CN111320602B - 九香虫多巴胺类化合物制备方法及抗睾丸细胞损伤应用 - Google Patents

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Abstract

本发明为九香虫多巴胺类新化合物制备方法及抗睾丸细胞损伤应用，一种从九香虫中制备多巴胺类新化合物的方法及其在锰中毒睾丸支持细胞损伤中的保护作用，属于药物技术领域。本发明以干燥的九香虫为原料，通过甲醇提取、真空浓缩、分步萃取、硅胶柱富集与洗脱、半制备高效液相色谱分离及产品纯化步骤，得到1种多巴胺类新化合物单体；并且利用上述单体干预损伤的睾丸支持细胞，获得良好的细胞保护作用。本发明为进一步研究中药昆虫九香虫的有效成分及其生殖保护作用奠定基础，有利于九香虫天然产物的深入开发利用。

Description

九香虫多巴胺类化合物制备方法及抗睾丸细胞损伤应用
技术领域
本发明涉及一种动物化合物单体分离纯化方法及其细胞作用，具体涉及一种从九香虫中制备多巴胺类新化合物的方法，以及该化合物在锰中毒致睾丸支持细胞损伤中的保护作用，属于药物技术领域。
背景技术
金属锰作为人体的一种微量元素，在生长发育过程中起着重要的作用，但是过量的锰会造成人体生殖系统的损伤，原因在于锰可以破坏血睾屏障进而导致生殖细胞损伤、睾丸组织破坏等雄性生殖系统器官的损伤。随着锰工业的发展、无铅汽油和农药的广泛使用，造成环境中锰含量不断增加，提升了金属锰相关从业人员锰暴露的机会，导致体内的锰含量超标，进而引发高危人群生殖器官损伤。目前，临床上用于治疗锰中毒的药物只有抗氧化类、多巴胺类和螯合剂等几种，亟待从天然产物中发掘出更为有效的治疗药物。
九香虫(Cotidiuschinensis)是一种重要的虫类中药，具有理气止痛、温中助阳的功效。临床上与其他药物配伍使用，治疗多种疾病，如肾虚阳痿、小儿遗尿等，疗效显著。研究发现，九香虫提取物对染锰雄性大鼠生殖器官损伤有一定的干预作用，机制可能是保护了血睾屏障，改善紧密连接蛋白之间的相互连接，进而阻抑睾丸生殖细胞的损伤，从而达到保护作用。
九香虫提取物虽然对生殖器官损伤具有一定的保护作用，但是该提取物为混合组分，究竟是哪种成分在起作用尚不清楚。因此，近年来人们更加关注九香虫有效成分的分离、纯化、鉴定以及功能验证，希望能够从九香虫中分离出针对某类疾病的有效单体成分，进而应用于临床。
发明内容
本发明的目的在于提供一种九香虫新化合物提取方法及其在锰致睾丸支持细胞损伤中的细胞保护作用，为进一步研究中药昆虫九香虫的有效成分及其生殖保护作用奠定基础，有利于九香虫天然产物的深入开发利用。本发明通过合理的工艺路线以及参数条件，从九香虫中分离得到1种高纯度新化合物单体成分，纯度达到99.9%以上。
本发明的上述目的是通过下述技术方案得以实现：
首先，本发明提供了一种九香虫多巴胺类的新化合物，其结构式如1所示：
Figure SMS_1
。
其次，本发明提供了上述九香虫多巴胺类新化合物的分离纯化方法，包括以下步骤：
步骤一：取干燥的九香虫药材为原料，粉碎成粗粉，用50%甲醇超声辅助提取2次，每次2小时，减压浓缩得到粗提物；
步骤二：将粗提物分散于适量的水中，用乙酸乙酯萃取3次，将萃取物合并后进行减压浓缩，得到乙酸乙酯粗提物；
步骤三：将乙酸乙酯粗提物经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯v/v 100:0，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，1:3，0:100梯度洗脱，再利用薄层色谱法检测，获得多个组分，其中石油醚-乙酸乙酯1:3洗脱得组分Fr.6用于后续步骤；
4）最后，用半制备型高效液相色谱法，乙腈：水，25:75，v/v，6.0ml/min，进一步分离纯化Fr.6组分，得到九香虫化合物。
再次，本发明提供了上述九香虫多巴胺类新化合物的结构确证，如下：
利用质谱仪检测九香虫多巴胺类新化合物的高分辨率质谱HR-ESI-MS峰，并结合核磁共振波谱仪检测异核单量子相关系HSQC谱，同时对比分析其核磁共振NMR数据，最终确证九香虫化合物结构式如下所示：
Figure SMS_2
。
最后，本发明提供了上述九香虫多巴胺类新化合物用于抗生殖细胞损伤的用途，具体用于锰致睾丸支持细胞损伤的应用。
采用上述技术方案的有益效果是：
1.本发明提供了一种九香虫多巴胺类新化合物，使九香虫的有效成分得到了进一步发掘，为明确中药昆虫九香虫的有效成分及其开发利用奠定基础。
2.本发明提供了九香虫多巴胺类新化合物的分离纯化方法，针对九香虫中存在的各种成分的理化性质，通过适当的顺序搭配以及适当的参数组合，设计工艺路线简便、可操作性强、分离效率高的分离提取方案，获得的多巴胺类单体化合物纯度达到99.9%以上；
3.本发明提供的九香虫多巴胺类新化合物，经细胞活性测试证明该化合物具有良好的抗生殖细胞损伤作用，为九香虫的有效成分应用于生殖保护方面奠定基础，可望应用于临床作为多巴胺类锰拮抗剂。
具体实施方式
下面通过对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种九香虫化合物，其结构式如1所示：
Figure SMS_3
。
实施例1：
九香虫新化合物的分离纯化方法，包括以下步骤：
步骤一：取干燥的九香虫药材为原料，粉碎成粗粉，用50%甲醇超声辅助提取2次，每次2小时，减压浓缩得到粗提物；
步骤二：将步骤一所得粗提物分散于适量的水中，用乙酸乙酯萃取3次，将萃取物合并后进行减压浓缩，得到乙酸乙酯粗提物；
步骤三：将步骤二所得乙酸乙酯粗提物经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯v/v100:0，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，1:3，0:100梯度洗脱，再利用薄层色谱法检测，获得多个组分，其中石油醚-乙酸乙酯1:3洗脱得组分Fr.6用于后续步骤；
步骤四：最后，用半制备型高效液相色谱法，乙腈：水, 25:75, v/v, 6.0ml/min，进一步分离纯化Fr.6组分，得到九香虫化合物。
九香虫化合物的结构确证
利用质谱仪检测九香虫化合物的高分辨率质谱HR-ESI-MS峰，并结合核磁共振波谱仪检测异核单量子相关系HSQC谱，同时对比分析其核磁共振NMR数据，最终确证九香虫化合物结构式如下所示：
Figure SMS_4
。
九香虫化合物的结构鉴定数据：
九香虫化合物是一种黄色固体，其核磁共振的氢谱（1H）和碳谱（13C）数据见表1，通过高分辨率质谱得到一个准离子峰m/z:360.1086，计算值为C18H16NO7-：360.1078。
表1 九香虫化合物核磁共振的光谱数据：
Figure SMS_5
。
注：1H (400Hz)，13C(100Hz)）。
九香虫化合物对重金属中的锰中毒致睾丸支持细胞损伤的应用，包括以下步骤：
步骤一：原代培养小鼠睾丸支持细胞，用96孔板按4×104个/孔细胞铺板，48小时后分为三组给药，即空白对照组、锰模型组和干预组，其中空白对照组给予一定量的培养液，锰模型组给予0.86mg/ml的氯化锰溶液，干预组给予0.86mg/ml的氯化锰溶液和5μg/ml的九香虫化合物溶液，每组设置6个复孔，培养24小时；
步骤二：用MTS试剂盒检测细胞活力，按照试剂盒说明书进行实验，每100μl培养液中加入20μl的MTS，在5%CO2、37℃的条件下孵育2-4小时；
步骤三：上述细胞在490nm处测定OD值，空白对照组、锰模型组和干预组的OD值结果按照均数±标准差（
Figure SMS_6
）表示，分别为0.5734±0.0255、0.2274±0.0128和0.3463±0.0783。根据SPSS 22.0软件进行统计学分析，锰模型组与空白对照组相比差异显著，具有统计学意义（P<0.05）；干预组与锰模型组相比差异显著，具有统计学意义（P<0.05）。由上述结果可知，九香虫化合物对锰致睾丸支持细胞损伤具有一定的拮抗修复作用。

