KR20060123377A - 트리테르펜 조성물의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는 캘러스를 인돌아세트산 및 이들 이외의 식물 호르몬과 함께 배양하고, 배양한 상기 캘러스로부터 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함한 트리테르펜 조성물을 얻는 트리테르펜 조성물의 제조 방법을 제공한다.

Description

트리테르펜 조성물의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING TRITERPENE COMPOSITION}

본 발명은 트리테르펜 조성물의 제조 방법, 트리테르펜 조성물 및 트리테르펜 조성물의 생산에 이용하기 위한 캘러스 (callus) 에 관한 것이다.

코로솔산 (corosolic acid), 토르멘트산 (tormentic acid) 및 마슬린산 (maslinic acid) 이라고 하는 트리테르펜은 각각 혈당값 저하 작용 등의 약리 활성을 나타내는 유용한 물질인 것이 알려져 있고, 천연 식물로부터 추출되는 성분으로서, 이들 트리테르펜이 얻어진 예가 지금까지도 보고되고 있다.

코로솔산을 함유하는 식물로는, 예를 들면 바나바 (Lagerstroemia speciosa) 가 알려져 있고 (예를 들면, 비특허문헌 1), 토르멘트산을 함유하는 식물로는, 예를 들면 황수지 (Tiarella polyphyla) 가 알려져 있으며 (예를 들면, 비특허문헌 2), 마슬린산을 함유하는 식물로는, 예를 들면 올리브 (Olea europasea) 가 알려져 있다 (예를 들면, 특허문헌 1).

특허문헌 1: 국제 공보 03/057224 호 팜플렛

비특허문헌 1:「약리와 치료」, 1999 년, 27 권, 6 호, p. 1075 ~ p. 1077

비특허문헌 2: Archives of Pharmacal Reserch, 한국, 2002 년, 25 권, 1 호, p. 57 ~ p. 60

발명이 해결하려는 과제

그렇지만 식물 중의 트리테르펜의 함유량은 반드시 많은 것은 아니고, 트리테르펜을 효율적으로 얻을 수 있다고는 말할 수 없었다. 더욱이, 인공적으로 재배하는 경우에도 그 생육에는 적어도 수주간 이상의 기간을 필요로 하며, 트리테르펜의 함유량은 기후나 재배지 토양의 영향을 받기 쉽기 때문에 공급 안정성의 점에서도 문제가 있었다.

또, 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산이라는 트리테르펜을 염가로 화학 합성할 수 있는 수법도 알려지지 않았다.

따라서, 본 발명의 목적은 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 트리테르펜을 포함한 트리테르펜 조성물을 안정하고 고효율로 공급할 수 있는 수단을 제공하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

캘러스 배양은 식물로부터 잘라낸 잎, 줄기, 뿌리 등의 부위를 배지 상에서 배양함으로써 유도되는 캘러스를 배양하는 기술이며, 대사 산물의 생합성 기초 연구 등에 이용되는 일이 있다.

본 발명자들은 이 캘러스 배양에서 캘러스를 유도하는 원(原) 식물로서 바나바 (banaba), 비파 (loquat), 자소 (perilla) 또는 구아바 (guava) 를 이용해 유도된 캘러스를 특정한 식물 호르몬과 함께 배양함으로써, 배양된 캘러스 중에 특정 트리테르펜이 고효율로 생산되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 트리테르펜 조성물의 제조 방법은 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는 캘러스를 인돌아세트산 및 이들 이외의 식물 호르몬과 함께 배양하고, 배양한 캘러스로부터 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종의 트리테르펜을 포함한 트리테르펜 조성물을 얻는 제조 방법이다.

본 발명의 트리테르펜 조성물의 제조 방법에서는 캘러스를 계대 배양하는 것이 바람직하다. 캘러스를 계대 배양함으로써, 바나바 등으로부터 유도한 캘러스로부터 새로이 다른 캘러스를 유도하는 일 없이 계속적으로 트리테르펜 조성물을 얻을 수 있다.

캘러스는 잎, 종자, 줄기, 생장점 (莖頂), 뿌리 또는 배세포로부터 유도할 수 있다. 이들 부위로부터 캘러스를 유도함으로써, 보다 단기간에 효율적으로 트리테르펜 조성물을 얻는 것이 가능해진다.

