CN115819213A - 一种抗肿瘤活性化合物、提取分离方法、药物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗肿瘤化合物技术领域，公开了一种抗肿瘤活性化合物、提取分离方法、药物及用途，所述化合物为式I的化学结构，或式I的化合物在药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物，

本发明能够从米团花中提取制备得到抗肿瘤活性化合物，且该化合物对人肝癌细胞具有抑制作用。

Description

一种抗肿瘤活性化合物、提取分离方法、药物及用途

技术领域

本发明涉及抗肿瘤化合物技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤活性化合物、提取分离方法、药物及用途。

背景技术

米团花为唇形科米团花属植物蜂蜜树Leucosceptrum canum Smith的叶或根皮，植物蜂蜜树，分布于四川、云南和西藏，具有清热解毒，利湿消肿，接骨止血之功效。主治高热无汗，无名肿毒，黄水疮，附骨疸，跌打骨折，外伤出血等。目前从米团花属植物中共分离出60多种化学成分，包括二倍半萜类、黄酮类、苯乙醇苷类、酰基糖苷类和酚类等，其中以二倍半萜和黄酮类为主要结构类型。

如上所述，在现有技术中，米团花主要用于主治高热无汗，无名肿毒，黄水疮，附骨疸，跌打骨折，外伤出血等疾病，将米团花的提取物作为抗肿瘤药物的目前还未有报道。

比如申请号为CN02149759.1的专利提出了一种米团花色素的提取方法及其应用。提取方法是：热水抽提米团花，然后把抽提液浓缩，加乙醇沉淀，离心或过滤，上清液浓缩得米团花色素的水剂。若再经干燥，得米团花色素粉剂，该提取方法工艺简单，提取率高。该专利方案主要是从米团花中提取出色素用于食品、药物、化妆品和化工行业，，虽然其提到从米团花中提取色素用于药物，但其仅仅是提取其中的色素用于药物，但其提取的是什么化学物质，用于治疗什么疾病的药物，该技术方案中并未提及。

因此，目前还没有关于从米团花中提取抗肿瘤活性化合物的相关研究，本申请就从米团花中提取相关活性化合物，用于抗肿瘤使用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种抗肿瘤活性化合物、提取分离方法、药物及用途，能够从米团花中提取制备得到抗肿瘤活性化合物，且该化合物对人肝癌细胞具有抑制作用。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

第一方面，本发明提供了一种抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C，化学名称为12-羟基-8,11,13,15-松香烷四烯-2,7-二酮，结构如下式I所示：

本发明还提供了式I的化合物在药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物。

第二方面，本发明还提供了上述抗肿瘤活性化合物的提取分离方法，采用如下技术方案：

步骤(1)、以米团花的风干枝条为原料，粉碎后有机溶剂浸提，低温减压浓缩得到浸膏；

步骤(2)、将浸膏和水混合得悬浊液，加入乙酸乙酯萃取，低温减压浓缩得到乙酸乙酯萃取相；

步骤(3)、采用硅胶柱层析分离乙酸乙酯萃取相，以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚和乙酸乙酯体积比依次为9.8～10.2:1、4.8～5.2:1、2.8～3.2:1、0.8～1.2:1，收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为0.8～1.2:1时对应的洗脱液，然后经薄层层析分析，合并相似组分得到不同的初组分F41-F44；

步骤(4)、将初组分F42经制备液相色谱分离，以乙腈和水作为洗脱剂等度洗脱，得到式I所示的抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C。

