KR20160093040A

KR20160093040A - 탑시아 세포 현탁 배양에 의한 탑시가르긴의 생산

Info

Publication number: KR20160093040A
Application number: KR1020167017320A
Authority: KR
Inventors: 길버트 고르; 하랄드 헥켄뮐러; 젠스 스테판 윌키; 데이비드 알렉산더 울리쉬; 얀트리 데비 상카르-토마스
Original assignee: 파이톤 홀딩스, 엘엘씨
Priority date: 2013-12-02
Filing date: 2014-12-02
Publication date: 2016-08-05
Also published as: EP3077523B1; DK3077523T3; AU2017202062A1; JP2016538887A; US20160312255A1; US10822628B2; AU2014358838B2; AU2014358838A1; HK1223979A1; CA2930767A1; CN105992823A; ES2806553T3; WO2015082978A1; CA2930767C; EP3077523A1

Abstract

본 발명은 탑시가르긴 과(thapsigargin family)의 세스퀴터펜 락톤(sesquiterpene lactones) 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 현탁 세포 배양에서 영양 배지에 탑시아 속(genus Thapsia)의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과(thapsigargin family)의 세스퀴터펜 락톤(sesquiterpene lactones) 중 하나 이상을 생산하며; (b) 상기 (a)에서 생산된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 회수하는 단계. 또한, 본 발명은 탑시아 속(genus Thapsia)의 식물 세포를 포함하는 현탁 세포 배양물에 관한 것이고, 상기 식물 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산할 수 있으며, 또한, 상기 현탁 세포 배양물로부터 획득된 탑시아 속의 식물 세포를 포함하는 식물 세포 바이오매스에 관한 것이다.

Description

탑시아 세포 현탁 배양에 의한 탑시가르긴의 생산{PRODUCTION OF THAPSIGARGINS BY THAPSIA CELL SUSPENSION CULTURE}

본 발명은 탑시가르긴 과(thapsigargin family)의 세스퀴터펜 락톤(sesquiterpene lactones) 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 현탁 세포 배양에서 영양 배지에 탑시아 속(genus Thapsia)의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과(thapsigargin family)의 세스퀴터펜 락톤(sesquiterpene lactones) 중 하나 이상을 생산하며; (b) 상기 (a) 단계에서 생산된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 회수하는 단계. 또한, 본 발명은 탑시아 속(genus Thapsia)의 식물 세포를 포함하는 현탁 세포 배양물에 관한 것이고, 상기 식물 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산할 수 있으며, 또한, 상기 현탁 세포 배양물로부터 획득된 탑시아 속의 식물 세포를 포함하는 식물 세포 바이오매스에 관한 것이다.

본 명세서에서, 특허 출원 및 제조 매뉴얼을 포함한 다수의 문헌들이 참조된다. 이들 문헌의 개시 내용은, 본 발명의 특허성에 대한 관련성을 고려하지 않으면서 그 전체가 참조로 인용된다. 보다 구체적으로는, 모든 참고 문헌은 각각의 개별 문헌이 특별히 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되더라도, 동일한 범위로 참고로 인용된다.

식물은 의약품을 포함한 넓은 범위의 화학 물질을 포함한다. 많은 경우 이러한 이차 대사 산물의 약학적 활성이 조사되고 있다. 가장 두드러진 예는 주목(Taxus) 속 구성원(member)으로 확인된 항암제 파클리탁셀 화합물이다. 수 년 전부터, 활성 약학적 성분으로서 파클리탁셀을 함유하는 제품들이 시판되고 있다. 파클리탁셀은 많은 암세포의 특징인 빠른 세포 성장을 나타내는 과증식된 인간 세포를 효과적으로 사멸시키는 것으로 나타났다.

세스퀴터펜 락톤의 화학 계열에 속하는 천연 탑시가르긴이, 이들의 세포 사멸 유도 활성에 대해 연구되었다. 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤의 구성원이 증식 독립적 방식으로 세포사멸 유도제(apoptosis inducers)의 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 탑시가르긴 과의 특징적인 구성원인 탑시가르긴(도 1)이 SERCA(sarco-endoplasmic reticulum calcium transport ATPase) 과의 특이 억제제인 것이 발견되었으며, 이는 암과의 싸움에 이용 가능하다는 것을 제시한다. 탑시가르긴이 암세포, 예컨대, 전립선 암세포를 타겟팅하기 위해서는, 암세포 특이적 단백질 분해 효소, 예컨대, PSA(prostate specific antigen)에 대하여 선택적인 기질로 작용하는 펩타이드에 결합될 수 있다[SB Christensen et al. 2009, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry; 9: 276-294]. 현재, 이러한 세포 독성 화합물인 탑시가르긴을 포함하는 소위 프로드로그(prodrug)가 임상 개발 중이다.

탑시가르긴 과의 구성원은 일반적으로 탑시아 속의 식물, 예컨대, 탑시아 가르가니카(Thapsia garganica), 탑시아 트랜스타가나(Thapsia transtagana) 및 탑시아 빌로사(Thapsia villosa) 또는 표 2에 기재된 임의의 탑시아 식물로부터 분리된다. 탑시아 속의 다양한 구성원에서 탑시가르긴의 분포는 다를 수 있다. 가장 두드러진 화합물인 탑시가르긴은 원래 탑시아 가르가니카로부터 분리되었지만 탑시아 속의 다른 구성원에서도 발견된다.

경제적으로 저렴한 가격으로 화학적 합성을 할 수 없는 이러한 화합물의 복잡한 화학 구조 때문에 현재 탑시아 가르가니카 식물은 화합물 탑시가르긴을 위한 유일한 상업적으로 이용가능한 소스이다. 가치있는 식물-유래 이차 대사 산물의 생산을위한 체외 배양은 대체 소스로서 인정받고 있다. 체외 배양의 확장성은 지속 가능한 방식으로 대량으로 목적 화합물의 상업적 공급과 자연 환경으로부터 독립적일 수 있도록 한다.

Jager 등[1993; Plant Cell Reports: 12, 517-520]은 탑시가르긴의 생산을 위한 대체 소스로서 체외에서 자라는 탑시아 종을 조사하였다. 고체 배지, 즉, 녹색 자엽 배아, 싹 및 뿌리에서 자라는 다양한 체외 식물 재료를 조사한 경우, 이들은 상기 식물 재료에서 펜타옥시게네이션화된(pentaoxygenated) 탑시가르긴 노르트리로볼리드(nortrilobolid) 및 트리로볼리드(trilobolid)를 확인하였다. 그러나, 헥사옥시게네이션화된(hexaoxygenated) 탑시가르긴은 확인되지 않았다. 또한, Smitt 등이 참조된다(1996; Smitt, UW, Jager, AK, 및 Nyman, U; XXIV Thapsia garganica L.: In vitro culture, somatic embryogenesis, and the production of Thapsigargins; In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol 37; Medicinal and Aromatic Plants IX (ed. By YPS Bajaj); Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1996].

또한, 고체 배지 또는 현탁 배양물에서 캘러스, 사전배발생(proembryogenic) 클러스터 또는 구형 단계 배아와 같은 다른 체외 재료를 사용하는 경우, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤은 전혀 확인되지 않았다.

따라서, 탑시가르긴의 생산을 위한 식물 세포 배양을 정립하는 방법에 많은 노력이 투자되었음에도 불구하고, 지금까지 식물 세포 배양에서 이들 화합물의 경제적이고 용이한 생산, 특히 대규모 접근 방식에 적합한 배양을 가능하게 하는 어떠한 방법도 존재하지 않았다. 따라서, 이러한 방법 및 세포 배양물을 제공할 필요성이 여전히 존재한다.

이러한 필요성은 특허 청구 범위에 특정된 구현예를 제공함으로써 해결된다.

본 발명은 식물 세포 배양물로부터 탑시가르긴 과 세스퀴터펜 락톤을 생산하는 다양한 방법을 제공한다. 본 발명의 목적은 현탁 배양물로부터 상업적으로 유의한 양의 최종 산물을 얻는 것이다.

따라서, 본 발명은, 하나 이상의 탑시가르긴을 생산하는 세포 배양물을 형성하는 영양 배지에 탑시아 속의 식물 세포를 배양하고, 하나 이상의 탑시가르긴을 회수하여, 현탁 세포 배양물로부터 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산하는 방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 식물 세포는 탑시아(Thapsia) 세포이다. 더욱 바람직하게는, 상기 식물 세포는 탑시아 가르가니카(Thapsia garganica ), 탑시아 빌로사(Thapsia villosa ), 탑시아 트랜스타가나(Thapsia transtagana ), 탑시아 짐네시카(Thapsia gymnesica ), 탑시아 막시마(Thapsia maxima), 탑시아 데쿠스사테(Thapsia decussate), 탑시아 라시니아타(Thapsia laciniata ), 아종/변종(sub-species/varieties)인 탑시아 가르가니카 ssp. 데쿠스사타 var. 안구스타(Thapsia garganica ssp . decussata var. angusta ), 탑시아 빌로사 Var. 디스섹타(Thapsia villosa Var . dissecta ), 탑시아 빌로사 Var. 미크로카르파(Thapsia villosa Var . microcarpa) 및 탑시아 빌로사 Var. 스테노프테라(Thapsia villosa Var . stenoptera)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더욱 바람직하게는, 상기 세포는 미분화 세포, 역-분화 세포 또는 세포 분열 세포 또는 이들의 혼합물이나, 배발생 세포는 아니다.

