KR101086642B1 - 셀라스트롤을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 셀라스트롤(celastrol) 또는 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 알러지(allergy) 예방 및 치료용 의약 조성물, 식품 조성물 및 화장품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 셀라스트롤 또는 노박덩굴 추출물은 세포주 및 동물실험에서 우수한 알러지 억제 효과가 있음이 입증되어, 알러지 질환 예방 및 치료용 조성물 제조에 유용하게 사용할 수 있다.

셀라스트롤, 노박덩굴, 알러지 질환, 예방, 치료

Description

셀라스트롤을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 치료용 조성물{A composition having an effect of curing and preventing allergy disease by containing Celastrol}

본 발명은 셀라스트롤을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 노박덩굴과 같이 셀라스트롤이 다량 존재하는 식물 또는 이들 식물로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하여 알러지 질환 예방 및 치료 효과가 있는 의약, 식품 또는 화장품 조성물에 관한 것이다.

종래 알러지(allergy)를 치료하는 방법에는 알러겐(allergen) 회피요법, 항 알러지 약물사용, 특정 알러겐에 대한 면역 치료 요법 등이 있고, 가장 널리 사용되는 알러지 치료약으로는 항히스타민(anti-histamine) 약품과 코르티코스테로이드(corticosteroid) 계통의 약품이 있다. 지난 수년간 다수의 약이 개발되었으나 증상을 완화하는데 그쳐 실제로 알러지의 근본 원인에 대한 대책은 현재까지 없는 실정이다. 이에 따라 새로운 개념의 알러지 치료제 개발이 시급한 시점에서 새로운 개념에 따른 알러지 치료제의 개발이 활발히 이루어지고 있다.

현재 개발 중이거나 종래 알러지에 대한 치료방법은 다음과 같다.

(1) 특정 알러겐을 이용한 면역치료법(specific allergen immunotherapy)

전통적인 면역 요법으로 알러겐을 장시간에 걸쳐 그 양을 증가시키면서 알러지 환자에 투입하는 방법이다. 상기 방법은 알러지성 비염의 치료에 효과를 보였고, 알러지성 천식에도 효과가 있으며 이러한 면역요법은 T 세포 반응을 Th2(T-helper 2) 유형에서 Th1(T-helper 1)으로 바꾸게 함으로써 알러지 환자의 증상을 완화시키게 하고 알러겐의 특이적 IgG(immunoglobulin G) 반응을 유도하는 치료방법이다. 하지만, 상기 면역 요법은 환자의 증상을 완화시킬 수는 있지만, 근본적인 치료는 되지 못한다는 문제점이 있다.

(2) 사이토카인(cytokine) 요법

인터루킨 4(IL-4)는 IgE(immunoglobulin E) 항체 생성에 매우 중요한 역할을 하고, 알러지 치료의 표적 단백질로 인식되어 왔으며, 동물 모델에 따르면 IL-4 수용체에 대한 항체는 각종의 알러지 질환을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이중, STAT6(signal transducet and activator of transcription 6; 전사 인자의 일종) 결손 쥐 실험결과에 따르면 IL-4에 의한 신호전달에 결함을 보이는데, 이러한 결과를 토대로 STAT6을 표적으로 한 치료제 개발이 시도되고 있다. 이외에도 IL-5, IL-13, IL-9 등의 사이토카인들을 표적으로 하는 치료제 개발이 시도되고 있다.

(3) 펩티드(peptide) 면역 치료

이 방법은 알러지 유발원에 의해 유도되는 CD4 T 세포 반응을 억제하는 펩티드 단편을 이용하는 방법이다. 알러겐 추출물(allergen extracts)을 이용하는 경우 IgE에 의해 매개되는 과민성 쇼크반응을 야기할 수 있는 등 그 위험성이 크나, 펩티드 단편을 이용할 경우 이러한 문제를 초래하지 않는 장점이 알려져 있다. 실례로 고양이의 알러지 유발원인 Fel d에서 유래된 펩티드의 경우 Th2 사이토카인의 발현 수준을 감소시킴으로써 알러지 증상을 완화시킨다는 연구결과가 보고되고 있으나, 긴 펩티드들의 경우에는 부작용이 보고되고 있어 최근에는 비교적 짧은 펩티드(16 또는 17량체의 아미노산)를 이용하는 치료법이 활발히 개발되고 있다. 그리고, 벌의 독소(venom)에 포함되어 있는 펩티드(mast cell degranulating peptide)를 이용하여 IgE 항체가 RBL2H3(렛의 호염기구 세포주) 세포주의 수용체에 결합하는 것을 방해함으로써 알러지를 치료하는 시도가 이루어지고 있다.

(4) 백신(vaccine)

바이러스(virus) 혹은 세균에 의한 감염은 흔히 Th1 면역반응을 유발하여 알러지 반응을 억제하는 효과를 나타내는데, 이러한 점에 착안하여 Th1 반응을 유발하는 백신의 경우 알러지를 억제할 수 있는 효과를 나타내리라 예상된다. 이중, 결핵균의 경우 IFN-γ(interferon-gamma), IL-12 등 Th1 반응을 유발하여 알러겐에 대한 감수성을 저하시키는 역할을 할 수 있으며, 실례로 BCG(Bacillus Calmette-Guㅹrin) 접종은 알러지 유발을 억제한다는 보고가 있다.

