CN115304467A - 一种从砂仁中提取的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种从砂仁中提取的化合物及其制备方法和应用，属于中药提取领域，具体涉及如式(I)‑(IV)所示罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物及其提取方法，所述化合物具有抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO活性以及保护过氧化氢(H2O2)诱导的小鼠神经小胶质瘤细胞BV‑2氧化损伤的作用，可以用于制备抗炎及抗氧化药物。本发明进一步丰富砂仁活性物质的结构多样性，在此基础上，为后续得到的单体化合物进行相关生物活性测试奠定基础，为新药开发提供活性先导化合物，同时也为砂仁药材的深层次研究与开发提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于中药提取领域，具体涉及一种从砂仁中分离的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物及其制备方法和在制备抗炎的药物中的应用。
背景技术
砂仁(Amomum villosum)是姜科(Zingiberaceae)豆蔻属(Amomum)多年生草本植物，为我国传统中药，集中分布于中国南部各省，如云南、广东、广西、海南等地。砂仁首次作为药物使用记载于《药性论》，其性温味甘，归脾、胃、肾经，具有化湿开胃、温脾止泻和理气安胎之功效(夏冬杰,张贵君,刘洋,方丽.中药砂仁近年来的研究概况[J].中医药信息,1996,2:19-20.)。现代药理学研究表明砂仁具有胃肠保护作用(Gao Y,Sun T,XieY.Effect of Amomun longiligulare on TFF1 and TFF1mRNA of gastric mucosa inrats with hepatogeniculcer[J].Shanxi Journal of Traditional Chinese Medicine,2016,32(7):52-54.)，抗氧化作用(唐建阳,刘凤娇,苏明星,黄素芳,陈菁瑛,陈清西.砂仁提取物的抗菌及抗氧化效应研究[J].厦门大学学报(自然科学版),2012,51(4):789-792.)，抗炎作用(Lee J A,Lee M Y,Shin I S,Seo C S,Ha H,Shin H K.Anti-inflammatory effects of Amomum Compactum on RAW 264.7cells via induction ofheme oxygenase-1[J].Archives of Pharmacal Research,2012,35(4):739-746.)以及抗过敏作用(Kim S H,Lee S,Kim I K,Kwon T K,Moon J Y,Park W H,Shin TY.Suppression of mast cell-mediated allergic reaction by Amomum Xanthiodes[J].Food and Chemical Toxicology,2007,45(11):2138-2144.)。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种从砂仁中提取的化合物，其为如式(I)-(IV)所示罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物，或该化合物的异构体，或该化合物在药学上可接受的盐。
本发明的第二个目的是提供所述罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的提取方法。
本发明的第三个目的是提供所述含有罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的药物组合物。
本发明的第四个目的是提供所述罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物，或该化合物的异构体，或该化合物在药学上可接受的盐，或包含该化合物的药物组合物在制备抗炎和/或抗氧化药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
所述的结构通式(I)(II)(III)(IV)如下：
以上结构通式中：R1选自氢，羟基，甲氧基中的一种；R2选自氢，羟基，甲氧基，羰基中的一种；R3和R4各自独立地选自甲基，羧基，醛基，酯基中的一种；R5和R6各自独立地选自酯基，4-甲氧基二氢吡喃酮基团一种。
进一步的，所述的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物，其为如下结构式1-4所示的化合物中的任一种，或该罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的异构体，或该罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物在药学上可接受的盐。
所述的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物在药学上可接受的盐，为该罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物与药学上可接受的盐形成的混合物，其中，药学上可接受的盐选自钠盐、钾盐、氨盐、盐酸盐及硫酸盐中的一种或几种。
所述的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的异构体，选自光学异构体、顺反异构体、外消旋体以及它们的混合物。
本发明还提供上述罗汉松烷型二萜类化合物1，半日花烷型二萜类化合物2，卡瓦内酯类化合物3、4的提取方法，包括如下步骤：
(1)以砂仁茎叶部分为原料，加入体积浓度80％-95％乙醇水溶液，回流提取2-4次，每次提取2-4h，合并得到的提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到5-15质量倍的水中，依次用5-15质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1-0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比50:1的馏分E3；