进一步的，步骤(1)中有机溶剂为体积分数≥90％的乙醇，与米团花枝条的体积质量比为10～20mL：1g；浸提温度为65～75℃，浸提2～3次，每次4～6h。

进一步的，步骤(1)和步骤(2)中低温减压浓缩的温度为40～50℃，真空度为0.07～0.09MPa。

进一步的，步骤(2)中浸膏和水的质量比为1:1～3，乙酸乙酯与悬浊液体积比0.8～1:1，萃取2～4次。

进一步的，步骤(4)洗脱剂中乙腈的体积分数为35～45％，其余为水。

本发明的抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C以米团花的枝条为原料，经破碎、浸提、减压浓缩、萃取和多次分离纯化得到。制备时，选用干燥的米团花枝条或者将米团花枝条干燥后使用，这样方便枝条破碎。以石油醚和乙酸乙酯等体积的洗脱液为目标分离体系，同时由于米团花中杂质成分较多，单一浓度洗脱无法得到抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C；而浓度梯度设置不合理，过大或者过小都可能会导致抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C无法充分洗脱出来。在缺少可借鉴材料提供可提取得到抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C的指示的情况下，处理米团花枝条并从中得到Leucosceptrum C具有很大的不确定性。

第三方面，本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括药学上可以接受的载体和上述的化合物，或该化合物在药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物。

第四方面，本发明还提供含有上述抗肿瘤活性化合物，或其药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物在制备抗肿瘤药物上的用途。

进一步的，所述肿瘤对应的肿瘤细胞为人肝癌SMMC7721细胞。

本发明的有益效果如下：

本发明的抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C为从米团花枝条中提取的天然抗肿瘤化合物，具有抑制肿瘤细胞的生物活性，如人肝癌SMMC7721细胞抑制作用明显，半数抑制浓度IC₅₀值比市场上的广谱抗肿瘤药物顺铂小，表明其具有很强的抗肿瘤活性，在制备抗肿瘤药物上具有非常大的应用前景，对提升米团花的医学和经济价值具有重要作用。

附图说明

图1是本发明抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C的制备流程图。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明进行详细说明：

如无特别说明，本发明中所采用的材料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

实施例1：抗肿瘤活性化合物抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C的理化性能测试

1.1分子结构式确定

所用核磁共振仪为Bruker公司制造的BrukerAVANCE III 500型核磁共振仪，核磁共振使用氘代CDCl₃(氘代氯仿)试剂，所得抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C的氢谱和碳谱数据见下表1所示。

表1Leucosceptrum C的氢谱¹H-NMR(500MHz)和碳谱¹³C-NMR(125MHz)数据

注：化学位移用δ表示；s表示单峰；br s表示宽单峰；m表示多重峰；dd表示双二重峰。

1.2分子量测试

采用高分辨质谱HR-ESI-MS对化合物的精确分子量进行测定，HR-ESI-MS[M-H]-m/z为313.1804。根据表1中的核磁NMR数据以及质谱数据确定，抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C的分子式为C₂₀H₂₆O₃，分子量为314，不饱和度为8，化学名称为12-羟基-8,11,13,15-松香烷四烯-2,7-二酮，结构如式I所示。

1.3熔点测试

所用熔点仪为上海物光制作的WRS-1C型熔点仪；经测试，抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C的熔点为m.p.259-261℃。

实施例2：制备抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C

运用本发明所述方法制备化合物Leucosceptrum C，包括以下步骤：

(1)将5kg米团花的枝条风干、粉碎，加入到体积分数95％的乙醇中浸提，按米团花质量与乙醇体积1g：10mL的比例加入乙醇，浸提温度70℃，浸提3次，每次5小时；过滤不溶物并合并滤液，然后在真空度为0.08MPa、温度为45℃下低温减压蒸干得到浸膏；

(2)将所得浸膏与水按质量比为1:2混合均匀制成悬浊液，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，在真空度为0.08MPa、温度为45℃下低温减压蒸干得到乙酸乙酯萃取相；

(3)将得到的乙酸乙酯萃取相与等质量的硅胶拌匀，然后置于硅胶柱中层析，采用石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的各梯度洗脱体积比为10:1、5:1、3:1、1:1，收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:1时的洗脱液，经薄层层析分析并合并相似组份，得到不同的初组份F41-F44；