또한, DNA 백신이 Th1 반응을 유도한다는 여러 보고들이 있어 이를 이용한 알러지 치료제 개발이 이루어지고 있다. 실례로 베타-갈락토시데이즈 유전자가 Th1 반응을 유도한다는 보고가 있으며, 집먼지진드기 알러겐의 일종인 Der p5를 암호화하는 유전자의 경우 IgE 생성을 억제하고, 히스타민 분비를 억제한다는 연구결과가 있다. 그리고, 동물실험의 경우 CpG-ODN(CpG oligodeoxynucleotides)이 Th1 반응을 유발한다는 보고가 있고, CpG-ODN의 경우에는 NK(natural killer, 자연살상세포), DC(dendric cell, 수지상 세포) 등을 자극하는데, 자극 받은 DC는 MHC class II, CD80, CD86과 같은 costimulatory molecules의 발현을 유도하고 IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α(tumor necrosis factor-alpha) 등과 같은 Th1 반응을 매개하는 사이토카인들의 발현을 증가시키는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 이중, CpG-ODN이 실제로 인체 내에서 알러지 유발을 억제하는지는 많은 연구결과를 요하나 현재 in vitro 실험결과에 따르면 인간 림프구(human lymphocytes)는 CpG-ODN에 대한 반응이 쥐와 유사함을 보이는 것으로 알려져 CpG-ODN은 알러지 치료제로 개발이 예상된다.

(5) 항 IgE 항체 치료

가장 효과적인 알러지 치료는 IgE 항체를 중화시키는 방법으로, IgE의 중화를 위해서는 수용체와 결합하는 IgE의 특정 부위에 대한 항체를 제조하는 것이 효과적인 방법이다. 이에, 과민성 쇼크(anaphylactic shock)를 유발하지 않는 anti IgE 항체들이 제조되었으며, 이러한 항체들은 IgE를 인지하지만 히스타민(histamine) 분비를 초래하지 않으므로 향후 매우 효과적인 알러지 치료제로 개발될 것으로 예상된다. 이중, 현재까지는 CDR(complementarity determining region) 이식 방법을 이용하여 수종의 알러지 치료용 인간화 항체가 만들어졌고, 이러한 항체들은 IgE 생성을 선택적으로 억제하여 치료하는 것으로 보고되고 있다. 상기와 같은 방법 이외에, 자연계에 존재하는 많은 물질로부터 알러지에 효과를 나 타내는 물질을 선별하는 작업 또한 이루어지고 있는데, 이중 본 발명자들이 주목한 셀라스트롤은 퀴논계열의 물질로서 노박덩굴과 같은 식물에 다량 존재하는 것으로 알려져 있고, 항산화 및 항염증 효과를 갖고 있어서 만성 염증, 자가 면역 질환 등의 치료제로 사용되고 있다.

최근 연구 결과에 따른 셀라스트롤의 효과는 다음과 같다.

(1) 염증을 유발하는 사이토카인의 분비를 억제(Pinna et al., 2004)

(2) TNF(tumor necrosis factor)에 의한 세포괴사를 증가시키며 전사인자인 NF-κB에 의해 조절되는 단백질들의 기능을 억제함으로써 암세포의 침윤을 억제(Sethi et al., 2007)

(3) 스트레스 관련 단백질인 힛쇽 단백질(heat shock protein)의 발현을 억제함으로써 스트레스에 의한 세포 괴사를 억제(Wester et al., 2004)

(4) 프로테아좀(proteasome)의 기능을 억제함으로써 전립선 암의 성장을 억제(Yang et al., 2006)

(5) 신경독성으로부터 세포를 보호

이러한 기능적인 특징을 갖는 셀라스트롤을 본 발명자들은 알러지의 예방 및 치료에 이용하고자 하였고, 셀라스트롤의 알러지에 대한 효과를 확인하기 위해 다음과 같은 기존에 밝혀진 알러지와 관련된 연구 결과들을 이용하였다.

연구 결과에 따르면, 비만세포(mast cell)와 호염기구 세포(basophils)는 일반적으로 아토피성 피부염과 천식 등에 중요한 역할을 담당하여, 알러지(아토피성 피부염, 알러지성 비염 및 천식 등) 치료제 개발에 이상적인 표적 세포로 사용될 수 있다(Kobayashi et al., 1997). 구체적으로 점막 비만 세포인 RBL2H3 세포주(rat basophilic leukemia)는 그 표면에 IgE 항체의 수용체(immunoglobulin receptor FcεRI)를 갖고 있는데, 이 수용체를 특정 항원으로 자극하여 수용체 간에 복합체를 이루면 세포 내에서 탈과립(degranulation)과 베타 헥소스아미니데이즈(β-hexoaminidase), 류코트라이엔(leukotriene), 히스타민(histamine) 등의 매개물질 분비(mediator release), MAPK(mitogen activated protein kinase), 티로신 키나제(tyrosine kinase) 및 포스포리파제 C(phospholipase C)의 활성, ROS(reactive oxygen species) 생성, 칼슘 유입(calcuim influx) 및 사이토카인(cytokine) 생성 등의 다양한 반응이 일어나고(Reth et al., 1999; Cambier et al., 1995; Wange et al., 1996), 특히 RBL2H3 세포 내에 탈과립 반응은 과립 내에 포함된 베타 헥소스아미니데이즈 효소가 분비되어 알러지 반응을 유도하고, 상기 유도 반응이 베타 헥소스아미니데이즈 효소의 분비를 급격히 증가시켜 과도한 알러지 반응이 일어나게 하는 것으로 알려져 있다. 활성산소종의 증가는 알러지 반응의 매개물질인 히스타민의 분비를 증가시키는 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2005; Matsui et al., 2000; Kim et al., 2002; Yoshimaru et al., 2002). 그리고, 알러지 반응 시 칼슘이온의 유입이 증가되면, 타이로신키나제의 일종인 Syk(세린/타이로신 키나제)의 활성화가 일어나서 MAPK(mitogen activated protein kinase) 등의 키나제 활성이 연쇄적으로 일어나게 되고, 활성화된 키나제 등에 의해 알러지 반응이 유도되는 것으로 알려져 있다.

