ES2831835T3 - Método de producción del Celastrol y de derivados triterpénicos pentacíclicos - Google Patents

Abstract

Procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido en un triterpeno pentacíclico que es el Celastrol que comprende las etapas siguientes: (i) una fase de proliferación de células de una planta de la familia de las Celastraceae que es Tripterygium wilfordii en un medio de proliferación, (ii) una fase de elicitación mediante la adición de un cóctel de elicitación al cultivo celular obtenido en la etapa (i), comprendiendo dicho cóctel de elicitación por lo menos un elicitor de tipo compuesto monocarboxílico que es el jasmonato de metilo y por lo menos un elicitor biótico que es la quitina y (iii) la preparación de un extracto bruto enriquecido en triterpenos pentacíclicos a partir del cultivo celular obtenido en la etapa (ii).

Description

DESCRIPCIÓN

Método de producción del Celastrol y de derivados triterpénicos pentacíclicos

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido con triterpenos pentacíclicos, en particular con Celastrol, a partir de un cultivo de células vegetales (PCC) en suspensión de una planta de la familia de las Celastraceae.

Tripterygium wilfordii es una planta medicinal que pertenece a la familia de las Celastraceae, utilizada desde hace siglos en el sureste asiático (incluida China) para tratar los trastornos inflamatorios, las enfermedades autoinmunes, y más recientemente, el cáncer. Los terpenos se encuentran entre los componentes más activos de la planta y están localizados principalmente en las raíces de la planta. Entre ellos, un triterpeno pentacíclico de tipo norfriedelano, el Celastrol, es evaluado por su eficacia en el tratamiento de la obesidad, de la artritis reumatoide, de la enfermedad de Crohn y del cáncer de próstata. Por lo tanto, las necesidades de aprovisionamiento de Celastrol aumentan constantemente.

La dermatosis inflamatoria, en particular la psoriasis o la dermatitis atópica, tiene unos orígenes o unas causas multifactoriales. Las razones de estas enfermedades denominadas autoinmunes aún no están completamente dilucidadas, pero estarían relacionadas con una desregulación del sistema inmunitario, en particular a nivel de las respuestas celulares. Las respuestas celulares se pueden clasificar en 3 categorías: Th1, Th2 y, recientemente, Th17. Aunque la psoriasis y la dermatitis atópica presentan diferencias a nivel de los signos clínicos, presentarían similitudes, en particular a nivel de la expresión de IL17 e IL22 características de la respuesta Th17 (Miyagaki et al. 2015). IL17 e IL22 serían por lo tanto unas dianas interesantes para tratar estas enfermedades. De esta forma, se han desarrollado los anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL17, IL17R, IL22, IL23, TNF alfa para bloquear la vía Th17 (Lowes et al. 2014). Estas moléculas son eficaces para el tratamiento de la psoriasis, pero presentan numerosos efectos secundarios e inducen un coste de tratamiento exorbitante.

Por otro lado, es conocido asimismo que la vía Th17 está muy activada en las lesiones de pacientes con acné (Kelhala et al. 2014).

El Celastrol se obtiene habitualmente mediante unos procedimientos de extracción vegetal a partir de las plantas de la familia de Celastraceae que implican la utilización de disolventes. Estos modos de biosíntesis implican unos ciclos de ocho a diez años para que un nuevo brote de planta alcance la madurez necesaria para ser sacrificado. Además, la utilización de productos fitosanitarios hace que el procedimiento sea costoso: se pueden acumular unos contaminantes externos (metales pesados) y el extracto bruto generado contiene múltiples metabolitos que necesitan varias etapas de purificación de este extracto vegetal con el fin de aislar la fracción triterpénica. Por otro lado, estos procedimientos tienen unos rendimientos bajos en Celastrol.

La síntesis química total del Celastrol es posible (Camelio et al. 2015) pero necesita una veintena de etapas, lo cual aumenta considerablemente el coste final de obtención del producto.

Una solución alternativa ha sido obtener Celastrol a partir de cultivos celulares en suspensión de células madre generadas a partir de las raíces o de las hojas de la planta. Recientemente, el equipo de Coppede (Coppede et al.

2014) pudo obtener a partir de un cultivo de células de M. ilicifolia una cantidad de Celastrol superior a la obtenida por extracción clásica a partir de la planta (0,304 mg de Celastrol por g de materias secas, concentración máxima obtenida al cabo de 8 días de cultivo, es decir, 8,85 veces mejor que por el método de extracción clásico). El equipo de Liu et al. (Liu et al. 2016) demostró por otro lado que añadiendo MeJa (jasmonato de metilo) (del orden de 50 |jM) a un cultivo de células vegetales de T. wilfordii, la cantidad de Celastrol aumenta en 4,82 veces con respecto a la de un cultivo sin MeJa: la concentración en mg de Celastrol por g de materia seca es de 0,752 mg/g (cultivo con MeJa) versus 0,154 mg/g (cultivo sin MeJa).

Estos procedimientos permiten obtener unos rendimientos en Celastrol mejorados. Sin embargo, todavía existe una necesidad real de procedimientos viables económicamente y que permitan obtener rápidamente Celastrol en gran cantidad.

La presente invención proporciona un procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido en Celastrol a partir de células vegetales de una planta de la familia de las Celastraceae, Tripterygium wilfordii.

En efecto, los inventores desarrollaron un procedimiento que permite aumentar de manera sorprendente el rendimiento en Celastrol en el cultivo de células vegetales a partir de una línea de T. wilfordii utilizando y comparando diversas combinaciones de elicitores. En efecto, los inventores observaron en particular que la división celular y la producción de Celastrol no son concomitantes. Sorprendentemente, incluso son incompatibles. Para resolver este problema, los inventores desarrollaron un procedimiento que comprende una etapa de proliferación celular y una etapa de elicitación con un cóctel de agentes elicitores que detiene la división celular. Los inventores demostraron además que la utilización de pares de elicitores, en particular el jasmonato de metilo (MeJa) y la quitina, permite obtener una concentración de 16,6 mg/g de Celastrol por peso seco al final del cultivo. El rendimiento en Celastrol de este cultivo obtenido es entonces 22 veces más elevado con respecto al obtenido por Liu et al. (citado arriba). Por otro lado, el rendimiento mediante el procedimiento según la invención es 57 veces más elevado que el obtenido por Coppede et al. (citado arriba) sin elicitación. El procedimiento según la invención permite además enriquecer en derivados del Celastrol, en particular de tipo triterpeno pentacíclico, tales como la Tingenina A (también denominada Tingenona o Maitenina), la Tingenina B (también denominada 22beta-hidroxitingenona), Pristimerina y Tripterigona.

Por otro lado, los inventores han demostrado de manera sorprendente que un extracto bruto enriquecido en triterpenos pentacíclicos obtenido mediante este procedimiento inhibe con un efecto de dosis las interleucinas específicas del Th17 inducidas en unas células T CD4+ humanas.

La presente invención se refiere por lo tanto a un procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido en triterpenos pentacíclicos que comprende las etapas siguientes:

(i) una fase de proliferación de células de una planta de la familia de las Celastraceae que es Tripterygium wilfordii en un medio de proliferación,

(ii) una fase de elicitación mediante la adición de un cóctel de elicitación al cultivo celular obtenido en la etapa (i), comprendiendo dicho cóctel de elicitación por lo menos un elicitor de tipo compuesto monocarboxílico que es el jasmonato de metilo y por lo menos un elicitor biótico, que es la quitina y

(iii) la preparación de un extracto bruto enriquecido en triterpenos pentacíclicos a partir del cultivo celular obtenido en la etapa (ii).

Por otro lado, la presente invención se refiere a un extracto susceptible de ser obtenido mediante el procedimiento según la invención, así como a sus utilizaciones.

Por "triterpenos pentacíclicos" según la invención, se entiende los triterpenos pentacíclicos producidos naturalmente por las células de una planta de la familia de las Celastraceae y en particular el Celastrol (de fórmula I), la Tingenina A (también denominada Tingenona o Maitenina) (de fórmula II), la Tingenina B (también denominada 22beta-hidroxi-tingenona) (de fórmula III), la Pristimerina (de fórmula IV) y la Tripterigona (de fórmula V), en particular el Celastrol, la Tingenina A y la Tingenina B, en particular el Celastrol.

Por "extracto bruto enriquecido en triterpenos pentacíclicos" según la invención, se entiende un extracto bruto enriquecido que comprende una cantidad de triterpenos pentacíclicos por lo menos 2 veces, en particular por lo menos 5 veces, en particular por lo menos 10 veces, en particular entre 10 y 100 veces superior a la obtenida mediante un procedimiento en ausencia de una fase de elicitación según la invención.

Por "extracto bruto enriquecido en Celastrol" según la invención, se entiende un extracto bruto enriquecido que comprende una cantidad de Celastrol por lo menos 2 veces, en particular por lo menos 5 veces, en particular por lo menos 10 veces, en particular entre 10 y 60 veces, en particular entre 10 y 20 veces superior a la obtenida mediante un procedimiento en ausencia de una fase de elicitación según la invención.

