CN103655582B - 一种环氧甾醇组合物及制备和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种环氧甾醇组合物，由环氧甾醇A和环氧甾醇B组成，两者的总含量大于95%。将海洋动物绿海葵经渗漉提取、浓缩中、柱层析分离纯化而制备。实验证明ESC显著抑制大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U251细胞的生长,诱导肿瘤细胞凋亡或坏死，可用于制备治疗脑胶质瘤药物。
Description
技术领域
本发明属医药领域，涉及一种环氧甾醇组合物的制备以及在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。具体来说，本发明涉及从海洋动物绿海葵Anthopleura midori中提取分离制备一种环氧甾醇组合物的方法和该组合物在治疗脑胶质瘤方面的应用。
背景技术
脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)是脑颅内最常见的肿瘤，约占颅内肿瘤的46%。世界卫生组织统计数据表明：恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35～54岁患者的第3位死亡原因，严重危害人类的健康及生命。与其它肿瘤的治疗类似，脑胶质瘤的治疗主要包括手术、放疗和化疗。化疗目前仍是世界上治疗胶质瘤的主要方法之一，常用治疗脑胶质瘤的药物有替莫唑胺(TMZ)、卡氮芥(BCNU)和环己亚硝脲(CCNU)等。但是，现有治疗脑胶质瘤的药物多有不足：(1)这些药物多为化学合成品，毒副作用比较大;(2)肿瘤细胞对药物耐药性的不断增加严重影响药物的疗效;(3)血脑屏障的阻碍限制了治疗脑胶质瘤药物到达脑内更有效发挥其疗效。因此，临床上需要疗效好、毒副作用小、容易透过血脑屏障的新型治疗脑胶质瘤药物，特别是天然来源的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种环氧甾醇组合物，是一种具有抗脑肿瘤生物活性的天然环氧甾醇组合物(ESC)，所述的ESC是由环氧甾醇A(epoxide sterol A,ES-A)和环氧甾醇B(epoxidesterol B,ES-B)两种化合物组成，它们的化学结构式为：
所述的ESC所含的环氧甾醇A和环氧甾醇B的比例为1～20：1克，优先1：1克；所述的ESC所含的环氧甾醇A和环氧甾醇B两者的总含量大于95%。
本发明的另一个目的是提供ESC的制备方法，通过以下步骤实现：
(1)ESC的提取分离纯化
将冷冻的绿海葵切成小块，用渗漉提取，合并渗漉液后经减压浓缩得到浓缩的提取液；浓缩的提取液用环己烷萃取，合并环己烷萃取液并经减压浓缩得到环己烷萃取物浸膏；环己烷萃取物浸膏经硅胶柱层析分离，分别用不同比例的环己烷/乙酸乙酯(4:1,2:1,1:1,1:2)、乙酸乙酯和甲醇依次洗脱；每100毫升1份分段收集环己烷/乙酸乙酯(1:2)的洗脱液，用硅胶薄层层析(TLC)检测各洗脱液，将含有ESC的各组分合并，经减压浓缩得到ESC粗品；ESC粗品再经反相硅胶(ODS)柱层析分离纯化，用体积比90%的甲醇洗脱，每50毫升1份分段收集洗脱液，用硅胶薄层层析检测各洗脱液，将含有ESC的组分合并，减压浓缩得ESC纯品。
所述渗漉提取用的溶媒为甲醇、乙醇或丙酮；所述硅胶柱层析硅胶用量与样品量的比例是30-60：1克；所述反相硅胶柱层析ODS用量与样品量的比例是30-60：1克。
(2)ESC的性质及组成成分的鉴定
ESC为无色粉末，溶于氯仿、乙酸乙酯、吡啶，微溶于甲醇、乙醇和丙酮，不溶于水和二甲基亚砜；Rf值为0.56(正相硅胶薄层层析，展开剂：环己烷/乙酸乙酯,1:2)和0.66(反相ODS薄层层析，展开剂：100%甲醇)；高效液相色谱(HPLC)分析证明ESC由ES-A(tR11.2min)和ES-B(tR11.7min)两个化合物组成，ES-A和ES-B的结构是根据NMR光谱分析和高分辨质谱数据而鉴定。