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이에, 본 발명자들은 상기와 같은 알러지 질환에 관련된 생체의 과민 반응을 억제할 수 있는 물질을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 항염증의 기능을 갖는 것으로만 알려진 본 발명의 셀라스트롤이 알러지 질환 예방 및 치료에 탁월한 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 알러지 질환 예방 및 치료효과를 갖는 셀라스트롤을 유효성분으로 포함하는 의약 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 셀라스트롤을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 치료용 식품 조성물 및 화장품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 셀라스트롤(celastrol) 또는 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 치료용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 셀라스트롤 또는 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 치료용 식품 조성물을 제공 한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 셀라스트롤 또는 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 치료용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 알러지 질환은 아토피성 피부염, 두드러기 또는 알러지성 비염인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다. 이때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복적인 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 종래 노박덩굴에서 추출되어 항염증의 기능을 갖는 것으로만 알려진 셀라스트롤을 알러지 질환의 예방 및 치료용 조성물의 용도로 사용한 것으로, 특히 셀라스트롤이 IgE(immunoglobulin E) 항체에 감작된 RBL2H3(rat basophilic leukemia, 렛의 호염기구 세포주) 세포주를 특정 항원으로 자극하여 유발되는 알러지 반응의 각종 분자생물학적 경로를 저해하고, 아토피 유발 동물에서 DNFB(2,4-dinitrofluorobenzene)에 의한 아토피 유발 억제 효과를 입증함으로써, 셀라스트롤을 알러지 질환에 새로운 예방 및 치료용 조성물로 사용할 수 있게 한 것이다. 특히, 본 발명의 셀라스트롤은 기존의 항 알러지 치료 약물인 케토티펜 퓨마레이 트(ketotifen fumarate)와 유사한 효과가 있다는 것을 입증함으로써, 알러지 질환의 예방 및 치료용 의약적 조성물로서도 그 활용가치가 매우 높다고 할 수 있다.

또한, 본 발명에서 셀라스트롤은 의약품, 식품 및 화장품 등의 용도로 사용할 수 있는데, 본 발명에서 알러지 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 실험적으로 입증한 셀라스트롤을 포함하는 추출 분획을 사용함이 바람직하다.

먼저, 본 발명에서는 셀라스트롤을 응용하여 알러지 예방 및 치료용 의약 조성물 또는 건강보조식품을 제공한다. 이때, 본 발명에 따른 의약 조성물 또는 건강보조식품은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.

상기 셀라스트롤은 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있다. 좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용하는 것이 바람직하다. 그리고 본 발명의 셀라스트롤 및 그의 염을 유효성분으로 함유하는 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투 여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리(pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 1 내지 5㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

또한, 상기 셀라스트롤의 유효량을 기준으로, 본 발명은 셀라스트롤 그 자체 또는 식품학적으로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 기본식이소재(其本食餌素材)로 포함하는 식품을 제공하는데, 상기 식품은 식육가공품, 어육제품, 두부, 묵, 죽, 라면이나 국수 등의 면류, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등의 조미식품, 소스, 과자, 발효유나 치즈 등의 유가공품, 김치나 장아찌 등의 절임식품, 과실, 채소, 두유, 발효음료 등의 음료수의 식품에 포함하여 사용할 수 있다. 이는 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자(이하, 당업자라 함)라면 자명한 사항으로 이의 구체적인 조리 방법이나 생산 방법의 기재는 생략하기로 한다. 또한 식품학적으로 허용된 담체는 상술한 약제학적으로 허용된 담체도 사용할 수 있다.

그리고 상기 셀라스트롤 의 유효량을 기준으로, 본 발명은 셀라스트롤 그 자체 또는 화장품학적으로 허용된 담체를 혼합한 조성물을 기능성 성분으로 포함하는 화장료 또는 화장품을 제공하는데, 상기 화장료 또는 화장품은 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지 크림, 팩 및 영양 에센스로 이루어진 군에서 선택된 형태로 제조되어 사용된다. 이때, 상술한 형태의 화장품 제조방법과 담체는 당업자에게 자명한 사항으로 구체적인 제조방법의 기재는 생략하기로 한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[실시예 1] 노박덩굴 추출물이 항원 자극에 의한 베타 헥소스아미니데이즈(β-hexosaminidase) 분비에 미치는 영향

본 실시예에서는 노박덩굴 추출액이 항원 자극에 의해 증가하는 알러지의 표지 효소인 베타 헥소스아미니데이즈(β-hexosaminidase)의 분비를 억제하는지 확인하고자 종래의 방법에 따라 수행하였다. 노박덩굴의 껍질, 줄기 또는 뿌리에서 선홍색 부위를 분리하여 에탄올을 가한 후, 36시간 동안 상온 추출 한다. 껍질, 줄기 또는 뿌리와 추출액을 분리하고, 추출액을 0.2㎛ 필터를 이용하여 여과한다. 그 후, 추출액 Thin-Layer Chromatography(TLC)를 실시하는 방법에 의해 수득하였다.

