CN103553888B

CN103553888B - 厚朴酚衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

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Publication number: CN103553888B
Application number: CN201310548100.3A
Authority: CN
Inventors: 吴成柱; 刘浩; 李红梅; 赵素容; 霍强; 李见春
Original assignee: BENGBU MEDICAL COLLEGE
Current assignee: BENGBU MEDICAL COLLEGE
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2033-11-07
Also published as: CN103553888A

Abstract

本发明提供一种和厚朴酚衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明通过采用活性追踪分离法从广玉兰的成熟果实中提取分离得到了新骨架的和厚朴酚衍生物。所述和厚朴酚衍生物或其盐可按本制剂领域已知方法制成肠道或非肠道组合药的剂型，制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂，制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。本发明提供的和厚朴酚衍生物具有比中药厚朴有效成分和厚朴酚更优良的抗肿瘤活性和较好的诱导肿瘤细胞凋亡的作用，具有良好的临床抗肿瘤药应用前景。

Description

厚朴酚衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于天然化合物领域，涉及一种从植物中提取的厚朴酚衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤的发生是细胞异常增生和凋亡不足的结果，细胞凋亡在肿瘤的发生发展中主要起负调控作用。抗凋亡蛋白Bcl-2是凋亡四大关键元件之一，Bcl-2的高表达往往被看作是对各种凋亡刺激的保护，因此Bcl-2低表达或缺失的细胞凋亡率明显增加。位于凋亡机制核心的半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinylaspartasespecificproteinase,Caspase)家族成员之一的Casepase3在凋亡机制中扮演着重要角色，参与多种因素诱导的细胞凋亡并使细胞凋亡得以完成。目前越来越多的研究表明，Bcl-2和Casepase3在肿瘤细胞凋亡过程中起重要作用，且关系密切。

随着药物的开发、研究水平不断提高，从天然来源物质中寻找对肿瘤具有抑制作用的活性化合物或药物组合物，并进一步获得具有临床价值的在制备抗肿瘤药物中的应用成为研究热点。

广玉兰(MagnoliagrandifloraL.)又名荷花玉兰，属木兰科木栏属植物，为常绿阔叶大乔木。广玉兰为传统中药厚朴(Magnoliaofficinalis)的同属植物，具有退热、止腹泻、抗风湿病、降压、抗氧化、抗真菌等药理作用。据文献报道，广玉兰花、叶、木部和果实中含有多种各类化学成分，包括木脂素类、黄酮类、萜类、厚朴分类、和厚朴酚类、生物碱和倍半萜内酯等(程永芳,宗磊,金玉兰.广玉兰叶乙醇提取物对植物病原真菌抗菌活性研究.中国农业通报.2010,26,267-270；HuangHC,HsiehWY,NiuYL,ChangTM.InhibitionofmelanogenesisandantioxidantpropertiesofMagnoliagrandifloraL.flowerextract.BMCComplementary&AlternativeMedicine.2012,12,72-81；WuSH,LuoXD,MaYB,HaoXJ,ZhouJ,WuDG.TwonewgermacranolidesfromMagnoliagrandiflora.JAsianNatProdRes.2001,3,95-102)。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种新结构的厚朴酚衍生物及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种厚朴酚衍生物，其结构式如下：

本发明通过采用活性追踪分离法从广玉兰的成熟果实中提取分离得到了新骨架的厚朴酚衍生物。

所述厚朴酚衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)用甲醇作为提取溶剂，利用冷浸法对广玉兰的果实进行提取，获得甲醇浸膏；

(2)将步骤(1)获得的甲醇浸膏用同等体积的水和乙酸乙酯进行萃取，获得乙酸乙酯层浸膏；

(3)对步骤(2)获得的乙酸乙酯层浸膏实施硅胶柱色谱，进行分离，获得活性馏分；

(4)将步骤(3)获得的活性馏分，通过半制备液相精制，获得新骨架的厚朴酚衍生物单体。

本发明提供含有所述厚朴酚衍生物或其盐作为有效成分的药物组合物。

本发明的另一个目的在于提供所述厚朴酚衍生物及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的关键之处是从广玉兰中提取分离得到新的厚朴酚衍生物，并证明了所述厚朴酚衍生物具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的作用；所述厚朴酚衍生物具有较强的抑制肿瘤细胞抗凋亡因子Bcl-2，并增强Caspase3活性。