Por "planta de la familia de las Celastraceae", se entiende el conjunto de las plantas que pertenecen a esta familia, y en particular las plantas de los géneros Trípterygium, Bhesa, Kokkona, Catha, Euonymus, Orthosphenia, Dicarpellum, Celastrus, Maytenus, Peritassa y Rzedowskia, en particular Tripterygium y Celastrus. Entre el género Tripterygium, se podrán citar en particular las especies Tripterygium Wilfordii, Tripterygium regeli, Tripterygium hypoglaucum o Tripterygium articulata, en particular Tripterygium wilfordii.

Por "células de una planta de la familia de las Celastraceae" según la invención, se entiende las células de cualquier parte de la planta: semillas, raíces, partes aéreas, y en particular unas partes aéreas.

Por "partes aéreas" según la invención, se entiende las partes de la planta situadas por encima el suelo, por ejemplo, las hojas, los tallos, los peciolos y/o las inflorescencias, en particular las hojas.

Por "fase de proliferación de células de una planta de la familia de las Celastraceae" se entiende según la invención una fase en la que las células de una planta de la familia de las Celastraceae están en suspensión en un medio de proliferación y en unas condiciones adaptadas a su proliferación. Estas células se podrán obtener en particular a partir de callos antes de su puesta en suspensión. Si es necesario, las suspensiones celulares se podrán volver a ser inoculadas regularmente con el fin de mantenerlas en unas condiciones de proliferación.

Por "callo" según la invención se entiende un grupo de células desdiferenciadas, denominadas asimismo células madre o células meristemáticas.

La inducción de callos se podrá obtener mediante cualquier método conocido por el experto en la materia. Los callos según la invención se podrán obtener en particular de la manera descrita a continuación.

La inducción de callos a partir de un explante de tejido de parte de planta, en particular una parte aérea, de la familia de las Celastraceae, que es Tripterygium wilfordii, es muy conocida por el experto en la materia.

La inducción de callos se podrá realizar en particular mediante:

- la obtención de un explante de tejido de la planta, por ejemplo, un pedazo de hoja de tamaño de aproximadamente 1 cm2,

- la puesta en cultivo del explante en un medio de proliferación según la invención gelosado (por ejemplo, mediante la adición de 4 a 12 g/l de agar, por ejemplo, aproximadamente 8 g/l de agar, al medio de proliferación según la invención),

- la incubación, en particular en la oscuridad, a una temperatura de aproximadamente 25-30°C, por ejemplo, a aproximadamente 27°C a 28°C.

Etapa (i): fase de proliferación de células

El experto en la materia que conoce los cultivos de células de una planta de la familia de las Celastraceae podrá determinar fácilmente la composición del medio de proliferación necesario para su proliferación. Preferentemente, este medio de proliferación permitirá la proliferación de las células en formas desdiferenciadas, es decir en formas totipotentes. El mantenimiento en forma desdiferenciada se podrá obtener en particular mediante la utilización de proporciones particulares citoquininas/auxinas en el medio de proliferación.

El "medio de proliferación" según la invención podrá comprender en particular:

- por lo menos un macroelemento, seleccionado en particular de entre NH⁴NO³, KNO³, CaCh.2H2O, MgSO4.7H2O, KH²PO⁴ y una mezcla de éstos, por ejemplo, a una concentración en macroelementos total comprendida entre 1000 y 9000 mg/l, por ejemplo, entre 3000 y 8000 mg/l de medio de proliferación: en la fase de proliferación, la concentración en macroelementos total del medio de proliferación estará comprendida en particular entre 3000 y 5500 mg/l de medio de proliferación;

- por lo menos un microelemento, seleccionado en particular de entre KI, H³BO³, MnSO4.4H2O, ZnSO⁴.H²O, Na²MoO⁴.² H²O, CuSO4.5H2O, CoCh.⁶ H²O, FeSO4.7H2O, Na²EDTA.² H²O y una mezcla de éstos, por ejemplo, a una concentración en microelementos total comprendida entre 10 y 200 mg/l, en particular entre 50 y 150 mg/l de medio de proliferación;

- por lo menos una vitamina, seleccionada en particular de entre el mio-inositol, el ácido nicotínico, la piridoxina-HCl, la tiamina-HCl y una mezcla de éstos, por ejemplo, a una concentración en vitaminas total que puede ir de 0,01 a 3 g/l, en particular de 0,05 a 1 g/l de medio de proliferación;

- por lo menos un aminoácido, en particular la glicina, por ejemplo, a una concentración en aminoácidos total que puede ir de 0,15 a 5 mg/l, en particular entre 1 y 4 mg/l de medio de proliferación: en la fase de proliferación, la concentración en aminoácidos del medio de proliferación estará comprendida en particular entre 1 y 2,5 mg/l de medio de proliferación;

- por lo menos una fuente de carbono, en particular sacarosa, por ejemplo, a una concentración total en fuente de carbono de 10 a 70 g/l de medio de proliferación, por ejemplo, a aproximadamente 30 g/l;

- por lo menos una hormona vegetal (denominada también hormona de crecimiento vegetal o factor de crecimiento vegetal o regulador del crecimiento vegetal), seleccionada en particular de entre una o varias citoquininas, en particular la cinetina y/o la 6-furfurilaminopurina, una o varias auxinas, en particular el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y/o el ácido naftaleno acético (NAA), y una mezcla de éstas. En la fase de proliferación, el medio de proliferación comprenderá en particular por lo menos una citoquinina y por lo menos una auxina.

Las hormonas de crecimiento vegetal se agregarán en particular al medio de proliferación en una concentración y una proporción que permite la proliferación de las células en formas desdiferenciadas. En particular, serán seleccionadas de entre la cinetina, la 6-furfurilaminopurina, el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), el ácido naftaleno acético (NAA) y una mezcla de éstos; seleccionadas en particular de entre la cinetina, el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), el ácido naftalenacético (NAA) y una mezcla de éstos. En particular, se podrá tratar de una mezcla de cinetina, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y ácido naftaleno acético.

La concentración en auxinas según la invención estará comprendida en particular entre 0,001 y 10 mg/l de medio de proliferación, por ejemplo, entre 0,1 y 3 mg/l de medio de proliferación.

La concentración en citoquininas según la invención estará comprendida en particular entre 0,01 y 0,5 mg/l de medio de proliferación, en particular entre 0,05 y 0,15 mg/l.

En un modo de realización, la proporción hormonal auxinas/citoquininas estará comprendida entre 0,2 a 2,5/0,01 a 0,5, en particular entre 1 a 2/0,05 a 0,2 y en particular será aproximadamente 1,5/0,1.

En particular, el medio de proliferación según la invención podrá comprender 1,5 mg/l de auxina, en particular de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y de ácido naftaleno acético (NAA), y 0,1 mg/l de citoquinina, en particular de cinetina.

El medio de proliferación será estéril y preferentemente a un pH cercano a la neutralidad.

Un ejemplo de medio de proliferación adaptado a la proliferación de las células de una planta de la familia de las Celastraceae según la invención se describe en particular por Murashige & Skoog (1962) o en los ejemplos de la presente solicitud.

Este medio de proliferación puede tener, por ejemplo, la composición siguiente (las concentraciones están expresadas con respecto al volumen de medio de proliferación sin células): Macroelementos: NH⁴NO³ a 1650 mg/l, KNO³ a 1900 mg/l, CaCh.2H2O a 440 mg/l, MgSO4.7H2O a 370 mg/l, KH²PO⁴ a 170 mg/l; Microelementos: KI a 0,83 mg/l, H³BO³ a 6,2 mg/l, MnSO4.4H2O a 22,3 mg/l, ZnSO⁴.H²O a 6,6 mg/l, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/l, CuSO4.5H2O a 0,025 mg/l, CoCh.⁶ H²O a 0,025 mg/l, FeSO4.7H2O a 27,8 mg/l, Na2EDTA.2H2O a 37,3 mg/l; Vitaminas: mio-inositol a 100 mg/l, ácido nicotínico a 0,5 mg/l, piridoxina-HCl a 0,5 mg/l, tiamina-HCl a 0,5 mg/l; Aminoácidos: glicina a 2 mg/l; Fuente de carbono: sacarosa a 30 g/l; y hormonas vegetales: ácido naftaleno acético a 1 mg/l, ácido 2,4-diclorofenoxiacético a 0,5 mg/l, cinetina a 0,1 mg/l, todo ajustado a pH 6 antes de la esterilización (por ejemplo, en autoclave durante 20 min a 121°C o por filtración sobre filtro de 0,2 |jm).

