KR102513830B1 - 셀라스트롤 및 펜타사이클릭 트리테르펜 유도체를 제조하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 셀라스트롤을 비롯한 펜타사이클릭 트리테르펜이 농축된 미정제 추출물을, 노박덩굴과 식물의 세포로부터 제조하기 위한 방법; 이러한 방법을 이용하여 수득될 수 있는 농축 미정제 추출물; 이러한 추출물의 치료적 적용; 그리고 이러한 추출물을 함유하는 약학 및 더모코스메틱 조성물에 관한 것이다.

Description

셀라스트롤 및 펜타사이클릭 트리테르펜 유도체를 제조하기 위한 방법

본 발명은 노박덩굴과(Celastraceae family) 식물의 현탁 식물 세포 배양액(PCC)으로부터 펜타사이클릭 트리테르펜, 특히 셀라스트롤이 농축된 미정제 추출물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

트립테리지움 윌포르디이(Tripterygium wilfordii)는 노박덩굴과의 약용 식물로서, (중국을 포함한) 동남아시아에서는 염증성 장애, 자가면역성 질환을 치료하는데 수 세기 동안 사용되고 있으며, 가장 최근에는 암을 치료하는 데에도 사용되고 있다. 테르펜은 식물 기원 성분들 중 가장 활성이 큰 것 중 하나로서, 주로 식물의 뿌리에 존재한다. 테르펜 중에서도 노르프레델란(norfriedelane)계 펜타사이클릭 트리테르펜인 셀라스트롤은 비만, 류머티즘성 관절염, 크론병 및 전립선암 치료에 있어서의 그 효능에 대해 평가중에 있다. 그러므로 셀라스트롤 공급에 대한 요구는 꾸준히 증가하고 있다.

염증성 피부병, 특히 건선 또는 아토피 피부염은 다인성 원인 또는 병인으로 말미암는다. 이처럼 소위 자가면역성 질환이라고 불리우는 질환에 대한 원인은 아직 완전히 규명되지 않았지만, 면역계 조절장애, 특히 세포 반응에 있어서의 조절장애와 관련이 있을 것으로 생각된다. 세포 반응은 3가지 범주, 즉 Th1, Th2 및 최근 규명된 Th17 관련 세포 반응으로 분류될 수 있다. 비록 건선과 아토피 피부염은 임상 징후에 있어서 차이를 보이지만, 이 질환들은, 특히 Th17 반응의 특징인 IL17 및 IL22 발현이라는 측면에서 유사성을 가지는 것으로 생각된다(Miyagaki et al. 2015). 그러므로 IL17과 IL22는 이러한 질환을 치료하기 위한 표적으로서 매력적일 것이다. 따라서 Th17 경로를 차단하기 위해 IL17, IL17R, IL22, IL23, TNF-알파에 대한 모노클로날 항체가 개발되었다(Lowes et al. 2014). 이와 같은 분자들은 건선을 치료함에 있어서는 유효하지만, 다수의 부작용을 보이는 관계로, 치료 비용이 과도하게 든다.

더욱이, Th17 경로는 여드름 환자의 병변에서 강력하게 활성화됨도 또한 공지되어 있다(Kelhala et al. 2014).

셀라스트롤은 보통 용매계 식물 추출 방법에 의해 노박덩굴과 식물로부터 수득된다. 이러한 생합성 방법은 한 주기(즉 어린 식물의 싹이 성숙한 상태에 도달하여 채취되어야 할 때까지로서, 8년 내지 10년)의 반복을 수반한다. 뿐만 아니라, 식물 보호 제품의 사용은 이 생합성 방법의 비용을 더 증가시키고; 외부 오염물(중금속)이 축적될 수 있어서, 이 방법으로부터 생산된 미정제 추출물은 대사물질을 다수 함유할 수 있어서, 트리테르펜 분획을 분리하기 위해서는 이 식물 추출물이 몇 번의 정제 단계를 거쳐야 한다. 더군다나, 이 방법은 셀라스트롤 수율이 낮다.

셀라스트롤을 온전히 화학 합성에 의해 합성할 수도 있지만(Camelio et al. 2015), 이에는 20 단계 이상의 단계가 필요하며, 결과적으로 생성물을 수득하는데 드는 총 비용이 증가하게 된다.

식물 뿌리나 잎에서 기원하는 줄기 세포를 기반으로 한 현탁 세포 배양액으로부터 셀라스트롤을 수득하기 위한 대안적인 해결책이 있었다. 최근, Coppede 팀(Coppede et al. 2014)은, 엠.일리시폴리아(M.ilicifolia) 세포 배양액으로부터 종래의 추출법에 의해 이 식물로부터 수득된 셀라스트롤보다 더 많은 양의 셀라스트롤을 수득할 수 있었다[건조 중량 1g당 셀라스트롤 0.304 mg로서, 배양 8일 후 달성된 최고 농도, 즉 종래의 추출 방법에 의해 달성되는 최고 농도의 8.85배에 해당함]. Liu외 다수의 팀(Liu et al. 2016)은, 또한 (대략 50 μM만큼의) MeJa(메틸 자스몬산염)를 티.윌포르디이(T.wilfordii) 식물 세포 배양액에 첨가함으로써 셀라스트롤의 양이 MeJa를 포함하지 않는 배양액에서에 비하여 4.82배까지 증가하였음, 즉 건조 중량 1g당 셀라스트롤 농도(mg)는 0.752 mg/g(MeJa 포함 배양액) 대 0.154 mg/g(MeJa 불포함 배양액)임을 보였다.

이러한 방법은 셀라스트롤 수율을 개선시킬 수 있다. 그러나, 다량의 셀라스트롤을 신속하게 수득하기 위한 방법으로서, 경제적으로 이익인 방법에 대한 필요성은 여전히 절실하다.

본 발명은 노박덩굴과 식물의 식물 세포로부터 셀라스트롤 농축 미정제 추출물을 제조하기 위한 방법을 제공한다.

실제로 본 발명자들은 놀라운 방법, 즉 유도인자(elicitor)들의 다양한 조합을 사용하고 비교함으로써 티.윌포르디이 주로부터 유래하는 식물 세포 배양액 중 셀라스트롤 수율을 증가시키기 위한 방법을 개발하였다. 구체적으로 본 발명자들은, 세포 분열과 셀라스트롤 생성은 동반되지 않음을 관찰하였다. 놀랍게도 세포 분열과 셀라스트롤 생성은 양립 불가능하기까지 하다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 세포 증식 단계와, 세포 분열을 중단시키는 유도 제제 칵테일에 의한 유도 단계를 포함하는 방법을 개발하였다. 본 발명자들은 또한, 유도인자 쌍, 특히 메틸 자스몬산염(MeJa)과 키틴이 사용되면, 배양의 막바지에 건조 중량당 셀라스트롤이 농도 16.6 mg/g로 생산될 수 있음을 입증하였다. 따라서, 이처럼 유도된 배양액 중 셀라스트롤 수율은 Liu외 다수(앞서 언급한 문헌 참조)에 의해 달성된 셀라스트롤 수율보다 22배 더 높다. 더욱이 본 발명에 따른 방법에 의한 수율은 Coppede외 다수(앞서 언급한 문헌 참조)(유도 단계 불포함)에 의해 달성된 수율보다 57배 더 높다. 본 발명에 따른 방법은 또한, 특히 펜타사이클릭 트리테르펜류의 셀라스트롤 유도체, 예컨대 틴게닌 A(틴게논 또는 메이테닌이라고도 칭하여짐), 틴게닌 B(22 베타-하이드록시-틴게논이라고도 칭하여짐), 프리스티메린 및 트립테리곤을 농축시킬 수도 있다.

더욱이 본 발명자들은, 놀랍게도 본 방법에 의해 수득된 펜타사이클릭 트리테르펜 농축 미정제 추출물이 용량 효과를 보이며 인간 CD4+ T 세포에서 유도된, Th17 특이 인터루킨을 억제함을 보여주었다.

그러므로 본 발명은 하기 단계들, 즉

(i) 증식 배지 중에서 노박덩굴과 식물의 세포를 증식시키는 단계,

(ii) 단계 (i)에서 수득된 세포 배양액에 유도 칵테일을 첨가하여 유도를 수행하는 단계[다만 상기 유도 칵테일은 모노카복실 화합물류의 유도인자 적어도 하나와 생물 유도인자 적어도 하나를 포함함], 및

(iii) 단계 (ii)에서 수득된 세포 배양액으로부터 펜타사이클릭 트리테르펜 농축 미정제 추출물을 제조하는 단계

를 포함하는, 펜타사이클릭 트리테르펜 농축 미정제 추출물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 추출물뿐만 아니라, 이의 용도에 관한 것이기도 하다.

본 발명에 따르면, "펜타사이클릭 트리테르펜"이란, 노박덩굴과 식물의 세포에 의해 자연에서 생산되는 펜타사이클릭 트리테르펜, 특히 셀라스트롤(화학식 I), 틴게닌 A(틴게논 또는 메이테닌으로도 칭하여짐)(화학식 II), 틴게닌 B(22 베타-하이드록시-틴게논으로도 칭하여짐)(화학식 III), 프리스티메린(화학식 IV) 및 트립테리곤(화학식 V), 특히 셀라스트롤, 틴게닌 A 및 틴게닌 B, 특히 셀라스트롤을 의미한다.

본 발명에 따르면 "펜타사이클릭 트리테르펜 농축 미정제 추출물"이란, 본 발명에 따른 유도 단계를 포함하지 않는 방법에 의해 수득된 펜타사이클릭 트리테르펜보다 적어도 2배, 특히 적어도 5배, 특히 적어도 10배, 특히 10배 내지 100배 많은 양의 펜타사이클릭 트리테르펜을 포함하는 농축 미정제 추출물을 의미한다.