本发明的有益效果是：(1)所述厚朴酚衍生物为全新结构的化学实体，具有比中药厚朴有效成分和厚朴酚更优良的抗肿瘤活性；(2)所述厚朴酚衍生物可有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肝癌HepG2细胞的增殖，且呈现浓度依赖性。(3)所述厚朴酚衍生物抑制肿瘤细胞抗凋亡因子Bcl-2，增强Caspase3活性，具有较好的诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

本发明所述的厚朴酚衍生物及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其中所述肿瘤为乳腺癌或肝癌。

本发明所述的厚朴酚衍生物及其盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其中所述肿瘤是造血系统、内分泌系统、肺系统、肠胃系统、骨骼肌系统、生殖系统、中枢神经系统或泌尿系统的癌症。

本发明所述的厚朴酚衍生物或其盐可按本制剂领域已知方法与药物赋形剂或载体组合制成肠道或非肠道组合药的剂型，制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂。

剂型的给药方式主要包括口服给药和注射给药。

附图说明

图1为本发明厚朴酚衍生物的提取分离流程图。

图2为本发明厚朴酚衍生物的¹H-NMR图谱。

图3为本发明厚朴酚衍生物的¹³C-NMR图谱。

图4为MTT法检测本发明厚朴酚衍生物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肝癌HepG2细胞增殖影响的直方图。

图5为溴化丙啶单染及流式细胞术检测处理本发明厚朴酚衍生物诱导人肝癌HepG2细胞凋亡能力的信号波形图。其中，对照为未加药组，给药组给药浓度依次为10、20μmol/l，阳性对照为紫杉醇100nmol/l。

图6为Westernblotting(蛋白印迹)检测经不同浓度本发明厚朴酚衍生物处理后的人肝癌HepG2细胞中Bcl-2和Caspase3蛋白表达的显影。其中，对照为未加药组，给药组给药浓度依次为10、20、30μmol/l。

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施作进一步的描述，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。以下为方便起见，本发明所述厚朴酚衍生物称为化合物1。

实施例1

化合物1的提取分离和结构鉴定

(1)实验材料：

试剂：硅胶(Kieselegel60,230～400目,Merk公司)；薄层色谱板(硅胶60F254,Meck公司)；色谱柱(YMC,J’sphereODS-H80,150X10mm,5μm)；所有试剂均为分析纯(天津市大茂化学试剂厂)。

仪器：BrukerARX-400核磁共振仪(德国Bruker公司)；JMS-HX/HX110A型质谱仪、半制备高效液相(美国Waters)；旋转蒸发仪(日本Eyela公司)。

(2)提取与分离：

如图1示，广玉兰果实1.4kg用10L甲醇在室温条件下，另用冷浸法提取两次。利用旋转蒸发仪将甲醇提取液进行浓缩，得甲醇浸膏100g。将甲醇浸膏溶于水中，用同等体积的乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯部位浸膏13g。乙酸乙酯浸膏经硅胶柱色谱(230～400目)，以正己烷-乙酸乙酯(80:20和75:25)梯度洗脱，TLC检查后合并得10个组分Fr.1～10，并检测活性。活性馏分Fr.4(2.2g)中取200mg，经半制备液相精制(色谱柱:YMC,J’sphereODS-H80,150x10mm,5μm；流动相:65％MeCN,4ml/min)，得化合物1(40mg)。

(3)结构鉴定：

化合物1：紫色油状物；ESI-MSm/z557.2[M-H]^-，m/z559.5[M+H]⁺；HRESI-MSm/z559.2835calculated559.2848forC₃₈H₃₉O₄。另外将化合物1溶于CDCl₃，进行了核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)检测，如图2和3所示化合物1的¹H-NMR图谱和¹³C-NMR图谱，其NMR数据见表1：

表1.化合物1的NMR数据(CDCl₃,400MHz)