Alternativamente, el medio de proliferación puede tener la composición siguiente: (las concentraciones están expresadas con respecto al volumen de medio de proliferación sin células): Macroelementos: NH⁴NO³ a 1650 mg/l, KNO³ a 2500 mg/l, CaCh.2H2O a 440 mg/l, MgSO4.7H2O a 370 mg/l, KH²PO⁴ a 130 mg/l; Microelementos: KI a 0,41 mg/l, H³BO³ a 6,2 mg/l, MnSO4.4H2O a 22,3 mg/l, ZnSO⁴.H²O a 7,5 mg/l, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/l, CuSO4.5H2O a 0,025 mg/l, CoCh.⁶ H²O a 0,025 mg/l, FeSO4.7H2O a 19,85 mg/l, Na2EDTA.2H2O a 26,64 mg/l; Vitaminas: mio-inositol a 50 mg/l, ácido nicotínico a 0,25 mg/l, piridoxina-HCl a 0,25 mg/l, tiamina-HCl a 0,25 mg/l; Fuente de carbono: sacarosa a 30 g/l; y hormonas vegetales: cinetina a 0,083 mg/l, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 0,575 mg/l, ácido naftaleno acético (NAA) a 0,350 mg/l.

Alternativamente, el medio de proliferación según la invención puede tener la composición siguiente (las concentraciones están expresadas con respecto al volumen de medio de proliferación sin células): NH⁴NO³ a 20 mM, KNO³ a 19 mM, CaCh.2H2O a 3 mM, MgSO4.7H2O a 1,50 mM, KH²PO⁴ a 1,2 mM, KI a 0,005 mM, H³BO³ a 0,1 mM, MnSO4.4H2O a 0,1 mM, ZnSO⁴.H²O a 0,04 mM, Na2MoO2.2H2O a 0,001 mM CuSO4.5H2O a 0,0001 mM, CoCl².⁶ H²O a 0,0001 mM, FeSO4.7H2O a 0,1 mM, Na2EDTA.2H2O a 0,1 mM, mioinositol 0,5 mM, ácido nicotínico a 0,004 mM, piridoxina-HCl a 0,002 mM, tiamina-HCl a 0,0015 mM, glicina a 0,03 mM, sacarosa a 87,6 mM, ácido naftaleno acético a 0,005 mM, ácido 2,4-diclorofenoxiacético a 0,002 mM y cinetina a 0,0005 mM.

La inoculación del medio de proliferación se podrá realizar a partir de la puesta en suspensión de células de callos a una concentración comprendida entre 20 y 300 g en 1 l de medio de proliferación y preferentemente entre 100 y 200 g en 1 l de medio de proliferación, por ejemplo, aproximadamente 150 g en 1 l de medio de proliferación.

La fase de proliferación tendrá lugar en unas condiciones de multiplicación de la biomasa. Por "condiciones de multiplicación de la biomasa" según la invención, se entiende en particular las condiciones de temperatura, de duración, de agitación y de luminosidad necesarias para la proliferación de las células en suspensión. El experto en la materia que conoce los cultivos de células de una planta de la familia de las Celastraceae podrá determinar fácilmente las condiciones de multiplicación de la biomasa. En un modo de realización según la invención, la etapa de proliferación de la biomasa se realizará en la oscuridad, a una temperatura comprendida entre 20 y 35°C, en particular entre 27 y 28°C, en particular a aproximadamente 27 o 28°C, en particular bajo una agitación comprendida entre 100 y 200 rpm, en particular a aproximadamente 125 rpm (orbital de 22,5 mm) y durante un tiempo comprendido entre 10 y 30 días, en particular 15 días de cultivo.

Durante esta etapa, las células se pueden "trasplantar" o propagarse, por ejemplo, cada 7 a 15 días. El trasplante de las células es bien conocido por el experto en la materia: podrá consistir en particular en diluir una parte del cultivo celular en medio fresco concentrado. Por ejemplo, 1/5 del cultivo se resuspende en un volumen de medio fresco que corresponde al volumen del cultivo inicial. Permite mantener la línea celular en medio líquido en un estado de proliferación.

Etapa (ii) - fase de elicitación

Tras la fase de proliferación, las células obtenidas en la fase (i) son elicitadas mediante la adición de un cóctel de elicitación. El medio de proliferación al que se ha agregado el cóctel de elicitación se denominará "medio de elicitación" de según la presente invención.

La fase de elicitación es la fase en la que las células son mantenidas en un estado fisiológico que favorece la biosíntesis de metabolitos secundarios tales como los triterpenos pentacíclicos.

La producción de triterpenos pentacíclicos, en particular de Celastrol, tiene lugar, durante la fase de elicitación, en el citosol de la célula y puede difundirse parcialmente en el medio de elicitación. La fase de elicitación en el sentido de la presente invención corresponde por lo tanto a la fase de producción (biosíntesis) del Celastrol y de sus derivados (triterpenos pentacíclicos).

La elicitación se realizará preferentemente después de una fase de proliferación de 7 a 21 días, en particular de 12 a 20 días, en particular 15, 16 o 17 días (en particular sin trasplante). Alternativamente, la adición del cóctel de elicitación se puede realizar cuando la concentración en células obtenida en la fase de proliferación es doble, en particular superior al doble, con respecto a la concentración inicial en células en el medio de proliferación. La adición del cóctel de elicitación se podrá realizar en particular cuando la concentración en células es superior a 200 g/l, por ejemplo, entre 200 y 400 g/l, en particular aproximadamente 300 g/l (en cantidad de células por litro de medio de proliferación). En un modo de realización, la adición del cóctel de elicitación se realizará en un cultivo cuya concentración en células ha pasado de 150 a 200 g/l al inicio de la fase de proliferación a una concentración comprendida entre 300 y 400 g/l al final de la fase de proliferación.

Después de la fase de proliferación, las células vegetales han consumido la mayor parte, incluso todos los elementos contenidos en el medio de proliferación, y en particular las fuentes de carbono tales como la sacarosa. Por lo tanto, puede ser necesario restablecer la composición del medio antes o al mismo tiempo que la adición del cóctel de elicitación.

Para restablecer la composición del medio, se puede concentrar en particular el cultivo celular obtenido después de la etapa de proliferación, por ejemplo, por decantación o filtración, y después añadir medio de proliferación fresco a las células así obtenidas. En este caso, las células serán resuspendidas en el medio de proliferación fresco de manera que se obtenga una concentración comprendida entre 200 g/l y 400 g/l, por ejemplo, entre 250 y 350 g/l, en particular de aproximadamente 300 g/l (en cantidad de células por litro de medio de proliferación).

Alternativamente, se puede añadir al cultivo celular una mezcla concentrada que permite restablecer las concentraciones de los elementos del medio de proliferación. La mezcla concentrada será añadida en particular justo antes, justo después o al mismo tiempo que el cóctel de elicitación. Por ejemplo, se puede reemplazar 1/5 del cultivo celular por un volumen equivalente del medio de proliferación concentrado 5 veces.

Se considera que la concentración en elementos del medio de proliferación es cercana o equivalente a cero tras 14, 15 o 16 días de la fase de proliferación. En particular, se considera que la concentración en elementos minerales (más particularmente los macroelementos y los microelementos) y carbonados (más particularmente las fuentes de carbono) es cercana o equivalente a cero tras 14, 15 o 16 días de la fase de proliferación.

En un modo de realización, el medio de proliferación según la invención al comienzo de la fase de elicitación comprenderá, entre otros:

- por lo menos un macroelemento, seleccionado en particular de entre NH⁴NO³, KNO³, CaCh.2H2O, MgSO4.7H2O, KH²PO⁴ y una mezcla de éstos, por ejemplo, a una concentración en macroelementos total comprendida entre 5000 y 8000 mg/l, preferentemente superior a 6000 mg/l de medio de proliferación, ventajosamente entre 6000 mg/l y 8000 mg/l;

- por lo menos un microelemento, seleccionado en particular de entre KI, H³BO³, MnSO4.4H2O, ZnSO⁴.H²O, Na²MoO⁴.² H²O, CuSO4.5H2O, CoCh.⁶ H²O, FeSO4.7H2O, Na²EDTA.² H²O y una mezcla de éstos, por ejemplo, a una concentración en microelementos total comprendida entre 10 y 200 mg/l, en particular entre 50 y 150 mg/l de medio de proliferación;

- por lo menos una vitamina, seleccionada en particular de entre el mio-inositol, el ácido nicotínico, la piridoxina-HCl, la tiamina-HCl y una mezcla de éstos, por ejemplo, a una concentración en vitaminas total que puede ir de 0,01 a 3 g/l, en particular de 0,05 a 1 g/l de medio de proliferación;

- por lo menos un aminoácido, en particular la glicina, por ejemplo, a una concentración en el medio de proliferación comprendida entre 3 y 4 mg/l de medio de proliferación;

- por lo menos una fuente de carbono, en particular sacarosa, por ejemplo, a una concentración total en fuente de carbono de 10 a 70 g/l de medio de proliferación, por ejemplo, a aproximadamente 30 g/l;

En un modo de realización, el medio de proliferación al comienzo de la fase de elicitación no comprenderá, o comprenderá una cantidad despreciable, en particular menos de 0,001 g/ml, de citoquinina y de auxina.

El medio de proliferación en la fase de elicitación será ventajosamente estéril y preferentemente a un pH cercano al neutro.