(4)馏分E3浓缩后，浓缩液E3经过硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到罗汉松烷型二萜类化合物1，半日花烷型二萜类化合物2和卡瓦内酯类化合物3-4。
上述提取方法中，所述的质量倍为加入的固态物质和液态物质的质量体积比。
所述步骤(1)中，按固液比，砂仁茎叶：乙醇水溶液＝1g：(7～15)mL。
所述步骤(4)馏分E3具体分离纯化过程为：
馏分E3浓缩后经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集石油醚和丙酮体积比为30:1的馏分，记为E33；
馏分E33浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为4:6的馏分E333和体积比为5:5的馏分E334；
馏分E334浓缩后经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、5:2、0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集石油醚和丙酮体积比为30:1的馏分，记为E3342，收集石油醚和丙酮体积比为10:1的馏分，记为E3344；
馏分E3342浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为80:20的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到罗汉松烷型二萜类化合物1；
馏分E3344浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为75:25的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到半日花烷型二萜类化合物2；
馏分E333浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为4:6的馏分，记为E3333；
馏分E3333浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为80:20的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到馏分E33331；
E33331经制备型手性色谱，以体积比为45:55的正己烷-异丙醇为流动相，进行纯化，得到卡瓦内酯类化合物3和卡瓦内酯类化合物4。
所述罗汉松烷型二萜类化合物、半日花烷型二萜类化合物及卡瓦内酯类化合物来自砂仁茎叶部分提取物。
所述砂仁茎叶部分提取物在制备抗炎和/或抗氧化药物中的应用。
一种药物组合物，其包含所述的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物、该罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的异构体、该罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物在药学上可接受的盐中的一种或多种；还包含药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂中的一种或它们的组合。所述药物组合物根据给药途径，分为口服药物组合物或注射给药药物组合物，所述的药物组合物剂型选自片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂和针剂中的一种。
本发明还提供所述的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物、该罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的异构体、该罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物在药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备抗炎和/或抗氧化药物中的应用。
本发明的优点在于：
本发明为了将砂仁的药用价值发挥到最大，对砂仁茎叶进行了系统的成分研究，提取了新的罗汉松烷型二萜类化合物、半日花烷型二萜类化合物及卡瓦内酯类化合物，利用核磁、质谱等手段对化合物的结构进行了确证。
本发明的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物或其异构体、在药学上可接受的盐或包含罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的药物组合物可以抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO活性。所述的罗汉松烷型二萜类化合物，或其异构体在药学上可接受的盐或包含罗汉松烷型二萜化合物的组合物可以保护过氧化氢(H2O2)诱导的小鼠神经小胶质瘤细胞BV-2氧化损伤，可以用于制备抗炎及抗氧化药物。并且相比于现有的从砂仁中提取的罗汉松烷型二萜类化合物，其具有良好的抗炎及抗氧化作用。
本发明进一步丰富砂仁活性物质的结构多样性，在此基础上，为后续得到的单体化合物进行相关生物活性测试奠定基础，为新药开发提供活性先导化合物，同时也为砂仁药材的深层次研究与开发提供理论依据。
附图说明
图1罗汉松烷型二萜类化合物1，半日花烷型二萜类化合物2，卡瓦内酯类化合物3和4对LPS诱导的RAW264.7中NO生成的抑制活性。
图2罗汉松烷型二萜类化合物1对H2O2诱导的BV-2细胞活力的评价。
图3罗汉松烷型二萜类化合物1对H2O2诱导的BV-2细胞裂解液中总GSH的含量的影响。
图4罗汉松烷型二萜类化合物1对H2O2诱导的BV-2细胞中ROS含量的影响。
图5罗汉松烷型二萜类化合物1通过激活NRF2/HO-1信号通路保护BV-2细胞免受氧化应激损伤。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步描述。
实施例1
砂仁中罗汉松烷型二萜类化合物1，半日花烷型二萜类化合物2，卡瓦内酯类化合物3、4的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为13.1kg的砂仁茎叶部分为原料，加入体积浓度90％乙醇水溶液(100L)，回流提取2次，每次提取2h，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到1348g总浸膏；
