CN103724318A - 九香虫酰胺a及其组合物和其在制药和食品中的应用 - Google Patents
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Abstract
提供从具有温中助阳的虫类中药九香虫中提取到的一个结构新颖的多巴胺三聚体即九香虫酰胺A及含其的药物组合物以及其在制备治疗糖尿病性肾病或慢性肾病的药物或保健食品中的应用。虫类通络理论临床应用效验，络与微血管病变相关。九香虫酰胺A具有显著抑制高糖诱导的肾系膜细胞分泌细胞外基质与炎症因子作用，且是Smad3磷酸化抑制剂，可显著抑制TGF-β1诱导的Smad3磷酸化及Smad3的表达，鉴于TGF-β/Smads信号途径是介导器官纤维化的主要病理，提示该化合物在慢性肾病包括糖尿病肾病与肾纤维化等中的应用价值。
Description
技术领域：
本发明属于药物技术领域，具体地，涉及九香虫酰胺A及含其的药物组合物及其在制备治疗糖尿病性肾病或慢性肾病的药物或保健食品中的应用。
背景技术：
糖尿病肾病或慢性肾病的危害、病理机制及药物研究的方法和原理，本申请人在已公开的专利申请（中国专利公开号：CN102153630A）中均有明确的描述。总之，慢性肾病在全球呈现高发和难治的局势。
现代研究表明TGF-β/Smads信号途径是介导慢性肾病包括糖尿病肾病和肾纤维化等的主要病理机制。Smad3过度磷酸化对于肾脏产生不利影响，因此对其进行有效地阻止将有利于肾病恢复。慢性肾病中多种促细胞炎症因子上调，细胞外基质分泌增加和聚集，降解减少，因此导致肾病不断进展。有效地降低细胞外基质和促细胞炎症因子等，可利于肾病恢复。
研究已经证实肾病属于微血管病变，属于中医的络病范畴。我们根据久病入络为瘀为虚，久病及肾，虫类通络的中医理论，提出肾病当从虫论治的思想。九香虫[Aspongopus chinensis Dallas(Pentatomidae)]属于传统中药，具有温中助阳功效，临床用于多种疾病，效果显著。但关于九香虫的现代研究几乎空白。我们根据上述中医药理论对九香虫抗慢性肾病作用进行了系统研究，并发现了具有抗慢性肾病前景的新颖化合物。现有技术中未见有本发明的化合物及其具有糖尿病肾病或慢性肾病价值治疗前景的活性的相关报道。
发明内容：
本发明提供了具有抗糖尿病肾病或慢性肾病价值的化合物九香虫酰胺A；含其的药物组合物；该发明的化合物在制备抗糖尿病性肾病或/和慢性肾病的药物或保健食品中的应用。
本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]，
治疗糖尿病肾病的药物组合物，含有治疗有效量的所述化合物九香虫酰胺A和药学上可接受的载体。
治疗慢性肾病的药物组合物，含有治疗有效量的所述化合物九香虫酰胺A和药学上可接受的载体。
本发明同时提供所述化合物九香虫酰胺A在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
所述化合物九香虫酰胺A在制备治疗慢性肾病的药物中的应用。
所述化合物九香虫酰胺A在制备治疗糖尿病肾病的保健食品中的应用。
所述化合物九香虫酰胺A在制备治疗慢性肾病的保健食品中的应用。
本发明还提供了化合物九香虫酰胺A的制备方法，取九香虫（Aspongopuschinensis Dallas），粉碎，依次用石油醚60-90℃,丙酮和50%甲醇室温不断搅拌提取，50%甲醇提取部分合并，减压回收溶剂得提取物，其用适量水混悬，然后用正丁醇等体积萃取3次，减压回收溶剂得正丁醇萃取物，正丁醇提取物经MCI gel CHP20P柱层析，10%-100%梯度甲醇水洗脱，1:1三氯化铁-铁氰化钾试剂显色跟踪，阳性斑点合并，并LC-MS跟踪分子量在450-600道尔顿区间的组份，得到组份Fr.3，其经Sephadex LH-20过滤层析(MeOH-H2O,80:20)，LC-MS如上跟踪得到Fr3.4，其经MCI gel CHP20P柱层析（10%-50%）得到10个组份，LC-MS如上跟踪得到Fr3.4.10，该组份经硅胶柱层析（CHCl3-MeOH,7:1–1:1)，LC-MS如上跟踪得到一个组份，其经半制备高效液相色谱纯化(MeOH-H2O,25:75)得到化合物1。
更具体的制备方法如下：取九香虫（Aspongopus chinensis Dallas），粉碎，依次用石油醚（60-90℃）(3×80L),丙酮(3×80L)和50%甲醇(3×80L)室温不断搅拌提取。50%甲醇提取部分合并，减压回收溶剂得提取物（1kg），其用适量水混悬，然后用正丁醇等体积萃取3次，减压回收溶剂得正丁醇萃取物(100g)。正丁醇提取物经MCI gel CHP20P柱层析，梯度甲醇水洗脱（10%-100%），三氯化铁-铁氰化钾（1:1）试剂显色跟踪，阳性斑点合并，并LC-MS跟踪分子量在450-600道尔顿区间的组份，得到组份Fr.3(10.5g)，其经Sephadex LH-20过滤层析(MeOH-H2O,80:20)，LC-MS如上跟踪得到Fr3.4（4g），其经MCI gel CHP20P柱层析（10%-50%）得到10个组份，LC-MS如上跟踪得到Fr3.4.10（50mg）。该组份经硅胶柱层析（CHCl3-MeOH,7:1–1:1)，LC-MS如上跟踪得到一个组份，其经半制备高效液相色谱纯化(MeOH-H2O,25:75)得到化合物1(1.3mg)。
本发明化合物可以单独直接应用或组合应用，也可以与其它药物包括植物提取物组成复方的形式使用，可以使用不同的药用辅料，制成多种固体制剂和液体制剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。
附图说明：