El medio de proliferación en la fase de elicitación podrá tener en particular la composición siguiente: Macroelementos: NH⁴NO³ a 2,8 g/l, KNO³ a 3 g/l, CaCh.2H2O a 0,45 g/l, MgSO4.7H2O a 74 mg/l, KH²PO⁴ a 34 mg/l; Microelementos: KI a 0,16 mg/l, H³BO³ a 6,2 mg/l, MnSO4.4H2O a 18,5 mg/l, ZnSO⁴.H²O a 6,6 mg/l, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/l, CuSO4.5H2O a 0,025 mg/l, CoCh.⁶ H²O a 0,025 mg/l, FeSO4.7H2O a 28 mg/l, Na2EDTA.2H2O a 37 mg/l; Vitaminas: mio-inositol a 250 mg/l, ácido nicotínico a 1,7 mg/l, piridoxina-HCl a 1 mg/l, tiamina-HCl a 1 mg/l; Aminoácido: glicina a 4 mg/l; Fuente de carbono: sacarosa a 30 g/l.

Por "cóctel de elicitación" según la invención, se entiende un cóctel que permite detener la división celular. Este cóctel de elicitación comprende por lo menos un elicitor de tipo compuesto monocarboxílico y por lo menos un elicitor biótico. El cóctel de elicitación es introducido, por ejemplo, con la ayuda de soluciones madre concentradas en el medio de cultivo.

Por "elicitor de tipo compuesto monocarboxílico" según la invención, se entiende más particularmente el jasmonato de metilo (MeJa), y una mezcla de éste con el ácido salicílico y/o el ácido 5-clorosalicílico. El elicitor de tipo compuesto monocarboxílico será añadido en particular de manera que se obtenga una concentración final comprendida entre 0,005 y 0,1 g/l, en particular 0,01 y 0,05 g/l de medio de elicitación, en particular 0,002 y 0,004 g/l de medio de elicitación.

Por "elicitor biótico" según la invención se entiende más particularmente la quitina. La quitina es un polímero lineal de motivo repetitivo: beta-1,4-W-acetil-D-glucosamina. El elicitor biótico será añadido en particular de manera que se obtenga una concentración final comprendida entre 0,05 y 50 g/l de medio de elicitación, por ejemplo, de 0,1 a 10 g/l, por ejemplo, de 0,5 a 7 g/l, en particular de 1 a 5 g/l de medio de elicitación.

En un modo de realización, el cóctel de elicitación comprende jasmonato de metilo, en particular a una concentración final en el medio de elicitación entre 0,002 y 0,005 g/l, y quitina, en particular a una concentración final entre 1 y 4 g/l de medio de elicitación.

En un modo de realización, el cóctel de elicitación según la invención comprenderá además por lo menos un factor de diferenciación celular de las células vegetales y/o por lo menos un precursor de la vía de síntesis de los terpenos.

El "factor de diferenciación celular de las células vegetales" según la invención se podrá seleccionar en particular de entre el grupo que comprende, preferentemente constituido por una citoquinina, en particular la bencilaminopurina (BAP), el ácido abscísico, la cinetina, el tiaziazurón, la 6-Y,Y-dimetilalilaminopurina (2iP o isopenteniladenina) o la zeatina, una giberelina y una mezcla de éstas, en particular la BAP y/o la 2iP, en particular la 2iP.

El "precursor de síntesis de los terpenos" según la invención se podrá seleccionar en particular de entre el grupo que comprende, preferentemente que consiste en el piruvato de sodio; el pirofosfato de potasio; el ácido mevalónico; el geraniol; el farnesol; el isopentenilo, el dimetilalilo, incluidas sus formas pirofosfatadas; el acetato de sodio; el ácido pirúvico y sus mezclas, en particular el geraniol, el farnesol, el piruvato de sodio, el pirofosfato de potasio y sus mezclas, tal como el piruvato de sodio y/o el pirofosfato de potasio.

La BAP se podrá utilizar en particular a una concentración final en el medio de elicitación comprendido entre 0,01 y 5 mg/l, por ejemplo, entre 0,5 y 5 mg/l de medio de elicitación.

El ácido 5-clorosalicílico (5-cloro-SA) se podrá utilizar en particular a una concentración final en el medio de elicitación comprendida entre 0,1 y 15 mg/l.

El ácido salicílico se podrá utilizar en particular a una concentración final en el medio de elicitación comprendida entre 0,1 y 100 mg/l, por ejemplo, entre 20 y 60 mg/l, por ejemplo, aproximadamente 45 mg/l.

El farnesol se podrá utilizar en particular a una concentración final en el medio de elicitación de 1 a 100 mg/l, por ejemplo, de 15 a 30 mg/l, por ejemplo, a aproximadamente 30 mg/l.

El geraniol se podrá utilizar en particular a una concentración final en el medio de elicitación de 1 a 100 mg/l, por ejemplo, de 20 a 30 mg/l.

El piruvato de sodio se podrá utilizar en particular a una concentración final en el medio de elicitación de 100 a 5000 mg/l, por ejemplo, de 500 a 2000 mg/l.

El pirofosfato de potasio se podrá utilizar en particular a una concentración final en el medio de elicitación de 1 a 2000 mg/l, por ejemplo, de 100 a 1000 mg/l de medio de elicitación.

La 2iP se podrá utilizar en particular a una concentración final en el medio de elicitación de 0,005 a 10 mg/l, por ejemplo, de 0,01 mg/l a 3 mg/l, por ejemplo, de 0,1 a 2 mg/l.

En un modo de realización de según la invención, el cóctel de elicitación comprende jasmonato de metilo, quitina, piruvato de sodio, pirofosfato de potasio o una mezcla de éstos.

En un modo de realización según la invención, el cóctel de elicitación comprende jasmonato de metilo, quitina, piruvato de sodio, pirofosfato de potasio y eventualmente BAP y/o 2iP.

En un modo de realización según la invención, el cóctel de elicitación comprende o consiste en (las concentraciones dadas entre paréntesis corresponden a la concentración en el medio de elicitación, pudiendo el cóctel inicial estar más o menos concentrado en función de la dilución prevista) piruvato de sodio (de 500 a 2000 mg/l), pirofosfato de potasio (de 100 a 1000 mg/l), 2iP (de 0,1 a 2 mg/l), jasmonato de metilo (de 0,002 a 0,005 g/l) y quitina (de 1 a 4 g/l).

En otro modo de realización, el cóctel de elicitación comprende o consiste en (las concentraciones dadas entre paréntesis corresponden a la concentración en el medio de elicitación, pudiendo el cóctel inicial estar más o menos concentrado en función de la dilución prevista) bencil-aminopurina (BAP) (de 0,5 a 5 mg/l, en particular de 0,5 a 3 mg/l); ácido 5-clorosalicílico (5-cloro-SA) (de 2 a 6 mg/l, en particular de 3 a 5 mg/l, por ejemplo, a aproximadamente 3 o aproximadamente 5 mg/l), ácido acetilsalicílico (AAS) y/o ácido salicílico (SA) (de 20 a 60 mg/l, en particular de 30 a 50 mg/l, en particular de 33 a 45 mg/l); jasmonato de metilo (MeJa) (de 0,002 a 0,005 g/l, en particular de 10 a 40 mg/l); quitina (de 1 a 4 g/l); y farnesol (F-OH) (de 19 a 40 mg/l) y/o geraniol (de 20 a 30 mg/l).

En otro modo de realización, el cóctel de elicitación comprende o consiste en (las concentraciones dadas entre paréntesis corresponden a la concentración en el medio de elicitación, pudiendo el cóctel inicial estar más o menos concentrado en función de la dilución prevista) piruvato de sodio (de 500 a 2000 mg/l), pirofosfato de potasio (de 100 a 1000 mg/l), 2iP (de 0,1 a 1 mg/l), jasmonato de metilo (MeJa) (de 0,002 a 0,005 g/l, en particular de 10 a 40 mg/l) y quitina (de 1 a 4 g/l).

En otro modo de realización, el cóctel de elicitación comprende o consiste en (las concentraciones dadas entre paréntesis corresponden a la concentración en el medio de elicitación, pudiendo el cóctel inicial estar más o menos concentrado en función de la dilución prevista) piruvato de sodio (aproximadamente 1,5 g/l), pirofosfato de potasio (aproximadamente 0,4 g/l), 2iP (aproximadamente 0,4 mg/l), jasmonato de metilo (MeJa) (aproximadamente 0,03 mg/l), quitina (aproximadamente 2 g/l).

Durante la fase de elicitación, tras la adición del cóctel de elicitación, el cultivo es mantenido bajo agitación, en particular entre 50 y 200 rpm, en particular a aproximadamente 125 rpm, durante un período comprendido entre 3 y 30 días, en particular entre 10 y 25 días, en particular de 12 a 15 días, en particular a una temperatura comprendida entre 20 y 35°C, en particular a aproximadamente 27°C y ventajosamente con una tasa de oxígeno disuelto en el medio de cultivo de 2 a 40%, preferentemente a aproximadamente 16%. Se podrá proporcionar si es necesario, una aportación de aire estéril suficientemente enriquecido en oxígeno, en particular en el volumen muerto del biorreactor o por difusión en el medio. Preferentemente, la fase de elicitación (iii) se lleva a cabo en la oscuridad. En la fase de elicitación, el cultivo celular preferentemente no está trasplantado.