Claims (5)

1.一种九香虫多巴胺类化合物，其结构式如1所示：
Figure QLYQS_1
。
2.权利要求1所述的九香虫多巴胺类化合物的分离纯化方法，包括以下步骤：
步骤一：取干燥的九香虫药材为原料，粉碎成粗粉，用50%甲醇超声辅助提取2次，每次2小时，减压浓缩得到粗提物；
步骤二：将粗提物分散于适量的水中，用乙酸乙酯萃取3次，将萃取物合并后进行减压浓缩，得到乙酸乙酯粗提物；
步骤三：将乙酸乙酯粗提物经过硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯v/v 100:0，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，2:1，1:1，1:3，0:100梯度洗脱，再利用薄层色谱法检测，获得多个组分，其中石油醚-乙酸乙酯1:3洗脱得组分Fr.6用于后续步骤；
步骤四：最后，用半制备型高效液相色谱法，乙腈：水，25:75， v/v，6.0ml/min，进一步分离纯化Fr.6组分，得到所述九香虫多巴胺类化合物。
3.如权利要求1所述的九香虫多巴胺类化合物在用于制备抗细胞损伤药物的用途，所述抗细胞损伤药物为抗生殖细胞损伤药物。
4.根据权利要求3所述的用途，所述的细胞损伤为重金属中毒所致的细胞损伤。
5.根据权利要求3所述的用途，所述抗细胞损伤药物为抗支持细胞损伤药物。
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