BSA 용액(2%)으로 96-well plate의 각 well을 코팅(2시간 반응)한 후, 각 well 당 2X10⁵ 개의 RBL2H3 세포주를 분주하였다. 다음날 anti-DNP IgE 항체(100ng/ml)로 RBL2H3 세포주를 14시간 동안 감작시켰다. 배지를 제거하고 PBS 완충용액으로 1회 씻어준 후, Tyrode's 완충용액(119mM NaCl, 4.74mM KCl, 2.54mM CaCl₂, 1.19mM MgSO₄, 1.19mM KH₂PO₄, 10mM HEPES, 5mM glucose, 0.1% BSA, pH7.3) 100㎕를 넣어주고 15분간 배양하였으며, 노박덩굴 각 부분의 추출물을 농도별로 넣어주고 15분간 배양하였다. 이때, 대조군은 종래 항 알러지성 약물인 케토티펜 퓨마레이트(ketotifen fumarate)를 100μM 농도로 사용하였고, 도 1에 KF라고 표기하였다.

항원인 DNP-HSA(100ng/ml)를 처리한 후 1시간을 더 배양하였다. 상등액(80㎕)을 취해서 다른 96-well plate에 넣고 동일한 부피의 기질 용액(0.2M citrate, 1mM 4-methylumberliferyl-N-acetyl-β-D-glucosamine, pH4.5)을 넣어준 후, 1시간 동안 반응을 수행하였다. 1시간 반응하는 동안, 세포내에 전체 효소의 양을 측정하기 위해 남은 세포에 lysis 완충용액(1% triton X-100 in 1X PBS)을 처리한 후, 스크래퍼(scraper)로 긁어 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 넣고 4℃ 12,000g 조건에서 5분간 원심분리하여 수득한 상등액을 새로운 96-well plate에 넣었다. 기질 반응을 중지시키기 위해 정지액(sodium bicarbonate pH10.0)100㎕를 넣어주고 5분간 반응시킨 후, 흡광도를 405nm에서 측정하여 도 1과 같은 그래프를 작성하였다.

이의 결과 도 1에서 나타난 바와 같이, 노박덩굴 껍질, 줄기 또는 뿌리에서 의 추출물 모두 항원 자극에 의해 증가하는 베타 헥소스아미니데이즈의 분비를 농도에 의존적으로 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 2] 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 베타 헥소스아미니데이즈(β-hexosaminidase) 분비에 미치는 영향

본 실시예에서는 노박덩굴에서 추출한 셀라스트롤이 항원 자극에 의해 증가하는 알러지의 표지 효소인 베타 헥소스아미니데이즈(β-hexosaminidase)의 분비를 억제하는지 확인하고자 종래의 방법에 따라 수행하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 노박덩굴 추출물 대신 셀라스트롤을 처리하여 도 2와 같은 그래프를 작성하였다.

이의 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 노박덩굴에서 추출한 셀라스트롤은 항원 자극에 의해 증가하는 베타 헥소스아미니데이즈의 분비를 농도에 의존적으로 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 3] 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 히스타민 분비에 미치는 영향

히스타민(분자량: 111)은 아미노산인 히스티딘의 탈 카르복실 화에 의해 생성되는 물질로써, 포유동물의 조직에 광범위하게 분포하고 즉각적인 면역과민 반응을 매개하며 비만 세포(mast cell) 및 호염기구 세포 등에 과량 존재하다가 알러지 유발물질에 의해 분비되는데, 알러지 유발물질들은 호염기구 세포 등에서 분비되는 히스타민의 양을 통해서 동정될 수 있다. 이와 같은 공지된 방법을 이용하여, 셀라 스트롤의 항 알러지성 효과를 동물모델을 이용하여 히스타민 분비를 측정함으로써, 그 여부를 확인하고자 하였다.

먼저, 본 발명에서는 해명(Hartley albmno female guinea pig)을 사용하였고, 상기 해명으로부터의 비만 세포의 분리는 공지된 방법에 따라 다음과 같이 수행하였다(Ro 등 Journal of Pharamcology and Experimental Therapeutics 292 (1) 114-121, 2000).

10마리의 해명으로부터 폐 조직을 기지의 방법에 따라 분리하였는데, 이때 해명은 마취하지 않은 상태로 뇌진탕을 유발하여 죽게 한다. 해명으로부터 얻은 폐 조직을 50㎖의 티로드 완충용액(137nM NaCl, 0.36nM NaH₂PO₄, 2.6nM KCl, 1nM CaCl₂, 1.5nM MgCl₂, 119nM NaHCO₃, 5.5nM glucose, 1g/l gelatin, pH7.4)으로 관류 시킨 후 기도와 혈관을 제거하였다. 이후 폐 조직을 맥웨인 조직 분쇄기(Mcllwain tissue chopper)로 잘게 썰고, 잘게 썬 폐 조직을 콜라게나제(125 U/g 조직)와 엘라스타제(5 U/g 조직)로 3회 처리를 각각 15, 15, 25분으로 하였다. 그리고, 폐 조직을 구성하는 세포들이 밖으로 분리되는데 이들 세포들을 nytex 망(100 ㎛)으로 여과시킨 후, 티로드 완충용액으로 씻어주었다.

상기 세포들을 퍼콜(percoll) 용액(밀도, 1.045g/㎖)위에 붓고 800g 에서 20분간 원심분리를 한 후, 비만 세포를 포함하는 침강세포들(pellet)을 1X 티로드 완충용액에 현탁 시키고 불연속 퍼콜 밀도 구배를 통해 정제하였다. 이때, 밀도구배를 통해 원심분리를 800g에서 20분간 수행 한 후 비만 세포의 밀도에 해당하는 밴 드를 잘라서 티로드 완충용액으로 씻어주어 비만 세포를 준비하였다.