Etapa (i¡¡) - fase de preparación del extracto bruto enriquecido en triterpenos pentacíclicos

Después de la fase de elicitación, el procedimiento según la invención comprende una etapa de preparación de un extracto bruto enriquecido en triterpenos pentacíclicos, en particular el Celastrol.

El extracto bruto enriquecido se podrá obtener en particular por separación de la biomasa y del sobrenadante de cultivo. La separación se podrá realizar en particular por filtración directa (0-50 pm), por centrifugación o por decantación de las células.

En un modo de realización, el extracto bruto enriquecido según la invención podrá consistir en el sobrenadante de cultivo así recuperado.

El extracto bruto enriquecido según la invención se podrá obtener asimismo después de la lisis de la biomasa. Por ejemplo, las células contenidas en la biomasa recuperada podrán ser lisadas mediante un método físico (sonicación o trituración) o químico (lisis ácida), y después este lisado será sometido a una extracción por disolvente. La fase orgánica, que comprende en particular los triterpenos procedentes del citosol, se recupera a continuación en particular por decantación o centrifugación. El disolvente será en particular un disolvente de tipo éster, y más particularmente un acetato de alquilo, siendo el alquilo más particularmente lineal o ramificado con 1 a 6 átomos de carbono, en particular el acetato de etilo o el acetato de isopropilo. El volumen de disolvente utilizado será en particular de 2 volúmenes por peso de biomasa.

Preferentemente, el extracto bruto enriquecido según la invención corresponderá a la fase orgánica así recuperada.

Alternativamente, el extracto bruto enriquecido según la invención se podrá obtener tras la evaporación del disolvente y su sustitución en particular por un soporte adaptado al campo de utilización del extracto (cosmética, farmacéutica) y en particular los aceites vegetales.

El extracto bruto enriquecido según la invención no está purificado. El extracto enriquecido bruto se podrá purificar eventualmente en una etapa posterior.

Cuando el extracto bruto enriquecido está purificado, para dar un extracto purificado, el procedimiento según la invención comprende además una etapa (iv) de obtención un extracto purificado de uno o varios triterpenos pentacíclicos a partir del extracto enriquecido bruto obtenido en la etapa (iii).

El extracto purificado según la invención comprenderá entonces más del 90%, en particular más del 95%, en particular más del 98% de uno o varios triterpenos pentacíclicos según la invención. En un modo de realización, el extracto purificado según la invención comprende más del 90%, en particular más del 95%, en particular más del 98% de Celastrol, en particular 100% de Celastrol.

La purificación del extracto enriquecido según la invención se podrá realizar en particular mediante una fase de separación del o de los triterpenos pentacíclicos, en particular el Celastrol, la Tingenina A y la Tingenina B, en particular mediante fraccionamiento por HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento), en particular los picos a 426 nm que comprenden el Celastrol, la Tingenina A y la Tingenina B salen respectivamente a los 10,5 minutos, 8,2 minutos y 6,5 minutos. La purificación del Celastrol se podrá efectuar en particular como se describe en los ejemplos de la presente solicitud.

Otro objeto de la descripción, pero no de la invención, se refiere a una composición farmacéutica, tal como dermatológica o dermocosmética, que comprende un extracto enriquecido bruto susceptible de ser obtenido mediante el procedimiento según la invención y uno o varios excipientes farmacéuticamente o dermocosmeticamente aceptables.

Los excipientes farmacéuticamente o dermocosmeticamente aceptables pueden ser cualquier excipiente de entre los conocidos por los expertos en la materia. La composición será en particular una composición tópica, en particular en forma de crema, de una loción, de un gel, de una pomada, de una emulsión, de una microemulsión, de un espray, etc.

La composición farmacéutica, tal como dermatológica, o dermocosmética según la invención, puede contener en particular unos aditivos y ayudas para la formulación, tales como unos emulsionantes, unos espesantes, unos gelificantes, unos fijadores de agua, unos agentes esparcidores, unos estabilizantes, unos colorantes, unos aromas y unos conservantes.

Otro objeto descrito en la presente memoria es un extracto enriquecido bruto obtenido mediante el procedimiento según la invención, para su utilización como un medicamento, en particular en el tratamiento o la prevención de una dermatosis inflamatoria que induce una respuesta celular mediada por TH17.

El experto en la materia podrá determinar fácilmente las dermatosis inflamatorias que inducen una respuesta celular mediada por TH17. El experto en la materia podrá medir en particular el nivel de expresión de IL-22, de IL-17 y/o de TNF-a de una zona lesionada con respecto a una muestra de control.

La dermatosis inflamatoria podrá ser seleccionada en particular de entre el grupo que comprende, preferentemente constituido por, la psoriasis, la dermatitis atópica y el acné.

La presente invención se ilustra mediante las figuras y ejemplos no limitativos detallados a continuación.

Figuras

Figura 1: Curva de crecimiento (línea continua) de un cultivo de células de Tripterygium wilfordii en g/l de biomasa húmeda (FW) en función del tiempo en días y concentración en Celastrol (línea de puntos) en mg de Celastrol por l de suspensión celular en función del tiempo en días.

Figura 2: Cromatograma de HPLC (A = 426 nm) del extracto bruto enriquecido de Tripterygium wilfordii obtenido el día 33.

Figura 3: Porcentaje de inducción de la síntesis de IL-17A mediante unos linfocitos T CD4+ tras la incubación con las muestras 2, 3, 4 y 5 con respecto al control negativo incubado con la muestra 1 seguida de una estimulación con unos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (*** valor p<0,001).

Figura 4: Porcentaje de inducción de la síntesis de INF-y mediante unos linfocitos T CD4+ tras la incubación con las muestras 2, 3, 4 y 5 con respecto al control negativo incubado con la muestra 1, seguida de una estimulación con unos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (*** valor p<0,001).

Figura 5: Porcentaje de inducción de la síntesis de IL-22 mediante unos linfocitos T CD4+ tras la incubación con las muestras 2, 3, 4 y 5 con respecto al control negativo incubado con la muestra 1, seguida de la estimulación con unos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (*** valor p <0,001).

Figura 6: Porcentaje de inducción de la síntesis de TNF-a mediante unos linfocitos T CD4+ tras la incubación con las muestras 2, 3, 4 y 5 con respecto al control negativo incubado con la muestra 1, seguida de la estimulación con unos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (*** valor p <0,001).

Figura 7: Porcentaje de inducción de la síntesis de IL-6 mediante unos linfocitos T CD4+ tras la incubación con las muestras 2, 3, 4 y 5 con respecto al control negativo incubado con la muestra 1, seguida de la estimulación con unos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (*** valor p <0,001).

Ejemplos

Ejemplo 1: Protocolo de desdiferenciación celular

Los callos se obtienen a partir de explantes de hojas de Tripterygium wilfordii.

Los explantes se esterilizan con etanol al 70%, y después con hipoclorito de sodio al 2,5% de cloro activo, y después se enjuagan con agua desmineralizada estéril. Opcionalmente, es posible un lavado con peróxido de hidrógeno al 7% antes del enjuague mediante agua desmineralizada estéril.

Las hojas se cortan en pedazos, por ejemplo, en cuadrados de aproximadamente 8-10 mm de lado. Los explantes foliares se depositan sobre un medio gelosado de proliferación.

La composición del medio de proliferación es la siguiente:

Macroelementos: NH⁴NO³ a 1650 mg/l, KNO³ a 1900 mg/l, CaCh.2H2O a 440 mg/l, MgSO4.7H2O a 370 mg/l, KH²PO⁴ a 170 mg/l,

Microelementos: KI a 0,83 mg/l, H³BO³ a 6,2 mg/l, MnSO4.4H2O a 22,3 mg/l, ZnSO⁴.H²O a 6,61 mg/l, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/l, CuSO4.5H2O a 0,025 mg/l, CoCh.⁶ H²O a 0,025 mg/l, FeSO4.7H2O a 27,8 mg/l, Na2EDTA.2H2O a 37,3 mg/l,

Vitaminas: mio-inositol a 100 mg/l, ácido nicotínico a 0,5 mg/l, piridoxina-HCl a 0,5 mg/l, tiamina-HCl a 0,5 mg/l, Aminoácido: glicina a 2 g/l,

Fuente de carbono: sacarosa a 30 g/l,

Hormonas vegetales: cinetina a 0,1 mg/l, ácido 2,4-dicloro-fenoxiacético (2,4-D) a 0,5 mg/l, ácido naftaleno acético (NAA) a 1 mg/l.

El medio de proliferación se gelifica mediante la adición de agar a 8-12 g/l, su pH se ajusta a pH 6 ± 0,5 (con KOH, 1M) antes del paso por autoclave durante 20 minutos a 121°C. Las placas de Petri que contienen los explantes se incuban en la oscuridad a 27-28°C.

El trasplante de los callos se realiza cada mes en el mismo medio gelosado. Para ello, los callos obtenidos se separan del explante foliar y se depositan sobre nuevas gelosas de medio de proliferación.

Ejemplo 2: Formulación de medios de cultivo y de propagación (fase de proliferación)

Tras algunos meses de trasplante, se obtienen unos callos friables y se transfieren a un medio de proliferación líquido.

