KR101829929B1 - 백합과 세포 배양에 의한 알칼로이드의 생산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백합과 세포 배양물로부터의 알칼로이드의 생산에 관한 것이다.

Description

백합과 세포 배양에 의한 알칼로이드의 생산{PRODUCTION OF ALKALOIDS BY LILIACEAE CELL CULTURE}

본 발명은 백합과 (Liliaceae) 세포 배양물로부터의 알칼로이드의 생산에 관한 것이다.

헷지호그 (Hedgehog: Hh) 경로는 인간 배아발생 및 조직 분화에서 중대한 역할을 하고, 따라서, Hh 경로의 붕괴는 일부 출생 결함 및 암에 관련된다. 예를 들어 Patched (세포분열을 억제하는 Hh 경로의 단백질), 또는 스무슨드(Smoothened) (세포분열을 촉진하는 Hh 경로의 단백질)를 표적화함으로써 Hh 경로를 활성화하거나 차단하기 위해 소분자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 백합과의 베라트룸 (Veratrum) 속의 식물에서 발견되는 알칼로이드 시클로파민은 스무슨드를 표적화함으로써 Hh 경로를 차단할 수 있고, 따라서 세포 성장을 억제한다. 시클로파민 및 베라트룸 슈퍼패밀리의 다른 알칼로이드는 Hh 경로가 관련되는 질병을 치료하기 위한 잠재적인 치료제로서 확인되었다. 이와 유사하게, 상기 알칼로이드의 생합성 전구체, 유도체, 또는 합성 유도체는 치료상 활성일 수 있다.

시클로파민은 동물에 의해 섭취될 때 중증 신경 결함을 야기하는 것으로 오래 동안 알려져 왔고, 이제 종양형성에서 그의 역할이 주목받고 있다. 시클로파민은 인간 암의 가장 흔한 형태인 기저 세포 피부 암종을 생성하는 돌연변이된 유전자의 작용을 차단할 수 있다. 마우스 세포에서의 연구는 시클로파민이 뇌의 수질모세포종 및 근육의 횡문근육종을 포함하는 많은 암의 치료에 사용될 수 있음을 제안한다. 또한, 과거의 발견은 특정 암에 중요한 특이적인 신호전달 경로를 표적화하는 메카니즘 기반 치료 방법의 가능성을 집중 조명하고 있다.

시클로파민 및 베라트룸 슈퍼패밀리의 다른 알칼로이드는 유용한 항암 약물로 증명될 수 있기 때문에, 이들 화합물의 효율적인 생산 방법에 대한 필요성이 존재한다. 식물이 특정 대사물질을 생산하는 것으로 알려진 경우에도 식물 세포가 비분화된 세포 배양에서 대사물질을 생산할 것인지를 예측할 수 없기 때문에, 알칼로이드 및 다른 2차 대사물질의 상업적인 효율적인 생산은 예측불가능하다. 마 (Ma) 등은 "베라트룸 칼리포르니쿰 (Veratrum californicum)의 체세포 배아발생 및 녹색 식물 재생을 위한 시험관내 배양 시스템"을 개시하였지만, 요약서에는 비분화된 세포 배양물로부터 알칼로이드의 생산이 개시되어 있지 않다 ([Ma et al., "Somatic Embryogenesis and Green Plant Regeneration from Veratrum californicum," 11^th IAPTC&B Congress Poster Sessions P-1033], [Ritala et al., "Tissue culture and genetic engineering of an important anticancer compound producing plant Veratrum californicum Duran," Planta Medica 2006; 72]). 또한, 미국 특허 공개 2009/0305338을 참조한다. 또한, 베라트룸 알칼로이드는 분화된 조직, 예를 들어 싹 (shoot) 또는 뿌리의 배양물에서 생산될 수 있다. 상기 분화된 조직, 예를 들어, 모상근 또는 싹 기형종 등은 초기에 비분화된 조직으로부터 또는 유전자 형질전환을 통해 유래될 수 있다. 형질전환된 조직은 또한 비분화된 세포의 현탁액으로서 배양될 수 있다. 본 발명은 비분화된 세포 배양물에서 알칼로이드를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 실시양태의 개요