본 발명에 따르면 "셀라스트롤 농축 미정제 추출물"이란, 본 발명에 따른 유도 단계를 포함하지 않는 방법에 의해 수득된 셀라스트롤보다 적어도 2배, 특히 적어도 5배, 특히 적어도 10배, 특히 10배 내지 100배 많은 양의 셀라스트롤을 포함하는 농축 미정제 추출물을 의미한다.

본 발명에 따르면, "노박덩굴과 식물"이란, 이 과에 속하는 모든 식물, 특히 트립테리지움(Tripterygium), 베사(Bhesa), 콕코나(Kokkona), 카타(Catha), 유오니무스(Euonymus), 오르토스페니아(Orthosphenia), 디카르펠럼(Dicarpellum), 셀라스트루스(Celastrus), 메이테누스(Maytenus), 페리타사(Peritassa) 및 르제도부스키아(Rzedowskia) 속의 식물, 특히 트립테리지움 및 셀라스트루스 속의 식물을 의미한다. 트립테리지움 속 중에서도 트립테리지움 윌포르디이, 트립테리지움 리겔리이(Tripterygium regelii), 트립테리지움 하이포글로쿰(Tripterygium hypoglaucum) 및 트립테리지움 아르티큘라타(Tripterygium articulata), 특히 트립테리지움 윌포르디이를 구체적인 예로서 들 수 있다.

본 발명에 따르면, "노박덩굴과 식물의 세포"란, 식물의 임의의 부분, 즉 종자, 뿌리, 지상부의 세포, 특히 지상부의 세포를 의미한다.

본 발명에 따르면, "지상부"란, 땅 위로 올라온 식물의 부분, 예를 들어 잎, 줄기, 잎자루 및/또는 꽃송이, 특히 잎을 의미한다.

본 발명에 따르면, "노박덩굴과 식물 세포의 증식 단계"란, 노박덩굴과 식물의 세포가 이의 증식에 적합한 조건 하에 증식 배지 중에 현탁되는 단계를 의미한다. 이때의 세포들은 특히 현탁되기 전 캘러스(callus)로부터 수득될 수 있다. 필요하다면, 세포 현탁액은 정기적으로 재접종되어 증식 조건하에 유지될 수 있다.

본 발명에 따르면, "캘러스"란 줄기 세포 또는 분열조직 세포라고도 칭하여지는 탈분화 세포 클러스터를 의미한다.

캘러스 유도는 당 업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 캘러스는, 특히 이하에 기술된 방식으로 수득될 수 있다.

노박덩굴과 식물, 예컨대 트립테리지움 윌포르디이의 한 부분, 특히 지상부로부터 유래하는 조직 외식편으로부터 캘러스를 유도하는 것은 당 업자에게 널리 공지되어 있다.

캘러스 유도는, 특히

- 식물로부터 조직 외식편, 예를 들어 크기 약 1 cm²의 잎 조각을 수득하는 단계,

- 이 외식편을 (예를 들어 4 g/L 내지 12 g/L의 아가, 예컨대 약 8 g/L의 아가를 본 발명에 따른 증식 배지에 첨가함으로써) 본 발명에 따른 아가 증식 배지 상에서 배양하는 단계,

- 특히 어두운 환경 및 약 25℃ 내지 약 30℃, 예컨대 약 27℃ 내지 약 28℃의 온도에서 항온처리하는 단계

에 의해 수행될 수 있다.

단계 (i): 세포 증식 단계

노박덩굴과 식물의 세포 배양에 대해 잘 알고 있는 당업자는, 이러한 세포의 증식에 필요한 증식 배지의 조성을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 우선적으로 이 증식 배지는 탈분화된 세포, 즉 전능성 형태인 세포의 증식을 허용할 것이다. 탈분화된 형태로의 유지는, 특히 증식 배지 중 특정 시토키닌/옥신 비율을 적용함으로써 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 "증식 배지"는, 특히

- 예를 들어 증식 배지 1L당 1000 mg 내지 9000 mg, 예컨대 증식 배지 1L당 3000 mg 내지 8000 mg을 포함하는 총 다량 원소 농도만큼의 다량 원소, 특히 NH₄NO₃, KNO₃, CaCl₂.2H₂O, MgSO₄.7H₂O, KH₂PO₄ 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 다량 원소 적어도 하나[다만 증식 단계 동안 증식 배지 중 다량 원소의 총 농도는, 특히 증식 배지 1L당 3000 mg 내지 5500 mg를 포함하는 만큼일 것임];

- 예를 들어 증식 배지 1L당 10 mg 내지 200 mg, 특히 증식 배지 1L당 50 mg 내지 150 mg을 포함하는 총 미량 원소 농도만큼의 미량 원소, 특히 KI, H₃BO₃, MnSO₄.4H₂O, ZnSO₄.H₂O, Na₂MoO₄.2H₂O, CuSO₄.5H₂O, CoCl₂.6H₂O, FeSO₄.7H₂O, Na₂EDTA.2H₂O 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 미량 원소 적어도 하나;

- 예를 들어 증식 배지 1L당 0.01 g 내지 3 g, 특히 증식 배지 1L당 0.05 g 내지 1 g의 범위의 총 비타민 농도만큼의 비타민, 특히 미오-이노시톨, 니코틴산, 피리독신-HCl, 티아민-HCl 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 비타민 적어도 하나;

- 예를 들어 증식 배지 1L당 0.15 mg 내지 5 mg, 특히 증식 배지 1L당 1 mg 내지 4 mg 범위의 총 아미노산 농도만큼의 아미노산 적어도 하나, 특히 글리신[다만 증식 단계 동안 증식 배지 중 아미노산의 농도는, 특히 증식 배지 1L당 1 mg 내지 2.5 mg을 포함하는 만큼일 것임];

- 예를 들어 증식 배지 1L당 10 g 내지 70 g, 예컨대 증식 배지 1L당 30 g의 총 탄소 공급원 농도만큼의 탄소 공급원 적어도 하나, 특히 수크로스;

- (식물 성장 호르몬 또는 식물 성장 인자 또는 식물 성장 조절인자라고도 칭하여지는) 식물 호르몬, 특히 하나 이상의 시토키닌, 특히 키네틴 및/또는 6-퍼푸릴아미노퓨린, 하나 이상의 옥신, 특히 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 및/또는 나프탈렌 아세트산(NAA) 및 이것들의 혼합물로부터 선택되는 식물 호르몬 적어도 하나[다만 증식 단계 동안 증식 배지는, 특히 적어도 하나의 시토키닌 및 적어도 하나의 옥신을 포함할 것임]

를 포함할 수 있다.

식물 성장 호르몬은, 특히 탈분화된 형태인 세포의 증식을 허용하는 농도 및 비율로 증식 배지에 첨가될 것이다. 식물 성장 호르몬은, 특히 키네틴, 6-퍼푸릴아미노퓨린, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 나프탈렌 아세트산(NAA) 및 이것들의 혼합물로부터 선택될 것이며, 특히 키네틴, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D), 나프탈렌 아세트산(NAA) 및 이것들의 혼합물로부터 선택될 것이다. 특히 식물 성장 호르몬은 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 및 나프탈렌 아세트산의 혼합물일 수 있다.

본 발명에 따른 옥신의 농도는, 특히 증식 배지 1L당 0.001 mg 내지 10 mg, 예를 들어 증식 배지 1L당 0.1 mg 내지 3 mg에 포함될 것이다.

본 발명에 따른 시토키닌의 농도는, 특히 증식 배지 1L당 0.01 mg 내지 0.5 mg, 특히 증식 배지 1L당 0.05 mg 내지 0.15 mg일 것이다.

일 구현예에서, 옥신/시토키닌 호르몬의 비율은 0.2 내지 2.5 / 0.01 내지 0.5, 특히 1 내지 2 / 0.05 내지 0.2일 것이며, 특히 약 1.5 / 0.1에 포함될 것이다.

특히 본 발명에 따른 증식 배지는 옥신, 특히 디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 및 나프탈렌 아세트산(NAA) 1.5 mg/L과, 시토키닌, 특히 키네틴 0.1 mg/L를 포함할 수 있다.

증식 배지는 멸균된 것으로서, 우선적으로는 중성에 가까운 pH를 보일 것이다.

본 발명에 따른 노박덩굴과 식물 세포의 증식에 적합한 예시적 증식 배지는, 특히 문헌(Murashige & Skoog (1962))에 기술되어 있거나, 또는 본 출원의 실시예에 기술되어 있다.

이러한 증식 배지는, 예를 들어 하기 조성을 가질 수 있다(농도는 무세포 증식 배지의 부피와 관련하여 표현됨): 다량 원소: NH₄NO₃ 1650　mg/L, KNO₃ 2500　mg/L, CaCl₂.2H₂O 440　mg/L, MgSO₄.7H₂O 370　mg/L, KH₂PO₄ 130　mg/L; 미량 원소: KI 0.41　mg/L, H₃BO₃ 6.2　mg/L, MnSO₄.4H₂O 22.3　mg/L, ZnSO₄.H₂O 7.5　mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25　mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.025　mg/L, CoCl₂.6H₂O 0.025　mg/L, FeSO₄.7H₂O 19.85　mg/L, Na₂EDTA.2H₂O 26.64　mg/L; 비타민: 미오-이노시톨 50　mg/L, 니코틴산 0.25　mg/L, 피리독신-HCl 0.25　mg/L, 티아민-HCl 0.25　mg/L; 탄소 공급원: 수크로스 30　g/L; 및 식물 호르몬: 키네틴 0.083　mg/L, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 0.575　mg/L, 나프탈렌 아세트산(NAA) 0.350　mg/L [이것들 모두 (예를 들어 121℃에서 20분 동안의 고압살균 또는 0.2 μm 필터를 통한 여과에 의한) 멸균처리 전 pH6으로 조정됨].

