将酶解原料加6倍量60%乙醇溶液，在50℃条件下超声提取3次，过滤得到提取液，减压浓缩至浸膏，加水分散，加入ADS-21大孔吸附树脂柱吸附，先用水洗脱，再取4BV60%乙醇洗脱，收集洗脱液减压浓缩得浸膏。将浸膏用甲醇溶解，注入制备型高效液相色谱仪，乙腈-水（33:67）为流动相，紫外在线检测，收集高浓度流分，旋转蒸发浓缩、低温干燥即得0.97g兰香草酮，含量98.1%。
 
实施例3：兰香草酮的制备
将兰香草粉碎，过20目筛，称取3kg投入提取罐中，称取12.6g果胶酶和纤维素复合酶（比例1:2）溶解在7LpH4.5的水溶液中加入提取罐，在50℃条件下酶解9小时，升温至80℃灭酶，过滤，将酶解原料加8倍量75%乙醇溶液，在50℃条件下微波提取2次，过滤得到提取液，减压浓缩至浸膏，加水分散，加入NK-9大孔吸附树脂柱吸附，先用水洗脱，再取3BV70%乙醇洗脱，收集洗脱液减压浓缩得浸膏。将浸膏用甲醇溶解，注入制备型高效液相色谱仪，乙腈-水（35:65）为流动相，紫外在线检测，收集高浓度流分，旋转蒸发浓缩、低温干燥即得0.66g兰香草酮，含量97.1%。
 
实施例4：兰香草酮的制备
将兰香草粉碎，过20目筛，称取4kg投入提取罐中，称取13.6g淀粉酶和果胶酶复合酶（比例1:1）溶解在7LpH4.5的水溶液中加入提取罐，在50℃条件下酶解8.5小时，升温至80℃灭酶，过滤，将酶解原料加7倍量80%乙醇溶液，在50℃条件下超声提取2次，过滤得到提取液，减压浓缩至浸膏，加水分散，加入HPD417大孔吸附树脂柱吸附，先用水洗脱，再取5BV65%乙醇洗脱，收集洗脱液减压浓缩得浸膏。将浸膏用甲醇溶解，注入制备型高效液相色谱仪，乙腈-水（40:60）为流动相，紫外在线检测，收集高浓度流分，旋转蒸发浓缩、低温干燥即得0.78g兰香草酮，含量95.3%。
 
实施例5：
兰香草酮的其在抗白血病药物中的应用
1、材料
动物：昆明种小鼠，雌雄各半性，体重20±2g，由南京中医药大学提供。
细胞株：HL-60（人髓原细胞白血病）细胞株，由中国科学院上海药物研究所提供。
2、方法
在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，将被试细胞调成密度为2×104细胞/ml。将上述细胞株悬液接种于96孔培养板，每孔50μl，置于饱和湿度、37℃和5%CO2培养箱中培养24小时。分别加入溶剂对照0.1%二甲基亚砜、阳性对照顺铂（DDP）以及不同浓度单体化合物的二甲亚砜溶液各50μl，每组设3个复孔。培养72小时，于培养结束前4小时，各培养孔加入5mg/ml四唑翁盐(MTT)10μl，置于饱和湿度、37℃和5%CO2培养箱中培养4小时，每孔中加入150μl二甲亚砜，振荡溶解生成MTT晶体甲臜，用酶标仪测570nmO.D值，细胞存活率由样品O.D值对于对照品O.D值的比值计算。其中，兰香草酮对HL-60细胞的半数抑制浓度（IC50）有剂量效应曲线得到。
3、结果
实现结果（见表1）本发明兰香草酮对HL-60细胞的生长有明显的抑制作用，其对HL-60细胞的生长抑制活性强于阳性对照顺铂（DDP），说明兰香草酮具有极佳的急性髓原细胞白血病的活性，在制备抗白血病药物中有良好的应用前景。
表1  本发明兰香草酮对HL-60细胞的抑制作用（n=10，±S）
组别 IC50（μM）
空白对照组 —
阳性对照组 6.8±1.3
兰香草酮组 6.9±1.1

Claims (6)

1. 兰香草酮的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）取兰香草粉碎，加生物酶酶解8-10小时，酶解原料加60-80%乙醇溶液微波或超声提取2-3次，提取液浓缩至浸膏；
（2）将提取浸膏加适量水分散后加入大孔树脂柱中吸附，先用水洗脱，再用50-70%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液；
（3）将洗脱液浓缩后采用制备型液相色谱分离，紫外在线检测，收集目标成分，低温干燥即得兰香草酮。
2. 根据权利要求1所述的兰香草酮的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述生物酶可选果胶酶、纤维素酶和淀粉酶中的任一种，用量为原料重量的0.2-0.5%。
3. 根据权利要求1所述的兰香草酮的制备方法，其特征在于步骤（2）中所述大孔树脂可选NK-9、ADS-21和HPD417中的一种。
4. 根据权利要求1所述的兰香草酮的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述制备型高效液相色谱中流动相为30-40%的乙腈溶液。
5. 根据权利要求1~4所述方法制备的兰香草酮，在制备抗白血病药物中的应用。
6. 根据权利要求5所述在制备抗白血病药物中的应用，其特征在于在制备防治淋巴性白血病和髓细胞白血病的应用。
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