배양한 캘러스에는 마슬린산과, 마슬린산의 중량에 대해서 4 ~ 10 배량의 코로솔산과, 마슬린산의 중량에 대해서 2 ~ 8 배량의 토르멘트산과, 1.5 ~ 4 배량의 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 특히, 혈당값 저하 작용 등의 점에서 유용성이 높은 코로솔산을 고순도로 얻는 것을 용이하게 하기 위해, 마슬린산에 대한 코로솔산의 비율이 높은 것이 중요하다.

본 발명은 또, 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는, 상기 제조 방법에서 이용하기 위한 캘러스를 제공한다. 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는 본 발명의 캘러스는 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산이라는 트리테르펜을 많이 함유한다.

따라서, 상기 제조 방법에 따라 얻어지는 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함한 트리테르펜 조성물이 제공 가능해진다. 이 트리테르펜 조성물은 건강식품, 의약, 화장품 등의 원료로서 이용할 수 있다.

본 발명은 더욱이, 이 트리테르펜 조성물로부터 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 또는 마슬린산 각각의 트리테르펜을 단리, 정제해 얻는 제조 방법을 제공한다. 이 제조 방법을 적용함으로써, 의약품 등에 이용하는 것이 가능한 고순도의 트리테르펜을 고효율로 얻을 수 있다.

발명의 효과

본 발명의 트리테르펜 조성물의 제조 방법에 의하면, 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함한 트리테르펜 조성물을 안정하고 고효율로 공급할 수 있다.

발명을 수행하기 위한 최적 형태

이하에, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해서 상세하게 설명한다.

본 발명의 트리테르펜 조성물의 제조 방법에서는 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 캘러스 (식물 세포로부터 유도된 미분화 세포 덩어리) 를 유도한다.

이들 중에서도 바나바로부터 캘러스를 유도하는 것이 바람직하다. 바나바 (학명：Lagerstroemia speciosa, Linn. 또는 Pers.) 는 미소하기과에 속하는 식물이며, 가로수로서 이용되는 것 외에 그 잎은 필리핀에서 전승 생약으로서 사용되고 있다.

캘러스의 유도에는 천연에서 자생하고 있거나 혹은 인공적으로 재배한 바나바, 비파, 자소 또는 구아바를 이용할 수 있다. 단기간의 배양으로 효율적으로 트리테르펜 조성물을 얻기 위해서, 잎, 종자, 줄기, 생장점, 뿌리 또는 배세포로부터 캘러스를 유도하는 것이 바람직하고, 잎 또는 종자로부터 유도하는 것이 보다 바람직하다. 또, 이들 부위로부터 조제한 원형질체 (protoplast) 로부터 캘러스를 유도해도 된다.

캘러스의 유도는, 예를 들면 바나바 등으로부터 잘라낸 잎 등의 부위를 차아염소산나트륨 등으로 멸균 처리 후, 메스로 적당한 크기로 자르거나 한 후에 배지에 이식해 배양하는 방법을 채용할 수 있다.

캘러스는 고체 배지 또는 액체 배지 중에서 유도할 수 있지만, 린스마이어-스쿠그 (Linsmaier-Skoog) 한천 배지 (이하,「LS 한천 배지」라고 한다.) 등의 고체 배지에서 유도하는 것이 바람직하다.

유도된 캘러스를 인돌아세트산 및 이들 이외의 식물 호르몬을 첨가한 배지에서 배양해 증식시킴으로써, 캘러스 중에 트리테르펜이 많이 생산된다. 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는 캘러스의 배양에서는 식물 호르몬으로서 인돌아세트산 및 이들 이외의 식물 호르몬을 조합해 이용하는 것이 특히 중요하고, 이들 이외의 식물 호르몬만을 이용했을 경우와 비교하여 캘러스 증식 및 상기 캘러스 중에서 트리테르펜의 생산 효율이 현저하게 향상한다.

인돌아세트산과 조합해서 이용되는 인돌아세트산 이외의 식물 호르몬으로는 카이네틴, 1-나프탈렌아세트산, 6-벤질아데닌 등을 들 수 있고, 특히 카이네틴을 매우 적합하게 채용할 수 있다.