본 발명은 식물 세포 배양물로부터 알칼로이드를 생산하는 다양한 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 목적은 상업적으로 유의한 양의 최종 생성물을 대용량 폭기 발효조로부터 얻는 것이다. 또 다른 목적은 용량 수율 (volumetric yield)을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 백합과의 식물 세포를 영양 배지에서 배양하여 베라트룸 알칼로이드의 슈퍼패밀리의 하나 이상의 알칼로이드, 또는 상기 알칼로이드의 전구체 또는 상기 알칼로이드의 유도체를 생산하는 세포 배양물을 형성하고, 하나 이상의 알칼로이드를 회수함으로써 현탁 세포 배양물로부터 하나 이상의 알칼로이드를 생산하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 식물 세포는 베라트룸 또는 아미안티움 (Amianthium) 세포이다. 구체적인 실시양태에서, 식물 세포는 베라트룸 칼리포르니쿰 세포이다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 비분화된 세포이고, 배발생 세포가 아니다.

또 다른 실시양태에서, 식물 세포는 성장 배지에서 배양된다. 구체적인 실시양태에서, 성장 배지는 1주에 적어도 50%의 성장 증가를 유도할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 식물 세포는 생산 배지에서 배양된다,

또 다른 실시양태에서, 식물 세포는 성장 배지에서 배양된 후, 생산 배지에서 배양된다. 구체적인 실시양태에서, 성장 및 생산 배지는 상이하다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 베라트룸 속의 식물 세포는 1주에 적어도 50%의 성장 증가를 유도할 수 있는 성장 배지에서 배양된 후, 이들 식물 세포는 성장 배지와 상이하고 적어도 약 0.1 mg/L의 베라트룸 알칼로이드의 슈퍼패밀리의 하나 이상의 알칼로이드 또는 그의 전구체 또는 유도체를 생성하는 생산 배지에서 배양되고, 이어서 적어도 하나의 알칼로이드가 회수된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 세포의 다양한 배양물, 예를 들어 베라트룸 세포의 현탁 배양물을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 적어도 약 0.1 mg/L의 베라트룸 알칼로이드의 슈퍼패밀리의 하나 이상의 알칼로이드 또는 그의 전구체 또는 유도체를 생산할 수 있는 베라트룸 세포의 배양물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 백합과의 세포 및 적어도 0.1 mg/L의 양의 베라트룸 알칼로이드의 슈퍼패밀리의 하나 이상의 알칼로이드를 포함하는 현탁 배양물을 제공한다. 또한, 본 발명은 알칼로이드, 전구체, 유도체, 또는 상기 비분화된 세포 배양물의 추출물을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 배양물은 적어도 약 0.1 mg/L, 보다 바람직하게는 적어도 약 0.3 mg/L, 적어도 약 0.5 mg/L, 적어도 약 0.75 mg/L, 적어도 약 1 mg/L, 또는 적어도 약 1.5 mg/L의 하나 이상의 알칼로이드를 생성한다. 상기 수율은 하나 이상의 개개의 알칼로이드의 생산으로서 또는 전체 알칼로이드의 양으로서 측정될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 알칼로이드는 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리를 함유한다. 바람직한 실시양태에서, 알칼로이드는 시클로파민 또는 제르빈 (jervine)이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리계-함유 알칼로이드 화합물의 생산 방법을 제공하고, 여기서 하나 이상의 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리계-함유 알칼로이드 화합물을 생산하는, 백합과에 속하는 식물의 비분화된 식물 세포가 영양 배지에서 배양되고, C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리계-함유 알칼로이드 화합물은 생성되는 배양물로부터 회수된다. 다른 실시양태에서, 세포는 예를 들어 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리계 함유 알칼로이드 화합물의 생합성을 자극하고/하거나 촉진하는 생물 (biotic) 및/또는 비생물 (abiotic) 인자(들)의 존재 하에 배양된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드의 생합성을 촉진하는 하나 이상의 자극제의 존재 하에 용기에서 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드 화합물을 생산하는 백합과에 속하는 식물의 세포를 배양하고, 여기서 배양 용기 내의 기체상은 배양 초기 단계의 분위기 내의 산소 농도 미만으로 제어되거나, 또는 세포와 접촉하는 유체 배지 내의 용존 산소 농도는 배양 초기 단계의 온도에서의 포화 용존 산소 농도 미만으로 제어되고, 생성되는 배양물로부터 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드 화합물을 회수함으로써 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드 화합물을 생산하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드 화합물을 생산하는 식물의 세포는 0.03%-10%의 이산화탄소를 함유하는 산소 기체를 배양 용기에 도입함으로써 배양된다.