(4)将收集的初组份F42经制备液相色谱分离，以乙腈：水按体积比为40:60作为洗脱剂等度洗脱，得到式I所示的具有抗肿瘤作用的二萜化合物C(8.0mg)。

该过程如图1所示。

实施例3：制备抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C

运用本发明所述方法制备化合物Leucosceptrum C，包括以下步骤：

(1)将5kg米团花的枝条风干、粉碎，加入到体积分数90％的乙醇中浸提，加入量为乙醇20mL/g米团花，浸提温度为65℃，浸提3次，每次4小时；过滤不溶物并合并滤液，然后在真空度为0.07MPa、温度为50℃下低温减压蒸干得到浸膏；

(2)将所得浸膏与水按质量比为1:1混合均匀制成悬浊液，等体积乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，在真空度为0.07MPa、温度为50℃下低温减压蒸干得到乙酸乙酯萃取相；

(3)将得到的乙酸乙酯萃取相与等质量的硅胶拌匀，然后置于硅胶柱中层析，采用石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的各梯度洗脱体积比为9.8:1、4.8:1、2.8:1、0.8:1，收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为0.8:1时的洗脱液，经薄层层析分析并合并相似组份，得到不同的初组份F41-F44；；

(4)将收集的层析分离初组份F42经制备液相色谱分离，以乙腈：水(体积比35:65)作为洗脱剂等度洗脱，得到式I所示的具有抗肿瘤作用的二萜化合物C(6.5mg)。

实施例4：制备抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C

运用本发明所述方法制备化合物Leucosceptrum C，包括以下步骤：

(1)将5kg米团花的枝条风干、粉碎，加入到体积分数95％的乙醇中浸提，加入量为乙醇15mL/g米团花，浸提温度为75℃，浸提2次，每次4小时；过滤不溶物并合并滤液，然后在真空度为0.09MPa、温度为40℃下低温减压蒸干得到浸膏；

(2)将所得浸膏与水按质量比为1:3混合均匀制成悬浊液，等体积乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，在真空度为0.09MPa、温度为40℃下低温减压蒸干得到乙酸乙酯萃取相；

(3)将得到的乙酸乙酯萃取相与等质量的硅胶拌匀，然后置于硅胶柱中层析，采用石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚与乙酸乙酯的各梯度洗脱体积比为10.2:1、5.2:1、3.2:1、1.2:1，收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为1.2:1时的洗脱液，经薄层层析分析并合并相似组份，得到不同的初组份F41-F44；；

(4)将收集的层析分离初组份F42经制备液相色谱分离，以乙腈：水(45:55)作为洗脱剂等度洗脱，得到式I所示的具有抗肿瘤作用的二萜化合物C(5.0mg)。

实施例5：抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C的抗肿瘤性能测试

取实施例2制备的抗肿瘤活性化合物Leucosceptrum C作抗肿瘤能力测试，过程如下：

体外肿瘤细胞增殖抑制试验：取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度(50000～100000个/毫升)，每孔100μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，接种24h后给药(100μl/孔)，分别设空白对照组、细胞对照组以及6个浓度(3.12，6.25，12.5，25，50，100μmol/L)受试药物组，细胞对照组中的药物为顺铂，继续培养72h后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培养液溶解)，37℃孵育4h，弃去各孔内液体后加入150μl酸化异丙醇(含0.04mol/LHCl)，避光放置30min，酶标仪测定570nm处吸光度，计算受试药物对肿瘤细胞的增殖抑制率，计算受试物对肿瘤细胞增殖(72h)的半数抑制浓度(IC₅₀)，为减小实验误差带来的影响，每次实验做三个平行，结果对应如下。