또한, 상기 식물 세포는 성장 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 상기 성장 배지는 1 주일에 최소 50%의 성장 증가를 유도 할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 식물 세포는 생산 배지에서 배양한다. 보다 더욱 바람직하게는, 식물 세포들은 성장 배지에서 배양되고 이어서 생산 배지에서 배양된다. 바람직하게는, 성장 및 생산 배지는 상이하다. 또한, 성장 배지는 식물 성장 조절제 2,4-D를 포함하지 않고/또는 생산 배지는 식물 성장 조절제 2,4-D를 포함하지 않는 것이 바람직하다.

도면을 보여준다:
도 1: 탑시가르긴 과의 헥사옥시게네이티드 세스퀴터펜 락톤의 일반적 핵심 구조, 치환기 R1 및 R2의 자세한 요약은 표 1을 참조한다.
도 2: 탑시가르긴의 분자 구조.
도 3: UPLC/MS로 분석한 비-배발생 현탁 세포 배양물로부터 유래된 탑시아 가르가니카 바이오매스 샘플 및 탑시가르긴 기준의 UPLC-MS/MS-스펙트럼. 탑시가르긴의 모(mother) 이온(m/z=668; M+NH₄ ⁺)으로부터 획득된 두 딸 이온(첫 번째(기준) 및 세 번째(샘플) 그래프 m/z=491 및 두 번째(기준) 및 네 번째(샘플) 그래프 m/z=551)은 비-배발생 현탁 세포 배양물로부터 유래된 샘플에서의 노이즈 수준 이상으로 검출되었다.

본 발명은 탑시가르긴 과(thapsigargin family)의 세스퀴터펜 락톤(sesquiterpene lactones) 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 현탁 세포 배양에서 영양 배지에 탑시아 속(genus Thapsia)의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과(thapsigargin family)의 세스퀴터펜 락톤(sesquiterpene lactones) 중 하나 이상을 생산하며; (b) 상기 (a) 단계에서 생산된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 회수하는 단계.

본 명세서에서 용어 "탑시가르긴(thapsigargin)"과 상호 교환적으로 이용되는 용어 "탑시가르긴 과(thapsigargin family)의 세스퀴터펜 락톤(sesquiterpene lactones)"은, 2β,3α,7β,8α,10β,11α-헥사옥시게네이티드(hexaoxygenated)-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스(guaianolide nucleus), 즉, 헥사옥시게네이티드 탑시가르긴(도 1), 또는 3α,7β,8α,10β,11α-펜타옥시게네이티드(pentaoxygenated)-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스(guaianolide nucleus), 즉, 펜타옥시게네이티드 탑시가르긴을 포함하는 구아이아놀라이드(guaianolide) 상과(superfamily)의 임의의 구성원을 의미한다. 탑시가르긴 과 세스퀴터펜 락톤의 특징은 락톤 고리의 트랜스-어닐레이션(annelation)을 야기하는 7β-하이드록시 그룹이다. 탑시가르긴 과의 비-제한적인 구성원은, 탑시가르긴(도 2), 탑시가르기친(thapsigargicin), 탑시트랜스타긴(thapsitranstagin), 탑시빌로신(thapsivillosin) A, 탑시빌로신 B, 탑시빌로신 C, 탑시빌로신 D, 탑시빌로신 E, 탑시빌로신 G, 탑시빌로신 H, 탑시빌로신 I, 탑시빌로신 J 및 탑시빌로신 K처럼 O(2) 및 O(8)에 부착되는 아실 그룹의 구조가 상이한 헥사옥시게네이티드 탑시가르긴, 및 트리로볼리드(trilobolide), 노르트리로볼리드(nortrilobolide) 및 탑시빌로신 F처럼 O(8)에 부착되는 아실 그룹의 구조가 상이한 펜타옥시게네이티드 탑시가르긴이다[Christensen et al. 1997; 129-167; in Progress in the Chemistry of Organic Natural Compounds; Ed. Herz, Kirby, Moore, Steglich and Tamm; Springer-Verlag Wien; ISBN 3-211-82850-8].

[표 1]

예시적인 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤. 화학 초록 서비스에 의해 할당된 CAS 등록 번호는 가능한 경우 표시된다. Christensen 등 에 따라 Oct = octanoic acid, But = butyric acid, Hex = hexanoic acid, 2-MeBut = 2-methylbutyric acid, 6-MeOct = 6-methyloctanoic acid, Sen = senecioic acid, Ang = angelic acid, 6-MeHep = 6-methylheptanoic acid, iVal = Isovaleric acid 3-methylbutanoic acid이다[SB Christensen et al. 2009, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry; 9: 276-294]

바람직하게는, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤은 탑시아 세포에서 생산될 수 있는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤이다. 더욱 바람직하게는 탑시아 세포에서 생산될 수 있는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤은 화합물 탑시가르긴이다.

또한, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤은 치료 활성을 보유하거나 또는 생체 활성 화합물을 수득하기 위해 변형될 수 있는 것이 바람직하다. 생체 활성 화합물은, 예를 들어 [US 7468345]에 기재된 바와 같이, 그들이 타겟팅하는 펩티드에 융합되는 치료 활성을 보유하는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 구현예에서, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 자체는 치료 활성을 보유하고, 예를 들어, 프로테아제에 의해 인간 또는 동물 신체의 환경에서 특이적으로 절단되는 타겟팅하는 펩티드에 융합하여 인간 또는 동물 신체의 특정 환경에서 타겟팅될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 포함은, 구체적으로 언급된 단계들 및/또는 구성 요소에 추가적인 단계들 및/또는 구성 요소를 추가로 포함될 수 있음을 나타낸다. 그러나, 이러한 용어는 청구된 목적-물이 정확하게 기재된 단계들 및/또는 구성 요소로 이루어지는 것을 포함한다.

본 발명에 따르면, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤을 생산하는 세포를 배양하여 상기 정의된 바와 같은 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산한다. 용어 "탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤을 생산하는 세포"는 배양 조건 중 최소 하나의 세트 하에서 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산할 수 있는 임의의 세포를 의미한다. 본 발명에 따르면, 상기 "탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤을 생산하는 세포"는 본 발명의 방법에서 정의한 바와 같은 배양 조건 하에서 검출 가능한 양의 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산하는 세포이다.

본 발명의 방법에 따르면, 세포 배양물은 탑시아 속의 세포를 포함한다. 탑시아 속의 식물은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 탑시아 가르가니카(Thapsia garganica), 탑시아 빌로사(Thapsia villosa ), 탑시아 트랜스타가나(Thapsia transtagana ), 탑시아 짐네시카(Thapsia gymnesica ), 탑시아 막시마(Thapsia maxima), 탑시아 데쿠스사테(Thapsia decussate), 탑시아 라시니아타(Thapsia laciniata), 아종/변종(sub-species/varieties)인 탑시아 가르가니카 ssp. 데쿠스사타 var. 안구스타(Thapsia garganica ssp . decussata var. angusta ), 탑시아 빌로사 Var. 디스섹타(Thapsia villosa Var . dissecta ), 탑시아 빌로사 Var. 미크로카르파(Thapsia villosa Var . microcarpa) 및 탑시아 빌로사 Var. 스테노프테라(Thapsia villosa Var . stenoptera)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 배양물의 식물 세포는 탑시아 가르가니카 세포, 탑시아 짐네시카 세포 및 탑시아 빌로사 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 세포 배양물은 탑시아 가르가니카 세포를 포함한다.

[표 2]

탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤의 생산에 유용한 예시적인 세포 종(species).

예를 들어, 한 종류의 세포들 및 동일한 현탁 세포 배양물은 종, 아종, 변종 또는 주(strain) 중 하나 이상이 될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 한 종류의 종이고, 더욱 바람직하게는 한 종류의 아종이며, 보다 더욱 바람직하게는 한 종류의 변종이고, 가장 바람직하게는 한 중류의 주이다.

