CN110368407B - 一种钩枝藤枝叶有效部位及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体公开了一种钩枝藤枝叶有效部位及其制备方法和应用，涉及天然药物化学技术领域。本发明以钩枝藤枝叶为原料，将其用乙醇提取，环己烷、二氯甲烷依次萃取后，将二氯甲烷萃取部位经过Diol基色谱闪式柱层析，得到钩枝藤枝叶有效部位。该钩枝藤枝叶有效部位在抗肿瘤细胞实验中具有显著的抗肿瘤活性，尤其是对非小细胞肺癌细胞A549，其细胞毒作用优于阳性药顺铂。本发明的成本低廉，制备工艺简单易操作，产品在抗肿瘤药物中具有广泛用途。

Description

一种钩枝藤枝叶有效部位及其制备方法和应用

技术领域

本发明公开了一种钩枝藤枝叶有效部位及其制备方法和应用，属于天然药物化学技术领域。

背景技术

当前，随着人口增长和老龄化，以及与社会和经济发展相关的某些癌症病因的变化，促使癌症发病人数逐年增加。据世卫组织发布的最新全球癌症报告显示，2018年全球新增1810万例癌症病例(男性950万，女性860万)，死亡人数达960万(男性540万，女性420万)；而且全球几乎一半的新发癌症病例及超过一半的癌症死亡病例都发生在亚洲，我国作为亚洲人口最多的国家，占亚洲癌症发病与死亡的一半左右。而在所有癌症中，肺癌的发病率和死亡率分别占整体癌症的11.6％和18.4％，均居所有癌症之首；在我国尤其是男性，肺癌的发病率超过0.4‰。临床上的肺癌病例，非小细胞肺癌占肺癌总病例数的85％～88％。因此，进一步开发癌症治疗药物具有重要价值和意义。

中药以及民族药的提取物活性成分在抗肿瘤治疗方面具有一定疗效。钩枝藤(Ancistrocladus tectorius)系钩枝藤科(Ancistrocladaceae)钩枝藤属(Ancistrocladus)的一种藤本植物，属内约有20个种，我国只有A.tectorius一种，产于海南岛，资源丰富。钩枝藤在海南民间药用历史悠久，具有消炎、止泻、行气和散结等功效，是我国少数民族药黎药的一个重要组成部分，常用于治疗疟疾、寄生虫感染等疾病。早在1981年，我国学者陈政雄等报道了钩枝藤中的生物碱类化学成分和其抗肿瘤作用，钩枝藤总生物碱对大鼠W-256有抑制作用，对小鼠S-180和艾氏腹水瘤抑制作用不明显。近年来，德国学者Bringmann的研究组最新报道显示，钩枝藤中的生物碱类成分具有较强的抗人急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)及其耐药细胞CEM/ADR5000的活性。但是，目前所有关于钩枝藤中化学成分抗肿瘤作用的报道，未有涉及其有效成分的制备工艺，也未见针对肺癌尤其是非小细胞肺癌的药物应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题，是提供一种钩枝藤枝叶有效部位的制备方法及其应用，由该方法制备得到的有效部位具有显著的抗癌作用尤其是抗非小细胞肺癌作用。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

一种钩枝藤枝叶有效部位的制备方法，其包含如下步骤：

(1)醇提步骤：取新鲜干燥后的钩枝藤枝叶，粉碎，用乙醇溶液提取，将提取液在50℃以下减压浓缩，制成浸膏或干粉，回收溶剂乙醇，制得钩枝藤枝叶醇提物；

(2)萃取步骤：在钩枝藤枝叶醇提物的浸膏或干粉中加入0.2～0.5倍重量的水，分散溶解，然后依次用环己烷和二氯甲烷萃取，分别得环己烷萃取部位和二氯甲烷萃取部位；

(3)Diol基色谱柱层析步骤：将二氯甲烷萃取部位上Diol基色谱层析柱，依次用环己烷/二氯甲烷(9:1)、二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇(5:1)及甲醇梯度洗脱，制备得到各个分离部位。收集二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的钩枝藤枝叶有效部位。

进一步的，醇提步骤中所述的乙醇溶液为体积分数为75～95％的乙醇水溶液；进一步优选的，醇提步骤中所述的乙醇溶液为体积分数为95％的乙醇水溶液。

进一步的，醇提步骤中干燥的钩枝藤枝叶与乙醇溶液的用量比为1g：5～20mL；进一步优选的，干燥的钩枝藤枝叶与乙醇溶液的用量比为1g：10～15mL。

进一步的，醇提步骤中所述的提取方法为加热回流提取，提取次数为1～3次，每次0.5～1.5h；最优选地，醇提步骤中所述的加热回流提取的提取次数为2次，每次1h。

进一步的，所述萃取步骤的具体方法为：将钩枝藤枝叶醇提物加入0.2～0.5倍重量的水混悬，然后先用环己烷萃取1～3次得环己烷萃取液，余下的药液再用二氯甲烷萃取1～3次得二氯甲烷萃取液，浓缩干燥二氯甲烷萃取液即得所述的二氯甲烷萃取部位。