대안적으로 본 증식 배지는 하기 조성을 가질 수 있다(농도는 무세포 증식 배지의 부피와 관련하여 표현됨): 다량 원소: NH₄NO₃ 1650　mg/L, KNO₃ 2500　mg/L, CaCl₂.2H₂O 440　mg/L, MgSO₄.7H₂O 370　mg/L, KH₂PO₄ 130　mg/L; 미량 원소: KI 0.41　mg/L, H₃BO₃ 6.2　mg/L, MnSO₄.4H₂O 22.3　mg/L, ZnSO₄.H₂O 7.5　mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25　mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.025　mg/L, CoCl₂.6H₂O 0.025　mg/L, FeSO₄.7H₂O 19.85　mg/L, Na₂EDTA.2H₂O 26.64　mg/L; 비타민: 미오-이노시톨 50　mg/L, 니코틴산 0.25　mg/L, 피리독신-HCl 0.25　mg/L, 티아민-HCl 0.25　mg/L; 탄소 공급원: 수크로스 30　g/L; 및 식물 호르몬: 키네틴 0.083　mg/L, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 0.575　mg/L, 나프탈렌 아세트산(NAA) 0.350　mg/L.

대안적으로 본 발명에 따른 증식 배지는 하기 조성을 가질 수 있다(농도는 무세포 증식 배지의 부피와 관련하여 표현됨): NH₄NO₃ 20　mM, KNO₃ 19　mM, CaCl₂.2H₂O 3　mM, MgSO₄.7H₂O 1.50　mM, KH₂PO₄ 1.2　mM, KI 0.005　mM, H₃BO₃ 0.1　mM, MnSO₄.4H₂O 0.1　mM, ZnSO₄.H₂O 0.04　mM, Na₂MoO₄.2H₂O 0.001　mM, CuSO₄.5H₂O 0.0001　mM, CoCl₂.6H₂O 0.0001　mM, FeSO₄.7H₂O 0.1　mM, Na₂EDTA.2H₂O 0.1　mM, 미오-이노시톨 0.5　mM, 니코틴산 0.004　mM, 피리독신-HCl 0.002　mM, 티아민-HCl 0.0015　mM, 글리신 0.03　mM, 수크로스 87.6　mM, 나프탈렌 아세트산 0.005　mM, 2,4-디클로로페녹시아세트산 0.002　mM, 및 키네틴 0.0005　mM.

증식 배지에의 파종(seeding)은, 증식 배지 1L 당 20 g 내지 300 g, 바람직하게 증식 배지 1L 당 100 g 내지 200 g, 예를 들어 증식 배지 1L 당 약 150 g을 포함하는 농도로 캘러스 세포를 현탁함으로써 수행될 수 있다.

증식 단계는, 바이오매스 증식 조건 하에서 진행될 것이다. 본 발명에 따르면, "바이오매스 증식 조건"이란, 특히 현탁된 세포의 증식에 필요한 온도, 지속기간, 진탕여부 및 광선 조건을 의미한다. 노박덩굴과 식물 세포의 배양에 대해 잘 알고 있는 당 업자는 바이오매스 증식 조건을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 일 구현예에서, 바이오매스 증식 단계는 어두운 환경과, 20℃ 내지 35℃, 특히 27℃ 내지 28℃를 포함하는 온도, 특히 약 27℃ 또는 약 28℃의 온도에서, 특히 100 rpm 내지 200 rpm, 특히 약 125 rpm(22.5 mm 궤도)에서의 진탕 하에, 10일 내지 30일을 포함하는 배양 지속 기간, 특히 15일 동안의 배양 지속 기간 동안 진행될 것이다.

이 단계 동안 세포는, 예를 들어 7일 내지 15마다 "계대배양" 또는 번식될 수 있다. 세포의 계대배양은 당 업자에게 널리 공지되어 있는데; 이는, 특히 농축 새 배지 중 세포 배양액 일부의 희석을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들어 배양액의 5분의 1만큼이, 초기 배양액 부피에 대응하는 부피만큼의 새 배지 중에 재현탁된다. 이는, 세포주를 증식 상태로 액체 배지 중에 유지시킬 수 있다.

단계 (ii) - 유도 단계

증식 단계 후, 단계 (i)에서 수득된 세포는 유도 칵테일이 첨가됨으로써 유도된다. 유도 칵테일이 첨가된 증식 배지는 본 발명에 따라 "유도 배지"라 칭하여질 것이다.

유도 단계는, 세포가 2차 대사물질, 예컨대 펜타사이클릭 트리테르펜의 생합성을 촉진하는 생리적 상태로 유지되는 단계이다.

펜타사이클릭 트리테르펜, 특히 셀라스트롤의 생성은 유도 단계 동안에 세포의 세포기질 중에서 이루어지며, 이후 셀라스트롤은 유도 배지에 부분적으로 확산될 수 있다. 그러므로 본 발명의 의미 중 유도 단계는, 셀라스트롤 및 이의 유도체(펜타사이클릭 트리테르펜)의 제조(생합성) 단계에 대응한다.

유도는, 우선적으로 7일 내지 21일간, 특히 12일 내지 20일간, 특히 15일, 16일 또는 17일간의 (특히 계대배양이 이루어지지 않는) 증식 단계 이후에 진행될 것이다. 대안적으로, 유도 칵테일은, 증식 단계 동안에 도달한 세포 농도가 증식 배지 중 세포의 처음 농도의 2배, 특히 2배를 초과할 때 첨가될 수 있다. 유도 칵테일은, 특히 세포 농도가 200 g/L 이상, 예컨대 200 g/L 내지 400 g/L, 특히 약 300 g/L일 때(다만 이 농도는 증식 배지 1 리터당 세포 중량을 기준으로 함) 첨가될 수 있다. 일 구현예에서, 유도 칵테일은 150 g/L 내지 200 g/L의 증식 단계 개시시 세포 농도로부터, 300 g/L 내지 400g/L에 포함되는 증식 단계 막바지 세포 농도로 증가하는, 배양액에 첨가될 것이다.

증식 단계 후, 식물 세포는 증식 배지 중에 함유된 원소, 특히 탄소 공급원, 예컨대 수크로스 대부분 또는 전부를 소모한다. 그러므로 유도 칵테일이 첨가되기 전이나 유도 카테일 첨가와 동시에 배지의 조성을 복구시킬 필요가 있을 수 있다.

배지의 조성을 복구하기 위해, 증식 단계 이후 수득된 세포 배양액은, 특히, 예를 들어 침강 또는 여과에 의해 농축될 수 있으며, 이후 이와 같이 수득된 세포에 새 증식 배지가 첨가된다. 이 경우, 세포는 새 증식 배지에 재현탁되어, (증식 배지 1 리터당 세포의 중량을 기준으로) 200 g/L 내지 400 g/L, 예를 들어 250 g/L 내지 350 g/L에 포함되는 농도, 특히 약 300 g/L의 농도에 이르게 될 것이다.

대안적으로 농축 혼합물이 세포 배양액에 첨가되어, 증식 배지 중 원소의 농도가 복구될 수 있다. 농축 혼합물은, 특히 유도 칵테일 첨가 직전, 직후 또는 동시에 첨가될 것이다. 예를 들어 세포 배양액의 5분의 1은 동일 부피의 5배 농축된 증식 배지로 교체될 수 있다.

증식 배지 중 원소의 농도는 증식 단계 14일, 15일 또는 16일 후 "0"에 가깝거나 "0"인 것으로 간주된다. 특히 무기 원소(더욱 구체적으로 다량 원소 및 미량 원소)와 탄소계 원소(더욱 구체적으로 탄소 공급원)의 농도는 증식 단계 14일, 15일 또는 16일 후 "0"에 가깝거나 "0"인 것으로 간주된다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 증식 배지는 유도 단계 개시시 다른 어떤 성분들보다도

- 예를 들어 증식 배지 1L당 5000 mg 내지 8000 mg에 포함되는 총 다량 원소 농도만큼의 다량 원소, 우선적으로 증식 배지 1L당 6000 mg 이상, 유리하게 증식 배지 1L당 6000 mg 내지 8000 mg에 포함되는 총 다량 원소 농도만큼의 다량 원소, 특히 NH₄NO₃, KNO₃, CaCl₂.2H₂O, MgSO₄.7H₂O, KH₂PO₄ 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 다량 원소 적어도 하나;

- 예를 들어 증식 배지 1L당 10 mg 내지 200 mg, 특히 증식 배지 1L당 50 mg 내지 150 mg에 포함되는 총 미량 원소 농도만큼의 미량 원소, 특히 KI, H₃BO₃, MnSO₄.4H₂O, ZnSO₄.H₂O, Na₂MoO₄.2H₂O, CuSO₄.5H₂O, CoCl₂.6H₂O, FeSO₄.7H₂O, Na₂EDTA.2H₂O 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 미량 원소 적어도 하나;

- 예를 들어 증식 배지 1L당 0.01 g 내지 3 g, 특히 증식 배지 1L당 0.05 g 내지 1 g 범위의 총 비타민 농도만큼의 비타민, 특히 미오-이노시톨, 니코틴산, 피리독신-HCl, 티아민-HCl 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 비타민 적어도 하나;

- 증식 배지 1L당 3 mg 내지 4 mg에 포함되는 증식 배지 중 농도만큼의 아미노산 적어도 하나, 특히 글리신;

- 증식 배지 1L당 10 g 내지 70 g, 예를 들어 증식 배지 1L당 약 30 g의 총 탄소 공급원 농도만큼의 탄소 공급원 적어도 하나, 특히 수크로스

를 포함할 것이다.

일 구현예에서, 유도 단계 개시시의 증식 배지는 시토키닌 및 옥신을 포함하지 않을 것이거나, 또는 무시할 수 있을 만큼의 양, 특히 0.001 g/ml 미만만큼을 포함할 것이다.

유도 단계 중 증식 배지는, 유리하게 멸균성일 것이며, 우선적으로는 중성에 가까운 pH를 보일 것이다.