El medio de proliferación tiene, por ejemplo, la composición indicada a continuación:

Macroelementos: NH⁴NO³ a 1650 mg/l, KNO³ a 2500 mg/l, CaCh.2H2O a 440 mg/l, MgSO4.7H2O a 370 mg/l, KH²PO⁴ a 130 mg/l,

Microelementos: KI a 0,41 mg/l, H³BO³ a 6,2 mg/l, MnSO4.4H2O a 22,3 mg/l, ZnSO⁴.H²O a 7,5 mg/l, Na2MoO4.2H2O a 0,25 mg/l, CuSO4.5H2O a 0,025 mg/l, CoCh.⁶ H²O a 0,025 mg/l, FeSO4.7H2O a 19,85 mg/l, Na2EDTA.2H2O a 26,64 mg/l,

Vitaminas: mio-inositol a 50 mg/l, ácido nicotínico a 0,25 mg/l, piridoxina-HCl a 0,25 mg/l, tiamina-HCl a 0,25 mg/l,

Fuentes de carbono: sacarosa a 30 g/l

Hormonas vegetales: cinetina a 0,083 mg/l, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 0,575 mg/l, ácido naftaleno acético (NAA) a 0,350 mg/l.

El pH del medio se ajusta a pH 6 ± 0,5 (por adición de KOH, 1M) antes de un tratamiento de esterilización apropiado, por ejemplo, autoclave a 121°C durante un tiempo mínimo de 20 minutos o por filtración esterilizante de 0,2 pm. La puesta en suspensión celular se realiza depositando aproximadamente 40 g de callos friables en un Erlenmeyer de 200 ml que contiene el medio de propagación, incubación durante una semana en una mesa de agitación a 100 rpm (revoluciones por minuto) en la oscuridad a 27-28°C. El sobrenadante celular se recoge con una pipeta, dejando los grupos de callos residuales. La suspensión celular obtenida se cultiva durante 15 días y después se propaga por dilución a 1/5 en nuevo medio cada 15 días.

La tasa de llenado de los Erlenmeyer es del 40% (80 ml) y la tasa de inoculación por transferencia de suspensión celular es del 20-25% del volumen, es decir aproximadamente 160 g/l de biomasa fresca. El cultivo se lleva a cabo así durante 15 días en la oscuridad a 27-28°C bajo agitación orbital a 110-120 rpm. En este momento, la biomasa está presente en una concentración de aproximadamente 300 g/l de biomasa fresca por litro de suspensión. Ejemplo 3: Producción de triterpenos en un Erlenmeyer (fase de elicitación y de preparación del extracto bruto enriquecido)

Fase de elicitación

Tras 15 días de cultivo, se retira del Erlenmeyer 1/5 del cultivo celular y se añaden 20 ml de medio de proliferación concentrado al Erlenmeyer. La composición del medio concentrado es la siguiente: Macroelementos: NH⁴NO³ a 13,9 g/l, KNO³ a 15,2 g/l, CaCh.2H2O a 2,2 g/l, MgSO4.7H2O a 370 mg/l, KH²PO⁴ a 170 mg/l; Microelementos: KI a 0,83 mg/l, H³BO³ a 31,2 mg/l, MnSO4.4H2O a 91,5 mg/l, ZnSO⁴.H²O a 33,05 mg/l, Na2MoO4.2H2O a 1,25 mg/l, CuSO4.5H2O a 0,125 mg/l l, CoCh.⁶ H²O a 0,125 mg/l, FeSO4.7H2O a 139 mg/l, Na2EDTA.2H2O a 186.5 mg/l; Vitaminas: mio-inositol a 1250 mg/l, ácido nicotínico a 8,5 mg/l, piridoxina-HCl a 5 mg/l, tiamina-HCl a 5 mg/l; Aminoácido: glicina a 20 mg/l; Fuente de carbono: sacarosa a 150 g/l (solubilizada en agua desmineralizada). Se añade a continuación el cóctel de elicitación en el Erlenmeyer al medio de proliferación con la ayuda de soluciones madre realizadas en dimetilsulfóxido. La composición del cóctel elicitor permite obtener las siguientes concentraciones en el medio de elicitación (+ células): de piruvato de sodio 1,5 g/l, pirofosfato de potasio 0,440 g/l, 2iP 0,0004 g/l, jasmonato de metilo 0,036 g/l y quitina 2 g/l.

La producción de Celastrol y sus derivados se realiza durante 12 días en la oscuridad a 27-28°C bajo agitación orbital a 120 rpm.

Recogida de la biomasa para extracción

Cuando se detiene el cultivo, se filtra el medio para recuperar la totalidad de la biomasa que contiene la mayoría de Celastrol.

Tras la separación de la biomasa por filtración de 0-50 pm, se mezclan 2 volúmenes de disolvente de tipo éster y más particularmente acetato de alquilo, en particular acetato de etilo (o también acetato de isopropilo) con 1 peso de biomasa. Esta mezcla es sometida a una extracción por sonicación que permite lisar las células y hacer que los componentes del citosol estén disponibles. La fase orgánica que comprende la fracción triterpénica se recupera tras la centrifugación de la mezcla.

Se mide la concentración en Celastrol en la fase orgánica. La concentración en Celastrol por litro de suspensión se estima en 553 mg, lo cual corresponde a un peso de 0,0166 g de Celastrol por gramo en peso seco de células.

Ejemplo 4: Producción de triterpenos (Celastrol y derivados) en biorreactores en bolsas de uso único de tipo WAVE

El ejemplo ilustrado se describe para unos reactores de tipo WAVE, por ejemplo, de marca Sartorius, para unos volúmenes de 5 lo 10 lo 2 X 5 l, pero el método se puede adaptar y aplicar a unos volúmenes superiores y a unos materiales procedentes de otros fabricantes.

El sistema binario descrito anteriormente para unos biorreactores tradicionales de laboratorio en vidrio o industriales de acero inoxidable se aplica de la misma manera con las 2 bolsas WAVE.

Proliferación

El biorreactor Wave A (5 l), colocado sobre su soporte, se llena con el medio de proliferación por filtración esterilizante en línea y se infla con aire.

Se realiza un precultivo de Tripterygium wilfordii durante 15 días en Erlenmeyer como se describe en el ejemplo 2. El medio de proliferación del biorreactor se inocula a continuación mediante este precultivo a una concentración de 160 g/l (bolsa A).

El biorreactor se incuba según las condiciones siguientes:

- ángulo de basculación: 5-8°;

- frecuencia de basculación: 16-30 rpm;

- caudal de aireación: 0,1-0,5 l/min de aire enriquecido al 50% en oxígeno puro;

- temperatura: 27°C;

- duración: 17 días.

En esta fase de proliferación, el crecimiento de las células se mide diariamente (figura 1).

Elicitación y producción de triterpenos (Celastrol y derivados)

Un volumen de aproximadamente 1000 ml de cultivo de la bolsa A (5 l) se transfiere a la bolsa B colocada al lado de la bolsa A sobre la misma plataforma. El medio de la bolsa A se complementa con 1000 ml de medio concentrado en agua desmineralizada que tiene la composición siguiente: Macroelementos: NH⁴NO³ a 13,9 g/l, KNO³ a 15,2 g/l, CaCh.2H2O a 2,2 g/l, MgSO4.7H2O a 370 mg/l, KH²PO⁴ a 170mg/l; Microelementos: KI a 0,83 mg/l, H³BO³ a 31,2 mg/l, MnSO4.4H2O a 91,5 mg/l, ZnSO⁴.H²O a 33,05 mg/l, Na2MoO4.2H2O a 1,25 mg/l, CuSO4.5H2O a 0,125 mg/l l, CoCh.⁶ H²O a 0,125 mg/l, FeSO4.7H2O a 139 mg/l, Na2EDTA.2H2O a 186,5 mg/l; Vitaminas: mio-inositol a 1250 mg/l, ácido nicotínico a 8,5 mg/l, piridoxina-HCl a 5 mg/l, tiamina-HCl a 5 mg/l; Aminoácido: glicina a 20 mg/l; Fuente de carbono: sacarosa a 150 g/l; al cual se añade el siguiente cóctel de elicitación: piruvato de sodio 7,5 g/l, pirofosfato de potasio 2,2 g/l, 2iP 0,002 g/l, jasmonato de metilo 1,8 g/l y quitina 10 g/l.

El contenido de la bolsa A se elicitan así bajo agitación a una temperatura de 27°C.

El cultivo en la fase de elicitación es seguido por la medición del crecimiento celular y por la concentración en Celastrol en el cultivo durante 16 días (figura 1).

Se puede constatar que la concentración del Celastrol en la bolsa A aumenta regularmente hasta el D32 y alcanza su máximo a 553 mg por litro de medio de elicitación tras 15 días de incubación.

La velocidad de producción del Celastrol es de aproximadamente 46 mg/l de suspensión celular por día durante 15 días tras la inducción y hasta el D32.

La cinética de la producción de Celastrol comienza a desviarse poco tiempo después de haber consumido casi la totalidad de la sacarosa disponible (figura 1).