所述的HPLC条件是:Agilent1200液相色谱仪,Poroshell120EC-C18色谱柱(150×3.0mm,2.7μm)，乙腈/水(50/50)为流动相，检测波长203nm，流速为0.5mL/min，检测温度为23℃。
本发明的第三个目的是提供ESC在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。ESC可显著抑制大鼠脑胶质瘤C6细胞和人脑胶质瘤U251细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡和坏死，在制备治疗脑胶质瘤药物方面具有应用前景。
本发明所述药物为ESC活性物质单独或与其他药物或与有效成分一起，与药学上可接受的载体组成的药物；所述药物的制剂包括液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂。
本发明从海洋动物绿海葵中提取分离纯化一种具有生物活性的甾醇组合物ESC,提供了高纯度ESC的制备方法，证明了ESC对大鼠脑胶质瘤C6细胞和人脑胶质瘤U251细胞的生长具有显著的抑制作用，ESC在制备治疗脑胶质瘤药物方面具有良好应用前景。
本发明提供一种具有抗脑胶质瘤生物活性的环氧甾醇组合物(Epoxide sterol composition,ESC)，是从海洋动物绿海葵Anthopleura midori中提取分离纯化而制备；ESC由环氧甾醇A和B两个化合物以不同比例组成,两个环氧甾醇的总含量为70～98%；ESC显著抑制大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U251细胞的生长,诱导肿瘤细胞凋亡或坏死；ESC可用于制备治疗脑胶质瘤药物。
附图说明
图1是ESC的薄层层析(TLC)图谱；其中A：正相TLC图谱Rf值为0.56；B：反相TLC图谱Rf值为0.66。
图2是ESC的HPLC图谱，ES-A保留时间:tR11.2min,ES-B保留时间:tR11.7min。
图3是ESC的氢谱(1H-NMR)。
图4是ESC的碳谱(13C-NMR)。
图5是ESC的1H-1H COSY谱。
图6是ESC的HMQC谱。
图7是ESC的HMBC谱。
图8是ES-A的氢谱(1H-NMR)。
图9是ES-A的碳谱(13C-NMR)。
图10是ES-A的高分辨质谱。
图11是ESC对胶质瘤细胞生长的抑制作用。
图12是ES-A对胶质瘤细胞生长的抑制作用。
图13是ES-A诱导人胶质瘤U251细胞凋亡和坏死。
图14是ES-A诱导人胶质瘤U251细胞凋亡和坏死的定量分析，图中B3为正常细胞，B4为早期凋亡细胞，B2为晚期凋亡细胞，B1为坏死细胞和细胞碎片。
具体实施例
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。但是，本发明不限于这些实施例。
实施例1ESC的制备
(1)ESC的提取分离纯化
将冷冻的绿海葵(10只)切成小块，用甲醇渗漉提取三次，第一次用甲醇2000mL，渗漉时间为24小时，后两次用甲醇1000mL，时间为4小时。甲醇渗漉液合并后经减压浓缩得到约300mL的甲醇提取液。甲醇提取液用环己烷萃取三次，每次环己烷300mL。合并环己烷萃取液并经减压浓缩得到环己烷萃取物浸膏(15.6克)。环己烷萃取物浸膏经硅胶柱层析分离，分别用不同比例的环己烷/乙酸乙酯(4:1,2:1,1:1,1:2)、乙酸乙酯和甲醇各1000mL依次洗脱。每100毫升1份分段收集环己烷/乙酸乙酯(1:2)的洗脱液，用硅胶薄层层析(展开剂：环己烷/乙酸乙酯,1:2，10%硫酸加热显色)方法检测各洗脱液，将含有ESC的各组分合并，经减压浓缩得到ESC粗品。ESC粗品再经反相硅胶(ODS)柱层析分离纯化,用90%甲醇洗脱，每50毫升1份分段收集洗脱液,用硅胶薄层层析(展开剂：环己烷/乙酸乙酯,1:2，10%硫酸加热显色)方法检测各洗脱液，将含有ESC的组分合并，减压浓缩得ESC纯品(168mg)。