현탁 세포 배양을 개시하는 데 사용되는 식물 조직은 임의의 식물 조직일 수 있고, 바람직하게는 조직, 예를 들면, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 특정 하나 이상의 생산에 유리한 능력에 기초하여 선택된 조직이다. 현탁 배양 개시에 사용하기 위한 조직의 비 제한적인 예로는 식물 파트, 예컨대, 미리 생성된 캘러스로부터 얻은 뿌리, 잎, 줄기, 분열 조직 또는 세포이고. 바람직하게는 무른 캘러스 재료이다. 식물 세포는 식물 또는 동결보존된 세포로부터 직접 얻어진 세포일 수 있다.

본 방법은 영양 배지에서 현탁 배양물을 배양하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 방법은 영양 배지에서 현탁 배양물을 배양하는 하나 이상의 단계를 포함할 수있다.

본 발명에 따르면, 영양 배지가 사용된다. 본 명세서에 사용된 용어 "영양 배지"는 식물 세포 캘러스 및/또는 현탁 배양물의 배양에 적합한 배지를 의미한다. 용어 "영양 배지"는, "성장 배지" 및 "생산 배지"를 모두 포함한다. 용어 "성장 배지"는 배양된 세포의 성장에 유리한 영양 배지를 말한다. 바람직한 구현예에서, 성장 배지는 1 주일에 최소 50%의 성장 증가를 제공한다. 바람직하게는, 배타적인 것은 아니지만, 성장 증가는 건조 중량을 기준으로 결정된다. 더욱 바람직하게는, 성장 증가는 신선 중량에 따라 측정된다. 본 발명에 따르면, "생산 배지"는, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상의 생산에 유리한 영양 배지이다. 또한 성장은 생산 배지에서 이루어질 수 있고, 생산은 성장 배지에서 이루어질 수 있으며, 따라서, 성장 및 생산 배지가 동일할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 그러나, 보다 바람직하게는, 생산 배지는 사용될 성장 배지보다 훨씬 더 타겟 화합물의 생산에 유리한 경우 선택된다.

당업계에는 일반적으로 탄소 대 무기 성분, 예를 들어 질소 및 포스페이트의 균형잡힌 또는 비교적 낮은 비율이 세포 성장에 도움이 되는 반면, 탄소 대 무기 성분의 비교적 높은 비율은 세포 성장을 제한한다는 것이 잘 공지되어 있다. 따라서, 생산 배지는 세포 성장과 반대로 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 생산을 촉진하기 위해 성장 제한 조건, 예를 들어 탄소 대 무기 성분의 높은 비율을 이용할 수 있다. 예를 들어, Majerus F. & Pareilleux A.을 참조한다["Alkaloid accumulation in Ca-alginate entrapped cells of Catharanthus roseus: Using a limiting growth medium", Plant Cell Reports (1986) 5: 302-305].

영양 배지는 당업계에 잘 확립되어 있고, 예를 들어, MS(Murashige and Skoog Basal Salts), SH(Schenk and Hildebrandt Basal Salts) 또는 B5(Gamborg)에 따른 화합물 조성을 기초로 할 수 있다.

예시적인 생산 배지(PM)로는, 염 염기 (예를 들어, MS 또는 SH) + 다량영양소, 미량영양소, 비타민, 및 탄소원, 바람직하게는 수크로오스를 함유하는 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

이용되는 수크로오스의 바람직한 양은, 0.01% 및 10% 사이, 보다 바람직하게는 0.05 및 8.% 사이, 보다 바람직하게는 0.5 및 6% 사이, 예를 들어, 1% 및 4% 사이이고, 가장 바람직한 양은 약 3%이다. 수크로오스는 예를 들어, Sigma Aldrich, Carl Roth 및/또는 VWR로부터 획득할 수 있다. 사용되는 질소의 바람직한 양은 0.1% 및 10% 사이, 보다 바람직하게는 0.5 및 5% 사이, 예를 들어, 1% 및 3% 사이이고, 가장 바람직하게는 2.63%이다. 질소는 질산염 암모늄 및 아미노산으로부터 얻을 수 있다.

예시적인 성장 배지로는 염 염기 (예를 들어, MS 또는 SH 또는 B5) + 탄소원, 바람직하게는 수크로오스를 함유하는 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

이용되는 수크로오스의 바람직한 양은, 0.01% 및 6% 사이, 보다 바람직하게는 0.1 및 5% 사이, 예를 들어, 1% 및 3% 사이이고, 가장 바람직한 양은 약 2%이다. 수크로오스는 예를 들어, Sigma Aldrich, Carl Roth 및/또는 VWR로부터 획득할 수 있다. 사용되는 질소의 바람직한 양은 0.1% 및 10% 사이, 보다 바람직하게는 0.5 및 5% 사이, 예를 들어, 1% 및 3% 사이이고, 가장 바람직하게는 2.63%이다. 질소는 질산 암모늄 및 아미노산으로부터 얻을 수 있다.

따라서 바람직한 성장 배지는 염 염기 (예를 들어, MS 또는 SH 또는 B5) + 2% 수크로오스를 함유한다.

적당한 영양분과 반응 조건이 사용되는 경우, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤을 생산하는 현탁 배양물은 빠른 성장율 및 높은 세포 밀도를 가질 수 있다. 본 기술 분야에서 본 명세서에서 사용 가능한 제공된 지침의 관점에서, 당업자는 세포주 사이에서 상이할 것으로 예상될 수 있는, 배지 조건을 쉽게 조합, 변경 및 조작할 수 있다.

식물 현탁 배양물에서 이차 대사 산물의 생산은 식물 성장 조절제에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 마찬가지로, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 생산을 위한 배양 배지에서, 식물 성장 조절제 물질을 생략하거나 또는 함량을 낮추는 것은 생산을 향상시킬 수 있다. 선택된 식물 성장 조절제에 의한 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤의 향상은 어려움 없이 당업자에 의해 실험적으로 확인될 수 있다.

탑시가르긴의 생산 속도는 단일 속도 제한 단계가 아니라 다수의 제한 인자 사이의 복잡한 상호작용에 의해 결정된다. 제한 인자 중의 임의의 하나의 완화가 탑시가르긴의 생산을 향상시킬 것이지만, 향상의 규모는 특정 제한이 완화된 후 탑시가르긴 생산에서의 다른 단계의 상대적인 제한 효과를 결정하는 특정 배양 조건에 따라 결정될 것이다. 다양한 제한 인자 사이의 상호작용에 영향을 주는 배양 조건은 세포의 유전자 구성, 배양 배지의 조성, 및 온도를 포함한다.

식물 성장 조절제는 일반적으로 식물 문헌에서 알려진 다양한 물질을 포함한다. 이들 중에서, 탑시아 현탁 배양에 적합한 성장 조절제는 옥신 및/또는 시토키닌-유사 화합물, 예를 들면, 인돌 아세트산, 인돌부티릭 산, NAA(naphthalene acetic acid), 피클로람, 디캄바, 벤질아미노푸린, 키네틴, 제아틴, 티디아주론 및 인돌 아세트산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 아미노산은 세포에 의해 이용되는 임의의 천연 또는 합성 아미노산을 포함하며, 예를 들어, 글루타민, 글루탐산 및 아스파라긴산이다. 이들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 첨부된 실시예에 나타낸 바와 같이, 디캄바, 벤질아미노푸린 및 티디아주론의 조합이 사용된다.

식물 성장 조절제인 2,4-디클로로페녹시아세트산이 탑시아 현탁 배양에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으므로, 비-배발생 단계에서의 식물 세포를 유지하기 위해서는 2,4-디클로로페녹시아세트산이 제거된 영양 배지가 가장 바람직하다.

또한, 세포 배양에서 산화 갈변을 감소시키거나 방지하는 것이 바람직하다. 따라서, 항갈변제는 페놀계 삼출액의 산화를 억제하기 위해 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 현탁 배양물은 배아 세포보다 갈변에 덜 민감한 미분화된 세포이다.

이들 배지 성분에 대해 제안된 농도 범위가 하기에 제공되나, 통상적인 최적화는 특정 세포주 및/또는 특정 배양 조건에 대한 이들 범위 외의 바람직한 조건을 입증할 수 있다. 모든 농도는 첨가 후에 세포외 배지 내의 초기 값의 평균을 의미한다. 공급 용액 내의 농도 및 따라서 국소적으로 세포와 접촉하는 농도는 표시된 것보다 높을 수 있다. 제제의 특정 성분의 농도 또는 배양 부피의 일부 분획을 기반으로 세포 내 물질을 함유하는 제제를 첨가할 수 있다.

식물 성장 조절제는 약 0.001 μmol/L 내지 약 2 mmol/L, 바람직하게는 약 0.01 μmol/L 내지 약 1 mmol/L의 농도로 사용될 수 있다.

아미노산은 약 1 μmol/L 내지 약 20 mmol/L, 바람직하게는 약 10 μmol/L 내지 약 10 mmol/L의 농도로 사용될 수 있다.