Ejemplo 5: Producción de un extracto enriquecido en Celastrol por extracción sólido/líquido de biomasa procedente de una suspensión celular de Tripterygium wilfordii (TW08)

A los 15 días después de la elicitación (32 días tras la inoculación), la mayor parte de la biomasa se recupera por filtración de la suspensión celular con un filtro de nailon (20 - 50 j M) (TW08).

A partir de 5 l de suspensión, se recuperan aproximadamente 1925 g de biomasa. Esta biomasa se extrae con acetato de etilo (o también acetato de isopropilo) en proporción 2:1 (Vol:Peso) con respecto al peso de la biomasa (en este caso 3850 ml de disolvente para 1925 g de biomasa). La mezcla biomasa/disolvente se somete entonces a una extracción física, por sonicación. La fase orgánica se recupera entonces tras la maceración bajo agitación. La adición de disolvente (seguida de una maceración bajo agitación y la recuperación de la fase orgánica) se repite 2 veces.

La concentración en Celastrol y derivados en la fase orgánica se mide por dosificación HPLC (cuantificación de Celastrol, derivados de Tingenina) (véase la figura 2). Condiciones experimentales: columna Waters Atlantis dC18 4,6 x 150 mm - 5 j equipada con una columna de protección Atlantis dC185 pm 4,6 x 20 mm Gd Columna - 5 j . Fases móviles: (A) Acetato de amonio, 0,1 mM pH 4,0; (B) Acetato de amonio, pH 0,1 mM 4,0 en acetonitrilo al 99,8%. Gradiente: inicial 25% (A)/75% (B) - 20 min 0% (A)/100% (B) - 24,5 min 0% (A)/100% (B) - 25 min 25% (A)/75% (B) - 30 min 25% (A)/75% (B)). Caudal: 1 ml/min. Detección a 426 nm: picos de retención (min): Tingenina B (6,5), Tingenina A (8,2), Celastrol (10,5).

Ejemplo 6: Purificación del Celastrol a partir del cultivo de Tripterygium wilfordii

A partir del extracto obtenido en el ejemplo 5, el acetato de etilo (o el acetato de isopropilo) se evapora a presión reducida con el fin de obtener un extracto seco. Una parte del extracto así obtenido se purifica en primer lugar mediante cromatografía líquida a media presión (CLMP) sobre sílice (40 g, 125 x 25 mm, 30 jm ) con un gradiente de elución CH²Ch/MeOH (100/0 a 0/100). Todas las fracciones obtenidas se analizan mediante cromatografía de capa fina (CCM - Fase estacionaria: sílice 60 A; Fase móvil: tolueno/acetato de etilo/ácido acético 70:33:3) y se reúnen las fracciones que contienen principalmente el Celastrol y sus derivados Tingenina (A y B). En segundo lugar, la fracción que contiene los productos de interés (Celastrol y derivados) se purifica mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) sobre fase inversa (Lichrospher 100RP18, 250 x 25 mm, 5 j M) con un gradiente lineal agua/acetonitrilo/ácido fórmico al 0,1% (80/20 a 0/100). El pico del Celastrol se recoge y se concentra a presión reducida; se obtienen aproximadamente 2,5 a 3 g de Celastrol a partir de 5 l de suspensión de cultivo inicial. Eventualmente, puede ser cristalizado para tener una pureza absoluta.

En paralelo, una parte del extracto seco obtenido se recoge en un tampón para dar el extracto R003034 que se evaluará en actividad farmacológica anti-Th17.

Ejemplo 7: Actividad anti-Th17 en células CD4+ humanas del extracto CCV enriquecido con Celastrol

En las dermatosis inflamatorias (en particular en la psoriasis), es conocido que las células T CD4+ sobreexpresan las interleucinas IL17, IL6 e IL22, así como la IFN gamma y la TNF alfa. En el caso de la dermatitis atópica, se sobreexpresa IL17 en una cierta fase de la patología. Además, la vía Th17 está muy activada en caso de acné. Se probó el poder inhibidor de un extracto enriquecido según la invención en la sobreexpresión de estas moléculas.

Se aislaron las células CD4+ humanas a partir de las células mononucleares de la sangre de 2 donantes en Ficoll Paque Plus® según el protocolo recomendado por el fabricante (GE Healthcare). Los linfocitos CD4+ se aíslan mediante clasificación positiva por el kit Miltenyi Biotec (CD4) y una columna LS column y se resuspenden en un medio de cultivo RPMI (Sigma-Aldrich: que contiene L-glutamina y 10% de suero de ternera fetal) completado con 100 |jg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina. Los linfocitos en suspensión se distribuyen en unos pocillos de microplacas. Se añaden a continuación varios extractos o controles a los pocillos:

1. control negativo (se añade el mismo volumen de tampón sin reactivo);

2. extracto R003034 a 0,06 mg/ml (titulado en Celastrol a 9 ng/ml) (concentración final en el pocillo);

3. extracto R003034 a 0,2 mg/ml (titulado en Celastrol a 30 ng/ml) (concentración final en el pocillo);

4. extracto R003034 a 0,6 mg/ml (titulado en Celastrol a 90 ng/ml) (concentración final en el pocillo);

5. dexametasona a 2 pM (control positivo) (concentración final en el pocillo).

Tras 2 horas de incubación a temperatura ambiente, los linfocitos CD4+ se activan a 37°C durante 20 horas con unos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 a una concentración final respectiva de 300 ng/ml y de 400 ng/ml. Los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 son conocidos por inducir una respuesta de tipo Th17.

Las citocinas IL-17A, INF gamma, IL-22, TNF alfa e IL-6 se cuantificaron en el sobrenadante de cada tubo mediante el método de Multiplex Immunoassays (Jager et al. 2003). Los resultados obtenidos proceden de 2 experimentos con unos linfocitos procedentes de 2 donantes diferentes. Los resultados se presentan en las figuras 3 a 7 en porcentaje de inducción con respecto al control negativo (1). Se constata que:

- el control positivo 5 (dexametasona 2 pM) inhibe la sobreexpresión de todas las citocinas: IL-17A, INF gamma, IL-22, TNF alfa e IL-6;

- el extracto según la invención (2, 3 y 4) inhibe en gran medida la sobreexpresión de las citocinas IL-17A, INF gamma, IL-22, TNF alfa e IL-6. La inhibición de la sobreexpresión de IL-17A y TNF alfa depende de la dosis. A la dosis más baja, titulada a 9 ng/ml en Celastrol, se constata una inhibición de la sobreexpresión de la IL-17A del 75%, una inhibición de la sobreexpresión del TNF alfa del 80% y una inhibición casi total de la sobreexpresión del INF gamma, de la IL-22 y de la IL-6.

Esto demuestra que el extracto R003034 tiene una actividad anti-Th17 muy fuerte, comparable si no superior a la dexametasona (2 pM), lo cual le confiere una actividad notable en el tratamiento de patologías dependientes de Th17 como la psoriasis, el acné y la dermatitis atópica.

Ejemplo 8: Comparación de los rendimientos de Celastrol obtenidos a partir de cultivos de células vegetales de Tripterygium wilfordii

Se realizaron diez cultivos en Erlenmeyer (volumen = 50 ml) en paralelo, a partir de una misma línea celular de Tripterygium wilfordii, por duplicado en las mismas condiciones de agitación, de aeración y de temperatura. Desde el final de la fase de crecimiento, siendo máxima la densidad de la suspensión, la cantidad de biomasa fresca pesada era equivalente (peso medio de 340 g de biomasa fresca/l) en cada uno de los Erlenmeyer. En ese momento, se añadieron los elicitores al medio de cultivo de los diez Erlenmeyer en las concentraciones indicadas en la tabla siguiente, en la que el rendimiento está expresado en mg de Celastrol/kg de biomasa fresca.

La dosificación del Celastrol en suspensión se realizó por HPLC según el ejemplo 5, habiéndose realizado una curva de calibración con unos productos de control.

Las suspensiones contenidas en los Erlenmeyer anotados E1, E2, E3 se elicitaron con una solución de control que no comprende ningún elicitor para E1, con la quitina sola (2 g/l) para E2 y con el MeJa solo (64 pM) para E3. La concentración de MeJa en E3 es equivalente a la descrita por Liu et al. 2016, es decir, 64 pM.

Las suspensiones contenidas en los Erlenmeyer anotados E4 a E10 se elicitaron a tres concentraciones diferentes en MeJa (36, 64 y 92 pM) y cinco concentraciones diferentes en quitina (1,3; 2; 2,5; 3,1 y 4,2 g/l).

Se constata que los rendimientos en Celastrol obtenidos para E6, E7 y E8 aumentaron respectivamente en 204%, 233% y 274%, con respecto a E3, siendo la concentración en MeJa la misma en estos cuatro Erlenmeyer. Se observa un rendimiento aún mejor para E5, en el que la concentración en MeJa es diferente.