유도 단계 중 증식 배지는, 특히 하기 조성을 가질 수 있다: 다량 원소: NH₄NO₃ 2.8　g/L, KNO₃ 3　g/L, CaCl₂.2H₂O 0.45　g/L, MgSO₄.7H₂O 74　mg/L, KH₂PO₄ 34　mg/L; 미량 원소: KI 0.16　mg/L, H₃BO₃ 6.2　mg/L, MnSO₄.4H₂O 18.5　mg/L, ZnSO₄.H₂O 6.6　mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25　mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.025　mg/L, CoCl₂.6H₂O 0.025　mg/L, FeSO₄.7H₂O 28　mg/L, Na₂EDTA.2H₂O 37　mg/L; 비타민: 미오-이노시톨 250　mg/L, 니코틴산 1.7　mg/L, 피리독신-HCl 1　mg/L, 티아민-HCl 1　mg/L; 아미노산: 글리신 4　mg/L; 탄소 공급원: 수크로스 30　g/L.

본 발명에 따르면, "유도 칵테일"이란, 세포 분열을 중단시키는 칵테일을 의미한다. 이러한 유도 칵테일은 모노카복실 화합물류의 유도인자 적어도 하나와, 생물 유도인자 적어도 하나를 포함한다. 유도 칵테일은, 예를 들어 농축 원액을 사용하여 배양 배지에 도입된다.

본 발명에 따르면, "모노카복실 화합물류 유도인자"란, 더욱 구체적으로 5-클로로살리실산(5-클로로-SA), 살리실산(SA), 아세틸살리실산(ASA), 메틸 에스테르, 특히 메틸 자스몬산염(MeJa) 및 이것들의 혼합물을 포함하거나, 바람직하게 이것들로 이루어진 군으로부터 선택된 유도인자를 의미한다. 본 발명에 따른 일 구현예에서, 모노카복실 화합물류 유도인자는 메틸 자스몬산염, 살리실산 및/또는 5-클로로살리실산, 특히 메틸 자스몬산염이다. 모노카복실 화합물류 유도인자는, 특히 유도 배지 1L당 0.005 g 내지 0.1 g, 특히 유도 배지 1L당 0.01 g 내지 0.05 g, 특히 유도 배지 1L당 0.002 g 내지 0.004 g에 포함되는 최종 농도를 달성하도록 첨가될 것이다.

본 발명에 따르면, "생물 유도인자"란, 더욱 구체적으로 N-아세틸아미노글루코사민, 특히 키틴, 키토산, 미생물이나 진균 추출물, 올리고당체(다당체, 펙틴, 셀룰로스)를 포함하거나, 바람직하게 이것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물 유도인자를 의미한다. 일 구현예에서, 생물 유도인자는 키틴이다. 키틴은 반복 단위 베타-1,4-N-아세틸-D-글루코사민을 가지는 선형 중합체이다. 생물 유도인자는, 특히 유도 배지 1L당 0.05 g 내지 50 g, 예컨대 유도 배지 1L당 0.1 g 내지 10 g, 예컨대 유도 배지 1L당 0.5 g 내지 7 g, 특히 유도 배지 1L당 1 g 내지 5 g에 포함되는 최종 농도를 달성하도록 첨가될 것이다.

일 구현예에서, 유도 칵테일은, 특히 유도 배지 1L당 최종 농도 0.002 g 내지 0.005 g 만큼의 메틸 자스몬산염과, 특히 유도 배지 1L당 최종 농도 1 g 내지 4 g 만큼의 키틴을 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명에 다른 유도 칵테일은 식물 세포에 대한 세포 분화 인자 적어도 하나 및/또는 테르펜 합성 경로의 전구체 적어도 하나를 추가로 포함할 것이다.

본 발명에 따른 "식물 세포에 대한 세포 분화 인자"는, 특히 시토카인, 특히 벤질아미노퓨린(BAP), 앱시스산, 키네틴, 티디아주론, 6-γ,γ-디메틸알릴아미노퓨린(2iP 또는 이소펜테닐아데닌) 또는 제아틴, 지베렐린 및 이것들의 조합, 특히 BAP 및/또는 2iP를 포함하거나, 바람직하게는 이것들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있거나, 특히 2iP일 수 있다.

본 발명에 따른 "테르펜 합성 전구체"는, 특히 피루브산나트륨; 피로인산칼륨; 메발론산; 게라니올; 파르네솔; 이소펜테닐, 디메틸알릴, 예컨대 이의 피로인산염 형태; 아세트산나트륨; 피루브산 및 이것들의 조합, 특히 게라니올, 파르네솔, 피루브산나트륨, 피로인산칼륨 및 이것들의 조합, 예컨대 피루브산나트륨 및/또는 피로인산칼륨을 포함하거나, 바람직하게 이것들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

BAP는, 특히 유도 배지 1L당 0.01 mg 내지 5 mg, 예를 들어 유도 배지 1L당 0.5 mg 내지 5 mg에 포함되는 만큼의, 유도 배지 중 최종 농도로 사용될 수 있다.

5-클로로살리실산(5-클로로-SA)은, 특히 0.1 mg/L 내지 15 mg/L에 포함되는, 유도 배지 중 최종 농도로 사용될 수 있다.

살리실산은, 특히 0.1 mg/L 내지 100 mg/L, 예를 들어 20 mg/L 내지 60 mg/L에 포함되는, 유도 배지 중 최종 농도, 예를 들어 약 45 mg/L만큼으로 사용될 수 있다.

파르네솔은, 특히 1 mg/L 내지 100 mg/L, 예를 들어 15 mg/L 내지 30 mg/L, 예를 들어 약 30 mg/L만큼의, 유도 배지 중 최종 농도로 사용될 수 있다.

게라니올은, 특히 1 mg/L 내지 100 mg/L, 예를 들어 20 mg/L 내지 30 mg/L만큼의, 유도 배지 중 최종 농도로 사용될 수 있다.

피루브산나트륨은, 특히 100 mg/L 내지 5000 mg/L, 예를 들어 500 mg/L 내지 2000 mg/L만큼의, 유도 배지 중 최종 농도로 사용될 수 있다.

피로인산칼륨은, 특히 유도 배지 1L당 1 mg 내지 2000 mg, 예를 들어 유도 배지 1L당 100 mg 내지 1000 mg에 포함되는, 유도 배지 중 최종 농도로 사용될 수 있다.

2iP는, 특히 0.005 mg/L 내지 10 mg/L, 예를 들어 0.01 mg/L 내지 3 mg/L, 예를 들어 0.1 mg/L 내지 2 mg/L만큼의, 유도 배지 중 최종 농도로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 일 구현예에서, 유도 칵테일은 메틸 자스몬산염, 키틴, 피루브산나트륨, 피로인산칼륨 또는 이것들의 혼합물을 포함한다.

본 발명에 따른 일 구현예에서, 유도 칵테일은 메틸 자스몬산염, 키틴, 피루브산나트륨, 피로인산칼륨, 그리고 선택적으로는 BAP 및/또는 2iP를 포함한다.

본 발명에 따른 일 구현예에서, 유도 카테일은 피루브산나트륨(500 mg/L 내지 2000 mg/L), 피로인산칼륨(100 mg/L 내지 1000 mg/L), 2iP(0.1 mg/L 내지 2 mg/L), 메틸 자스몬산염(0.002 g/L 내지 0.005 g/L) 및 키틴(1 g/L 내지 4 g/L)를 포함하거나, 이것들로 이루어져 있다[다만 괄호 안에 기재된 농도는 유도 배지, 즉 의도된 희석률에 따라 가변적으로 더 농축될 수 있거나 덜 농축될 수 있는 초기 칵테일 중 농도에 해당함].

또 다른 구현예에서, 유도 칵테일은 벤질아미노퓨린(BAP)(0.5 mg/L 내지 5 mg/L, 특히 0.5 mg/L 내지 3 mg/L); 5-클로로살리실산(5-클로로-SA)(2 mg/L 내지 6 mg/L, 특히 3 mg/L 내지 5 mg/L, 예를 들어 약 3 mg/L 또는 약 5 mg/L), 아세틸살리실산(ASA) 및/또는 살리실산(SA)(20 mg/L 내지 60 mg/L, 특히 30 mg/L 내지 50 mg/L, 특히 33 mg/L 내지 45 mg/L); 메틸 자스몬산염(MeJa)(0.002 g/L 내지 0.005 g/L, 특히 10 mg/L 내지 40 mg/L); 키틴(1 g/L 내지 4 g/L); 그리고 파르네솔(F-OH)(19 mg/L 내지 40 mg/L) 및/또는 게라니올(20 mg/L 내지 30 mg/L)을 포함하거나, 이것들로 이루어져 있다[다만 괄호 안에 기재된 농도는 유도 배지, 즉 의도된 희석률에 따라 가변적으로 더 농축될 수 있거나 덜 농축될 수 있는 초기 칵테일 중 농도에 해당함].

또 다른 구현예에서, 유도 칵테일은 피루브산나트륨(500 mg/L 내지 2000 mg/L), 피로인산칼륨(100 mg/L 내지 1000 mg/L), 2iP(0.1 mg/L 내지 1 mg/L), 메틸 자스몬산염(MeJa)(0.002 g/L 내지 0.005 g/L, 특히 10 mg/L 내지 40 mg/L) 및 키틴(1 g/L 내지 4 g/L)을 포함하거나, 이것들로 이루어져 있다[다만 괄호 안에 기재된 농도는 유도 배지, 즉 의도된 희석률에 따라 가변적으로 더 농축될 수 있거나 덜 농축될 수 있는 초기 칵테일 중 농도에 해당함].

또 다른 구현예에서, 유도 칵테일은 피루브산나트륨(약 1.5 g/L), 피로인산칼륨(약 0.4 g/L), 2iP(약 0.4 mg/L), 메틸 자스몬산염(MeJa)(약 0.03 mg/L) 및 키틴(약 2 g/L)을 포함하거나, 이것들로 이루어져 있다[다만 괄호 안에 기재된 농도는 유도 배지, 즉 의도된 희석률에 따라 가변적으로 더 농축될 수 있거나 덜 농축될 수 있는 초기 칵테일 중 농도에 해당함].