(2)将得到的总浸膏分散到7.4质量倍的水(10L)中，依次用5质量倍体积(6.74L)的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液(149g)和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比50:1的馏分E3；
(4)浓缩馏分E3得到25.2g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到3.7mg罗汉松烷型二萜类化合物1，2.1mg半日花烷型二萜类化合物2，4.1mg卡瓦内酯类化合物3和3.8mg卡瓦内酯类化合物4。具体分离纯化过程为：
馏分E3浓缩后经过硅胶柱色谱分离，收集石油醚和丙酮体积比为30:1的馏分，记为E33；
馏分E33浓缩后得到7.8g浓缩液，经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为4:6的馏分，记为E333，收集体积比为5:5的馏分，记为E334；
馏分E334浓缩后得到1.8g的浓缩液，经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、5:2、0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集石油醚和丙酮体积比为30:1的馏分，记为E3342，收集石油醚和丙酮体积比为10:1的馏分，记为E3344；
馏分E3342浓缩后得到262.2mg浓缩液，经制备型HPLC色谱，以体积比为80:20的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到3.7mg罗汉松烷型二萜类化合物1；
馏分E3344浓缩后得到578.2mg浓缩液，经制备型HPLC色谱，以体积比为75:25的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到2.1mg半日花烷型二萜类化合物2；
馏分E333浓缩后得到1.3g的浓缩液，经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为4:6的馏分，记为E3333；
馏分E3333浓缩后得到121.5mg浓缩液，经制备型HPLC色谱，以体积比为80:20的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到7.9mg E33331；
E33331经制备型手性色谱，以体积比为45:55的正己烷-异丙醇为流动相，进行纯化，得到4.1mg卡瓦内酯类化合物3和3.8mg卡瓦内酯类化合物4。
对提取到的罗汉松烷型二萜类化合物1，半日花烷型二萜类化合物2，卡瓦内酯类化合物3和4进行结构鉴定，具体的物理化学数据如下：
罗汉松烷型二萜类化合物1：白色无定型粉末，
HRESIMS(positive)m/z 285.1833[M+Na]+(calcd for C17H26O2Na,285.1825)，确定罗汉松烷行二萜类化合物有1分子式C17H26O2，1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见表1。
半日花烷型二萜类化合物2：黄色油状物，
HRESIMS(negative)m/z 347.2232[M-H]-(calcd for C21H31O4,347.2227)，确定半日花烷型二萜类化合物2分子式C21H32O4，1H-NMR(600MHz,CD3OD)和13C-NMR(150MHz,CD3OD)数据见表2。
卡瓦内酯类化合物3：白色无定型粉末，
HRESIMS(positive)m/z 413.1360[M+Na]+(calcd for C24H22O5Na,413.1359)，确定卡瓦内酯类化合物3分子式C24H22O5，ECD(CH3OH,c＝0.5mg/mL)λnm(Δε)235(+18.8),280(+15.0)，1H-NMR(600MHz,CD3OD)和13C-NMR(150MHz,CD3OD)数据见表3。
卡瓦内酯类化合物4：白色无定型粉末，
HRESIMS(positive)m/z 413.1360[M+Na]+(calcd for C24H22O5Na,413.1359)，确定卡瓦内酯类化合物4分子式C24H22O5，ECD(CH3OH,c＝0.5mg/mL)λnm(Δε)235(-18.8),280(-15.4)，1H-NMR(600MHz,CD3OD)和13C-NMR(150MHz,CD3OD)数据见表3。
表1罗汉松烷型二萜类化合物1的碳谱和氢谱数据
表2半日花烷型二萜类化合物2的碳谱和氢谱数据
表3卡瓦内酯类化合物3和4的碳谱和氢谱数据
通过理化数据和现代波谱学手段(HRESIMS和NMR)，结合公开文献相关数据，鉴定上述罗汉松烷型二萜类和半日花烷型二萜类以及卡瓦内酯类化合物的结构，确定化合物1-4为新化合物，结构如下所示：
实施例2
砂仁中罗汉松烷型二萜类化合物1，半日花烷型二萜类化合物2，卡瓦内酯类化合物3、4的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为13kg的砂仁茎叶部分为原料，加入体积浓度为90％乙醇水溶液(110L)，回流提取2次，每次提取2h，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到1345g总浸膏；
(2)将总浸膏分散到8.6质量倍的水中(11.5L)，依次用6质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液(154g)和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比50:1的馏分E3；
(4)浓缩馏分E3得到26.5g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱收集体积比30:1的馏分E33；浓缩馏分E33得到8.1g浓缩液，浓缩液经过ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3和1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到3.5mg罗汉松烷型二萜类化合物1，2.6mg半日花烷型二萜类化合物2，3.6mg卡瓦内酯类化合物3，3.8mg卡瓦内酯类化合物4。具体分离纯化过程同实施例1。