Ejemplo 9: Actividad inhibidora frente a NPkB

El factor de transcripción NPkB controla la expresión de un gran número de genes implicados en la regulación de la respuesta inflamatoria. En el estado inactivo, NPkB es secuestrado en el citoplasma por la proteína IKB. Ciertos estímulos proinflamatorios tales como el TNF alfa y la IL-1-beta conducen a la activación de NPkB, es decir, a su translocación nuclear. Una vez en el núcleo, NPkB inducirá la transcripción de genes proinflamatorios que codifican para unas citocinas, unas quimiocinas, unas moléculas de adhesión, unos factores de crecimiento y unas enzimas inducibles.

Las actividades antiinflamatorias de los extractos obtenidos a partir de las suspensiones contenidas en los Erlenmeyer E1, E2, E3 y E6 del ejemplo 8 se evaluaron in vitro en unos queratinocitos humanos HaCaT según el método descrito por Albanesi et al. Los extractos pesados en peso seco se recogieron en un tampón y se introdujeron en una solución de cultivo de células HaCaT en concentraciones finales equivalentes (ng/ml) para cada extracto, y se incubaron durante 1 hora. La expresión de NPkB es inducida a continuación por estimulación con TNF alfa (0,3 ng/ml).

La dexametasona a 2 pM, usada como control positivo, inhibe en más del 40% la expresión de NPkB.

El extracto según la presente invención (obtenido a partir de E6, con el par de elicitores MeJa y quitina) evaluado a unas concentraciones de 0,19 y 0,58 ng/ml inhibe respectivamente en 20% y 70% la expresión de NPkB.

El extracto preparado según Liu et al. (a partir de E3, con MeJa como único elicitor) evaluado a las mismas concentraciones no induce ninguna inhibición notable de la expresión de NPkB. Asimismo, los extractos procedentes de E2 (con la quitina como único elicitor) y del control E1 no tienen ningún efecto en la expresión de NPkB.

Solo el extracto procedente de cultivo elicitado según la presente invención inhibe en gran medida el NPkB, y de manera dependiente de la concentración.

Ejemplo 10: Actividad antimicrobiana frente a Propionibacterium acnes de un extracto preparado según el procedimiento de la presente invención comparada con la de otros compuestos

La actividad se evalúa en la cepa Propionibacterium acnes (CIP 53117T), con una suspensión de inoculación a 108 UFC/ml. El medio de mantenimiento está compuesto por gelosa Columbia 5% de sangre de oveja, con una incubación durante 24 h a 36 ± 1°C bajo anaerobiosis. El medio de ensayo está compuesto por caldo Mueller Hinton 10% de suero de ternera fetal (SVF) y gelosa Columbia 5% de sangre de oveja, con una incubación durante 24 h a 36 ± 1°C bajo anaerobiosis. La determinación de las concentraciones mínimas inhibidoras (CMI) se realiza mediante micro-método en medio líquido. Se depositan 100 pl de medio de cultivo líquido en cada pocillo de una microplaca estéril de 96 pocillos. Se depositan 100 pl del producto que debe ser probado en el primer pocillo de una fila. Unas diluciones de razón 2 se realizan a continuación de los pocillos 1 a 10. Las suspensiones de prueba de Propionibacterium acnes se preparan extemporáneamente en sal Triptona. Se depositan 100 pl en cada pocillo de una segunda microplaca, excepto la columna 11. El conjunto de la primera microplaca se inocula, con la ayuda de un inoculador multipunto Denley, a partir de la segunda microplaca. Tras la incubación, las CMI se definen como la mayor dilución con ausencia de crecimiento visible. Las columnas 11 y 12 sirven respectivamente de control negativo y positivo de crecimiento. Se probaron dos referencias en paralelo. La determinación de las concentraciones mínimas bactericidas (CMB) se realiza trasplantando las unas microplacas MIC sobre medio gelosado con la ayuda del inoculador multipunto Denley. Tras la incubación, la CMB se define como la mayor dilución con ausencia de crecimiento visible. Todos los ensayos se realizan por duplicado.

Los compuestos probados son:

- el Celastrol purificado en el DMSO (solución madre = 150 ug/ml/10% DMSO)

- el extracto preparado según el procedimiento de la presente invención en el pentilenglicol (solución madre = 2%/2% de pentilenglicol)

- la Tingenina A en el DMSO (solución madre = 150 ug/ml/10% DMSO)

- la Tingenina B en el DMSO (solución madre = 150 ug/ml/10% DMSO)

- las referencias son la amoxicilina, el DMSO (solución madre = 100%) y el pentilenglicol (solución madre = 2%)

Los resultados obtenidos se resumen en la tabla siguiente, que indica los valores de CMI y CMB para las 4 muestras y los dos excipientes. La concentración máxima de ensayo corresponde a la concentración de la solución madre/2.

En conclusión, el Celastrol tiene una actividad antibacteriana sobre Propionibacterium acnes, completamente interesante, pero parece que es el extracto preparado según el procedimiento de la invención el que presenta el nivel de actividad antibacteriana sobre Propionibacterium acnes más impoertante La Tingenina B presenta una actividad antibacteriana superior a la observada con la Tingenina A.

Ejemplo 11: Actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus a partir de un extracto preparado según el procedimiento de la presente invención comparada con la de otros compuestos

Se sabe que S. aureus es un patógeno que coloniza las lesiones de pacientes que padecen dermatitis atópica y está presente asimismo en los pacientes que padecen psoriasis (Tomi et al. 2005).

Se evaluó la actividad antibacteriana contra el S. aureus del extracto obtenido según el procedimiento de la presente invención. El experimento se realizó como se describe en el ejemplo 10, con la cepa patógena S. aureus CIP 4.83, el medio de mantenimiento Gelosa Tripticasa Soja, el medio de ensayo CMI/CMB caldo y gelosa Mueller Hinton y una incubación a 36°C durante 24 h.

Los resultados obtenidos se resumen en la tabla siguiente. Se constata que mientras el Celastrol tiene una fuerte actividad antibacteriana, la actividad anti-S. aureus del extracto obtenido según el procedimiento de la presente invención titulado en equivalente en Celastrol es todavía mejor. Por otro lado, la molécula Tingenina B tiene una mejor actividad que la Tingenina A.

En conclusión, este extracto posee no solo una actividad farmacológica anti-Th17 interesante, sino sorprendentemente una fuerte actividad anti-S. aureus, lo cual la hace muy atractiva como activo en el tratamiento tópico de la dermatitis atópica y de la psoriasis.

Ejemplo 12: Crema para aplicación tópica

El extracto de Tripterygium wilfordii se prepara de acuerdo con la presente invención, estando su concentración expresada en peso de extracto seco en un disolvente compatible con la formulación, tal como el aceite de oliva, el pentilenglicol o el miritol 318 u otros.

Este ejemplo de formulación no es de ninguna manera limitativo y puede ser adaptado según el tratamiento. De esta manera, para el tratamiento del cuero cabelludo, se podrá formular un champú recurriendo a los conocimientos del experto en la materia.

Referencias

Camelio et al. JACS 2015, 137:11864-67

Coppede et al. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2014, 118:33-43

Jager et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003, 10(1):133-9

Kelhala et al. PLOS One 2014, 9(8):e105238

Liu et al. J. Asian Nat. Prod. Res. 2016, 19:1-10

Lowes et al. Annu. Rev. Immunol. 2014, 32:227

Miyagaki et al. J. Derm. Science 2015, 78:89

Murashige & Skoog Physiol. Plant. 1962, 15: 473-497

Albanesi et al. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 2005, 4(3):329-334

Tomi et al. J. Am. Acad. Dermatol. 2005, 53(1):67-72.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido en un triterpeno pentacíclico que es el Celastrol que comprende las etapas siguientes:

(i) una fase de proliferación de células de una planta de la familia de las Celastraceae que es Tripterygium wilfordii en un medio de proliferación,

(ii) una fase de elicitación mediante la adición de un cóctel de elicitación al cultivo celular obtenido en la etapa (i), comprendiendo dicho cóctel de elicitación por lo menos un elicitor de tipo compuesto monocarboxílico que es el jasmonato de metilo y por lo menos un elicitor biótico que es la quitina y

(iii) la preparación de un extracto bruto enriquecido en triterpenos pentacíclicos a partir del cultivo celular obtenido en la etapa (ii).

2. Procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido según la reivindicación 1, en el que el cóctel de elicitación comprende además por lo menos un factor de diferenciación celular de las células vegetales y por lo menos un precursor de la vía de síntesis de los terpenos.

3. Procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido según la reivindicación 2, en el que el por lo menos un factor de diferenciación celular de las células vegetales se selecciona de entre una citocina, una giberelina y una mezcla de éstas.

4. Procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido según la reivindicación 3, en el que el por lo menos un factor de diferenciación celular de las células vegetales se selecciona de entre la bencilaminopurina (BAP), la 6-Y,Y-dimetilalilaminopurina (2iP) y una mezcla de éstas.

5. Procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el por lo menos un precursor de síntesis de los terpenos se selecciona de entre el grupo constituido por el piruvato de sodio, el pirofosfato de potasio y una mezcla de éstos.

6. Procedimiento de producción de un extracto bruto enriquecido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una etapa (iv) de obtención de un extracto purificado del triterpeno pentacíclico a partir del extracto bruto enriquecido obtenido en la etapa (iii).