유도 단계 중, 유도 칵테일을 첨가한 후에 배양액은, 특히 50 rpm 내지 200 rpm, 특히 약 125 rpm에서, 3일 내지 30일, 특히 10일 내지 25일, 특히 12일 내지 15일에 포함되는 기간 동안, 구체적으로는 20℃ 내지 35℃에 포함되는 온도, 특히 약 27℃에서, 유리하게는 배양 배지 중 용존 산소 수준 2% 내지 40%, 바람직하게는 약 16%에서 계속 진탕되는 상태가 유지된다. 필요하다면, 특히 생물반응기의 빈 공간 내에 산소가 충분히 농축된 멸균 공기를 공급하거나 또는 배지 중에 이 공기를 확산시킴으로써 이러한 공기의 공급이 이루어질 수 있다. 바람직하게 유도 단계 (iii)은 어두운 환경에서 진행된다. 유도 단계 중, 세포 배양액은 우선적으로 계대배양되지 않는다.

단계 (iii) - 펜타사이클릭 트리테르펜 농축 미정제 추출물의 제조 단계

유도 단계 이후, 본 발명에 따른 방법은 펜타사이클릭 트리테르펜, 특히 셀라스트롤 농축 미정제 추출물의 제조 단계를 포함한다.

농축된 미정제 추출물은, 특히 바이오매스와 배양 상청액의 분리에 의해 수득될 수 있다. 분리는, 특히 직접 여과(0 μm ~ 50 μm), 원심분리 또는 세포 침강에 의해 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명에 따라 농축된 미정제 추출물은 이렇게 회수된 배양 상청액으로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 농축 미정제 추출물은 또한 바이오매스 분해 이후에 수득될 수도 있다. 예를 들어 회수된 바이오매스 중에 함유된 세포는, 물리적 방법(초음파처리 또는 분쇄) 또는 화학적 방법(산 용해)에 의해 용해될 수 있으며, 이후 이 용해물은 용매 추출의 대상이 될 것이다. 그 다음, 세포기질 유래 유기상, 특히 트리테르펜을 포함하는 유기상은, 특히 침강이나 원삼분리에 의해 회수된다. 용매는, 특히 에스테르류의 용매일 것이며, 더욱 구체적으로는 아세트산알킬일 것인데, 다만 이 알킬은, 더욱 구체적으로 탄소를 1개 내지 6개 가지는 선형 또는 분지형 알킬, 특히 아세트산에틸 또는 아세트산이소프로필일 것이다. 사용된 용매의 부피는 바이오매스 중량당 2 부피일 것이다.

우선적으로 본 발명에 따른 농축 미정제 추출물은 이렇게 회수된 유기상에 해당할 것이다.

대안적으로 본 발명에 따른 농축 미정제 추출물은, 용매가 증발되어, 특히 추출물이 사용되는 분야(화장품, 제약)에 적합한 담체, 특히 식물성 오일로 대체된 후에 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 농축 미정제 추출물은 정제되지 않는다. 농축 미정제 추출물은, 선택적으로 후속 단계에서 정제될 수 있다.

농축 미정제 추출물이 정제되어, 정제된 추출물이 얻어지면, 본 발명에 따른 방법은 단계 (iii)에서 수득된 농축 미정제 추출물로부터 하나 이상의 펜타사이클릭 트리테르펜의 정제된 추출물을 수득하는 단계 (iv)를 추가로 포함한다.

그 다음, 본 발명에 따라 정제된 추출물은 본 발명에 따른 펜타사이클릭 트리테르펜 하나 이상을 90% 초과, 특히 95% 초과, 특히 98% 초과하여 포함할 것이다. 일 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 추출물은 셀라스트롤을 90% 초과, 특히 95% 초과, 특히 98% 초과하여, 특히 100% 포함한다.

본 발명에 따른 농축 추출물의 정제는, 특히 구체적으로 10.5분, 8.2분 및 6.5분에 각각 용리되는 셀라스트롤, 틴게닌 A 및 틴게닌 B의 피크들을 포함하여 426 nm에서 피크들을 보이는 것들의 HPLC(고 성능 액체 크로마토그래피) 분획화에 의해, 특히 펜타사이클릭 트리테르펜(들), 특히 셀라스트롤, 틴게닌 A 및 틴게닌 B를 분리하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 셀라스트롤의 정제는, 특히 본 출원의 실시예에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 농축 미정제 추출물에 관한 것이기도 하다.

본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 농축 미정제 추출물과, 약학적으로나 더모코스메틱(dermocosmetic)상 허용 가능한 부형제 하나 이상을 포함하는, 피부과 약과 같은 약, 또는 더모코스메틱 조성물에 관한 것이다.

약학적으로나 더모코스메틱상 허용 가능한 부형제는 당 업자에게 공지된 부형제들 중 임의의 것일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은, 특히 국소 조성물, 특히 크림, 로션, 겔, 연고, 에멀전, 마이크로에멀전, 스프레이 등의 형태를 가지는 국소 조성물일 것이다.

본 발명에 따른 약, 예컨대 피부과 약 또는 더모코스메틱 조성물은, 구체적으로 부형제 및 제형 보조제, 예컨대 유화제, 증점제, 겔화제, 수성 접착제(water fixative), 도포제(spreading agent), 안정화제, 염료, 향수 및 보존제를 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 특히 TH17 매개성 세포 반응을 유도하는 염증성 피부병의 치료 또는 예방에 약품으로서 사용될, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 농축 미정제 추출물이다.

당 업자는, TH17 매개성 세포 반응을 유도하는 염증성 피부병을 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 당 업자는, 특히 대조군 시료에서의 IL-22, IL-17 및/또는 TNF-α의 발현 수준에 비한, 병변 부위에서의 IL-22, IL-17 및/또는 TNF-α의 발현 수준을 측정할 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 염증성 피부병은, 특히 건선, 아토피 피부염 및 여드름을 포함하거나, 바람직하게 이것으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 비제한적 도면과 이하에 상술된 실시예들에 의해 예시된다.

도면:

도 1: 시간(일)에 따라 가변적인, 습윤 바이오매스(FW) 1L당 트립테리지움 윌포르디이 세포 배양액(g)의 성장 곡선(실선), 그리고 시간(일)에 따라 가변적인, 세포 현탁액 1L당 셀라스트롤(mg)로 나타낸 셀라스트롤 농도 곡선(점선).

도 2: 23일에 수득된 트립테리지움 윌포르디이의 농축 미정제 추출물의 HPLC 크로마토그램(λ = 426 nm).

도 3: 시료 1과 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 IL-17A 합성의 유도%에 비한, 시료 2, 3, 4 및 5와 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 IL-17A 합성의 유도%(*** p-값 < 0.001).

도 4: 시료 1과 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 IFN-γ 합성의 유도%에 비한, 시료 2, 3, 4 및 5와 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 IFN-γ 합성의 유도%(*** p-값 < 0.001).

도 5: 시료 1과 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 IL-22 합성의 유도%에 비한, 시료 2, 3, 4 및 5와 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 IL-22 합성의 유도%(*** p-값 < 0.001).

도 6: 시료 1과 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 TNF-α 합성의 유도%에 비한, 시료 2, 3, 4 및 5와 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 TNF-α 합성의 유도%(*** p-값 < 0.001).

도 7: 시료 1과 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 IL-6 합성의 유도%에 비한, 시료 2, 3, 4 및 5와 함께 항온처리된 후, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 자극되고 나서의 CD4+ T 림프구에 의한 IL-6 합성의 유도%(*** p-값 < 0.001).

실시예

실시예 1: 세포 분화 프로토콜

트립테리지움 윌포르디이 잎 외식편으로부터 캘러스를 수득하였다.

외식편을 70% 에탄올로 멸균한 다음, 유효 염소 2.5%인 차아염소산나트륨으로 멸균하고 나서, 멸균 탈염수로 헹구었다. 선택적으로 7% 과산화수소로 세척한 후 멸균 탈염수로 헹구는 것도 가능하였다.

잎을 조각(예컨대 한 변이 약 8 mm ~ 약 10 mm인 정사각형) 내었다. 잎 외식편을 아가 증식 배지 위에 올려 놓았다.

증식 배지의 조성은 다음과 같았다:

다량 원소: NH₄NO₃ 1650　mg/L, KNO₃ 1900　mg/L, CaCl₂.2H₂O 440　mg/L, MgSO₄.7H₂O 370　mg/L, KH₂PO₄ 170　mg/L,

미량 원소: KI 0.83　mg/L, H₃BO₃ 6.2　mg/L, MnSO₄.4H₂O 22.3　mg/L, ZnSO₄.H₂O 6.61　mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25　mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.025　mg/L, CoCl₂.6H₂O 0.025　mg/L, FeSO₄.7H₂O 27.8　mg/L, Na₂EDTA.2H₂O 37.3　mg/L,

비타민: 미오-이노시톨 100　mg/L, 니코틴산 0.5　mg/L, 피리독신-HCl 0.5　mg/L, 티아민-HCl 0.5　mg/L,

아미노산: 글리신 2　g/L,

탄소 공급원: 수크로스 30　g/L,

식물 호르몬: 키네틴 0.1　mg/L, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 0.5　mg/L, 나프탈렌아세트산(NAA) 1　mg/L.

여기에 아가 8 g/L ~ 12 g/L를 첨가하여 증식 배지를 겔화하였고, (KOH 1M을 사용하여) 이의 pH를 pH 6 ± 0.5로 조정한 다음, 121℃에서 20분 동안 고압멸균하였다. 외식편이 담겨있는 페트리 디쉬를 27℃ ~ 28℃의 어두운 곳에서 항온처리하였다.

캘러스를 매달 동일한 아가 배지에서 계대배양하였다. 이를 위해, 수득한 캘러스를 잎 외식편으로부터 분리해내어 새 아가 증식 배지상에 올려놓았다.