도 1a, b, 및 c는 LC-MS에 의한 베라트룸 칼리포르니쿰 캘러스 (callus) 내의 시클로파민의 검출을 보여준다. 도 1a는 추출된 단일 이온 (시클로파민의 m/z 412 M⁺+H)을 보여준다. 도 1b는 3.40에서 TIC 피크의 MS 스펙트럼을 보여주고, 도 1c는 캘러스 추출물의 TIC 스펙트럼을 보여준다.
도 2a, b, 및 c는 LC-MS에 의한 베라트룸 칼리포르니쿰 캘러스 내의 시클로파민의 검출을 보여준다. 도 2a는 추출된 단일 이온 (시클로파민의 m/z 412 M⁺+H)을 보여준다. 도 2b는 3.40에서 TIC 피크의 MS 스펙트럼을 보여주고, 도 2c는 캘러스 추출물의 TIC 스펙트럼을 보여준다.
도 3은 베라트룸 세포 현탁액 샘플의 다중 반응 모니터링 (MRM) 스펙트럼을 보여준다. 관심있는 2개의 분석물에 대한 이온은 노이즈 (noise) 수준 이상에서 검출되었다: 시클로파민 및 제르빈.
도 4는 UPLC/MS/MS에 의한 베라트룸 칼리포르니쿰 현탁 배양물의 다중 반응 모니터링 (MRM) 스펙트럼을 보여준다. 샘플은 주입 전에 농축되었다.
도 5a 및 b는 베라트룸 칼리포르니쿰 현탁 배양을 사용하여 제8, 9, 및 10일에 MS- 및 SH-계 생산 배지에서 시클로파민 역가를 보여준다. 도 5b는 건조 웰로부터의 이상치 (outlier)를 포함하지 않는 데이터를 보여준다.
도 6은 베라트룸 칼리포르니쿰 현탁 배양을 사용하여 제8, 9, 및 10일에 MS- 및 SH-계 생산 배지에서 시클로파민 역가를 보여준다.
도 7은 베라트룸 칼리포르니쿰 현탁 배양을 사용하여 제8, 9, 및 10일에 MS- 및 SH-계 생산 배지에서 시클로파민 역가를 보여준다.
도 8은 베라트룸 칼리포르니쿰 현탁 배양을 사용하여 제8, 9, 및 10일에 MS- 및 SH-계 생산 배지에서 시클로파민 역가를 보여준다.
도 9는 베라트룸 칼리포르니쿰 현탁 배양을 사용하여 제8, 9, 및 10일에 MS- 및 SH-계 생산 배지에서 시클로파민 역가를 보여준다.

발명의 상세한 설명

알칼로이드 및 알칼로이드-생산 세포

본원에서 사용되는 용어 "알칼로이드"는 베라트룸 알칼로이드의 슈퍼패밀리의 임의의 구성원 및 상기 알칼로이드의 전구체 및 상기 알칼로이드의 유도체를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 베라트룸 알칼로이드의 슈퍼패밀리의 구성원의 생산에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리계 함유 알칼로이드 화합물의 생산에 관한 것이다. 베라트룸 알칼로이드의 예는 하기 표에 나열된 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다:

하나의 실시양태에서, 알칼로이드는 베라트룸 또는 아미안티움 세포로부터 생산될 수 있는 알칼로이드이다. 또 다른 실시양태에서, 알칼로이드는 베라트룸 세포로부터 생산될 수 있는 알칼로이드이다. 하나의 실시양태에서, 알칼로이드 자체가 치료적 활성을 갖거나, 또는 생활성 화합물을 생성하도록 변형될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 알칼로이드는 C-노르~D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리를 함유한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 알칼로이드는 시클로파민 또는 제르빈이다.

방법은 상기 규정된 바와 같은 하나 이상의 알칼로이드를 생산하기 위해 알칼로이드-생산 세포를 배양하는 것을 포함한다. 용어 "알칼로이드-생산 세포"는 적어도 하나의 세트의 배양 조건 하에 하나 이상의 알칼로이드를 생산할 수 있는 임의의 세포를 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, "알칼로이드-생산 세포"는 실시양태의 배양 조건 하에 검출가능한 양으로 하나 이상의 알칼로이드를 생산하는 세포를 나타낸다.

