CN104926758A - 斑籽素的制备方法及其在抗白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物提取物的制备方法及应用，尤其涉及斑籽素的制备方法及其在抗白血病药物中的应用。制备方法包括以下步骤：取山斑籽根粉碎，采用低浓度醇回流提取，提取液浓缩至无醇，上聚酰胺树脂柱吸附，酸醇洗脱，洗脱液回收溶剂，再采用高速逆流色谱法纯化，收集流出液，浓缩，低温干燥得高纯度的斑籽素。采用本发明制备方法，工艺操作简便、得率高，污染小，适合高纯度斑籽素的生产。斑籽素具有抗肿瘤作用，药理实验表明斑籽素在抗肿瘤方面有很好的效果，尤其是对人淋巴细胞白血病<u/>(P388)效果更佳，可用于制备抗白血病药物。
Description
技术领域
本发明公开了一种植物提取物的制备方法及应用，特别涉及斑籽素的制备方法及其在抗白血病药物中的应用。
背景技术
斑籽素（Baliospermin），分子式为C32H50O8，分子量为562.74，结构式为
斑籽素来源于大戟科(Euphorbiaceae) 山斑籽Baliospermum montanum(Willd.)Muell.－Arg.的根。斑籽素具有抗癌作用。对P388淋巴细胞白血病体内0.2mg/kg时，T/C为131。体外试验对P388的ED50为0.6μg/mL。
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官，同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。据报道，我国各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位。
发明内容
为满足临床需要，扩大用药品种，更好地治疗癌症，提供一种斑籽素的制备方法及其在抗白血病药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
斑籽素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取山斑籽根粉碎，采用4~10倍量20~40%乙醇回流提取1~4次，每次0.5~1.5h，过滤，合并提取液，浓缩至无醇，得浓缩液；
2）将上述浓缩液加入至聚酰胺树脂柱中吸附，用4~8BV的酸醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，得斑籽素粗提物；
3）将上述斑籽素粗提物采用高速逆流色谱仪分离，收集洗脱液，浓缩，低温干燥得斑籽素。
所述步骤2）中的聚酰胺树脂粒度为80~120目，用量与药材量的体积重量比为1：1-3。
所述步骤2）中的酸醇是含1%乙酸的30~50%乙醇溶液。
所述步骤3）中的高速逆流色谱仪的参数设定为：转速750~1050r/min，流动相的流速2~10ml/min。
所述制备的斑籽素，在制备抗白血病药物中的应用，尤其在制备防治淋巴性白血病和髓细胞白血病的应用。
所述制备的斑籽素，在其口服配方中添加肠吸收促进剂，包含中链脂肪酸盐、胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、壳聚糖及其衍生物中的一种或几种。
采用本法制备斑籽素，工艺简便易操作，制备量大，产品得率高，而且低污染；添加肠吸收促进剂，有利于提高生物利用度。
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式
实施例1：
斑籽素的制备
取山斑籽根1kg，粉碎，加入4L40%乙醇回流提取4次，每次1.5h，固液分离得提取 液，浓缩至无醇味，取350g80目的聚酰胺树脂，装柱，浓缩液上柱，用8BV的含1%乙酸的30%乙醇洗脱，洗脱液回收溶剂，得斑籽素粗提物；取正丁醇、乙酸、水按3:1:4体积比置于分液漏斗中混匀，静置分层，分离上下相，取上相为固定相，下相为流动相，将斑籽素粗提物用下相溶解，开启制备型高速逆流色谱仪，以2ml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样，控制转速为750r/min，收集流出液，浓缩，低温干燥得斑籽素，检测含量99.3%。
实施例2：
斑籽素的制备