실시예 2: 배양 배지 및 번식 배지의 제조(증식 단계)

계대배양한지 수개월 후, 물러진(friabl) 캘러스를 수득하여 이를 액체 증식 배지에 옮겨 담았다.

증식 배지는, 예를 들어 하기 명시된 조성을 가졌다:

다량 원소: NH₄NO₃ 1650　mg/L, KNO₃ 2500　mg/L, CaCl₂.2H₂O 440　mg/L, MgSO₄.7H₂O 370　mg/L, KH₂PO₄ 130　mg/L,

미량 원소: KI 0.41　mg/L, H₃BO₃ 6.2　mg/L, MnSO₄.4H₂O 22.3　mg/L, ZnSO₄.H₂O 7.5　mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25　mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.025　mg/L, CoCl₂.6H₂O 0.025　mg/L, FeSO₄.7H₂O 19.85　mg/L, Na₂EDTA.2H₂O 26.64　mg/L,

비타민: 미오-이노시톨 50　mg/L, 니코틴산 0.25　mg/L, 피리독신-HCl 0.25　mg/L, 티아민-HCl 0.25　mg/L,

탄소 공급원: 수크로스 30　g/L,

식물 호르몬: 키네틴 0.083　mg/L, 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 0.575　mg/L, 나프탈렌 아세트산(NAA) 0.350　mg/L.

(KOH 1M을 첨가하여) 배지의 pH를 pH 6 ± 0.5로 조정한 다음, 적당한 멸균 처리, 예컨대 121℃에서 최소 20분의 지속기간 동안의 고압멸균, 또는 0.2 μm 멸균 여과를 실시하였다.

물러진 캘러스 약 40 g을, 번식 배지가 담겨있는 200 ml들이 Erlenmeyer 플라스크 내에 넣은 후, 진탕기 테이블(100 rpm(분당 회전수)) 상에서 1주일 동안 항온처리함으로써(어두운 환경, 27℃ ~ 28℃) 세포 현탁을 실시하였다. 잔여 캘러스 클러스터는 남기고 세포 상청액을 피펫으로 수집하였다. 수득한 세포 현탁액을 15일 동안 배양한 다음, 새 배지로 15일마다 5배 희석함으로써 번식을 진행해 나갔다.

Erlenmeyer 플라스크를 40%(80 mL) 정도 채웠으며, 세포 현탁액을 옮겨담는 방식의 접종이 이루어졌는데, 이 때의 접종률은 새 바이오매스 부피의 20% ~ 25% 또는 약 160 g/L이었다. 그 다음, 15일 동안 27℃ ~ 28℃의 어두운 환경에서 배양을 수행하였는데, 이 때 110 rpm ~ 120 rpm의 궤도형 진탕이 이루어졌다. 이 단계에서, 바이오매스는 현탁액 1 리터당 새 바이오매스 약 300 g의 농도로 존재하였다.

실시예 3: Erlenmeyer 플라스크 내에서의 트리테르펜 제조(유도 단계 및 농축 미정제 추출물 제조 단계)

유도 단계:

배양 15일 후, Erlenmeyer 플라스크로부터 세포 배양액 5분의 1을 덜어낸 다음, Erlenmeyer 플라스크에 농축 증식 배지 20 mL를 첨가하였다. 농축 배지의 조성은 이하와 같았다:

다량 원소: NH₄NO₃ 13.9　g/L, KNO₃ 15.2　g/L, CaCl₂.2H₂O 2.2　g/L, MgSO₄.7H₂O 370　mg/L, KH₂PO₄ 170　mg/L; 미량 원소: KI 0.83　mg/L, H₃BO₃ 31.2　mg/L, MnSO₄.4H₂O 91.5　mg/L, ZnSO₄.H₂O 33.05　mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 1.25　mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.125　mg/L, CoCl₂.6H₂O 0.125　mg/L, FeSO₄.7H₂O 139　mg/L, Na₂EDTA.2H₂O 186.5　mg/L; 비타민: 미오-이노시톨 1250　mg/L, 니코틴산 8.5　mg/L, 피리독신-HCl 5　mg/L, 티아민-HCl 5　mg/L; 아미노산: 글리신 20　mg/L; 탄소 공급원: 수크로스 150　g/L(탈염수 중 용해).

그 다음, 유도 칵테일을 설폭시화디메틸 중 제조된 원액을 사용하여 Erlenmeyer 플라스크내 증식 배지에 첨가하였다. 유도인자 칵테일의 조성은 유도 배지(+ 세포) 중 이하와 같은 농도를 제공하였다: 피루브산나트륨 1.5　g/L, 피로인산칼륨 0.440　g/L, 2iP 0.0004　g/L, 메틸 자스몬산염 0.036　g/L 및 키틴 2　g/L.

셀라스트롤과 이의 유도체를 27℃ ~ 28℃의 어두운 환경에서 12일 동안 궤도 진탕(120 rpm)하여 제조하였다.

추출을 위한 바이오매스 수집:

배양을 중단하고 나서, 배지를 여과함으로써 셀라스트롤을 다량 함유하는 전체 바이오매스를 회수하였다.

0 μm ~ 50 μm 여과에 의해 바이오매스를 분리한 후, 에스테르류 용매, 더욱 구체적으로 아세트산알킬, 특히 아세트산에틸(또는 아세트산이소프로필) 2 부피를 바이오매스 1 중량과 혼합하였다. 이 혼합물을 초음파 처리하여 세포를 용해하고, 세포기질 성분을 이용 가능하게 만들었다. 이 혼합물을 원심분리한 후 트리테르펜 분획을 포함하는 유기상을 회수하였다.

유기상 중 셀라스트롤 농도를 측정하였다. 현탁액 1 리터당 셀라스트롤 농도는 553 mg인 것으로 추산되었는데, 이는 건조 세포 중량 1 그램당 셀라스트롤 중량 0.0166 g에 해당하는 양이다.

실시예 4: 웨이브형 1회용 생물반응기 백 내에서의 트리테르펜(셀라스트롤 및 유도체)의 제조

예시된 본 실시예에는, 웨이브형 반응기(예컨대 Sartorius 브랜드)(부피 5 L들이 또는 10L들이, 또는 5L들이 2개)가 기술되어 있지만, 방법은 더 큰 부피와 다른 제조사의 장비에 따라 수정되어 실시할 수 있다.

유리로 제작된 전통적 실험실용 생물반응기들 또는 스테인레스 강철로 제작된 산업용 생물반응기들을 위한 시스템으로서, 이미 기술된 2원 시스템을 동일한 방식으로 적용하였다(2개의 웨이브 백 사용).

증식

자체의 플랫폼 위에 장착된 웨이브 생물반응기(5 L들이)를 인라인 멸균 여과를 거친 증식 배지로 채운 다음, 공기를 발포시켰다.

실시예 2에 기술된 바와 같이, 트립테리지움 윌포르디이 예비 배양액을 Erlenmeyer 플라스크 내에서 15일 동안 제조하였다. 그 다음, 생물반응기의 증식 배지에 이 예비 배양액을 접종하였다(농도 160 g/L)(백 A).

생물반응기를 하기 조건에 따라 항온처리하였다:

- 진동 각도(rocking angle): 5°~ 8°;

- 진동 회전수: 16 rpm ~ 30 rpm;

- 통기량: 순수 산소가 50%까지 농축된 공기 0.1 L/분 ~ 0.5 L/분;

- 온도: 27℃;

- 지속기간: 17일.

이 증식 단계 동안 세포 성장을 매일 측정하였다(도 1).

트리테르펜(셀라스트롤 및 유도체)의 유도 및 제조

백 A(5 L들이)로부터 얻어진 부피 약 1000 ml만큼의 배양액을, 동일 플랫폼상 백 A의 바로 옆에 놓아두었던 백 B로 옮겼다. 백 A 배지에, 하기 조성, 즉 다량 원소: NH₄NO₃ 13.9　g/L, KNO₃ 15.2　g/L, CaCl₂.2H₂O 2.2　g/L, MgSO₄.7H₂O 370　mg/L, KH₂PO₄ 170　mg/L; 미량 원소: KI 0.83　mg/L, H₃BO₃ 31.2　mg/L, MnSO₄.4H₂O 91.5　mg/L, ZnSO₄.H₂O 33.05　mg/L, Na₂MoO₄.2H₂O 1.25　mg/L, CuSO₄.5H₂O 0.125　mg/L, CoCl₂.6H₂O 0.125　mg/L, FeSO₄.7H₂O 139　mg/L, Na₂EDTA.2H₂O 186.5　mg/L; 비타민: 미오-이노시톨 1250　mg/L, 니코틴산 8.5　mg/L, 피리독신-HCl 5　mg/L, 티아민-HCl 5　mg/L; 아미노산: 글리신 20　mg/L; 탄소 공급원: 수크로스 150　g/L의, 탈염수 중 농축 배지 1000 mL를 보충하고 나서; 여기에 하기 조성, 즉 피루브산나트륨 7.5　g/L, 피로인산칼륨 2.2　g/L, 2iP 0.002　g/L, 메틸 자스몬산염 1.8　g/L 및 키틴 10　g/L의, 유도 칵테일을 첨가하였다.

그 다음, 백 A의 내용물을 27℃의 온도에서 진탕시켜 유도를 수행하였다.

유도 단계에서 배양 이후에는 16일 동안 배양액 중의 세포 성장 및 셀라스트롤 농도를 측정하였다(도 1).

백 A 내 셀라스트롤 농도는 32일이 될 때까지 꾸준히 증가하였으며, 항온처리 15일 후에는 유도 배지 1 리터당 최대 553 mg이 되었음을 확인할 수 있었다.

셀라스트롤 생성률은, 유도후 15일부터 32일까지 매일 세포 현탁액 1 L당 약 46 mg이었다.

셀라스트롤 생성 속도는, 가용 수크로스가 거의 모두 소비된 직후에 변하기 시작하였다(도 1).