가이드로써 이러한 제안된 농도를 사용하는 통상적인 최적화를 통해 어떤 성분, 또는 성분의 조합, 및 상기 제안된 범위를 벗어난 농도를 포함하여 어떤 농도가 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 생산의 최대화에 유용할 것인지 파악할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 세포는 먼저 성장 배지에서 배양된 후, 상기 세포는 성장 배지와 상이한 생산 배지에서 배양된다. 또한, 성장 배지는 바람직하게는 무기 또는 유기 질소, 예를 들어 아미노산의 공급원을 포함한다. 세포가 성장 배지로부터 생산 배지로 옮겨질 때, 생산 배지는 바람직하게는 보다 높은 수준의 탄소 공급원 및/또는 C:N 비, 예를 들어 보다 높은 농도의 사카라이드를 갖는다. 또한, 생산 배지는 바람직하게는 무기 또는 유기 질소, 예를 들어 아미노산의 공급원을 포함한다. 또한, 영양 배지의 다른 성분은 세포 및 배지가 처음 접촉한 후 배양물 내에 도입될 수 있다. 하나의 구현예에서, 이들 성분, 예를 들어 추가의 사카라이드는 필요한 바에 따라 간헐적으로 또는 연속적으로 공급 스트림에 공급된다.

본 발명의 방법은 성장 배지에서 세포를 배양하는 하나 이상의 단계 및/또는 생산 배지에서 세포를 배양하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

일반적인 세포 배양 조건은 당업계에 공지되어 있으며 목적하는 효과, 예를 들면, 성장 또는 생산은 하나 이상의 영양소 또는 다른 제제의 농도를 추가, 제거, 또는 변경하여 상술한 배지의 조건을 조작함으로써 달성될 수 있다고 알려져 있다. 또한, 배지 구성 요소의 변경 외에, 다른 반응 조건을 변경하여 원하는 결과를 획득할 수 있으며, 예를 들면, 온도 및 pH를 포함하나 이에 제한되지 않는 조건을 변경하거나 또는 이들 조건의 임의의 조합을 변경하는 것이다.

예를 들어, 온도 범위를 조정할 수 있다. 바람직한 온도는 약 0℃ 내지 약 40℃를 포함하고, 보다 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 35℃이며, 보다 더욱 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 30℃이다. 보다 더욱 바람직하게는, 세포 배양 조건은 진탕 조건을 포함하며, 바람직하게는 약 40 rpm 내지 약 350 rpm이며, 보다 바람직하게는 약 80 rpm 내지 약 200 rpm, 예를 들어, 약 100 rpm 및 약 150 rpm 사이이고, 보다 더욱 바람직하게는 약 130 rpm이며, 가장 바람직하게는 진탕 빈도는 130 rpm이고, 약 23℃ 내지 27℃ 온도, 바람직하게는 약 25℃의 암실이다. 또한, 세포 배양물은 14 일마다 계대-배양하는 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용된 용어 "약"은, 명시적으로 인용된 값뿐만 아니라, 이들의 작은 편차도 포함한다. 즉, "약 130 RPM"의 진탕 속도는, 인용된 130 rpm의 정확한 값일 필요는 없고, 다양한 rpm으로 상이할 수 있으며, 예를 들어 131 rpm, 132 rpm, 129 rpm, 또는 128 rpm을 포함한다. 당업자라면 이러한 값이 해당 인용된 값에 가까운 근접치 값인 한, 완벽히 정확한 값을 요구하지 않는 상대 값임을 인식한다. 따라서, 인용된 값으로부터 편차는, 예를 들어, 15%이고, 보다 바람직하게는 10%이며, 가장 바람직하게는 5%가 용어 "약"에 포함된다.

상술한 것 이외에, 일반적으로 공정 작동은 당업자라면 문제없이 조정할 수있다. 식물 세포 배양 방법의 작동 방식은 영양소, 세포, 및 생산물이 시간에 따라 추가 또는 제거되는 방식을 의미한다[Payne, G., et al., 1991; "Plant Cell and Tissue Culture in Liquid System", 62-66 & 298-297 (Hanser Publishers]. 세포에 제공되는 성분은 다양한 방식으로 제공될 수 있다. 성분들은 유도기, 대수기 또는 정지기와 같은 특정 성장 단계에서 첨가될 수 있다. 모든 성분이 한 번에 제공될 수 있으며, 이어서 적당한 시간이 지난 후, 생산물을 회수할 수 있다. 다른 경우에, 모든 성분이 동시에 제공될 수 있는 것은 아니다. 오히려, 성분 중의 하나 이상이 배양 동안 상이한 시간에 제공될 수 있다. 또한, 첨가는 불연속적이거나 초기 접촉 시간에 대해 시차를 두고 이루어질 수 있고, 이러한 제공 기간은 상이한 성분에 대해 다를 수 있다. 성분들은 다수의 부분으로 제공될 수 있다. 하나 이상의 성분은 세포 배양물 또는 그의 부분과 별개로 접촉하는 용액의 일부로서 공급될 수 있다. 배양물의 일부는 임의의 시점에 또는 주기적으로 제거되어 냉동 보존, 추가의 세포 증식, 생산, 및/또는 회수를 위해 사용될 수 있다. 그러한 세포-함유 부분은 영양소 또는 요구되는 다른 성분에 추가로 노출될 수 있다. 예시적인 계대배양 절차가 본 명세서에 기재된다.

일 구현예에서, 제거된 부피의 일부 또는 전부를 보충하기 위해서 영양소 또는 다른 성분을 함유하는 배지를 첨가할 수 있다. 상기 제거된 물질의 일부는 본래의 배양물 내로 다시 첨가될 수 있고, 예를 들어, 세포 및 배지가 제거되고, 세포 또는 배지의 일부는 생산물 회수를 위해 사용될 수 있고, 나머지 세포 또는 배지는 재사용될 수 있다. 성분의 배양물로의 공급 속도 또는 배양물 내의 다양한 성분의 수준은 생산물을 유리하게 생산하고 회수하도록 제어될 수 있다. 배양물의 별개의 부분이 상기 임의의 방식에서 성분에 노출된 후, 생산에 유리한 것으로 결정된 비율로 조합될 수 있다. 또한, 배양물의 세포 함량은 유리하게 생산물을 생산하거나 세포를 증식시키도록 조정될 수 있다. 세포 함량의 조정은 영양소 또는 다른 성분과 접촉시키기 위한 전략과 유리하게 조합될 수 있다.

활발한 생합성이 일어나는 세포에 신선한 배지를 보충하면, 고갈된 필수 영양소를 제공함으로써 생산을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 미야사까 (Miyasaka) 등은 간단히 수크로스를 배지에 첨가함으로써 디테르펜 대사물질인 크립토탄시논 및 페루기놀을 생산하기 위해 살비아 밀티오리자 (Salvia miltiorhiza)의 정지기 세포를 자극할 수 있었다[Miyasaka et al., "Regulation of Ferruginol and Cryptotanshinone Biosynthesis in Cell Suspension Cultures of Salvia miltiorrhiza," Phytochemistry 25: 637-640 (1986)]. 아마, 생합성은 정지기에서 탄소 제한에 의해 중지된 것으로 추정되었다.

본 배양 방법을 위한 주기적인 배지 교환 프로토콜의 이용은 유사한 이점을 제공할 수 있다.

교환되는 배지의 양, 교환 빈도, 및 보충되는 배지의 조성은 본 발명의 다양한 구현예에 따라 상이할 수 있음이 고려된다. 배지 교환에 의해 생합성 및 분비를 자극하는 능력은 연속식, 반연속식, 또는 유가식(fed-batch)에서 효율적 상업적인 공정의 설계 및 작동을 위해 중요한 의미를 갖는다. "유가식" 작동에서, 특정 배지 성분, 예를 들어 영양소는 주기적으로 또는 연속적으로 공급된다. 일 바람직한 구현예에서, 배치(batch) 배양물의 내용물의 전부는 아니지만 실질적인 부분을 계속된 세포 성장 및 생산을 위해 신선한 배지로 교체하고; 상기 공정 방식은 "반복적인 배출 및 충전 (repeated draw and fill)" 작동과 유사하고, "반연속식 공정"으로 불린다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 공정은 "연속식"이며, 즉, 신선한 배지가 연속적으로 공급되고, 유출 배지는 연속적으로 또는 반복적으로 제거된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "현탁 배양"은 세포의 배양, 바람직하게는 액체 영양 배지 내에 분산되는 구조적으로 미분화된 세포를 의미한다. 이러한 배양 기법으로 인해, 세포는 고체 지지체 또는 배양 용기에 부착되지 않는다. 현탁 배양물은 다양한 응집 단계의 세포를 포함하는 것으로 용이하게 이해된다. 일정 범위의 응집물 크기가 현탁액에 존재하고, 크기는 직경이 수십 마이크로미터 (단일 세포 또는 수개의 응집된 세포) 내지 직경이 수 밀리미터이고 수천 개의 세포로 구성된 응집체를 포함한다. 이러한 응집체를 포함하는 현탁 배양은 본 발명의 방법에 포함된다.