实施例2

MTT法检测化合物1对肿瘤细胞增殖的影响

该实验部分通过化合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肝癌HepG2细胞的杀伤作用进行效果评价。

(1)实验材料：

细胞株：人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肝癌HepG2细胞来源于美国AmericanTypeCultureCollection(ATCC)公司。

试剂：化合物1和格尔德霉素，蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；(噻唑蓝)MTT购自美国Sigma公司；培养液、(二甲基亚砜)DMSO、0.25％胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Hyclone；96孔培养板购自Corning公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司。

仪器：二氧化碳培养箱(美国SHELLLAB公司)；多功能酶标仪(美国BioTek)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

(2)方法：

细胞培养：将人乳腺癌细胞MDA-MB-231或人肝癌HepG2接种于DMEM(含10％灭活胎牛血清，100IU/l青霉素，100μg/ml链霉素)，置5％CO2，37℃，饱和湿度环境下培养并传代。

MTT法：取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μl培养液中含有8000个细胞，于5％CO₂饱和湿度37℃培养箱中培养。培养14h后，按不同浓度处理化合物1(同时设阳性对照组,格尔德霉素20μmol/l)，每个处理3个复孔，继续培养48h后每孔加入10μl浓度为5g/l的MTT溶液继续孵育4h，弃去培养液，每孔加入DMSO150μl，37℃孵育30min，微量振荡器振荡10min使结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm波长下检测每孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率：细胞存活率/％＝实验组A_570nm/对照组A_570nm×100％，绘制剂量效应曲线。以上实验重复3次。

(3)实验结果：

见附图4，从结果可看出，化合物1在体外可抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肝癌HepG2细胞的增殖，IC₅₀值分别为4.8μmol/l和5.1μmol/l，并且其细胞毒性与药物浓度成正比。

实施例3

溴化丙啶单染及流式细胞术检测化合物1诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的能力

(1)实验材料：

细胞株：人肝癌HepG2细胞来源于美国AmericanTypeCultureCollection(ATCC)公司。

试剂：化合物1和紫杉醇，蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；培养液、DMSO、0.25％胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Hyclone；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司；溴化丙啶(propidiumiodine,PI)购自美国Sigma公司。

仪器：二氧化碳培养箱(美国SHELLLAB公司)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；流式细胞仪(美国BECTONDICKNSON公司)。

(2)方法：

将对数生长期的HepG2细胞制成单细胞悬液接种于6孔细胞培养板，每孔5×10⁵个细胞，培养14h细胞贴壁后分别加入化合物1(1020)和阳性对照紫杉醇处理，继续培养48h后收集细胞至10ml离心管，2000r·min^-1，离心10min，去上清。用PBS洗涤一次并转移到5ml离心管，2000r·min^-1，离心5～10min，去上清，各管分别加入冰上预冷的75％乙醇1ml固定,置于4℃冰箱过夜。第二天取出各管，2000r·min^-1，离心5min，去上清。各管分别加3mlPBS重悬，2000r·min^-1，离心5min，去上清。各管分别加入600μl的PI染液染色，室温，避光反应30min，上流式细胞仪进行检测，以上实验重复3次。检测具有亚G₁期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。

(3)实验结果：

见附图5，从结果可看出不同浓度化合物1处理人肝癌HepG2细胞48h后，可观察到化合物1在低浓度(10、20μmol/l)具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡作用，凋亡率分别为5.9％和21.4％，阳性对照组(紫杉醇100nmol/l)为7.5％。此结果说明化合物1具有显著地诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并且与药物浓度成正比。

实施例4

Westernblotting检测化合物1对人肝癌HepG2细胞中Bcl-2,Caspase3蛋白表达的影响

(1)实验材料：

试剂：化合物1，蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；DMEM培养液、DMSO、0.25％胰蛋白酶、青霉素和链霉素、购自Hyclone；6孔板购自Corning公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司；兔抗人Bcl-2抗体(Proteintech公司)；兔抗人Caspase3(Abcam公司)；β-actin(美国SantaCruz公司)；二抗(美国SantaCruz公司)；ECL反应液(美国SantaCruz公司)。