(2)ESC的性质及组成成分的结构鉴定
ESC为白色粉末，溶于氯仿、乙酸乙酯、吡啶，微溶于甲醇、乙醇和丙酮，不溶于水和二甲基亚砜；Rf值为0.56(正相硅胶薄层层析，展开剂：环己烷/乙酸乙酯,1:2，10%硫酸加热显色，附图1-A)和0.66(反相ODS薄层层析，展开剂：100%甲醇，10%硫酸加热显色，附图1-B)；高效液相色谱(HPLC)分析证明ESC由ES-A(保留时间tR11.2min)和ES-B(保留时间tR11.7min)两个化合物组成(附图2)，根据ESC的氢谱(附图3)，碳谱(附图4)，COSY谱(附图5)，HMQC谱(附图6)，和HMBC谱(附图7)，ES-A和ES-B的结构鉴定为两个新天然环氧甾醇化合物，ESC的13C和1H NMR信号归属和远程氢-碳相关性(HMBC)见表一。
ESC进一步用HPLC分离得到纯化合物ES-A。所用HPLC的分离条件是:Agilent1200高效液相色谱仪，Poroshell120EC-C18色谱柱(150×3.0mm,2.7μm)，乙腈/水(50/50)为流动相，检测波长203nm，流速为0.5mL/min，温度为23℃。ES-A为无色粉末，分子式为C28H46O2，溶于氯仿、乙酸乙酯、吡啶，微溶于甲醇、乙醇和丙酮，不溶于水和二甲基亚砜。ES-A的氢谱见附图8，碳谱见附图9(13C和1H NMR信号归属见表一)；高分辨质谱为415.3563[M+H]+(附图10，计算值C28H47O2：415.3576)。
实施例2ESC和ES-A抑制胶质瘤细胞生长的作用
大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U251细胞用DMEM和10%FBS培养基在37℃和5%二氧化碳的孵化箱中培养，经过三代培养的细胞用于本发明的实验研究。目前临床上治疗脑胶质瘤的一线药物替莫唑胺(TMZ)用作阳性对照。ESA由ES-A和ES-B两种化合物(1:1克)组成，两者的总含量为97.8%。
用磺酰罗丹明B(SRB)法测定肿瘤细胞存活率。细胞接种于96孔板中，贴壁24h后加入不同浓度的ESC和ES-A。药物处理72h后用SRB染色，用酶标仪测定515nm处的吸收光度值，检测肿瘤细胞的存活率，计算ESC和ES-A的IC50值。实验结果表明：ESC和ES-A对大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U251细胞有显著的抑制作用，并成剂量依赖性(附图11和12)，其IC50值见表二。
实施例3ES-A诱导肿瘤细胞凋亡和坏死的作用
用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和碘化丙啶(PI)双重染色测定ES-A诱导人胶质瘤U251细胞凋亡和坏死的作用。肿瘤细胞和不同浓度的ES-A在37℃的孵化箱中培养72小时后用10μg/mL的DAPI和5μg/mL的PI在室温下染色20分钟。用PBS洗涤两次后，在40倍的荧光显微镜观察肿瘤细胞凋亡和坏死情况，凋亡细胞经DAPI染色后为亮蓝色，坏死细胞经碘化丙啶(PI)染色后为红色。实验结果显示：ES-A40(μM和80μM))引起人胶质瘤U251细胞凋亡和坏死(附图13)。
表一：ESC和ES-A的核磁共振光谱(NMR)数据(in pyridine-d5)
a每一纵列带有相同字母的数据可能会互相变换。
表二.ESC和ES-A对胶质瘤细胞的抑制作用(IC50:μM)
| 肿瘤细胞 | ESC | ES-A | TMZ |
| 大鼠胶质瘤C6 | 18.59±0.32 | 2.41±0.52 | 69.58±6.10 |
| 人胶质瘤U251 | 64.26±3.75 | 40.94±1.06 | >200 |