세포를 현탁 배양물 내로 옮기기 위해서, 이들은 예를 들어, 캘러스로부터 제거되거나 영양 배지가 있는 멸균 배양 용기로 옮긴다. 현탁 배양물은, 예를 들어, 바람직하게는 겔화제 없이 이전에 생성된 무른 캘러스 배양에 성공적인 배양 배지를 사용하여 개시할 수 있다. 그러나, 현탁 배양에 최적화된 배지는 동일한 세포주의 캘러스에 대한 최적 배지와 상이할 수 있음을 이해해야한다. 당업자는 문제없이 적절한 배지를 확인할 수 있다.

또한, 선택적으로, 또는 부가적으로, 세포 배양물은 냉동 보존된 세포 집단으로부터 유래될 수 있다.

일단 개시되면, 현탁 배양물은 (i) 세포를 배지로부터 실질적으로 분리한 후 (일반적으로 여과에 의해), 일부를 영양소를 함유하는 배지에 재도입함으로써, 또는 (ii) 일정 부피의 배양 브로쓰 (broth)를 영양소를 함유하는 배지에 옮김으로써, (iii) 또는 세포를 침강시킨 후 이미 존재하는 배지의 임의의 부분을 제거하고 영양소-함유 배지를 재도입함으로써 추가로 배양될 수 있다. 세포 및 배지가 부피 기준으로 옮겨질 때, 옮겨지는 부피 대 최종 부피의 비율은 바람직하게는 약 1% 내지 실질적으로 모든 부피일 수 있고, 보다 바람직하게는 약 5% 내지 약 50%이며, 보다 더욱 바람직하게는 10% 내지 약 20%이다. 모든 부피가 옮겨지는 경우, 신선한 영양분은 농축된 형태로 공급될 수 있고, 단지 작은 부피 증가만을 야기할 수 있다. 따라서, 배양물은 여러 부분으로 나뉠 수 있고, 각각의 부분은 추가적으로 세포를 배양하는 데 이용하거나 또는 탑시가르긴 또는 모두를 생산하는 데 이용할 수 있다. 각각의 부분은 서로와 또는 본래 배양물과 동일한 조건 하에서 배양될 수 있지만, 꼭 그럴 필요는 없다. 성장 기간은 부분적으로 고갈된 배지를 영양소로 보충함으로써 연장될 수 있다.

상기 정의된 바와 같은 본 발명의 방법에 따라 배양된 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생성한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "하나 이상"은, 예를 들어, 본 명세서에서 사용 된 "탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상"은 정확히 하나뿐만 아니라 둘 이상을 지칭하며, 예컨대 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱 등이다. 또한, 용어 "하나 이상"은 존재하는 분자의 한 종류의 실제 수를 정의하는 것이 아니고, 인용된 유형의 구별된 분자의 수를 의미한다. 예를 들어, 용어 "탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상"은 바람직한 세스퀴터펜 락톤인 탑시가르긴과 같은 정확히 하나의 세스퀴터펜 락톤을 의미할 뿐만 아니라, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱 등의 상기 과의 다양한 세스퀴터펜 락톤과 같은 하나 이상을 의미한다.

본 발명의 방법의 제2 단계에서, 배양된 세포에 의해 생산된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤(들)은 회수된다. 탑시가르긴은 전체 배양물 또는 임의의 배양물 일부로부터 회수될 수 있으며, 그것들은 배양 동안 또는 배양 기간의 종료 후에 언제든지 회수할 수 있다. 생산된 모든 탑시가르긴을 회수할 수 있거나 또는 바람직하게는 목적의 하나 이상의 특정 탑시가르긴, 예를 들어, 헥사옥시게네이티드(hexaoxygenated) 탑시가르긴만을 단독으로, 펜타옥시게네이티드(pentaoxygenated) 탑시가르긴만을 단독으로 또는 단일 화합물 탑시가르긴만을 단독으로 회수할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

세포 재료는 추출 절차에 앞서 동결건조될 수 있다. 적절한 추출 방법을 위한 세포 재료 또는 현탁 재료를 제조하기 위해 당업계에 공지된 다른 방법을 사용할 수 있다. 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤은 비수성 극성 용매를 사용하는 추출, 산성 배지를 사용하는 추출, 염기성 배지를 사용하는 추출, 배양 용기의 내부 또는 외부에 있는 수지 흡수에 의한 회수를 포함하며, 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 회수할 수 있다.

생산된 분자를 분리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 에틸 아세테이트, 아세톤 또는 톨루엔과 같은 유기 용매를 이용하여 동결건조된 세포 또는 수성 세포 현탁물을 추출한 후 이어서 액체 크로마토그래피(LC), 역상 LC 또는 액체/액체 크로마토그래피를 이용하여 크로마토그래피 분리를 실시하는 단계를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 회수할 수 있는 유일한 세스퀴터펜 락톤이 화합물 탑시가르긴인 경우, Ollivier A [Ollivier, A. 2013; J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.; 926: 6-20] 또는 Rasmussen et al. 1978 [Rasmussen U. et al. 1978;. Acta Pharm Suec.; 15(2);133-40]에 기재된 바와 같이 정제 서열을 이용하여 회수하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 회수는 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이, 즉, 세포 배양에서 얻은 바이오매스를 동결건조하고 상기 동결건조된 바이오 매스를 비드 밀에서 용매로 균질화한 후, 원심분리하여 조 추출물을 획득하고, Ollivier 그룹에 기재된 바와 같이 상기 조 추출물의 성분의 정제를 실시한다[Ollivier, A. 2013; J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.; 926: 6-20].

본 발명에 따르면, 신규한 방법은 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤의 생산을 위해 제공된다. 현탁 배양에서 배양된 세포를 이용하여 탑시가르긴의 대량 생산이 예를 들어, 반연속식 또는 연속식 세포 배양 기술에 의해 이제 달성될 수 있다. 발명자의 최선의 지식에서는, 탑시가르긴의 대량 생산에 접근한 이러한 식물 세포 배양 방식은 현재 사용할 수 없다. 이러한 방법의 부족은 현재 많은 양의 탑시가르긴의 분리를 위해 유일하게 가능한 소스인 탑시아 속의 식물의 존재에 위협을 제공해한다[SB Christensen et al. 2009, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry; 9: 276-294]. 이들 화합물의 합성 방법은 최소 42 단계가 필요하기 때문에 경제적 관점에서 이용할 수 없다.

본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, (b) 단계에서 회수된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상은 2β,3α,7β,8α,10β,11α-헥사옥시게네이티드(hexaoxygenated)-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스(guaianolide nucleus)를 포함한다.

상술한 바와 같이, 각각의 식물 세포에 의해 생산되는 세스퀴터펜 락톤들은 동일할 수 있으며, 즉, 이들은 세스퀴터펜 락톤의 한 분자 유형만을 나타내거나, 또는 다른 분자 유형의 세스퀴터펜 락톤의 혼합물일 수 있다. 또한, 상술한 바와 같이, 모든 이러한 생산된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜이 회수되거나, 또는 이러한 군으로부터 바람직한 화합물만이 회수될 수 있다.

따라서, 본 바람직한 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 방법에 따라 (b) 단계에서 회수된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나는 2β,3α,7β,8α,10β,11α-헥사옥시게네이티드-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스를 포함하고, (ii) 본 발명의 방법에 따라 (b) 단계에서 회수된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 모두가 아닌 다수는 2β,3α,7β,8α,10β,11α-헥사옥시게네이티드-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스를 포함하거나 (iii) 본 발명의 방법에 따라 (b) 단계에서 회수된 모든 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤은 2β,3α,7β,8α,10β,11α-헥사옥시게네이티드-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스를 포함한다.

본 발명의 방법의 더욱 바람직한 구현예에서, 2β,3α,7β,8α,10β,11α-헥사옥시게네이티드-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스를 포함하는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤은 탑시가르긴이다.

탑시가르긴은 탑시가르긴 과의 가장 일반적으로 사용되는 세스퀴터펜 락톤이며, 그 구조는 도 1에 나타냈다. 바람직하게는, 탑시가르긴은 본 발명의 방법에 따라 상기 식물 세포로부터 회수된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 단독이다.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에서, (b) 단계에서 회수된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상은 3α,7β,8α,10β,11α-펜타옥시게네이티드(pentaoxygenated)-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스(guaianolide nucleus)를 포함한다.