进一步的，Diol基色谱柱层析步骤中Diol基柱的Diol填料的粒径为40～60μm，重量用量为二氯甲烷萃取部位的20～40倍；最优选地，Diol基柱层析步骤中Diol柱中Diol基填料的重量用量为二氯甲烷萃取部位的30倍。

进一步的，Diol基色谱柱层析时5种洗脱溶剂的用量分别为3～5倍柱体积。

进一步的，Diol基色谱柱层析方法为闪式柱层析。

进一步的，制备收集的二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)有效部位中富含萘基异喹啉类生物碱类成分。

本发明同时请求保护由上述制备方法制备得到的钩枝藤枝叶有效部位。

本发明还提供一种上述钩枝藤枝叶有效部位在白血病HL-60细胞、肺癌A549细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞、结肠癌SW480细胞的杀伤和抑制作用，进一步优选的，特别是对非小细胞肺癌细胞A549具有显著的抗肿瘤选择性。

进一步的，上述钩枝藤枝叶有效部位在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供了一种全新的钩枝藤枝叶有效部位的制备方法，本发明所述的钩枝藤枝叶有效部位经乙醇提取、环己烷及二氯甲烷萃取以及Diol色谱闪式柱层析等步骤制备得到；该方法中，Diol色谱闪式柱层析及其所用的洗脱溶剂为关键的有效成分分离及富集步骤，研究表明在本发明所述的Diol色谱柱层析洗脱条件下得到的钩枝藤枝叶有效部位具有显著抗癌活性。

(2)本发明首次提出将富含萘基异喹啉类生物碱的钩枝藤枝叶有效部位用于非小细胞肺癌的药物用途，具有广泛的开发应用前景。

附图说明

图1钩枝藤枝叶有效部位的HPLC色谱图(波长240nm)；

图2钩枝藤枝叶有效部位的¹H-NMR图(溶剂CDCl₃)，其中A处为萘基异喹啉类生物碱¹H-NMR特征信号；

图3钩枝藤枝叶有效部位中富含的萘基异喹啉类生物碱的基本骨架。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。

实施例1钩枝藤枝叶有效部位的制备

(1)醇提步骤：取新鲜干燥后的钩枝藤枝叶，粉碎，用10倍量95％乙醇溶液提取3次，每次0.5h，将提取液在50℃以下减压浓缩，制成浸膏，回收溶剂乙醇，制得钩枝藤枝叶醇提物；

(2)萃取步骤：在钩枝藤枝叶醇提物的浸膏中加入0.3倍重量的水，分散溶解，然后依次用环己烷和二氯甲烷萃取分别萃取2次，得环己烷萃取部位和二氯甲烷萃取部位；

(3)Diol基色谱柱层析步骤：取二氯甲烷萃取部位，装填于其30倍重量的Diol基色谱层析柱上，依次用3倍柱体积的环己烷/二氯甲烷(9:1)、二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇(5:1)及甲醇梯度洗脱，制备得到各个分离部位。收集二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的钩枝藤枝叶有效部位。

实施例2钩枝藤枝叶有效部位的制备

(1)醇提步骤：取新鲜干燥后的钩枝藤枝叶，粉碎，用20倍量75％乙醇溶液提取2次，每次1h，将提取液在50℃以下减压浓缩，制成干粉，回收溶剂乙醇，制得钩枝藤枝叶醇提物；

(2)萃取步骤：在钩枝藤枝叶醇提物的干粉中加入0.5倍重量的水，分散溶解，然后依次用环己烷和二氯甲烷萃取分别萃取3次，得环己烷萃取部位和二氯甲烷萃取部位；

(3)Diol基色谱柱层析步骤：取二氯甲烷萃取部位，装填于其40倍重量的Diol基色谱层析柱上，依次用5倍柱体积的环己烷/二氯甲烷(9:1)、二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇(5:1)及甲醇梯度洗脱，制备得到各个分离部位。收集二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)洗脱部位，浓缩干燥后即得所述的钩枝藤枝叶有效部位。钩枝藤枝叶有效部位的¹H-NMR图(溶剂CDCl₃)如图2所示，钩枝藤枝叶有效部位中富含的萘基异喹啉类生物碱的基本骨架如图3所示。

实施例3钩枝藤枝叶醇提物的抗肿瘤活性

采用MTS法，测定钩枝藤不同萃取部位及Diol基色谱不同分离部位对不同的肿瘤细胞白血病HL-60细胞、肺癌A549细胞、肝癌SMMC-7721细胞、乳腺癌MCF-7细胞及结肠癌SW480细胞的增殖能力的影响。

(1)实验方法

①接种细胞：用含10％胎牛血清的培养液(DMEM或者RMPI1640)配成单个细胞悬液，以每孔3000～15000个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，细胞提前12～24h接种培养。

②加入待测样品溶液：待测样品用DMSO溶解，以100μg/ml、20μg/ml、4μg/ml、0.8μg/ml、0.16μg/ml浓度复筛，每孔终体积200μl，每种处理均设3个复孔。