用Annexin V-FITC/PI双染色分析方法对ES-A诱导人胶质瘤U251细胞凋亡和坏死的作用进行了定量分析。将人胶质瘤U251细胞用ES-A(40μM和80μM)处理72小时后，收集1×106个细胞。细胞用冷的PBS缓冲液洗涤后重新分散在100μL含有5μL Annexin V-FITC和1μL100μg/mL PI工作液的结合缓冲液中。细胞在室温下孵化15分钟后加入400μL结合缓冲液，用流式细胞仪检测其荧光(激发波长：488nm；发射波长：530nm和575nm)。实验结果表明：与对照组U251细胞凋亡和坏死率(2.12%)比较，ES-A处理后72小时可引起U251细胞凋亡和坏死率升高到16.98%(40μM)和27.92%(附图14，图中B3为正常细胞，B4为早期凋亡细胞，B2为晚期凋亡细胞，B1为坏死细胞和细胞碎片)。
综上所述，本发明证明ESC和它的主要成分之一ES-A显著抑制大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U251细胞的生长，诱导肿瘤细胞的凋亡和坏死。所以，由ESC制备的相关药物在治疗脑胶质瘤方面具有应用前景。
Claims (7)
1.一种环氧甾醇组合物，其特征在于，包含环氧甾醇A和环氧甾醇B，它们的化学结构式为：
其中环氧甾醇A和环氧甾醇B的比例为1~20：1，环氧甾醇A和环氧甾醇B两者的总含量大于95%；
所述的环氧甾醇组合物通过以下步骤实现：
将冷冻的绿海葵切成小块，用渗漉提取，合并渗漉液后经减压浓缩得到浓缩的提取液；浓缩的提取液用环己烷萃取，合并环己烷萃取液并经减压浓缩得到环己烷萃取物浸膏；环己烷萃取物浸膏经硅胶柱层析分离，分别用4: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2比例的环己烷/乙酸乙酯、乙酸乙酯和甲醇依次洗脱；每100毫升1份分段收集环己烷/乙酸乙酯的洗脱液，用硅胶薄层层析检测各洗脱液，将含有环氧甾醇组合物的各组分合并，经减压浓缩得到环氧甾醇组合物粗品；环氧甾醇组合物粗品再经反相硅胶柱层析分离纯化，用90%的甲醇洗脱，每50毫升1份分段收集洗脱液，用硅胶薄层层析检测各洗脱液，将含有环氧甾醇组合物的组分合并，减压浓缩得环氧甾醇组合物纯品；其中渗漉提取用的溶媒为甲醇。
2.根据权利要求1所述的一种环氧甾醇组合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
将冷冻的绿海葵切成小块，用渗漉提取，合并渗漉液后经减压浓缩得到浓缩的提取液；浓缩的提取液用环己烷萃取，合并环己烷萃取液并经减压浓缩得到环己烷萃取物浸膏；环己烷萃取物浸膏经硅胶柱层析分离，分别用4: 1, 2: 1, 1: 1, 1: 2比例的环己烷/乙酸乙酯、乙酸乙酯和甲醇依次洗脱；每100毫升1份分段收集环己烷/乙酸乙酯的洗脱液，用硅胶薄层层析检测各洗脱液，将含有环氧甾醇组合物的各组分合并，经减压浓缩得到环氧甾醇组合物粗品；环氧甾醇组合物粗品再经反相硅胶柱层析分离纯化，用90%的甲醇洗脱，每50毫升1份分段收集洗脱液，用硅胶薄层层析检测各洗脱液，将含有环氧甾醇组合物的组分合并，减压浓缩得环氧甾醇组合物纯品；其中渗漉提取用的溶媒为甲醇。
3.根据权利要求2所述环氧甾醇组合物的制备方法，其特征在于，所述硅胶柱层析硅胶用量与样品量的比例是30~60：1。
4.根据权利要求2所述环氧甾醇组合物的制备方法，其特征在于，所述反相硅胶柱层析ODS用量与样品量的比例是30~60：1。
5.根据权利要求1所述的一种环氧甾醇组合物在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物由环氧甾醇组合物单独或与其它抗肿瘤药物或与其它活性化合物一起，与制剂允许的赋形剂或载体制成。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、缓释制剂。
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