图1表示化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]抑制高糖诱导的肾系膜细胞促炎症因子及细胞外基质测定实验：采用USCK公司的ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6，Collagen IV和Fibronectin的表达；图1A为化合物对白细胞介素-6(IL-6)的抑制作用（量效与时效关系），*P<0.05vs正常糖;#P<0.05vs高糖；图1B为化合物对纤粘连蛋白（fibronectin）的抑制作用.*P<0.05vs正常糖;#P<0.05vs高糖；图1C为化合物对IV型胶原的抑制作用.*P<0.05vs正常糖;#P<0.05vs高糖;
图2表示化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamine A]抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化水平；
图3为化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]结构示意图。
具体实施方式：
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。
实施例1：
化合物1九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]的分离纯化：
取九香虫（Aspongopus chinensis Dallas），粉碎，依次用石油醚（60-90℃）(3×80L),丙酮(3×80L)和50%甲醇(3×80L)室温不断搅拌提取。50%甲醇提取部分合并，减压回收溶剂得提取物（1kg），其用适量水混悬，然后用正丁醇等体积萃取3次，减压回收溶剂得正丁醇萃取物(100g)。正丁醇提取物经MCI gel CHP20P柱层析，梯度甲醇水洗脱（10%-100%），三氯化铁-铁氰化钾（1:1）试剂显色跟踪，阳性斑点合并，并LC-MS跟踪分子量在450-600道尔顿区间的组份，得到组份Fr.3(10.5g)，其经Sephadex LH-20过滤层析(MeOH-H2O,80:20)，LC-MS如上跟踪得到Fr3.4（4g），其经MCI gel CHP20P柱层析（10%-50%）得到10个组份，LC-MS如上跟踪得到Fr3.4.10（50mg）。该组份经硅胶柱层析（CHCl3-MeOH,7:1–1:1)，LC-MS如上跟踪得到一个组份，其经半制备高效液相色谱纯化(MeOH-H2O,25:75)得到化合物1(1.3mg)。
化合物1的结构确证：
化合物1的结构式如下所示：
化合物1的结构鉴定数据为：
Aspongamine A(1).yellowish solid;[α]D 240(c0.03,MeOH).UV(MeOH)λmax:283(3.77),204(4.67)nm;1H and13C NMR spectroscopic data,see Table1;ESIMS:(positive)m/z600[M+Na]+;HREIMS:m/z577.2045[M]+(calcd forC30H31N3O9,577.2060).
Table1.1H(600MHz)and13C NMR(150MHz)Data of1in Methanol-d4(δ,ppm)
实施例2：
实施例1所得化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]，按常规法加注射用水，精滤，灌封灭菌后可制成注射液。
实施例3：
实施例1所得化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]，将其溶于无菌注射用水中，用无菌漏斗过滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。
实施例4：
实施例1所得化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]，按常规法配以各种药用辅料可制成片剂。
使用实施例1所得化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]作为药物活性成分，使用几种赋形剂作为制备组合药物片剂的辅料成分，按照一定比例配比制成每片含有药物成分1-100mg的片剂样品。
实施例5：
实施例1所得化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]按常规法配以各种药用辅料可制成胶囊剂：
含有实施例1所得化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]作为有效成分的药物组合胶囊制剂的制备，使用实施例1所得化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]作为药物活性成分、使用几种赋形剂作为制备组合药物胶囊剂的辅料成分，按照一定比例配比制成每粒胶囊中含有化合物成分1-100mg的胶囊制剂。
实施例6：
本发明化合物九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]及其与药用辅料组成的药物组合物的抗糖尿病肾病或慢性肾病的药理作用：
化合物1九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]抑制肾系膜细胞株炎症因子、细胞外基质的测定实验（见图1所示）：
采用Uscn公司的ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6，CollagenIV和Fibronectin表达。图1A为IL-6的化合物剂量和时效(30μM)依赖性表达；图1B为Fibronectin的化合物剂量和时效(30μM)依赖性表达；图1C为CollagenIV的化合物剂量和时效(30μM)依赖性表达。
炎症因子和细胞外外基质实验原理：
