CN113633704B - 一种细轴荛花叶提取物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物提取物技术领域，特别涉及一种细轴荛花叶提取物的制备方法及其应用，包括以下步骤：S1.在干燥的细轴荛花叶中加入5～10倍体积的90～95％的乙醇溶液，超声提取20～50min得到提取液；S2.将步骤S1提取之后得到的提取液浓缩得到浸膏，将浸膏进一步用有机溶剂提取得到有机溶剂提取物；其中，所述步骤S2中有机溶剂为：石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。本发明细轴荛花叶的取物对人乳腺癌(MCF‑7)，结肠癌(SW480)，肺癌(A549)，肝癌(SMM‑7721)细胞系有显著的抗增殖活性，本发明为该植物提取物的抗癌或辅助治疗作用研究奠定了一定的基础。

Description

一种细轴荛花叶提取物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于植物提取物技术领域，特别涉及一种细轴荛花叶提取物的制备方法及其应用。
背景技术
自然界是结构新颖抗癌候选药物最丰富的来源，天然产物及衍生物或模拟天然产物及其药效团的药物在抗癌药物中占了相当比例。一些微生物和海洋来源的天然产物更有可能直接成为癌症治疗的候选新药。1981年至2019年9月，全球主要国家批准的抗肿瘤新药共计247 个，其中天然产物及其衍生物共计62个，占该阶段批准的抗肿瘤药物的25％。Imatinib、 Gefitinib和Crizotinib等药物的成功上市，推动了药效团来自天然产物或天然产物模拟物作为抗癌药物的快速发展。而在肿瘤治疗中，传统的化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也造成机体骨髓抑制和免疫功能低下，毒副作用大。天然药物无论在减轻临床症状，提高生存质量，防止复发转移，延长生存期，还是在与化疗配合增效减毒方面都有很好的效果。
本发明中的研究对象细轴荛花(Wikstroemia nutans Champ.ex Benth.)，别名，野棉花，地皮棉是瑞香科荛花属中的一种，广泛分布于我国南方亚热带地区，广东、海南、广西、福建，台湾等省 。常见于海拔300-800-1650米的常绿阔叶林中。细轴荛花为民间常用中草药，性寒味苦，全株有毒，民间药用祛风，散血，止痛。目前未见关于细轴荛花植物化学成分及生物活性的研究报道。我们对该植物的乙醇提取物进行了初步的体外细胞毒活性评价，发现其提取物具有显著的抗乳腺癌和结肠癌活性。这为后期这种植物提取物的抗癌或辅助治疗作用研究奠定了一定的基础。
发明内容
为了克服上述现有技术中的问题提供一种细轴荛花叶提取物的制备方法及其应用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种细轴荛花叶提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1.在干燥的细轴荛花叶中加入5～10倍体积的90～95％的乙醇溶液，超声提取20～50min 得到提取液；
S2.将步骤S1提取之后得到的提取液浓缩得到浸膏，将浸膏进一步用有机溶剂提取得到有机溶剂提取物；
其中，所述步骤S2中有机溶剂为：石油醚、乙酸乙酯和正丁醇。
优选地，所述步骤S1中，细轴荛花叶与乙醇的质量比为1:(4～8)。
优选地，所述步骤S2中，用有机溶剂提取浸膏，按照质量1:(1～5)，将浸膏分散与水中，混合均匀后，得到混合溶液；按混合溶液与有机溶剂体积比1:(1～2)的比例加入有机溶剂。
优选地，所述步骤S1中，采用超声提取，超声功率为80～120W。
优选地，所述步骤S2中，提取液经过在42℃～48℃、真空度0.04～0.06Mpa条件下减压蒸馏得到浸膏。
优选地，所述步骤S2中，浸膏用有机溶剂提取后，再在42℃～55℃、真空度0.04～0.06Mpa 条件下减压蒸馏得到所述有机溶剂提取物。
所述方法获得的石油醚细轴荛花叶提取物、乙酸乙酯细轴荛花叶提取物和正丁醇细轴荛花叶提取物。
所述石油醚细轴荛花叶提取物、乙酸乙酯细轴荛花叶提取物和正丁醇细轴荛花叶提取物在抗癌药物中的应用。