取山斑籽根5kg，粉碎，加入10L20%乙醇回流提取0.5h，固液分离得提取液，浓缩至无醇味，取5kg120目的聚酰胺树脂，装柱，浓缩液上柱，用4BV的含1%乙酸的50%乙醇洗脱，洗脱液回收溶剂，得斑籽素粗提物；取正丁醇、乙酸、水按7:3:10体积比置于分液漏斗中混匀，静置分层，分离上下相，取上相为固定相，下相为流动相，将斑籽素粗提物用下相溶解，开启制备型高速逆流色谱仪，以3.5ml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样，控制转速为1050r/min，收集流出液，浓缩，低温干燥得斑籽素，检测含量99.1%。
实施例3：
斑籽素的制备
取山斑籽根10kg，粉碎，加入80L30%乙醇回流提取2次，每次1h，固液分离得提取液，浓缩至无醇味，取6kg80目的聚酰胺树脂，装柱，浓缩液上柱，用6BV的含1%乙酸的45%乙醇洗脱，洗脱液回收溶剂，得斑籽素粗提物；取正丁醇、乙酸、水按6:2:7体积比置于分液漏斗中混匀，静置分层，分离上下相，取上相为固定相，下相为流动相，将斑籽素粗提物用下相溶解，开启制备型高速逆流色谱仪，以10ml/min流速泵入流动相，并通过进样阀连续进样，控制转速为900r/min，收集流出液，浓缩，低温干燥得斑籽素，检测含量98.5%。
实施例4：
斑籽素的其在抗白血病药物中的应用
1、材料
动物：昆明种小鼠，雌雄各半性，体重20±2g，由南京中医药大学提供。
细胞株：P388（白血病）细胞株，由中国科学院上海药物研究所提供。
2、方法
在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，将被试细胞调成密度为2×104细胞/ml。将上述细胞株悬液接种于96孔培养板，每孔50μl，置于饱和湿度、37℃和5%CO2培养箱中培养24小时。分别加入溶剂对照0.1%二甲基亚砜、阳性对照顺铂（DDP）以及不同浓度单体化合物的二甲亚砜溶液各50μl，每组设3个复孔。培养72小时，于培养结束前4小时，各培养孔加入5mg/ml四唑翁盐(MTT)10μl，置于饱和湿度、37℃和5%CO2培养箱中培养4小时，每孔中加入150μl二甲亚砜，振荡溶解生成MTT晶体甲臜，用酶标仪测570nmO.D值，细胞存活率由样品O.D值对于对照品O.D值的比值计算。其中，斑籽素对P388细胞的半数抑制浓度（IC50）有剂量效应曲线得到。
3、结果
实现结果（见表1）本发明斑籽素对P388细胞的生长有明显的抑制作用，其对P388细胞的生长抑制活性强于阳性对照顺铂（DDP），说明斑籽素具有极佳的抗白血病的活性，在制备抗白血病药物中有良好的应用前景。
表1 本发明斑籽素对P388细胞的抑制作用（n=10，±S）
| 组别 | IC50（μM） |
| 空白对照组 | — |
| 阳性对照组 | 5.6±3.3 |
| 斑籽素组 | 6.1±2.1 |
Claims (6)
1.斑籽素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取山斑籽根粉碎，采用4~10倍量20~40%乙醇回流提取1~4次，每次0.5~1.5h，过滤，合并提取液，浓缩至无醇，得浓缩液；
2）将上述浓缩液加入至聚酰胺树脂柱中吸附，用4~8BV的酸醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，得斑籽素粗提物；
3）将上述斑籽素粗提物采用高速逆流色谱仪分离，收集洗脱液，浓缩，低温干燥得斑籽素。
2.根据权利要求1所述的斑籽素的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的聚酰胺树脂粒度为80~120目，用量与药材量的体积重量比为1：1-3。
3.根据权利要求1所述的斑籽素的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的酸醇是含1%乙酸的30~50%乙醇溶液。
4.根据权利要求1所述的斑籽素的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的高速逆流色谱仪的参数设定为：转速750~1050r/min，流动相的流速2~10ml/min。
5.根据权利要求1~4所述方法制备的斑籽素，在制备抗白血病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述在制备抗白血病药物中的应用，其特征在于在制备防治淋巴性白血病和髓细胞白血病的应用。
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