상기의 방법에 따라 정제된 비만 세포에 항 OVA 항체(anti-ovalbumin antibody)를 세포 10⁶ 당 1㎖을 넣어 37℃에서 2시간 반응하여 감작 시킨 후, 비만세포들을 티로드 완충용액으로 씻어주고 항원(0.1 ㎍/ml ovalbumin)으로 10분간 자극하고 반응을 중단하였다. 원심 분리를 수행하고 그 상등액을 취하여 항원에 의해 분비된 히스타민(histamine)의 양을 측정하였다. 이때, 히스타민 분비 측정은 자동 형광분석계를 이용하여 수행하였고 하기 표 1에 나타내었다.

이의 결과 표 1에 나타난 바와 같이, 셀라스트롤은 항원 자극에 의한 히스타민 분비를 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다.

표 1. 셀라스트롤의 처리 농도에 따른 히스타민 분비

처리	농도(μg/ml)	히스타민 분비(억제율%)
셀라스트롤	0	30.1±0.25a
	3	29.3±0.36(2.5%)***
	5	19.7±0.45(34.4%)*
	10	15.9±0.52(47.0%)***
	30	15.6±0.18(48.2%)***

(값은 ±표준편차로 표기, a : 대조군, * p < 0.05, *** p < 0.0005)

[실시예 4] 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 활성산소 증가에 미치는 영향

셀라스트롤이 항원 자극에 의해 증가하는 알러지 반응의 특징 중 하나인 활성산소 생성을 억제하는지 확인하고자 종래의 방법에 따라 수행하였다.

RBL2H3 세포주를 anti-DNP IgE 항체로 감작한 후, 5μM의 2, 7-디클로로디하이드로프로레신 디아세테이트(2, 7-Dichlorodihydrofluorescin diacetate)를 넣고 30분 반응하였다. 반응 종료 전 5분에 DNP-HSA(100ng/ml)을 넣고 생성된 활성산소를 레이져 스케닝 콘포컬 현미경(laser scanning confocal microscope, LSM410, Carl Zeiss)으로 관찰하였다(도 3(a)). 셀라스트롤(5μM) NAC(N-acetyl-L-cysteine)100㎕은 반응 종료 15분 전에 첨가하였다. 셀라스트롤이 미토콘드라에서의 활성산소 증가에 미치는 영향을 조사하기 위하여 디히드로로다민(DHR123, 10μM)과 미토콘드리아 추적 형광 염색약인 Mitotracker Red CMXRos(10nM)을 사용하였다(도 3(b)).

이의 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 셀라스트롤은 항원 자극에 의한 활성산소 증가를 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 5] 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 칼슘 유입 증가에 미치는 영향

일반적으로 RBL2H3 세포주에서는 항원 자극에 의해 칼슘이온의 유입이 증가하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 실시예에서는 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 칼슘 이온 유입 증가에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 칼슘(Calcium ion)의 유입량은 형광 시약인 fluo-3AM을 이용하여 결정하였다.

RBL2H3 세포주를 anti-DNP IgE 항체(100ng/ml)로 16시간 동안 감작하였다. 배양 배지를 완충용액으로 갈아 준 후 1%(v/v) fetal bovine serum과 0.04% pluronic F-127의 존재 상태에서 4μM 농도의 fluo-3-AM을 처리하고 암소에서 45분간 반응하였다. 세포를 3회 세척하고 셀라스트롤(200 ug/ml)을 처리한 직 후, DNP-HSA(100ng/ml)로 RBL2H3 세포주를 자극하였다. 처리 전 후의 fluo-3-AM 형광 밀도 변화를 측정하는데, 여기파장은 488nm로, 방사파장은 540nm로 하여 측정하여 도 4의 그래프를 작성하였다.

이의 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 셀라스트롤은 RBL2H3 세포주에서 항원 자극에 의한 칼슘의 유입량을 현저히 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 6] 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 ERK, p38 MAPK 인산화 증가에 미치는 영향

본 실시예에서는 알러지 반응 경로에서 신호전달분자로 알려진 ERK, p38 MAPK의 인산화 반응에 셀라스트롤이 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

RBL2H3 세포주를 anti-IgE 항체(100ng/ml)로 16시간 동안 감작시킨 후 셀라스트롤을 농도별로 15분간 처리하였다. 항원(DNP-HSA 100ng/ml)을 넣고 15분간 배양한 후, 세포 추출물로부터 단백질을 기지의 방법에 따라 분리하고 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 5).

도 5(A)의 왼측 사진은 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 ERK, p38 MAPK의 인산화 증가를 억제함을 나타낸 것이고, 도 5(A)의 우측 사진은 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 ERK 키나제의 활성증가를 억제함을 나타낸 것으로 ERK의 하위 target 인 Elk-1 을 기질로 수행한 결과이다. 도 5(B) 내지 도 5(E)는 ERK의 억제제인 PD98059를 사용한 것으로, 도 5(B)는 PD98059이 항원 자극에 의한 베타 헥소스아미니데이즈의 분비 증가를 억제함을 나타낸 것이고, 도 5(C)는 PD98059와 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 히스타민 분비 증가를 억제함을 나타낸 것이다. 또한, 도 5(D)와 도 5(E)는 PD98059와 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 IL-13 또는 IL-5의 사이토카인 분비 증가를 억제함을 나타낸 것이다.