또, 캘러스의 배양은 LS 한천 배지 등의 고체 배지에서 무균 하, 20 ~ 30℃, 어두운 곳에서 실시하는 것이 바람직하다.

배양한 캘러스로부터 직접 트리테르펜 조성물을 얻을 수도 있고, 배양한 캘러스의 일부를 다른 새로운 고체 배지 또는 액체 배지에 이식해 재차 배양하여, 즉 계대 배양을 실시한 캘러스로부터 트리테르펜 조성물을 얻을 수도 있다. 계대 배양을 반복해 실시함으로써, 장기적으로 안정하게 트리테르펜 조성물을 얻을 수 있다.

계대 배양은 먼저 배양한 캘러스의 일부를 그대로 이용해 배양해도 되고, 배양한 캘러스의 일부로부터 마이크로플라스트를 조제해, 그 마이크로플라스트를 액체 배지 중에서 현탁 배양시키거나 해도 된다. 계대 배양을 실시하는 조건은, 캘러스를 유도하는 경우의 상기한 조건과 동일한 것이 바람직하다. 또, 계대 배양에 있어서의 1 대의 배양 기간은 5 ~ 30 일간이 바람직하다. 계대 배양은 목적으로 하는 트리테르펜의 캘러스 중에 있어서의 생산량이 현저하게 감소하지 않는 한, 세대를 갱신시키면서 계속할 수 있다.

상기와 같이 배양된 캘러스 중에 생산하는 트리테르펜 중에서도, 코로솔산 및 토르멘트산이 약리 활성 등의 점에서 유용성이 크고, 캘러스 중의 코로솔산 및 토르멘트산의 함유율이 큰 것이 바람직하다. 구체적으로는 마슬린산과 마슬린산의 중량에 대해서 4 ~ 10 배량의 코로솔산과, 2 ~ 6 배량의 토르멘트산과, 1.5 ~ 4 배량의 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산을 포함하는 것이 바람직하다.

특히, 큰 혈당값 저하 작용을 나타내는 코로솔산을 고순도로 얻는 것을 용이하게 하기 위해서, 캘러스 중에서의 마슬린산에 대한 코로솔산의 비율이 높은 것이 중요하다. 코로솔산과 마슬린산은 화학 구조가 지극히 가깝기 때문에, 이 둘을 분리하는 것이 곤란하기 때문이다.

캘러스 중에 포함되는 트리테르펜의 함유량을 정량하는 방법으로는, 배양한 캘러스로부터 메탄올 등을 이용해 추출한 성분을 액체 크로마토그래피로 분석해, 얻어진 크로마토그램의 면적으로부터 정량하는 방법을 매우 적합하게 채용할 수 있다.

배양한 캘러스로부터 공지의 방법을 채용해 추출해 얻은 엑기스는 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산을 많이 함유하는 트리테르펜 조성물이다. 이 트리테르펜 조성물을 건강식품 등의 원료로서 이용할 수도 있고, 더욱 정제해 불필요한 성분을 제거해도 된다.

배양한 캘러스로부터의 추출은, 배양 후의 생 캘러스를 이용해도 되고, 건조시키고 나서 분쇄하는 등 처리한 캘러스를 이용해 실시해도 된다.

추출 용매로는 물 또는 메탄올, 에탄올 등의 알코올 등의 친수성 용매를 이용하는 것이 바람직하고, 가온한 물/알코올 혼합 용매를 이용하는 것이 보다 바람직하다. 구체적으로는 건조한 캘러스의 분쇄화물 (원료) 에 에탄올 또는 에탄올 수용액 (에탄올 함량 50 ~ 80 중량%) 을 원료에 대해서 5 ~ 20 중량배, 바람직하게는 8 ~ 10 중량배 가하고, 상온 ~ 90℃, 바람직하게는 약 50 ~ 85℃ 의 온도에서 30 분 ~ 2시간 가열 환류해, 이 추출을 2 ~ 3 회 반복하는 방법을 매우 적합하게 채용할 수 있다.

상기와 같이 해 얻어지는 트리테르펜 조성물로부터 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 또는 마슬린산을 단리, 정제해 각각의 트리테르펜을 얻을 수도 있다. 이들 트리테르펜의 단리와 정제는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피나 재결정 등의 방법에 따라 실시할 수 있다.