实施例3
砂仁中罗汉松烷型二萜类化合物1，半日花烷型二萜类化合物2，卡瓦内酯类化合物3、4的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为13.3kg的砂仁茎叶部分为原料，加入体积浓度为80％乙醇水溶液(150L)，回流提取4次，每次提取3h，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到1353g总浸膏；
(2)将总浸膏分散到11.7质量倍的水中(15.8L)，依次用10质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液(157g)和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比50:1的馏分E3；
(4)浓缩馏分E3得到26.9g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱收集体积比30:1的馏分E33；浓缩馏分E33得到8.1g浓缩液，浓缩液经过ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3和1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到3.8mg罗汉松烷型二萜类化合物1，2.1mg半日花烷型二萜类化合物2，4.0mg卡瓦内酯类化合物3，4.8mg卡瓦内酯类化合物4。具体分离纯化过程同实施例1。
实施例4
上述实施例提取得到的罗汉松烷型二萜类化合物1，半日花烷型二萜类化合物2，卡瓦内酯类化合物3和4具有对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的抑制作用，具体操作如下：
(1)细胞培养
将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养于含10％的胎牛血清、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素钠的DMEM培养基中，在条件为37℃、5％CO2的恒温培养箱中进行孵育生长。
(2)检测化合物1-4对RAW264.7细胞生成NO的影响研究
取对数期生长的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7，将细胞浓度调至3.5×104cells/well接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬浮液。实验中同时设立对照组(RAW264.7细胞、DMSO)、模型组(RAW264.7细胞、DMSO、0.5μg/mL的LPS)、阳性药组(RAW264.7细胞、地塞米松、0.5μg/mL的LPS)以及待测药物组(RAW264.7细胞、待测各化合物、0.5μg/mL的LPS)。在5％CO2、37℃恒温培养箱中培养孵育24h，再吸取40μL细胞上清液放置于酶标板内，每孔加入40μL等体积的Griess试剂，使其与细胞上清液混匀反应完全。室温反应10min后使用酶标仪检测孔中溶液在540nm处的吸光度值。计算化合物1-4处理组的抑制率(％)以评价抑制释放NO活性。结果如表4及附图1所示。
表4罗汉松烷型二萜类化合物1对RAW264.7细胞的抑制率
从实验结果可以发现，化合物1-4对RAW264.7细胞的抑制率分别为20％，32％，30％，-10％。表明本发明的化合物1-3具有体外抗炎效应。
实施例5
上述实施例提取得到的罗汉松烷型二萜类化合物1具有对过氧化氢(H2O2)诱导的小鼠神经小胶质瘤细胞BV-2氧化损伤的保护作用，具体如下：
(1)细胞培养
将小鼠神经小胶质瘤细胞培养于含10％的胎牛血清、100μg/mL链霉素、100U/mL青霉素钠的DMEM培养基中，在条件为37℃、5％CO2的恒温培养箱中进行孵育生长。
(2)使用CCK-8法对罗汉松烷型二萜类化合物1的抗氧化活性进行评价
取对数期生长的小鼠神经小胶质瘤细胞BV-2，以浓度为1×104cells/well种于96孔板中，每孔含细胞悬液100μL。实验中同时设立对照组(BV-2细胞，DMSO)、模型组(BV-2细胞，DMSO，250μM H2O2)及待测药物组(BV-2细胞，待测化合物，250μM H2O2)。给药组给予罗汉松烷型二萜类化合物1后于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养孵育24h，接着模型组和待测药物组给予250μM H2O2，作用0.5h后每孔加入CCK-8试剂10μL，将96孔培养板放在培养箱中孵育1-4h，使用酶标仪测量450nm处的吸光度。计算罗汉松烷型二萜类化合物1处理组的细胞存活率(％)以评价其抗氧化活性。结果如图2所示：与H2O2模型组相比，给予罗汉松烷型二萜类化合物1进行预保护后显著提高BV-2细胞的存活率，表明本发明的化合物1具有体外抗氧化活性。
(3)上述提取得到的罗汉松烷型二萜类化合物1进行还原型谷胱甘肽GSH的检测
取对数生长期的BV-2细胞接种于6孔板中(5×105cells/well)，细胞在给予不同浓度罗汉松烷型二萜类化合物1预保护24h后，给予250μM H2O2处理30分钟后，收集细胞，按照检测试剂盒说明书提示进行细胞中GSH含量的检测。结果如图3所示，与对照组相比，H2O2组GSH含量下调。而与H2O2组相比，给予化合物1预保护后，BV-2细胞中总GSH含量上调，表明化合物1促进细胞中抗氧化相关产物还原型谷胱甘肽GSH的生成增加。
(4)罗汉松烷型二萜类化合物1进行细胞内活性氧ROS的检测
取对数生长期的BV-2细胞接种于6孔板中(5×105cells/well)，细胞在给予不同浓度罗汉松烷型二萜类化合物1预保护24h后，给予250μM H2O2处理30分钟后，收集细胞，按照活性氧检测试剂盒说明书提示进行细胞中ROS含量的检测。结果如图4所示，与对照组相比H2O2组ROS含量显著上调，而给予不同浓度罗汉松烷型二萜类化合物1后，ROS含量显著下调，表明罗汉松烷型二萜类化合物1可以抑制氧化应激过程中ROS的生成，进而抑制氧化损伤的发生。
(5)罗汉松烷型二萜类化合物1激活NRF2/HO-1信号通路保护BV-2细胞免受氧化应激损伤，具体操作如下：