이의 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 셀라스트롤은 RBL2H3 세포주에서 항원 자극에 의한 ERK, p38 MAPK의 인산화 증가를 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 7] 셀라스트롤이 항원자극에 의한 세포부착능 증가에 미치는 영향

일반적으로 항원 자극 시 RBL2H3 세포주는 세포 외 기질(fibronectin, type IV collagen)에 부착되는 능력을 향상시키고, ROS, ERK, p38 MAPK 등이 항원 자극에 의한 세포부착능 증가를 매개하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 실시예에서는 셀리스트롤이 항원 자극에 의한 세포부착능 증가에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 이때, 세포부착능을 측정하기 위해서 피브로넥틴(fibronectin), 마트리젤(matrigel) 등으로 코팅된 24 well plate를 사용하였다.

세포부착능 실험을 위해 IgE 항체로 감작된 RBL2H3 세포주를 항원인 DNP-HSA(100 ng/ml)로 자극하였다. 셀라스트롤은 항원 자극전 15 분 동안 처리 하였다. 항원 자극을 받은 RBL2H3 세포주(5,000 세포)를 0.5%(w/v) BSA를 포함하는 DMEM 배지에 녹인 후, 각각의 피브로넥틴, 타입 4 콜라겐 및 마트리젤이 10μg/cm²로 코팅된 플레이트에 뿌리고 37℃에서 1시간 동안 반응을 수행하였다. PBS 완충용액으로 3번 세척하고, 부착된 세포는 헤마토자일린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였으며, 그 수를 세어 도 6의 그래프를 작성하였다.

이의 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 셀라스트롤은 항원 자극에 의한 세포부착능을 현저히 감소시킴을 알 수 있었다.

[실시예 8] 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 Th2 사이토카인 발현 증가에 미치는 영향

본 실시예에서는 셀라스트롤이 항원자극에 의해 분비가 증가되는 Th2 사이토카인의 발현 증가를 억제하는지의 여부를 확인하고자 하였다.

IgE 항체로 감작된 RBL2H3 세포주를 셀라스토롤(5μM) 또는 완충용액으로 각각 15분간 처리한 후 항원인 DNP-HSA(100ng/ml)로 2시간 동안 자극하였다. 트리졸(Trizol) 방법을 통해 전체 RNA를 분리하고, 분리된 전체 RNA는 역전사 효소(Superscript reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA로 전환시켰다. 전환된 cDNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. 이때, 하기의 프라이머들을 이용하여 RT- PCR 을 수행하였다.

IL-13: 5'-GCT CTC GCT TGC CTT GGT GGT C-3' 및 5'-CAT CCG AGG CCT TTT GGT TAC AG-3';

GM-CSF: 5'-GCA TGT AGA TGC CAT CAA AGA AGC-3' 및 5'-CAT TTC TGG ACC GGC TTC CAG C-3';

MIP-2: 5'-CTA CAT TGG TGC AGA CTG TG-3' 및 5'-CGT ATG TAG CAA AGA TGC AG-3';

IL-2: 5'-CTG TGT TGC ACT GAC GCT TGT C-3' 및 5'-CTG AGT CAT TGT TGA GAT GAT GC-3';

IL-4: 5'-ACC TTG CTG TCA CCC TGT TC-3' 및 5'-TTG TGA GCG TGG ACT CAT TC-3';

β-actin: 5'-TAA CCA ACT GGG ACG ATA TG-3' 및 5'-ATA CAG GGA CAG CAC AGC CT-3';

상기의 프라이머를 사용하여 다음과 같이 조건으로 PCR을 수행하였다.

IL-13: 94℃에서 60초, 60℃에서 45초 및 72℃에서 45초를 27사이클로 수행하였다.

GM-CSF: 94℃에서 60초, 60℃에서 45초 및 72℃에서 45초를 25사이클로 수행하였다.

MIP-2: 94℃에서 30초,　55℃에서 30초 및　72℃에서 1분을 30사이클로 수행하였다.

IL-2: 94℃에서 60초,　60℃에서 45초 및　72℃에서 45초를 34사이클로 수행하였다.

IL-4: 94℃에서 60초,　58℃에서 45초 및　72℃에서 45초를 24사이클로 수행하였다.

β-actin: 94℃에서 60초, 58℃에서 45초 및 72℃에서 45초를 20사이클로 수행하였다(도 7).

이의 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 Th2 사이토카인(IL-4 등)의 발현 증가를 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 9] 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 FcεRI 신호전달에 미치는 영향

RBL2H3 세포주에서 항원 자극은 IgE의 수용체인 FcεRI의 신호전달을 활성화 시킨다. 본 실시예에서는 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 FcεRI 신호전달 활성에 미치는 영향을 조사하였다.

RBL2H3 세포주를 anti-IgE 항체(100ng/ml)로 16시간 동안 감작시킨 후 셀라스트롤을 15분간 전처리 하였다. DNP-HSA(100 ng/ml)를 이용하여 시간대별로 자극한 다음 Lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.3, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 μg/ml leupeptin)로 셀을 긁어 13,000 rpm, 4 ℃에서 15분간 원심 분리한다. 상층액을 취하여 FcεRIγ 항체로 Immunoprecipitation을 수행 한 후 웨스턴 블롯을 통하여 결합하는 단백질의 종류를 확인하였다.

도 8(A)은 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 FcεRIγ-ERK, FcεRIγ-PKCδ 결합을 억제함을 나타낸 것이고, 도 8(B)는 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 Rac1-ERK, Rac1-PKCδ 결합을 억제함을 나타낸 것이다.