仪器：二氧化碳培养箱(美国SHELLLAB公司)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)；电泳仪(美国BIO-RAD公司)；倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)；超速离心机(美国Beckman)。

(2)方法：

Westernblotting：调细胞浓度为5x10⁵/ml接种于6孔板，2ml/孔，24h后开始给药。收集培养细胞，用冰PBS清洗后，滤纸吸干液体后加入细胞裂解液，200μl/孔，置冰上30min，细胞刮下，转移至EP管内80℃冻存，经3次反复冻融后BCA法定量。取蛋白提取物40μg，加入5xSDS上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，做SDS-PAGE电泳，积层胶恒压70V，分离胶恒压90V，电泳至溴酚蓝燃料到达凝胶最前沿，停止电泳。

转膜：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的Transferbuffer中。同时取适当大小的PVDF膜和4张3M滤纸，将PVDF先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一起浸于Transferbuffer中，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒压50V，4℃层析柜中转膜1.5h。

封膜：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1h。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于1:1000稀释的兔抗人Bcl-2(含5％脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)、1:1000兔抗人Caspase3一抗(含5％脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)中，在4℃过夜。TBST漂洗5minx5次，再浸于1：5000稀释的二抗(含5％脱脂奶粉的TBST，pH7.4配制)中，在室温1h，TBST漂洗5minx4次。配制显色液(ECLA0.5ml,ECLB0.5ml)，放置凝胶成像系统中显色分析。

(3)实验结果：

见附图6，从结果可看出，随着化合物1浓度的增加，抗凋亡因子Bcl-2蛋白质含量显著减少，并且促凋亡蛋白Caspase3的活性增强。泳道1：对照；泳道2：10μmol/l的化合物1；泳道3：20μmol/l的化合物1；泳道4：30μmol/l的化合物1。

实施例5.

化合物1与和厚朴酚的细胞毒性对照实验

(1)实验材料：

试剂：和厚朴酚、化合物1蚌埠医学院安徽省生化药物工程技术研究中心；(噻唑蓝)MTT购自美国Sigma公司；培养液、二甲基亚砜购自Hyclone；96孔培养板购自Corning公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司。

(2)方法：

取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100μl培养液中含有8000个细胞，于5％CO₂饱和湿度37℃培养箱中培养。培养14h后，按不同浓度处理和厚朴酚和化合物1，每个处理3个复孔，继续培养48h后每孔加入10μl浓度为5g/l的MTT溶液继续孵育4h，弃去培养液，每孔加入DMSO150μl，37℃孵育30min，微量振荡器振荡10min使结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm波长下检测每孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率，其半数抑制浓度(IC₅₀)数据见表2。

(3)实验结果：

见表2结果可看出，本发明中涉及的化合物1与中药厚朴中的主要活性成分和厚朴酚相比对肿瘤细胞具有更强的的细胞毒性。化合物1与和厚朴酚比较，在人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人肝癌HepG2细胞中的细胞毒性(IC₅₀)分别为强4.6倍和3.8倍。

表2.和厚朴酚与化合物1的细胞毒性

以上实验充分证明了本发明中的厚朴酚衍生物(化合物1)具有抗肿瘤药用价值，并且比中药厚朴中的有效成分和厚朴酚具有更优良的抗肿瘤活性。

Claims

1.一种厚朴酚衍生物，其结构式如下：

2.如权利要求1所述的厚朴酚衍生物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

3.如权利要求1所述的厚朴酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.如权利要求3所述的厚朴酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤为乳腺癌或肝癌。

5.如权利要求3所述的厚朴酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤是造血系统、内分泌系统、肺系统、肠胃系统、骨骼肌系统、生殖系统、中枢神经系统或泌尿系统的癌症。

6.如权利要求3至5中任一项所述的厚朴酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述厚朴酚衍生物与药物赋形剂或载体组成药物组合物，药物组合物的制剂形式包括液体制剂、片剂、颗粒剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或口崩制剂。

7.如权利要求6所述的厚朴酚衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述制剂的给药形式包括口服给药和注射给药。