트리테르펜 조성물의 양이 많은 경우에는, 트리테르펜 조성물을 물에 현탁하고 에테르나 헥산 등에 분배해 저극성 성분을 제외하고 나서, 수층을 다이아이온 HP-20 컬럼 크로마토그래피 등을 이용해 물, 메탄올 및 아세톤으로 차례차례 용출해, 메탄올 용출 회분을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 등으로 분리, 정제를 실시하는 것이 바람직하다.

또, 단리, 정제해 얻어지는 트리테르펜의 순도를 높이기 위해서, 트리테르펜 조성물 중의 트리테르펜의 수산기를 아세틸화하거나 카르복실기를 메틸에스테르화한 상태로 컬럼 크로마토그래피나 재결정 등에 의한 정제를 실시한 후 가수분해해, 원하는 트리테르펜을 얻는 방법도 매우 적합하게 채용할 수 있다.

상기와 같이 단리, 정제해 얻어지는 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 또는 마슬린산은 각각 일종의 트리테르펜을 적어도 90.0 중량% 이상 포함하는 것이며, 98.0 중량% 이상 포함하는 것이 보다 바람직하고, 99.9 중량% 이상 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 트리테르펜 조성물은 상술한 방법에 따라 얻어지며, 하기 화학식 1 로 나타내는 코로솔산, 하기 화학식 2 로 나타내는 토르멘트산, 하기 화학식 3 으로 나타내는 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 하기 화학식 4 로 나타내는 마슬린산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함한 트리테르펜 조성물이다.

이들 트리테르펜을 포함한 트리테르펜 조성물은 각각 혈당값 저하 작용이나 항종양 활성 등의 약리 활성을 가지는 것이 알려져 있어, 건강식품이나 의약 등의 원료로서 이용할 수 있다. 또, 이들 트리테르펜 중에서도, 약리 활성이 강한 코로솔산 및 토르멘트산을 포함하고 있는 트리테르펜 조성물이 특히 유용성이 높다.

이하에서 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

(캘러스의 유도)

바나바로부터 잘라낸 잎을 차아염소산나트륨에 15 분간 침지해 멸균 처리했다. 식물 호르몬으로서 인돌아세트산 10μM 및 카이네틴 10μM 를 가하고, pH 를 5.8 로 한 LS 한천 배지를 삼각 플라스크 중에 조제해 두고, 거기에 멸균 처리한 바나바의 잎을 치상(置床)해, 25℃, 어두운 곳에서 배양함으로써 캘러스가 유도되었다.

또, 유도된 캘러스를 30 일간 배양한 후, 캘러스의 일부를 다른 LS 한천 배지에 이식해 배양했는데, 이식한 캘러스가 다시 증식하는 것이 확인되었다. 즉, 바나바로부터 유도한 캘러스의 계대 배양을 실시할 수 있었다.

(캘러스의 배양 및 캘러스 중의 트리테르펜 함유량)

유도된 캘러스를 인돌아세트산 10μM 및 카이네틴 10μM 를 가한 LS 한천 배지에서 3 주간 배양해 증식시키고, 증식한 캘러스를 메탄올에 냉침하여 추출한 성분에 대해서 고속 액체 크로마토그래피 분석을 실시함으로써 얻은 크로마토그램 (자외선 흡광 광도계, 검출 파장: 220 nm) 에 있어서의 각 트리테르펜에 대응하는 피크 면적으로부터, 배양한 캘러스의 트리테르펜 함유량을 구했다. 또, 캘러스 유 도 전의 원 식물 (바나바잎) 중의 트리테르펜 함유량도 같은 방법으로 구했다. 결과를 표 1 에 나타낸다.

캘러스 중의 코로솔산의 함유량은 원 식물에 대해 약 10 배로 증가했다. 또, 원 식물 중에는 검출되지 않았던 토르멘트산 및 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산은 캘러스를 유도함으로써 처음으로 생산되는 것을 알 수 있었다.