优选地，所述抗癌药物包括：抗人乳腺癌药物、抗结肠癌药物、抗肺癌药物、抗肝癌药物。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明公开的一种细轴荛花叶提取物的制备方法，提取工艺简单，而且获得的植物提取物具有良好的抗癌活性。本发明细轴荛花叶的石油醚萃取物对人乳腺癌(MCF-7)，结肠癌 (SW480)，肺癌(A549)，肝癌(SMM-7721)细胞系有显著的抗增殖活性，IC50为22.18μg/mL， 33.36μg/mL，5.85μg/mL，52.04μg/mL。尤其对人乳腺癌(MCF-7)，结肠癌(SW480)作用效果非常明显。本发明首次发现细轴荛花植物提取物具有抗肿瘤活性，为该植物提取物的抗癌或辅助治疗作用研究奠定了一定的基础。
附图说明
图1为细轴荛花叶三种提取物对五种细胞株的抗细胞增殖活性图。
图2为细轴荛花石油醚提取物对肺癌(A549)细胞株的抗细胞增殖活性图。
图3为细轴荛花石油醚提取物对肝癌(SMM-7721)细胞株的抗细胞增殖活性图。
图4为细轴荛花石油醚提取物对乳腺癌(MCF-7)细胞株的抗细胞增殖活性图。
图5为细轴荛花石油醚提取物对结肠癌(SW480)细胞株的抗细胞增殖活性图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种细轴荛花叶提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将700g干燥细轴荛花叶粉碎后，浸泡在3L浓度为95％的乙醇溶液中超声提取30 分钟。静止1小时后过滤提取液，重复提取3～4次后，合并滤液得到提取滤液。
(2)提取液在48℃、真空度0.05Mpa条件下减压蒸馏浓缩至无醇味；
(3)按照质量比1:1的比例在浓缩后的提取物中添加蒸馏水，混合均匀，按混合溶液与萃取溶剂的体积比1:2的比例，在混合溶液中依次加入石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，收集石油醚萃，乙酸乙酯，正丁醇萃取相，反复萃取3次，合并各萃取相；在40～55℃、真空度0.06Mpa条件下减压蒸馏浓缩石油醚浓缩物，乙酸乙酯浓缩物和正丁醇浓缩物，浓缩物先在40℃下常压干燥12h后，再在50℃下真空干燥8h，得到石油醚，乙酸乙酯，正丁醇提取物。
实施例2
细轴荛花叶提取物的体外抗增殖活性实验
活性实验中用到的细胞株，试剂以及仪器
人非小细胞肺癌A549，人乳腺癌MF-7，结肠癌SW480，肝癌SMM-7721，肝癌PLC/PRF/5。 DMEM培养液(GIBCO)，胎牛血清(GIBCO)，胰蛋白酶(GIBCO)，DMS0(分析纯，Amresco)，MTS(Amresco)，96孔板，细胞培养箱(Thermo)，酶标仪(Tecan)，生物操作台(海尔)。
肿瘤细胞培养方法
基础培养基1640+10BS(胎牛血清)，培养条件为37℃，5％CO2浓度及饱和湿度；当细胞生长至对数期时，用胰蛋白酶消化细胞，洗涤吹散细胞，以每孔3000～15000个细胞接种于 96孔板，每孔体积100μL。细胞提前12～24小时接种培养，以备MTS实验。
细胞增殖实验(MTS法)
将细轴荛花石油醚提取物，乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物溶于DMS0溶液，配置浓度为100μg/mL的溶液进行初筛实验。加入细轴荛花叶石油醚，乙酸乙酯，正丁醇提取物，每种处理均设3个复孔，每孔终体积为并200μL。37摄氏度培养48小时后，贴壁细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液100μL；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。每次实验均设顺铂(DDP)阳性化合物，以浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制细胞生长曲线。按照以下公式计算抑制率：存活率＝(实验组吸光度/对照组吸光度)×100％。
实验结果见表1(图1)，从表中可以看出：细轴荛花叶的石油醚萃取物对人非小细胞肺癌A549，人乳腺癌MF-7，结肠癌SW480，肝癌SMM-7721均显示出显著的细胞增殖抑制活性。
表1细轴荛花叶提取物对五种细胞株的抗增殖活性数据
Figure BDA0003225388700000041
IC50细胞增殖实验(MTS法)