采用双抗体夹心法测定标本中大鼠系膜细胞培养上清IL-6、Fibronectin及Collagen IV表达水平。用纯化的抗IL-6、Fibronectin及Collagen IV抗体包被微孔板，制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入含表达IL-6、Fibronectin及Collagen IV的待测样品，再与HRP标记的抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-6、Fibronectin及Collagen IV的表达呈正相关。用酶标仪450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠IL-6、Fibronectin及Collagen IV浓度。
样本处理：
1）细胞培养上清：无菌管收集，2,000rpm/min，离心20min。仔细收集上清。分装冻存于-80℃。
2）刮取底壁细胞，总蛋白裂解液裂解，12,000rpm/min，4℃离心10min，收集上清，Bradford法测量总蛋白含量。
ELISA检测：
操作按试剂盒说明进行：
1）标准品的稀释与加样：酶标包被板设标准品孔，倍比稀释（稀释后各孔加样量都为50μl）加入IL-6、Fibronectin及Collagen IV的标准品。
2）加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品和酶标试剂，其余各骤操作相同）、待测样品孔（样品稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀。
3）温育：37℃，30min。
4）洗涤：弃去板中液体，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水纸拍干。
5）加酶：每孔加入50μl酶标记液，空白孔除外。
6）温育：37℃，30min。
7）洗涤：弃去板中液体，甩干，洗液洗5次，30秒/次。吸水纸拍干。
8）显色：每孔加入底物A、B液各50μl/孔。37℃，15min。避光。
9）终止：每孔加入终止液各50μl/孔。
10）测定：以空白孔调零，酶标仪450nm读吸光度（OD值）。
11）实验重复3次。
结果计算：利用标准品定量曲线分析计算样品浓度并以细胞总蛋白含量校正（IL-6：pg/mg cell protein；Fibronectin&Collagen IV：ng/mg cell protein）。
以上结果说明化合物(+)-1和(-)-1在1，3，10和30μM时对高糖诱导的肾系膜细胞株炎症因子IL-6、Fibronectin及Collagen IV均有剂量依赖性的抑制作用。
为了排除化合物1对于细胞的毒性影响，每次实验结束均采用MTT实验检测细胞活力。各组间数据没有统计学差异（数据未显示），显示化合物在起效浓度时对细胞无毒性，。
化合物1九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞Smad3磷酸化：
大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）用含10%胎牛血清(Gibco,life technologies)的DMEM培养基培养，化合物用DMSO溶解.人重组TGF-β1(catalog number240-B/CF,R&D systems)按照指定方法用含0.1%的胎牛血清的去离子水溶解。细胞用不同浓度的药物提前孵育1小时，然后用TGF-β1(10ng/mL)刺激1小时，收集细胞按照常规指定方法进行Western blot分析。抗体为anti-phospho-Smad3(catalog number9520S),anti-Smad3(catalog number9523S,Cell SignalingTechnology,Inc.,Beverly,MA).
鉴于上述细胞因子、胶原和Smad3蛋白磷酸化在慢性肾病中呈现过度表达和分泌，因此本发明结果提示化合物1对慢性肾病具有积极的防治效果。
Claims (8)
1.具有下述结构式的九香虫酰胺A[(±)-Aspongamide A]，
2.治疗糖尿病肾病的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。
3.治疗慢性肾病的药物组合物，含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。
4.权利要求1所述的化合物在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
5.权利要求1所述的化合物在制备治疗慢性肾病的药物中的应用。
6.权利要求1所述的化合物在制备治疗糖尿病肾病的保健食品中的应用。
7.权利要求1所述的化合物在制备治疗慢性肾病的保健食品中的应用。
8.权利要求1所述的化合物的制备方法，取九香虫（Aspongopus chinensisDallas），粉碎，依次用石油醚60-90℃,丙酮和50%甲醇室温不断搅拌提取，50%甲醇提取部分合并，减压回收溶剂得提取物，其用适量水混悬，然后用正丁醇等体积萃取3次，减压回收溶剂得正丁醇萃取物，正丁醇提取物经MCI gel CHP20P柱层析，10%-100%梯度甲醇水洗脱，1:1三氯化铁-铁氰化钾试剂显色跟踪，阳性斑点合并，并LC-MS跟踪分子量在450-600道尔顿区间的组份，得到组份Fr.3，其经Sephadex LH-20过滤层析(MeOH-H2O,80:20)，LC-MS如上跟踪得到Fr3.4，其经MCI gel CHP20P柱层析（10%-50%）得到10个组份，LC-MS如上跟踪得到Fr3.4.10，该组份经硅胶柱层析（CHCl3-MeOH,7:1–1:1)，LC-MS如上跟踪得到一个组份，其经半制备高效液相色谱纯化(MeOH-H2O,25:75)得到化合物1。
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