③显色：37℃培养48h后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液100μL；悬浮细胞弃100μL培养上清液，每孔加20μL的MTS溶液；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)，继续孵育2～4h，使反应充分进行后测定光吸收值。

④比色：选择492nm波长，多功能酶标仪(MULTISKAN FC)读取各孔光吸收值，记录结果，数据处理后以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算样品的IC₅₀值。

⑤阳性对照化合物：每次实验均设顺铂(DDP)和紫杉醇(Taxol)两个阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线，应用两点法(Reed and Muench法)计算化合物的IC₅₀值。

(2)实验结果

实验结果如表1所示。

表1钩枝藤醇提物各分离部位抗肿瘤活性筛选

^*注：GZT-1：95％乙醇总提物；GZT-2：75％乙醇总提物；GZT-3～GZT-9：95％乙醇总提物的不同分离部位，其中GZT-3为环己烷层萃取物；GZT-4位二氯甲烷层萃取物；GZT-5为二氯甲烷层萃取物经Diol基色谱柱环己烷/二氯甲烷(9:1)的洗脱物；GZT-6为二氯甲烷层萃取物经Diol基色谱柱二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)的洗脱物；GZT-7为二氯甲烷层萃取物经Diol基色谱柱乙酸乙酯的洗脱物；GZT-8为二氯甲烷层萃取物经Diol基色谱柱乙酸乙酯/甲醇(5:1)的洗脱物；GZT-9为二氯甲烷层萃取物经Diol基色谱柱甲醇的洗脱物。

从表1可以看出，钩枝藤醇提物的不同分离部位针对不同类型的肿瘤细胞，表现出不同的抗肿瘤活性。其中分离部位GZT-6[Diol基色谱柱二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)的洗脱物]具有较强的选择性抑制非小细胞肺癌细胞A549的作用，活性作用远优于阳性药顺铂，是其7倍。

综上所述，我们发明了一种从钩枝藤枝叶中制备具有抗癌活性尤其是抗非小细胞肺癌活性有效部位的方法，该方法的工艺技术简单，所得有效部位的抗肿瘤活性显著，是一种具有广泛开发前景的药物制备方法。

以上根据上述实施方法对本发明的钩枝藤枝叶中有效部位的制备及其抗肿瘤的应用进行了说明，但本发明并不限于上述实施方法，在不脱离其要旨的范围内，可在各种方式中实施本发明。除上述实施方法之外，其他等同技术方案也应当在其保护范围之内，在此不再一一叙述。

Claims (9)

1.一种钩枝藤枝叶有效部位的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)醇提：取新鲜干燥后的钩枝藤枝叶，粉碎，用乙醇溶液提取，将提取液在50℃以下减压浓缩，制成浸膏或干粉，回收溶剂乙醇，制得钩枝藤枝叶醇提物，所述的乙醇溶液为体积分数为75～95％的乙醇水溶液；

(2)萃取：在钩枝藤枝叶醇提物的浸膏或干粉中加入0.2～0.5倍重量的水，分散溶解，然后依次用环己烷和二氯甲烷萃取，分别得环己烷萃取部位和二氯甲烷萃取部位；

(3)Diol基色谱柱层析：将二氯甲烷萃取部位上Diol基色谱层析柱，依次用环己烷/二氯甲烷(9:1)、二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯/甲醇(5:1)及甲醇梯度洗脱，制备得到各个分离部位；收集二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)洗脱部位，浓缩干燥后即得钩枝藤枝叶有效部位。

2.根据权利要求1所述的钩枝藤枝叶有效部位的制备方法，其特征在于，醇提钩枝藤枝叶与乙醇溶液的用量比为1g：5～20mL。

3.根据权利要求1所述的钩枝藤枝叶有效部位的制备方法，其特征在于，醇提中所述的提取方法为加热回流提取，提取次数为1～3次，每次0.5～1.5h。

4.根据权利要求1所述的钩枝藤枝叶有效部位的制备方法，其特征在于，所述萃取的具体方法为：将钩枝藤枝叶醇提物加入0.2～0.5倍重量的水混悬，然后先用环己烷萃取1～3次得环己烷萃取液，余下的药液再用二氯甲烷萃取1～3次得二氯甲烷萃取液，浓缩干燥二氯甲烷萃取液即得所述的二氯甲烷萃取部位。

5.根据权利要求1所述的钩枝藤枝叶有效部位的制备方法，其特征在于，Diol基色谱柱层析中Diol基柱的Diol填料的粒径为40～60μm，重量用量为二氯甲烷萃取部位的20～40倍。

6.根据权利要求1所述的钩枝藤枝叶有效部位的制备方法，收集的二氯甲烷/乙酸乙酯(20:1)有效部位中富含萘基异喹啉类生物碱类成分。

7.根据权利要求1～6任一项所述的制备方法制备得到的钩枝藤枝叶有效部位。

8.根据权利要求7所述的钩枝藤枝叶有效部位，其特征在于，所述有效部位具有抑制非小细胞肺癌A549细胞的作用。

9.根据权利要求7所述的钩枝藤枝叶有效部位在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用。

Images