将细轴荛花石油醚提取物溶于DMSO溶液，分别配置浓度为100mg/mL、20mg/mL、4mg/mL、0.8mg/mL、0.16mg/mL共5个浓度，每个浓度5倍稀释；加入待测化合物溶液，每孔终体积200μL，每种处理均设3个复孔。37摄氏度培养48小时后，细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液100μL；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL 的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。按照以下公式计算抑制率：存活率＝(实验组吸光度/对照组吸光度)×100％；实验结果如图2～5及表2、3、4、5。
Figure BDA0003225388700000042
Figure BDA0003225388700000051
Figure BDA0003225388700000052
Figure BDA0003225388700000053
从表中可以看出：细轴荛花石油醚提取物具有显著抑制MCF-7、SW480、SMMC-7721和A549细胞生长的作用，且抑制作用具有浓度效应关系，IC50分别为22.18μg/mL，33.36 μg/mL，52.04μg/mL，5.85μg/mL。以上结果表明细轴荛花叶提取物具有较好的抗癌生物活性，可以进一步应用于抗癌药物的研究以及抗癌药物制剂中。
阳性对照药物顺铂的细胞增殖实验
取粉末状药物顺铂，用DMSO进行稀释，初始浓度为40μg/mL，5倍梯度稀释，共稀释5个梯度，37摄氏度培养48小时后，细胞弃孔内培养液，每孔加MTS溶液20μL和培养液 100μL；设3个空白复孔(MTS溶液20μL和培养液100μL的混合液)，继续孵育2～4小时，使反应充分进行后测定光吸收值。
按照以下公式计算抑制率：存活率＝(实验组吸光度/对照组吸光度)×100％；
实验结果见表6、7、8、9，从表中可以看出，顺铂能抑制MCF-7、SW480、SMMC-7721 和A549细胞生长，且抑制作用与药剂量成正相关；通过计算，得到顺铂在MCF-7、SW480、 SMMC-7721和A549细胞上的IC50分别为24.71μg/mL，15.08μg/mL，2.67μg/mL，4.17μg/mL。
Figure BDA0003225388700000061
Figure BDA0003225388700000062
Figure BDA0003225388700000071
Figure BDA0003225388700000072
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种细轴荛花叶石油醚提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述抗癌药物为：抗人乳腺癌药物、抗结肠癌药物、抗肺癌药物；
所述提取物的提取方法，包括以下步骤：
S1.将细轴荛花叶中加入5～10倍体积的90～95％的乙醇溶液，提取20～50min得到提取液；
S2.将步骤S1提取之后得到的提取液浓缩得到提取浸膏，将浸膏进一步用石油醚提取，即得。
2.根据权利要求1所述细轴荛花叶石油醚提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述步骤S1中，细轴荛花叶与乙醇的质量比为1:4～8。
3.根据权利要求1所述细轴荛花叶石油醚提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述步骤S2中，按照质量1:1～5，将提取浸膏分散与水中，混合均匀后，得到混合溶液；按混合溶液与石油醚的体积比为1:1～2加入石油醚进行提取。
4.根据权利要求1所述细轴荛花叶石油醚提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述步骤S1中，采用超声提取，超声功率为80～120W。
5.根据权利要求1所述细轴荛花叶石油醚提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述步骤S2中，提取液经过在42℃～48℃、真空度0.04～0.06Mpa条件下减压蒸馏得到浸膏。
6.根据权利要求1所述细轴荛花叶石油醚提取物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述步骤S2中，浸膏用石油醚提取后，再在42℃～55℃、真空度0.04～0.06Mpa条件下减压蒸馏得到所述石油醚提取物。
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