또한, 헥사옥시게네이티드 탑시가르긴에 관한 것과 동일한 고려사항이 펜타옥시게네이티드 탑시가르긴에 적용되며, 즉, 바람직한 구현예에 따르면, (i) 본 발명의 방법에 따라 (b) 단계에서 회수된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 는 3α,7β,8α,10β,11α-펜타옥시게네이티드-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스를 포함하고, (ii) 본 발명의 방법에 따라 (b) 단계에서 회수된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 모두가 아닌 다수는 3α,7β,8α,10β,11α-펜타옥시게네이티드-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스를 포함하거나 (iii) 본 발명의 방법에 따라 (b) 단계에서 회수된 모든 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤은 3α,7β,8α,10β,11α-펜타옥시게네이티드-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스를 포함한다.

또한 상기 헥사옥시게네이티드 탑시가르긴 및 펜타옥시게네이티드 탑시가르긴의 혼합물을 회수할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 방법의 다른 바람직한 구현예에서, 상기 식물 세포는 비-배발생 세포이다.

본 발명에 따르면, 용어 "비-배발생 세포(non-embryogenic cells)"는 미분화, 탈분화 및 분열 세포를 의미한다. 비-배발생 세포는 액포의 존재에 의해 배발생 세포와 구별될 수 있는 반면, 배발생 세포에는 세포질 함량이 높고 액포가 존재하지 않는다.

본 발명의 방법에 사용하는 비-배발생 세포를 얻기 위한 수단 및 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 비-배발생 세포를 얻기 위한 비 제한적인 예로는 무른 캘러스로부터 유도를 포함한다. 실시예를 제공하기 위해, 약 0.01 내지 약 10 g/25 ㎖의 무른 캘러스로부터 접종을 이용하여 본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 비- 배발생 현탁 배양물을 제조할 수 있다. 본 발명에 따르면, 식물 세포는 현탁 배양시 비-배발생 상태이다.

용어 "무른 캘러스 재료(friable callus material)"는 고체 배지에 대량 배양된 실질적으로 미분화된 세포를 말한다. 무른 캘러스 재료 형성 및 캘러스 번식을 위한 방법은 일반적으로 당업계에 공지되어있다. 캘러스를 얻기 위한 비제한적 방법은 예를 들어 깨끗한 물로, 소독제, 예를 들어 차아염소산염, 습윤제, 트윈 (Tween) 또는 트리톤(Triton), 항생제, 및/또는 항진균제를 사용하여 철저히 세척함으로써 식물 공급원 물질의 표면을 멸균하는 것을 포함할 수 있다. 캘러스 형성은 식물의 임의의 가능한 부분, 바람직하게는 식물의 뿌리 조직(또한 "식물 외식편(plant explant)"으로 지칭)으로부터 개시될 수 있다. 식물 원료는 식물의 온전한 일부, 또는 이들의 일부분일 수 있다. 일반적으로, 식물 원료는 고체 배지의 표면 상에 배치하여 미분화 세포(무른 캘러스 재료)의 질량이 식물 원료에 근접할 정도로 성장하는 약 1-12 주 까지 무균 환경에서 배양된다. 무른 캘러스 재료를 확립 한 후, 세포는 본 발명의 방법에 따른 영양 배지에서 배양된다.

배지 성분, pH 범위, 탄소 공급원, 질소 공급원, 거대염 (macro-salt) 및 미세염 (microsalt), 비타민, 및 성장 조절인자를 포함하는 무른 캘러스 증식의 배양 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 그 전체를 본원에 참고로 포함시킨 WO97/44476 (Bringi)에 기재되어 있다. 바람직한 구현예에서, 무른 캘러스 번식은 겔화제의 사용을 포함한다. 겔화제는 예를 들어 아가, 히드로겔, 젤라틴 및 젤라이트®를 포함한다. 목탄은 폐기물 및 바람직하지 않은 유기 화합물을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 무른 캘러스 번식은 2,4-디클로로페녹시아세트산이 없는 배지에서의 개시를 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 무른 캘러스의 번식은 2,4-디클로로페녹시아세트산이 없는 배지에서의 무른 캘러스의 배양을 포함한다. 본 발명의 모든 구현예를 위한 무른 캘러스의 개시 및 번식용 배지는 예를 들어, 고체 배지 또는 반-고체 배지일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 모든 구현예를 위한 무른 캘러스의 개시 및 번식용 배지는 고체 배지이다.

당업계에 공지된 계대 기술을 이용하여 영양소의 새로운 소스로 무른 캘러스의 일부를 주기적으로 일련으로 옮길 수 있다. 바람직하게는, 캘러스를 옮기는 빈도는 4-6 주 사이이다.

본 명세서에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 탑시가르긴의 대량생산에 적합한 현탁 세포 배양물을 최초로 제공한다. 세포 배양물로부터 탑시가르긴을 생산하려는 종래 기술의 시도가 개시된 반면(상기 인용된 Jager 등 1993 참조), 그것들은 현탁 배양물로부터의 탑시가르긴 생산의 바람직한 포맷을 제공하지 않았다. 이론에 구속됨 없이, 본 발명자들은 종래 기술에서 식물 재료의 배발생을 초래하는 방식으로 유도된 캘러스로부터 획득된 세포들을 이용하였고, 이는 상기 식물 재료로부터 획득된 세포에 의한 탑시가르긴 생산에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 관찰하였다.

상술한 바에 따라, 보다 바람직한 구현예에서 본 방법은 (a) 단계 전에 하기 추가적인 단계(a-0)를 실시하는 것을 포함하며, 상기 단계는 상기 배지에 탑시아 식물 외식편(explant)을 배양하여 무른 캘러스 재료(friable callus material)를 획득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 모든 구현예를 위한 무른 캘러스의 개시용 배지는 예를 들어, 고체 배지 또는 반-고체 배지일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 모든 구현예를 위한 무른 캘러스의 개시용 배지는 고체 배지이다.

상기 본 명세서에 제공된 정의 및 바람직한 구현예는 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.

특정 바람직한 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 생산 방법을 제공한다:

(a) 현탁 세포 배양에서 영양 배지에 탑시아 속의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산하며; 상기 세포 배양 조건은 진탕, 바람직하게는 130 rpm으로, 약 23℃ 내지 약 27℃, 바람직하게는 약 25℃ 온도의 암실에서의 조건을 포함하고, 상기 세포 배양물은 일정한 간격, 바람직하게는 14 일마다 계대 배양하고;

(b) 상기 (a)에서 생산된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤을 회수하는 단계.

본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 영양 배지는 2,4-디클로로페녹시아세트산이 없는 것이다.

2,4-디클로로페녹시아세트산(또는 본 명세서에서 2,4-D로 지칭)은, 합성 옥신, 즉, 식물 호르몬이며, 이는 예를 들어, 배아가 될 때까지 캘러스 재료의 유도 및 유지 및 현탁 배양을 위한 성장 조절제로서 사용되는 경우 일반적으로 식물 세포 배양 배지에 보충하여 식물 연구에 이용된다.

따라서, 배 발생을 방지하기 위해, 현탁 배양물은 본 구현예에 따라 2,4-디클로로페녹시아세트산이 제거된 영양 배지에서 배양된다. 다른 바람직한 구현예에서, 현탁 배양물은 2,4-디클로로페녹시아세트산이 제거된 영양 배지에서 유지된다. 본 발명에 따르면, 현탁 배양물의 유지는 세포가 생존하지만 크게 성장하지 않는 것을 특징으로 한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 현탁 배양물은 2,4-디클로로 페녹시아세트산이 제거된 영양 배지에서 번식된다.

본 명세서에서 상술한 바와 같이, 세포 배양물로부터 탑시가르긴을 생산하려는 종래 기술의 시도가 개시되었으나(상기 인용된 Jager 등 1993 참조), 현탁 배양물로부터의 임의의 탑시가르긴 생산을 나타내지 않았다. 다시 이론에 구속됨 없이, 본 발명자들은 종래 기술에서 식물 재료의 배발생을 초래하는 식물 호르몬인 2,4-D를 이용하는 배양 기술에 의해 획득된 세포들을 이용하였고, 이는 상기 식물 재료로부터 획득된 세포에 의한 탑시가르긴 생산에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 관찰하였다. 배 발생의 개시에 있어 2,4-D의 긍정적인 영향이 논의되고 확인된 바 있다. 배양 배지로의 2,4-D의 첨가 및 이에 따라 개시된 배발생은 이러한 펜타옥시게네이티드 탑시가르긴만이 확인되고 추가적인 분화된 배아 단계, 즉, 자엽 단계에서, 고체 배지에서 새싹 및 뿌리가 성장되는 이유를 설명할 수 있다.