이의 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 FcεRIγ-ERK, FcεRIγ-PKCδ, Rac1-ERK 및 Rac1-PKCδ 결합을 억제함으로써 FcεRI 신호전달을 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 10] 셀라스트롤이 아토피 유발 동물모델에서 화학물질(chemical)의 항원에 의한 아토피 유발에 미치는 효과

본 실시예에서는 4주령의 Nc/Nga 생쥐(mouse)를 사용하여 셀라스트롤이 화학물질에 의한 아토피 유발 억제효과가 있는지의 여부를 조사하였다.

통상 Nc/Nga 마우스에서, 아토피 피부염은 일반적인 환경에 있을 때 태어난 지 8주 후부터 나타나기 시작하고, 아토피 피부염의 범위는 10주가 지나면 머리와 목의 뒤에서 처음 나타나서, 11주에는 귀와 등으로 번지며, 13주에는 배부에서도 병변을 관찰되는 것으로 알려져 있다. 또한, 일반적인 환경에서 Nc/Nga 생쥐의 아토피 피부염은 사람의 아토피 피부염 환자에서 관찰되어지는 피부의 특징을 보여줌으로써, 임상 실험에서 많이 사용되고 있다. 하지만, Nc/Nga 마우스에서 자연발생적인 아토피 피부염이 유도될 확률이 낮기 때문에, DNFB(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)의 화학제를 처리하여 접촉성 과민반응(contact hypersensitivity reaction)으로 아토피 피부염이 유도되도록 하였다.

아세톤/올리브유에 0.15%의 DNFB를 혼합하고 25㎕를 4주령의 NC/Nga 마우스 등에 7일 간격으로 5번 발라준 후 병변의 상태를 사진을 찍어서 관찰하였다. 이때, 셀라스트롤의 알러지 예방효과를 관찰하기 위해서 아세톤/올리브유에 0.15% DNFB/셀라스트롤 (50㎍) 25㎕를 4 주령의 NC/Nga 마우스 등에 7일 간격으로 5번 발라 발라준 후 병변의 상태를 사진을 찍어서 관찰하였다(도 9).

이의 결과 도 9에 나타난 바와 같이, 셀라스트롤을 DNFB와 혼합하여 마우스의 등에 발랐을 경우 아토피 피부염이 현저하게 없어짐을 알 수 있었다. 따라서, 셀라스트롤은 아토피 피부염 예방 효과가 있음을 입증할 수 있었다.

[실시예 11] 셀라스트롤이 아토피 유발 동물모델에서 조직 병변에 미치는 영향

Nc/Nga 생쥐에 DNFB를 처리 하면 3-4주 후에 아토피 피부염의 전형적인 증상인 피부의 각질화 및 비후화가 나타나는데, 이러한 피부의 각질화와 조직 병변과의 상관관계를 알아보기 위하여 기지의 방법에 따라 조직 염색을 수행하였다. 간단히 말하자면, 각질화가 일어난 부위를 절제한 후 기지의 방법에 따라 헤마톡실린 (hematoxylin)과 에오신(eosin)을 사용하여 조직 염색을 수행하였다(도 10).

이의 결과 도 10에 나타난 바와 같이, 셀라스트롤은 DNFB에 의한 피부의 비후화(lichenification)를 현저히 억제시킴을 알 수 있었다.

[실시예 12] 노박덩굴 추출물이 아토피 유발 동물모델에서 화학물질(chemical)의 항원에 의한 염증 유발에 미치는 효과

본 실시예에서는 5주령의 Balb/c 생쥐(mouse)를 사용하여 노박덩굴 추출물이 화학물질에 의한 염증 유발 억제효과가 있는지의 여부를 조사하였고, 이를 위해, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(PMA)의 화학제를 처리하여 염증을 유도하였다.

물질을 처리하지 않은 쥐의 양쪽 귀의 두께를 dial thickness gauge를 사용하여 측정한 후,　노박덩굴 추출물(10%) 또는 아세톤/올리브유 50㎕를 1시간 전처리하고 아세톤/올리브유에 0.015%의 PMA를 혼합하여 20㎕를 5주령 Balb/c 생쥐의 양쪽 귀에 발라준 후 병변의 상태를 관찰하였다. 6시간 후, 양쪽 귀의 두께를 측정하여 귀의 두께변화를 계산하였다(도 11).

이의 결과 도 11에 나타난 바와 같이, 노박덩굴 추출물을 전처리 하였을 경우 염증이 현저하게 억제됨을 알 수 있었다. 따라서, 노박덩굴 추출물은 염증 예방 효과가 있음을 입증할 수 있었다.

[실시예 13] 노박덩굴 추출물이 염증 유발 동물모델에서 조직 병변에 미치는 영향

Balb/c 생쥐(mouse)에 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(PMA)의 화학제를 처리하여 염증을 유도하였다. PMA와 같은 피부 자극제(skin irritants)에 의해 유도된 급성 피부 염증은 혈관확장(vasodilation), 백혈구의 침윤(leukocyte infiltration), 부종(edema)으로 인하여 피부의 두께가 증가하게 된다. 이러한 피부 두께 증가와 조직 병변과의 상관관계를 알아보기 위하여 기지의 방법에 따라 조직 염색을 수행하였다. 간단히 말하자면, 급성 피부 염증이 일어난 부위를 절제한 후 기지의 방법에 따라 헤마톡실린(hematoxylin) 과 에오신(eosin)을 사용하여 조직 염색을 수행하였다(도 12).

이의 결과 도 12에 나타난 바와 같이, 노박덩굴 추출물은 PMA에 의한 피부의 두께 증가를 현저히 억제함을 알 수 있었다.