取对数生长期的BV-2细胞接种于6孔板中(5×105cells/well)，细胞在给予不同浓度罗汉松烷型二萜类化合物1预保护24h后，给予250μM H2O2处理30分钟后，收集细胞，按照western blot实验方法进行操作，检测NRF2/HO-1信号通路相关蛋白KEAP1，NRF2，HO-1的表达。结果如图5所示，罗汉松烷型二萜类化合物1促进了NRF2的表达和KEAP1的降解，进一步促进了下游抗氧化相关蛋白HO-1的上调。这表明罗汉松烷型二萜类化合物1是通过激活NRF2/HO-1信号通路保护BV-2细胞免受氧化应激损伤。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。
Claims (10)
1.一种从砂仁中提取的化合物，其特征在于，所述化合物为如式(I)-(IV)所示罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物、或该化合物的异构体、或该化合物在药学上可接受的盐；
其中：R1选自氢，羟基，甲氧基中的一种；R2选自氢，羟基，甲氧基，羰基中的一种；R3和R4各自独立地选自甲基，羧基，醛基，酯基中的一种；R5，R6各自独立地选自酯基，4-甲氧基二氢吡喃酮基团一种。
2.根据权利要求1所述的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物，其特征在于，其为如下所示化合物中的任一种、或该化合物的异构体、或该化合物在药学上可接受的盐；
3.一种权利要求2所述的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以砂仁茎叶部分为原料，加入体积浓度为80％-95％乙醇水溶液，回流提取2-4次，每次提取2-4h，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到5-15质量倍的水中，依次用5-15质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1-0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比50:1的馏分E3；
(4)浓缩馏分E3，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到罗汉松烷型二萜化合物1，半日花烷型二萜类化合物2，卡瓦内酯类化合物3和4。
4.根据权利要求3所述的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，按固液比，砂仁茎叶：乙醇水溶液＝1g：(7～15)mL。
5.根据权利要求3所述的罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，对馏分E3的具体分离纯化过程包括：
馏分E3浓缩后经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集石油醚和丙酮体积比为30:1的馏分，记为E33；
馏分E33浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为4:6的馏分E333；收集体积比为5:5的馏分E334；
馏分E334浓缩后经过硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:1、50:1、30:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、5:2、0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集石油醚和丙酮体积比为30:1的馏分E3342；收集石油醚和丙酮体积比为10:1的馏分E3344；
馏分E3342浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为80:20的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到罗汉松烷型二萜类化合物1；
馏分E3344浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为75:25的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到半日花烷型二萜类化合物2；
馏分E333浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为2:8、4:6、5:5、7:3、1:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为4:6的馏分，记为E3333；
馏分E3333浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为80:20的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到馏分E33331；
E33331经制备型手性色谱色谱，以体积比为45:55的正己烷-异丙醇为流动相，进行纯化，得到卡瓦内酯类化合物3和卡外内酯类化合物4。
6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物、或所述化合物的异构体、或所述化合物在药学上可接受的盐中的一种或多种。
7.一种药物制剂，其特征在于，其为活性成分和药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂中的一种或它们的组合；其中，活性成分为权利要求1或2所述罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物或权利要求6所述药物组合物；所述制剂的给药途径为口服给药或注射给药，剂型为片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂或针剂。
8.权利要求1或2所述罗汉松烷型二萜类或半日花烷型二萜类或卡瓦内酯类化合物在制备抗炎和/或抗氧化药物中的应用。
9.权利要求6所述药物组合物或权利要求7所述药物制剂在制备抗炎和/或抗氧化药物中的应用。
10.一种砂仁茎叶部分提取物在制备抗炎和/或抗氧化药物中的应用。
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