따라서, 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 생산 방법을 제공한다:

(a) 현탁 세포 배양에서 2,4-디클로로페녹시아세트산이 제거된 영양 배지에 탑시아 속의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산하며;

(b) 상기 (a) 단계에서 생산된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤을 회수하는 단계.

가장 바람직한 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 생산 방법을 제공한다:

(a) 현탁 세포 배양에서 2,4-디클로로페녹시아세트산이 제거된 영양 배지에 탑시아 속의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산하며; 상기 세포 배양 조건은 진탕, 바람직하게는 130 rpm으로, 약 23℃ 내지 약 27℃, 바람직하게는 약 25℃ 온도의 암실에서의 조건을 포함하고, 상기 세포 배양물은 일정한 간격, 바람직하게는 14 일마다 계대 배양하고;

다른 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 생산 방법을 제공한다:

(a-0) 배지에 탑시아 식물 외식편(explant)을 배양하여 무른 캘러스 재료(friable callus material)를 획득하는 단계;

(a) 현탁 세포 배양에서 2,4-디클로로페녹시아세트산이 제거된 영양 배지에 (a-0) 단계에서 획득된 탑시아 속의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산하며;

보다 바람직한 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 생산 방법을 제공한다:

(a-0) 탑시아 식물 외식편(explant)을 2,4-디클로로페녹시아세트산이 제거된 배지에 배양하여 무른 캘러스 재료(friable callus material)를 획득하는 단계;

(a) 현탁 세포 배양에서 영양 배지에 (a-0) 단계에서 획득된 탑시아 속의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산하며;

(a) 현탁 세포 배양에서 2,4-디클로로페녹시아세트산이 제거된 영양 배지에 (a-0) 단계에서 획득된 탑시아 속의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산하며; 상기 세포 배양 조건은 진탕, 바람직하게는 130 rpm으로, 약 23℃ 내지 약 27℃, 바람직하게는 약 25℃ 온도의 암실에서의 조건을 포함하고, 상기 세포 배양물은 일정한 간격, 바람직하게는 14 일마다 계대 배양하며;

또한, 본 발명은 탑시아 속의 식물 세포를 포함하는 현탁 세포 배양물에 관한 것으로서, 상기 식물 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 현탁 세포 배양물은 본 명세서 상술한 임의의 구현예에 따라 배양/생산/생산가능/제공된다.

본 발명의 방법에 대하여 상기 본 명세서에 제공된 정의 및 바람직한 구현예는 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 현탁 세포배양물에 적용된다.

발명자의 최선의 지식에서는, 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤을 생산할 수 있는, 당업계에서 이용가능한 탑시아 속의 식물 세포의 현탁 세포 배양은 없다. 본 발명의 방법에 기초하여, 이러한 현탁 세포 배양은 최초로 하나 이상의 탑시가르긴을 제공할 수 있고, 대량 생산에 적합하다.

또한, 본 발명은 본 발명의 현탁 세포 배양물로부터 획득된 탑시아 속의 식물 세포를 포함하는 식물 세포 바이오매스에 관한 것이다.

다시, 본 발명의 방법에 대하여 상기 본 명세서에 제공된 모든 정의 및 바람직한 구현예는 필요한 부분만 약간 수정하여 본 발명의 이러한 식물 세포 바이오매스에 적용된다.

본 명세서에 사용된 용어 "바이오매스(biomass)"는, 현탁 배양물의 세포 덩어리를 구성하는 생체 물질을 말한다. 즉, 현탁 세포 배양물의 세포가 액체 배지로부터 분리될 때, 바이오매스가 획득된다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용된 바와 같이, 바이오매스는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 포함한다.

본 발명의 바이오 매스는 탑시가르긴의 유용한 소스를 나타낸다. 바이오매스는 갓 얻은 바이오매스 또는 예컨대, 냉동 샘플 또는 동결건조 분말의 형태로 저장되어있는 바이오 매스일 수 있다.

본 명세서에 기재된 모든 방법 단계는 설명된 순서, 즉, (a) 단계는 (b) 단계 이전에 실시하는 것을 이해할 것이다. 추가적인 (a-0) 단계가 포함되는 경우, 이 단계는 (a) 단계에 앞서, 먼저 실시된다. 즉, 청구된 방법은 (또는 구성) 첫 번째 (a) 단계 및 후속 (b) 단계 또는, 대안적인, 첫 번째 단계 (a-0), 후속 단계 (a) 및 세 번째 단계 (b) 단계를 포함(구성)한다.

다르게 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 당업자에 의해 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 특허 명세서를 우선한다.

본 명세서, 특히 특허 청구 범위에서의 특징적인 구현예에 관해서, 종속항에 언급된 각각의 구현예는 각 청구항(독립 또는 종속)의 각 구현예와 결합되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 3 대안적인 A, B 및 C를 인용하는 독립 청구항 1, 3 대안적인 D, E 및 F를 인용하는 종속항 2 및 청구항 1 및 2에 따르고 3 대안적인 G, H 및 I를 인용하는 청구항 3의 경우, 특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서는 명합하게 A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I 조합에 해당하는 구현예들을 개시하고 있음을 이해해야한다.

유사하게, 또한 독립 및/또는 종속항이 대안적으로 인용하지 않는 경우, 종속항이 복수의 이전 항을 다시 인용하면, 이에 의해 커버된 목적-물의 임의의 조합으로 간주되는 것이 이해된다. 예를 들어, 독립항 1, 독립항 1을 다시 인용하는 종속항 2, 청구항 2 및 1 모두를 다시 인용하는 종속항 3의 경우, 청구항 3 및 1의 목적-물의 조합은 청구항 3, 2 및 1의 목적-물의 조합인 것으로 명백하고 분명하게 개시된다. 다른 종속항 4가 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항을 인용하는 경우, 청구항 4, 3, 2 및 1 뿐만 아니라 청구항 4 및 1, 청구항 4, 2 및 1, 청구항 4, 3 및 1의 목적-물의 조합이 명백하고 분명하게 개시된다.

상기 고려 사항은 필요한 부분만 약간 수정하여 모두 첨부된 청구항에 적용된다. 비-제한적인 예를 제공하자면, 청구항 9, 8 및 1의 조합은 청구항 구조의 관점에서 명백하고 분명하게 예상된다. 예를 들어 청구항 9, 8, 7 및 1 등의 조합으로 동일하게 적용된다.

상술한 상세한 설명은 특정 실험적인 구현예를 참조하여 본 발명을 설명한다. 그러나, 다양한 수정 및 변경이 첨부된 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 상세한 설명 및 첨부 도면은 제한적인 것이 아닌 단지 예시, 및 이러한 모든 변경 또는 변형으로 간주되어야하고, 임의의 경우, 본 명세서에 기재된 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

보다 구체적으로, 본 발명의 예시적인 실시예들이 본 명세서에 설명되나, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니라, 상술한 상세한 설명에 기초하여 당업자에 의해 이해될 수 있는 변형, 생략, 조합(예를 들어, 다양한 실시예들 전반에 걸친 양태), 적용 및/또는 변형을 갖는 임의의 모든 구현예를 포함한다. 청구 범위에서의 제한은 청구 범위에 이용된 용어에 기초하여 넓게 해석되어야 하고, 상기 상세한 설명 또는 또는 출원 기소 동안 설명된 실시예에 한정되지 않으며, 이는 실시예가 비-배타적인 것으로 이해된다.

실시예는 본 발명을 예시한다:

실시예 1: 온전한 식물 재료의 표면 살균

탑시아 가르가니카의 뿌리를 충분히 수돗물로 세척하였다. 뿌리는 약 3 × 3cm의 작은 큐브(식물 외식편)로 절단하였다. 식물 외식편(explant)을 충분히 세제로 세척하고 약 10 내지 15 분 동안 흐르는 물에 세척하였다. 2-3 방울의 트윈 20을 함유한 70% 이소프로필 알코올(IPA)(v/v) 용액에 1 분 동안 외식편을 침지하여 외식편의 표면 살균을 실시하였다(부드럽게 교반). 그 후, 식물 외식편을 15 내지 30 분 동안 NaOCl 용액(2.8 g/100 ml sodium hypochlorite)으로 처리하였다. 그 후 외식편을 멸균 증류수로 3 내지 4 회 간단히 세정하여 살균제의 모든 흔적을 제거하였다. 표면 살균 후 외식편은 탈수를 방지하기 위해 처리할 준비가 될 때까지 층류형 캐비닛에 있는 페트리 접시에 보관하였다. 외식편을 고체 배지에 넣고, 외식편의 절단 말단을 멸균 메스로 제거하고, 외식편을 적당한 크기(0.5-1 cm)의 작은 조각으로 절단하였다.