한편, 식물 호르몬으로서 인돌아세트산만, 또는 카이네틴만을 각각 가한 LS 한천 배지나, 식물 호르몬을 가하지 않은 LS 한천 배지에서 캘러스의 배양을 시도했지만, 이러한 경우에는 캘러스의 실질적인 증식은 적었다.

Claims (18)

1. 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는 캘러스를 인돌아세트산 및 이들 이외의 식물 호르몬과 함께 배양하고, 배양한 상기 캘러스로부터 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함한 트리테르펜 조성물을 얻는 트리테르펜 조성물의 제조 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 배양이 상기 캘러스의 계대 배양인 트리테르펜 조성물의 제조 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 캘러스가 바나바, 비파, 자소 또는 구아바의 잎, 종자, 줄기, 생장점, 뿌리 또는 배세포로부터 유도되는 캘러스인 트리테르펜 조성물의 제조 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,

   배양한 상기 캘러스가 마슬린산과, 마슬린산의 중량에 대해서 4 ~ 10 배량의 코로솔산과, 2 ~ 6 배량의 토르멘트산과, 1.5 ~ 4 배량의 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산을 포함하는 트리테르펜 조성물의 제조 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 트리테르펜 조성물의 제조 방법에 따라 얻어지는 코로솔산, 토르멘트산, 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산 및 마슬린산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함한 트리테르펜 조성물.
6. 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는, 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 트리테르펜 조성물의 제조 방법에서 이용하기 위한 캘러스.
7. 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는 캘러스를 인돌아세트산 및 이들 이외의 식물 호르몬과 함께 배양하고, 배양한 상기 캘러스로부터 코로솔산을 포함한 트리테르펜 조성물을 수득하여, 상기 트리테르펜 조성물로부터 코로솔산을 얻는 코로솔산의 제조 방법.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 배양이 캘러스의 계대 배양인 코로솔산의 제조 방법.
9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,

   상기 캘러스가 바나바, 비파, 자소 또는 구아바의 잎, 종자, 줄기, 생장점, 뿌리 또는 배세포로부터 유도되는 캘러스인 코로솔산의 제조 방법.
10. 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는 캘러스를 인돌아세트산 및 이들 이외의 식물 호르몬과 함께 배양하고, 배양한 상기 캘러스로부터 토르멘트산을 포함한 트리테르펜 조성물을 수득하여, 상기 트리테르펜 조성물로부터 토르멘트산을 얻는 토르멘트산의 제조 방법.
11. 제 10 항에 있어서,

    상기 배양이 캘러스의 계대 배양인 토르멘트산의 제조 방법.
12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,

    상기 캘러스가 바나바, 비파, 자소 또는 구아바의 잎, 종자, 줄기, 생장점, 뿌리 또는 배세포로부터 유도되는 캘러스인 토르멘트산의 제조 방법.
13. 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는 캘러스를 인돌아세트산 및 이들 이외의 식물 호르몬과 함께 배양하고, 배양한 상기 캘러스로부터 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산을 포함한 트리테르펜 조성물을 수득하여, 상기 트리테르펜 조성물로부터 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산을 얻는 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산의 제조 방법.
14. 제 13 항에 있어서,

    상기 배양이 캘러스의 계대 배양인 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12- 엔-28-산의 제조 방법.
15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,

    상기 캘러스가 바나바, 비파, 자소 또는 구아바의 잎, 종자, 줄기, 생장점, 뿌리 또는 배세포로부터 유도되는 캘러스인 2α,19α-디히드록시-3-옥소-우르스-12-엔-28-산의 제조 방법.
16. 바나바, 비파, 자소 또는 구아바로부터 유도되는 캘러스를 인돌아세트산 및 이들 이외의 식물 호르몬과 함께 배양하고, 배양한 상기 캘러스로부터 마슬린산을 포함한 트리테르펜 조성물을 수득하여, 상기 트리테르펜 조성물로부터 마슬린산을 얻는 마슬린산의 제조 방법.
17. 제 16 항에 있어서,

    상기 배양이 캘러스의 계대 배양인 마슬린산의 제조 방법.
18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,

    상기 캘러스가 바나바, 비파, 자소 또는 구아바의 잎, 종자, 줄기, 생장점, 뿌리 또는 배세포로부터 유도되는 캘러스인 마슬린산의 제조 방법.