[실시예 14] 노박덩굴 추출물이 인터루킨-5(IL-5)와 인터루킨-13(IL-13)의 분비에 미치는 영향

노박덩굴 추출물이 면역제어제(immunomodulator) 특성을 갖는지 확인하기 위하여 T 림프구(lymphocyte) 활성의 표지(marker)로서 싸이토카인(cytokine)의 분비 량을 측정하였다.

전체 splenocytes를 RPMI 1640 배지에 현탁하여 96-well plate에 1× 10⁶ 세포/㎖ 농도로 분주하고 37℃, 5% CO 2에서 배양한 후, 노박덩굴 추출물(1%)을 1시간 전처리하여, concanavalin A(1㎍/㎖)와 함께 48시간 동안 배양하였다. 분비된 IL-5와 IL-13의 양을 측정하기 위하여 배양액을 회수하였고, 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay)을 이용하여 분비된 양을 측정하였다(도 13).

이의 결과 도 13에 나타난 바와 같이, 노박덩굴 추출물은 ConA에 의한 싸이토카인 분비 증가를 현저히 억제함을 알 수 있었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 셀라스트롤 또는 노박덩굴 추출물은 세포주 및 동물실험에서 우수한 알러지 억제 효과가 있음이 입증되어, 알러지 질환 예방 및 치료용 조성물 제조에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 셀라스트롤이 포함되어 있는 노박덩굴 각 부위의 추출물이 항원 자극에 의한 베타 헥소스아미니데이즈(β-hexosaminidase) 분비 증가에 미치는 영향을 나타낸 그래프,

도 2는 본 발명의 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 베타 헥소스아미니데이즈의 분비 증가에 미치는 영향을 나타낸 그래프,

도 3은 본 발명의 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 활성 산소 증가에 미치는 영향을 나타낸 레이져 스케닝 콘포컬 현미경 사진,

도 4는 본 발명의 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 칼슘 유입에 미치는 영향을 나타낸 그래프,

도 5는 본 발명의 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 ERK, p38 MAPK 등 신호 전달 분자들의 인산화 증가에 미치는 영향을 나타낸 웨스턴 블롯 사진 및 그래프(PD : ERK의 억제제인 PD98059),

도 6은 본 발명의 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 RBL2H3 세포주의 부착능에 미치는 영향을 나타낸 그래프,

도 7은 본 발명의 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 Th2 사이토카인(IL-4 등)의 발현 증가에 미치는 영향을 나타낸 RT-PCR 전기영동 사진,

도 8은 본 발명의 셀라스트롤이 항원 자극에 의한 FcεRI의 신호전달을 억제함을 나타내는 웨스턴 블롯 사진,

도 9는 본 발명의 셀라스트롤이 2, 4-dinitrofluorobenzene(DNFB)를 이용한 아토피 유발 동물 실험에서 아토피 억제 효과가 있음을 나타내는 사진,

도 10은 본 발명의 셀라스트롤이 DNFB를 이용한 아토피 유발 동물 실험에서 아토피 억제 효과가 있음을 조직 염색을 통해 나타낸 현미경 사진,

도 11은 본 발명의 셀라스트롤을 포함하는 노박덩굴 추출물이 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate(PMA)를 이용한 아토피 유발 동물모델에서 아토피 유발에 따른 귀 두께의 증가를 억제함을 나타낸 그래프,

도 12는 본 발명의 셀라스트롤을 포함하는 노박덩굴 추출물이 PMA를 이용한 아토피 유발 동물 실험에서 아토피 억제 효과가 있음을 조직 염색을 통해 나타낸 사진,

도 13은 본 발명의 셀라스트롤을 포함하는 노박덩굴 추출물이 concanavalin A(conA)에 의해 증가되는 인터루킨 5(IL-5), 인터루킨 13(IL-13) 등의 사이토카인 분비증가를 억제함을 나타낸 그래프이다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> A compostion having an effect of curing and preventing allergy disease by containing Celastrol <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of IL-13 <400> 1 gctctcgctt gccttggtgg tc 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of IL-13 <400> 2 catccgaggc cttttggtta cag 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of GM-CSF <400> 3 gcatgtagat gccatcaaag aagc 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of GM-CSF <400> 4 catttctgga ccggcttcca gc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of MIP-2 <400> 5 ctacattggt gcagactgtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of MIP-2 <400> 6 cgtatgtagc aaagatgcag 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of IL-2 <400> 7 ctgtgttgca ctgacgcttg tc 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of IL-2 <400> 8 ctgagtcatt gttgagatga tgc 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of IL-4 <400> 9 accttgctgt caccctgttc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of IL-4 <400> 10 ttgtgagcgt ggactcattc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of Beta-actin <400> 11 taaccaactg ggacgatatg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of Beta-actin <400> 12 atacagggac agcacagcct 20

Claims (9)

1. 셀라스트롤(celastrol)을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 치료용 의약 조성물.
2. 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 치료용 의약 조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 알러지 질환은 아토피성 피부염, 두드러기 또는 알러지성 비염인 것을 특징으로 하는 알러지 질환 예방 및 치료용 의약 조성물.
4. 셀라스트롤을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 개선용 식품 조성물.
5. 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 알러지 질환 예방 및 개선용 식품 조성물.
6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 알러지 질환은 아토피성 피부염, 두드러기 또는 알러지성 비염인 것을 특징으로 하는 알러지 질환 예방 및 개선용 식품 조성물.
7. 셀라스트롤을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 또는 두드러기 예방 및 개선용 화장품 조성물.
8. 노박덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염 또는 두드러기 예방 및 개선용 화장품 조성물.
9. 삭제

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