실시예 5: 바이오매스 고체/액체 추출을 통한, 트립테리지움 윌포르디이 세포 현탁액(TW08)으로부터의 셀라스트롤 농축 추출물 제조

유도 후 15일(접종 후 32일), 세포 현탁액을 여과(나일론 필터, 20 μM ~ 50 μM)함으로써 바이오매스 거의 모두를 회수하였다(TW08).

현탁액 5 L로부터 약 1925 g의 바이오매스를 회수하였다. 이 바이오매스를 아세트산에틸(또는 아세트산이소프로필)로 추출하였다[바이오매스 중량을 기준으로 하여 2:1(부피:중량)의 비율(여기에서는 바이오매스 1925 g에 대하여 용매 3850 mL)]. 그 다음, 바이오매스/용매 혼합물을 대상으로 초음파처리에 의한 물리적 추출을 수행하였다. 이어서 진탕에 의한 온침 후 유기상을 회수하였다. 용매 첨가(그리고 이후의 진탕에 의한 온침 및 유기상 회수)를 2회 반복하였다.

셀라스트롤 및 유도체의 유기상 중 농도를 HPLC 검정(셀라스트롤, 틴게닌 유도체 정량)에 의해 측정하였다(도 2 참조). 실험 조건은 다음과 같았다: Atlantis dC18 가드 컬럼 5 μm 4.6 x 20 mm Gd 컬럼 - 5μ가 장착된 Waters Atlantis dC18 컬럼 4.6 x 150 mm - 5μ. 이동상: (A) 아세트산암모늄, 0.1　mM pH 4.0; (B) 아세트산암모늄, 0.1　mM pH 4.0, 99.8% 아세토니트릴중. 구배: 처음 25%(A)/75%(B) → 20분 0%(A)/100%(B) → 24.5분 0%(A)/100%(B) → 25분 25%(A)/75%(B) → 30분 25%(A)/75%(B). 유속: 1 mL/분. 426 nm:에서 검출 체류 피크(분): 틴게닌 B(6.5), 틴게닌 A(8.2), 셀라스트롤(10.5).

실시예 6: 트립테리지움 윌포르디이 배양액으로부터의 셀라스트롤 정제

실시예 5에서 수득한 추출물로부터 아세트산에틸(또는 아세트산이소프로필)을 감압 하에 증발시킨 결과, 건조 추출물을 수득하였다. 이렇게 수득한 추출물의 일부를 처음에 실리카 상 중간 압력 액체 크로마토그래피(MPLC)(40 g, 125 x 25 mm, 30 μm)(CH₂Cl₂/MeOH 용리 구배 100/0 → 0/100)로 정제하였다. 수득한 모든 분획들을 박층 크로마토그래피(TLC - 정지상: 60 Å 실리카; 이동상: 70:33:3 톨루엔/아세트산에틸/아세트산)로 분석하여, 주로 셀라스트롤과 이의 틴게닌 유도체(A 및 B)를 함유하는 분획들을 수집하였다. 두 번째 단계에서, 관심 생성물(셀라스트롤 및 유도체)을 함유하는 분획을 역상 모드의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(LiChrospher 100RP18, 250 x 25 mm, 5 μM)(물/아세토니트릴/0.1% 포름산 선형 구배, 80/20 → 0/100)로 정제하였다. 셀라스트롤 피크를 보이는 분획들을 수집하여, 감압 하에 농축하였는데; 처음 배양 현탁액 5 L로부터 셀라스트롤 약 2.5 g 내지 약 3 g이 수득되었다. 선택적으로 이는 절대 순도(absolute purity)를 가지도록 결정화될 수 있었다.

이와 동시에, 수득한 건조 추출물 일부를 완충제 중에 취한 결과, 항 Th17 약리 활성에 대해 평가될 추출물 R003034가 얻어졌다.

실시예 7: 셀라스트롤 농축 PCC 추출물의, 인간 CD4+ 세포에 대한 항 Th17 활성

염증성 피부병(특히 건선)에 있어서, CD4+ T 세포는 인터루킨 IL17, IL6 및 IL22뿐만 아니라, IFN-감마 및 TNF-알파를 과발현하는 것으로 알려져 있다. 아토피 피부염의 경우, 이 질환의 어떤 단계에서 IL17이 과발현된다. 더욱이, Th17 경로는 여드름에서 강력하게 활성화된다. 본 발명에 따른 농축 추출물의, 이러한 분자의 과발현에 대한 억제력을 시험하였다.

2명의 공여자의 혈액 단핵세포로부터 인간 CD4+ 세포를, 제조사(GE Healthcare)에 의해 권고되는 프로토콜에 따라 Ficoll Paque Plus®상에서 분리하였다. Miltenyi Biotec 키트(CD4) 및 LS 컬럼을 사용하는 양성 분류법에 의해 CD4+ 림프구를 분리하고 나서, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 100　U/ml 페니실린이 보충된 RPMI 배양 배지(Sigma-Aldrich: L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청 함유)에 재현탁하였다. 현탁된 림프구를 미세평판 웰에 분배하였다. 그 다음, 다양한 추출물 또는 대조군을 웰에 첨가하였다:

1. 음성 대조군(시약을 함유하지 않고 동일 부피의 완충제 첨가);

2. 추출물 R003034 0.06 mg/ml(셀라스트롤 역가 9 ng/ml)(웰 중 최종 농도);

3. 추출물 R003034 0.2 mg/ml(셀라스트롤 역가 30 ng/ml)(웰 중 최종 농도);

4. 추출물 R003034 0.6 mg/ml(셀라스트롤 역가 90 ng/ml)(웰 중 최종 농도);

5. 덱사메타손(양성 대조군) 2 μM(웰 중 최종 농도).

실온에서 2시간 동안 항온처리한 다음, CD4+ 림프구를 37℃에서 20시간 동안 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체로 활성화하였다(이때, 이 항체들의 최종 농도는 각각 300 ng/ml 및 400 ng/ml). 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체는 TH17형 반응을 유도하는 것으로 공지되어 있다.

다중 면역검정 방법에 의해 각각의 튜브의 상청액 중 시토카인 IL-17A, INF-감마, IL-22, TNF-알파 및 IL-6을 정량하였다(Jager et al. 2003). 얻어진 결과는 2회의 실험(2명의 상이한 공여자로부터 얻은 백혈구 사용)을 바탕으로 하였다. 그 결과를, 음성 대조군(1)에 의한 유도%와 비교되는 유도%로 도 3 내지 도 7에 제시하였다. 이로부터

- 양성 대조군 5(2　μM 덱사메타손)가 시토카인 모두, 즉 IL-17A, INF-감마, IL-22, TNF-알파 및 IL-6의 과발현을 억제하고;

- 본 발명에 따른 추출물(2, 3 및 4)은 시토카인 IL-17A, INF-감마, IL-22, TNF-알파 및 IL-6의 과발현을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. IL-17A 및 TNF-알파 과발현 억제는 용량 의존적이었다. 최저 용량, 즉 셀라스트롤 역가 9 ng/ml일 때 IL-17A 과발현은 75% 억제되었고, TNF-알파 과발현은 80% 억제되었으며, INF-감마, IL-22 및 IL-6의 과발현은 거의 완전히 억제되었다.

이는, 추출물 R003034가, 덱사메타손(2 μM)과 거의 동일하거나 심지어 더 월등하게 매우 강력한 항 Th17 활성을 가져서, Th17-의존적 질환, 예컨대 건선, 여드름 및 아토피 피부염의 치료에 탁월한 활성을 발휘함을 보여준다.

실시예 8: 트립테리지움 윌포르디이 식물 세포 배양으로부터 수득한 셀라스트롤의 수율 비교

Erlenmeyer 플라스크들(각각의 부피 = 50 mL) 내에서 10개 세포주(모두 트립테리지움 윌포르디이 세포주)의 배양을 동시에 수행하였는데, 이때 동일한 진탕, 통기 및 온도 조건 하에 1회씩 더 수행하였다. 성장 단계의 막바지에는 각각의 Erlenmeyer 플라스크들 간에 현탁액의 최고 밀도, 즉 계량된 새 바이오매스 양은 동등하였다(새 바이오매스의 평균 중량 = 리터당 340 g). 이 때, 유도인자를 Erlenmeyer 플라스크 10개에 담긴 배양 배지에 이하 표에 명시된 농도로 첨가하였다(이하 표에 있어서 수율은 새 바이오매스 1 kg당 셀라스트롤 mg으로 표시함):

현탁된 셀라스트롤의 검정을, 실시예 5에 따른 HPLC에 의해 수행하였는데, 이때 대조군 생성물로 교정 곡선을 작성하였다.

Erlenmeyer 플라스크 E1, E2, E3에 담긴 현탁액들을 대상으로, E1에 대하여는 그 어떤 유도인자도 포함하지 않는 대조군 용액, E2에 대하여는 키틴 단독(2　g/L), 그리고 E3에 대하여는 MeJa 단독(64 μM)으로 유도를 실시하였다. E3 중 MeJa 농도는, 문헌(Liu et al. 2016)에 기술된 바, 즉 64 μM에 상당하였다.

Erlenmeyer 플라스크 E4 내지 E10에 담긴 현탁액들을 대상으로, 상이한 MeJa 농도 3가지(36 μM, 64 μM 및 92 μM)와, 상이한 키틴 농도 5가지(1.3 g/L; 2 g/L; 2.5 g/L; 3.1 g/L 및 4.2　g/L)로 유도를 실시하였다.

E6, E7 및 E8에 대해 얻어진 셀라스트롤의 수율은, E3에 대해 얻어진 셀라스트롤의 수율에 비하여 각각 204%, 233% 및 274%까지 증가하였으며, MeJa 농도는 이들 4개의 Erlenmeyer 플라스크들 간에 동일하였음에 주목하였다. MeJa 농도가 상이하였던 E5에서는 심지어 훨씬 더 높은 수율이 관찰되었다.