5.1人肝癌SMMC7721细胞

(1)对照组顺铂对SMMC7721细胞的抑制作用，见表2、3和4。

表2顺铂对SMMC7721细胞的抑制作用平行测试一结果

由Graphpad Prism 6.0求得IC₅₀＝21.97。

表3顺铂对SMMC7721细胞的抑制作用平行测试二结果

由Graphpad Prism 6.0求得IC₅₀＝22.68。

表4顺铂对SMMC7721细胞的抑制作用平行测试三结果

由Graphpad Prism 6.0求得IC₅₀＝18.72。

由以上数据可求得：顺铂的IC₅₀＝21.12±2.11。

(2)化合物Leucosceptrum C对SMMC7721细胞的抑制作用，见表5、6和7。

表5化合物Leucosceptrum C对SMMC7721细胞的抑制作用平行测试一结果

由Graphpad Prism 6.0求得IC₅₀＝17.92。

表6化合物Leucosceptrum C对SMMC7721细胞的抑制作用平行测试二结果

由Graphpad Prism 6.0求得IC₅₀＝18.37。

表7化合物Leucosceptrum C对SMMC7721细胞的抑制作用平行测试三结果

由Graphpad Prism 6.0求得IC₅₀＝14.40。

由以上数据可求得：Leucosceptrum C的IC₅₀＝16.90±2.17。

5.2Leucosceptrum C和顺铂对SMMC7721细胞72小时半数抑制浓度IC₅₀(μmol/L)见表8所示。

表8Leucosceptrum C和顺铂对SMMC7721细胞的72小时半数抑制浓度IC50(μmol/L)

从上述表5～8中可以看出，不同浓度的化合物Leucosceptrum C对人肝癌SMMC7721有抑制作用，Leucosceptrum C在72h后的IC₅₀值达到16.90±2.17μmol/L，其IC₅₀值低于顺铂对照组21.12±2.11μmol/L，说明Leucosceptrum C对SMMC7721细胞有着极为显著的抑制作用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤活性化合物，其特征在于：所述化合物为式I的化学结构，或式I的化合物在药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物，

2.一种抗肿瘤活性化合物的提取分离方法，其特征在于：包括以下步骤，

步骤(1)、以米团花的风干枝条为原料，粉碎后有机溶剂浸提，低温减压浓缩得到浸膏；

步骤(2)、将浸膏和水混合得悬浊液，加入乙酸乙酯萃取，低温减压浓缩得到乙酸乙酯萃取相；

步骤(3)、采用硅胶柱层析分离乙酸乙酯萃取相，以石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行梯度洗脱，石油醚和乙酸乙酯体积比依次为(9.8～10.2):1、(4.8～5.2):1、(2.8～3.2):1、(0.8～1.2):1；收集石油醚和乙酸乙酯的体积比为(0.8～1.2):1时对应的洗脱液，然后经薄层层析分析，合并相似组分得到不同的初组分F41-F44；

步骤(4)、将初组分F42经制备液相色谱分离，以乙腈和水作为洗脱剂等度洗脱，得到所述抗肿瘤活性化合物。

3.根据权利要求2所述的一种抗肿瘤活性化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述有机溶剂与米团花的风干枝条的体积质量比为10～20mL：1g；浸提温度为65～75℃，浸提2～3次，每次4～6h。

4.根据权利要求3所述的一种抗肿瘤活性化合物的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中低温减压浓缩的温度为40～50℃，真空度为0.07～0.09MPa。

5.根据权利要求4所述的一种抗肿瘤活性化合物的提取分离方法，其特征在于：步骤(2)中浸膏和水的质量比为1:1～3，乙酸乙酯与悬浊液体积比0.8～1:1，萃取2～4次。

6.根据权利要求5所述的一种抗肿瘤活性化合物的提取分离方法，其特征在于：步骤(4)洗脱剂中乙腈的体积分数为35～45％，其余为水。

7.一种药物，其特征在于：所述药物包括药学上可以接受的载体和权利要求1所述的化合物，或该化合物在药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物。

8.一种如权利要求1所述的抗肿瘤活性化合物在制备抗肿瘤药物上的用途。

9.一种如权利要求1所述的抗肿瘤活性化合物在药学上可接受的盐、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物在制备抗肿瘤药物上的用途。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于：所述抗肿瘤的肿瘤细胞为人肝癌SMMC7721细胞。

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