실시예 2: 2,4-D를 포함하는 고체 배지에서 배 발생 캘러스 유도

식물 외식편을 Musharige 및 Skoog(half strength MS basal salt, 3% sucrose, 0.5 mg/l BAP 및 0.5 mg/l 2,4-D)의 고체 변형 기본 배지에 두었다. 이 후 배양물을 25 ± 2℃로 유지되는 배양기에서 암실 배양하였다. 6-8주 후에 일차 캘러스 재료를 얻었다. 2,4-D가 보충된 MS 배지에서 배양된 외식편은 배양 시간이 늘어남에 따라 체세포 배아의 다른 단계로 추가적으로 발달되는 배 발생 캘러스로 전환된다. 배 발생 캘러스로의 전환 빈도는 성장 속도에 의존적이고 4-8 주 정도였다.

실시예 3: 2,4-D- 비포함 고체 배지에서의 무른 캘러스 (Friable callus) 유도

식물 외식편을 두 개의 서로 다른 Gamborg(full strength B5 basal salt, 2% sucrose, 5 mM picloram 및 0.01 mM BAP 또는 1 mg/l Dicamba 및 0.22 mg/l TDZ) 고체 변형 기본 배지에 두었다. 이 후 배양물을 25 ± 2℃로 유지되는 배양기에서 암실 배양하였다. 6-8주 후에 일차 캘러스 재료를 얻었다. 4-6주 후에 2,4-D가 없는 변형 B 배지에서 배양된 외식편 둘 다로부터 무른 캘러스 재료를 정립하였다. 무른 캘러스로의 전환 빈도는 성장 속도에 의존적이고 4-6 주 정도였다.

실시예 4: 탑시아 가르가니카의 현탁 배양 개시

현탁 배양의 개시를 위하여, 무른 캘러스 재료(약 40~60 g/l)를 상술한 2,4-D-비포함 변형 액체 B5 배지로 옮겼다. 현탁 배양물을 큰 세포 집합체에서 성장시켜서 50 ml 배양 배지가 있는 250 ㎖ 삼각 플라스크에서 130 rpm의 회전 진탕기로 암실 배양하였다. 배양 온도는 25 ± 2℃였다. 추가적으로 높은 초기 수크로오스 농도 또는 암모늄에 비해 비율이 높은 나이트레이트와 같은 배지 변형을 적용하여 미세 현탁 세포주가 받아들이도록 할 수 있다.

실시예 5: 탑시아 가르가니카의 현탁 배양 유지

현탁물의 유지를 위하여, 진공-여과 바이오매스(40-60 g/l)를 상술한 새로운 2,4-D-비포함 변형 액체 B5 배지 50 ㎖로 옮겼다. 배양물을 250 ㎖ 삼각 플라스크에서 130 rpm의 회전 진탕기로 암실 배양하여 유지하고 14 일마다 계대 배양하였다. 배양 온도는 25 ± 2℃였다. 모든 정립된 배양물은 최소 3 개월 동안 유지하였다.

실시예 6: 탑시아 가르가니카의 바이오매스의 추출

탑시아 가르가니카의 바이오매스(캘러스 물질 또는 현탁물로부터의 진공-여과 바이오매스)를 샘플링한 후 액체 질소로 즉시 옮겨서 세포 내 세포 신진 대사를 방지하였다. 추출을 하기 위해, 동결 건조된 바이오매스를 칭량하고, 15 배만큼 용매를 첨가하였다. 용매로서 EtOAc, 아세톤 또는 에탄올을 사용하였다. 세포를 비드 밀에서 90 초 동안 균질화하고, 이어서 이 혼합물을 10 분(14.000 RPM) 동안 원심분리하여 조 추출물을 제작하고 추가적인 분석에 이용하였다.

실시예 7: 현탁물의 추출

탑시아 가르가니카의 현탁 배양물의 샘플을 동결 건조하고 이어서 칭량하였다. 동결 건조물을 용매 15 배 부피에 재현탁하였다. 용매로서 EtOAc, 아세톤 또는 에탄올을 사용하였다. 혼합물을 비드밀에서 90 초 동안 균질화하고 이어서 10 분(14.000 RPM) 동안 원심분리하여 조 추출물을 제작하고 추가적인 분석에 이용하였다.

실시예 8: 탑시가르긴 과 세스퀴터펜 락톤의 분석

다음 방법을 탑시가르긴 과 세스퀴터펜 락톤의 검출에 사용하였다:

컬럼: C18, 예를 들어, Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 x 50 mm; 1,7 μ

크로마토그래프: UPLC, 예를 들어, 이진 펌프가 있는 Waters Acquity UPLC,

용매: A: 10 mmol 암모늄 아세테이트 버퍼 + 0.1% 포름산

B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산

구배: 시간(분): 0.00 1.50 1.51 4.00 4.10 5.00

% 용매 A: 20 20 5 5 20 20

% 용매 B: 80 80 95 95 80 80

실행 시간: 5.00 분

주입량: 4 μL

체류 시간: 약 1.18 분 (탑시가르긴)

검출기: 질량 분석기, 예를 들어, Waters Quattro Premier

검출: ESI+

동정: 탑시가르긴 m/z=668,4(M+NH₄)⁺/551,4(M-OAng)⁺/491,4(M-HOAc-OAng)⁺

조건 : 모세관 전압: 2.5 kV

콘 전압 : 18 V

소스 온도 : 150℃

탈 용매 온도 : 400℃

탈 용매 가스: 900 L/h

콘 가스: 50 L/h

예를 들어, 실시예 7에서 설명한 세포 추출물에 이러한 조건을 적용시키기 위하여, 샘플(도 3 샘플 참조)에서 기준 물질(도 3 기준 참조)과 비교하여 탑시가르긴을 명확하게 확인하였다. m/z=668(M+NH₄)⁺의 모(mother) 이온의 m/z=491(기준 및 샘플에서 상단 그래프) 및 m/z=551(기준 및 샘플에서 하단 그래프)의 딸(daughter) 이온으로의 기준 및 샘플 파쇄분리(fragmentation)가 명확하게 관찰되었다.

실시예 9: 탑시가르긴 과 탑시가르긴의 분리 및 기타 세스퀴터펜 락톤의 분리

탑시가르긴은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 사용하여 PCF 세포 현탁액으로부터 분리될 수 있다. 에틸 아세테이트, 아세톤 또는 톨루엔과 같은 유기 용매를 사용한 동결 건조된 세포 또는 수성 세포 현탁액의 초기 추출물은 이어서 정상 또는 역상 고정상을 이용하여 크로마토그래피 분리를 실시한다. 잠재적인 정제 서열들의 예를 참조한다: Ollivier A, Grougnet R, Cachet X, Meriane D, Ardisson J, Boutefnouchet S, Deguin B. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci . 2013; 926 ; 16-20 or Rasmussen U, Broogger Christensen S, Sandberg F. Acta Pharm Suec . 1978; 15(2);133-40.

Claims

다음 단계를 포함하는 탑시가르긴 과(thapsigargin family)의 세스퀴터펜 락톤(sesquiterpene lactones) 생산 방법:
(a) 현탁 세포 배양에서 영양 배지에 탑시아 속(genus Thapsia)의 식물 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 탑시가르긴 과(thapsigargin family)의 세스퀴터펜 락톤(sesquiterpene lactones) 중 하나 이상을 생산하며;
(b) 상기 (a) 단계에서 생산된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 회수하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 회수된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상은 2β,3α,7β,8α,10β,11α-헥사옥시게네이티드(hexaoxygenated)-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스(guaianolide nucleus)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤은 탑시가르긴인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 회수된 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상은 3α,7β,8α,10β,11α-펜타옥시게네이티드(pentaoxygenated)-6β,12-구아이아놀라이드 뉴클레어스(guaianolide nucleus)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포는 탑시아 가르가니카(Thapsia garganica) 세포, 탑시아 짐네시카(Thapsia gymnesica) 세포 및 탑시아 빌로사(Thapsia villosa) 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 세포는 비-배발생(non-embryogenic) 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 (a) 단계 전에 하기 추가적인 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: (a-0) 배지에 탑시아 식물 외식편(explant)을 배양하여 무른 캘러스 재료(friable callus material)를 획득하는 단계.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 영양 배지는 1 주일에 최소 50%의 성장 증가를 유도할 수 있는 배양 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영양 배지는 2,4-디클로로페녹시아세트산(Dichlorophenoxyacetic acid)이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
탑시아 속(genus Thapsia)의 식물 세포를 포함하는 현탁 세포 배양물로서, 상기 식물 세포는 탑시가르긴 과의 세스퀴터펜 락톤 중 하나 이상을 생산할 수 있는 것을 특징으로 하는 현탁 세포 배양물.
제10항의 현탁 세포 배양물로부터 획득된 탑시아 속의 식물 세포를 포함하는 식물 세포 바이오매스(biomass).