실시예 9: NFkB에 대한 억제 활성

전사 인자 NFκB는 염증 반응의 조절에 수반되는 다수 유전자의 발현을 제어한다. 비활성 상태일 때 NFκB는 IKB 단백질에 의해 세포질로부터 격리되어 있다. 임의의 전염증 자극인자, 예컨대 TNF-알파와 IL-1 베타는, NFκB의 활성화, 즉 이의 핵내 전위를 유도한다. 일단 NFκB가 핵 내에 들어가면, 이는 시토카인, 케모카인, 접착 분자, 성장 인자 및 유도성 효소를 암호화하는 전염증 유전자의 전사를 유도할 것이다.

실시예 8의 Erlenmeyer 플라스크 E1, E2, E3 및 E6에 담겨있던 현탁액들로부터 수득한 추출물의 소염 활성을, Albanesi외 다수에 의해 기술된 방법에 따라 인간 HaCaT 각질세포를 대상으로 시험관 내 평가하였다. 건조 중량으로 계량한 추출물을 완충제 중에 취한 다음, 각 추출물 동일한 최종 농도(ng/mL)만큼을 HaCaT 세포 배양 용액에 도입한 다음, 1시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, TNF-알파(0.3 ng/mL)로 자극함으로써 NFκB 발현을 유도하였다.

양성 대조군으로 사용된 덱사메타손 2μM은 NFκB 발현을 40% 초과하여 억제하였다.

본 발명에 따른 추출물(E6으로부터 수득, 유도인자 쌍: MeJa 및 키틴)(농도 0.19 ng/mL 및 0.58　ng/mL에서 평가)은 NFκB 발현을 각각 20% 및 70% 억제하였다.

Liu외 다수에 의해 제조된 추출물(E3 유래, 단일 유도인자: MeJa)(동일 농도에서 평가)은, NFκB 발현을 평가가 전혀 불다능한 정도로 유도하였다. 이와 유사하게, E2 유래 추출물(단독 유도인자: 키틴) 및 대조군 E1 유래 추출물은 NFκB발현에 그 어떠한 효능도 발휘하지 못하였다.

오로지 본 발명에 따라 유도된 배양액으로부터 유래하는 추출물만이, 농도 의존적 방식으로 NFκB를 강력하게 억제하였다.

실시예 10: 다른 화합물의 프로피오니박테리움 아크네스( Propionibacterium acnes )에 대한 항미생물 활성과 비교되는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 추출물의 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항미생물 활성

접종 현탁액(10⁸ CFU/mL)으로 프로피오니박테리움 아크네스(CIP 53117T)에 대한 활성을 평가하였다. 유지 배지(maintenance medium)는, 혐기 조건 하 36 ± 1℃에서 24시간 동안 항온처리가 된 콜롬비아 아가 + 5% 양 혈액이었다. 시험 배지는 혐기 조건 하 36 ± 1℃에서 24시간 동안 항온처리가 된 Mueller Hinton 발효액 + 10% 소 태아 혈청(FCS) 및 콜롬비아 아가 + 5% 양 혈액으로 이루어졌다. 액체 배지 중 미시적 방법에 의해 최소 억제 농도(MIC) 측정을 수행하였다. 액체 배양 배지 100 μL를 멸균 96-웰 미세평판의 각 웰에 넣었다. 시험될 생성물 100 μL를 어느 한 열의 첫 번째 웰에 넣었다. 그 다음, 1번 웰로부터 10번 웰에 이르기가지에서 2배 희석을 수행하였다. 프로피오니박테리움 아크네스 시험 현탁액을 즉석에서 트립톤 염 중에 제조하였다. 두 번째 미세평판의 각 웰(11번 컬럼 제외)에 100 μL씩을 넣었다. Denley 다점접종기를 사용하여 첫 번째 미세평판 모두에 두 번째 미세평판으로부터 얻은 물질들을 접종하였다. 접종 후 MIC를, 가시적 성장이 없을 때의 최고 희석률로 정의하였다. 11번 컬럼과 12번 컬럼은 각각 음성 성장 대조군 및 양성 성장 대조군으로 사용하였다. 2개의 기준도 동시에 시험하였다. Denley 다점접종기를 사용하여 아가 배지 상 MIC 미세평판을 계대배양시켜 최소 살균 농도(MBC)의 측정을 수행하였다. 항온처리후 MBC를, 가시적 성장이 없을 때의 최고 희석률로 정의하였다. 모든 시험은 2회씩 반복 수행하였다.

시험된 화합물은 하기와 같았다:

- DMSO중 정제된 셀라스트롤(원액 = 150 μg/mL/10% DMSO)

- 본 발명의 방법에 따라 제조된, 펜틸렌글리콜 중 추출물(원액 = 2%/2% 펜틸렌글리콜)

- DMSO 중 틴게닌 A(원액 = 150 μg/mL/10% DMSO)

- DMSO 중 틴게닌 B(원액 = 150 μg/mL/10% DMSO)

- 기준물질은 DMSO 중 아목시실린(원액 = 100%) 및 펜틸렌글리콜(원액 = 2%)

얻어진 결과들을, 4개의 시료와 2개의 부형제에 대한 MIC 값 및 MBC 값을 보여주는 이하 표에 요약하였다. 최고 시험 농도는 원액 농도/2에 해당하였다.

결과적으로, 셀라스트롤은 프로피오니박테리움 아크네스에 대해 꽤 매력적인 항균 활성을 보이는 것으로 보아, 이는 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 최고 수준의 항균 활성을 보이는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 추출물인 것으로 보인다. 틴게닌 B의 항균 활성은 틴게닌 A로 관찰되는 항균 활성보다 더 컸다.

실시예 11: 다른 화합물의 스타필로코커스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus )에 대한 항미생물 활성과 비교되는, 본 발명의 방법에 따라 제조된 추출물의 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항미생물 활성

에스.아우레우스는 아토피 피부염 환자의 병변에 집락을 형성하고, 건선 환자에도 존재하는 병원체인 것으로 공지되어 있다(Tomi et al. 2005).

본 발명의 방법에 따라 수득된 추출물의, 에스.아우레우스에 대한 항균 활성을 평가하였다. 실시예 10에 기술된 바와 같이 실험을 실시하였는데, 다만, 병원체 균주는 에스.아우레우스 CIP 4.83였고, 유지 배지는 트립티카아제 콩 아가였으며, 시험 배지는 MIC/MBC 발효액과 Mueller Hinton 아가였고, 36℃에서 24시간 동안 항온처리가 행하여졌다.

얻어진 결과들을 이하 표에 요약하였다. 셀라스트롤은 항균 활성이 컸으며, 본 발명의 방법에 따라 수득되어, 셀라스트롤 등가물 중에 적정된 추출물의 항 에스.아우레우스 활성은 이보다 훨씬 더 컸다. 뿐만 아니라, 틴게닌 B 분자의 활성은 틴게닌 A 분자의 활성보다 더 컸다.

결과적으로, 이 추출물은 매력적인 항 Th17 약리 활성뿐만 아니라, 놀랍게도 강력한 항 에스.아우레우스 활성도 보였는데, 이 점은 본 추출물을, 아토피 피부염과 건선의 국소 치료에 있어 매우 매력적인 활성 제제로 만들어준다.

실시예 12: 국소 적용을 위한 크림

본 발명에 따라 트립테리지움 윌포르디이 추출물을 제조하였으며, 이때 이의 농도는 이 제제와 양립 가능한 용매(예컨대 올리브 오일, 펜틸렌 글리콜 또는 미리톨 318 등) 중 건조 추출물 중량으로 표시하였다.

본 예시적 제제는 결코 제한적인 것이 아니며, 치료법에 따라 수정될 수 있다.

그러므로 당 업자의 지식을 동원하여 비듬 치료를 위한 샴푸를 제제화할 수 있다.

참고문헌:

Claims (16)

1. 셀라스트롤 (celastrol)인 펜타사이클릭 트리테르펜 농축 미정제 추출물을 제조하기 위한 방법으로서, 하기 단계들, 즉
   (i) 증식 배지 중에서 트립테리지움 윌포르디이 (Tripterygium wilfordii)인 노박덩굴과 식물의 세포를 증식시키는 단계,
   (ii) 단계 (i)에서 수득된 세포 배양액에 유도 칵테일을 첨가하여 유도를 수행하는 단계로서, 상기 유도 칵테일은 메틸 자스몬산염 (methyl jasmonate)인 모노카복실 화합물류의 유도인자 적어도 하나와 키틴 (chitin)인 생물 유도인자 적어도 하나를 포함하는 상기 단계, 및
   (iii) 단계 (ii)에서 수득된 세포 배양액으로부터 셀라스트롤인 펜타사이클릭 트리테르펜 농축 미정제 추출물을 제조하는 단계
   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 유도 칵테일은 식물 세포에 대한 세포 분화 인자 적어도 하나와, 테르펜 합성 경로 전구체 적어도 하나를 추가로 포함하는, 농축 미정제 추출물을 제조하기 위한 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 식물 세포에 대한 세포 분화 인자 적어도 하나는 시토카인, 지베렐린 및 이것들의 조합으로부터 선택되는, 농축 미정제 추출물을 제조하기 위한 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 식물 세포에 대한 세포 분화 인자 적어도 하나는 벤질아미노퓨린(BAP), 6-γ,γ-디메틸알릴아미노퓨린(2iP) 및 이것들의 조합으로부터 선택되는, 농축 미정제 추출물을 제조하기 위한 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 테르펜 합성 전구체는 피루브산나트륨, 피로인산칼륨 및 이것들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 농축 미정제 추출물을 제조하기 위한 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (iii)에서 수득된 농축 미정제 추출물로부터 펜타사이클릭 트리테르펜의 정제된 추출물을 수득하는 단계 (iv)를 추가로 포함하는, 농축 미정제 추출물을 제조하기 위한 방법.
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