본원에 기재된 알칼로이드 생산 방법에서, 세포 배양물은 백합과의 세포를 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 세포 배양물은 베라트룸 및/또는 아미안티움 속의 세포를 포함한다, 보다 바람직한 실시양태에서, 세포 배양물은 브이. 칼리포르니쿰 세포를 포함한다. 배양물 내의 세포는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 세포는 하나 이상의 속, 종, 변이체, 또는 세포주 (strain)에서 유래한 것일 수 있다. 세포는 천연 생성될 수 있거나, 하이브리드 (hybrid) 또는 유전적으로 변경된 세포일 수 있다. 예시적인 식물 세포는 아래 표에 나열된 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

세포 배양을 개시하기 위해 사용된 조직은 예를 들어 하나 이상의 특정 알칼로이드의 생산을 지지하는 능력을 기초로 하여 선택될 수 있다.

세포 배양은 캘러스 배양일 수 있다. 캘러스는 고화 배지 상에 배양된 실질적으로 비분화된 세포 덩어리이다. 캘러스 형성 및 캘러스 증식을 위한 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 하나의 실시양태에서, 캘러스는 단자엽 식물, 바람직하게는 단자엽 식물의 미성숙 배아의 임의의 가변부에 의해 개시된다. 예를 들어, 세포 배양 개시는 예를 들어 깨끗한 물로, 소독제, 예를 들어 차아염소산염, 습윤제, 트윈 (Tween) 또는 트리톤 (Triton), 항생제, 및/또는 항진균제를 사용하여 철저히 세척함으로써 식물 공급원 물질의 표면을 멸균하는 것을 포함할 수 있다. 식물 부분은 무손상 상태로 사용될 수 있거나, 또는 그의 일부, 예를 들어 종자로부터 제거된 배아가 사용될 수 있다. 일반적으로, 식물 부분은 고화 배지의 표면 상에 놓이고, 멸균 환경에서 약 1-12주 동안 비분화된 세포의 덩어리 (캘러스)가 식물 부분에 유사하게 성장할 때까지 인큐베이팅된다. 캘러스 배양을 확립한 후에, 세포는 아래에서 보다 상세하게 설명되는 영양 배지에서 배양된다. 비분화된 세포는 액포의 존재에 의해 배발생 세포와 구별될 수 있고, 그 이유는 배발생 세포에는 세포질 함량이 높고 액포가 존재하지 않기 때문이다.

캘러스 증식을 위해, 배지 성분, pH 범위, 탄소 공급원, 질소 공급원, 거대염 (macro-salt) 및 미세염 (micro-salt), 비타민, 및 성장 조절인자를 비롯한 배양 조건은 모두 예를 들어 그 전체를 본원에 참고로 포함시킨 WO 97/44476 (Bringi)에 기재되어 있다. 하나의 실시양태에서, 캘러스 증식은 겔화제, 항갈변제, 목탄, 및/또는 명/암 주기의 사용을 포함한다. 겔화제는 예를 들어 아가, 히드로겔, 젤라틴 및 젤라이트 (gelrite)를 포함한다. 목탄은 폐기물 및 바람직하지 않은 유기 화합물을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 접종량은 약 0.01 내지 약 10 g/25 ml이다. 캘러스의 분획을 신선한 영양소 공급원 내로 주기적으로 연속적으로 전달하기 위해 당업계에 공지된 계대배양 기술을 사용할 수 있다.

알칼로이드를 생산하기 위한 세포 배양은 현탁 배양일 수 있다. 용어 "현탁 배양"은 액체 영양 배지 내에 분산되는 구조적으로 비분화된 세포를 설명하기 위해 사용된다. 현탁 배양물은 다양한 응집 단계의 세포를 포함하는 것으로 이해된다. 일정 범위의 응집물 크기가 현탁액에 존재하고, 크기는 직경이 수십 마이크로미터 (단일 세포 또는 수개의 응집된 세포) 내지 직경이 수 밀리미터인 응집체 (수천 개의 세포로 구성됨)를 포함한다. 일반적으로, 현탁 배양은 겔화제 없이 캘러스 배양에서 성공적인 배양 배지를 사용하여 개시할 수 있지만, 현탁 배양에 최적화된 배지는 동일한 세포주의 캘러스에 대한 최적 배지와 상이할 수 있다. 또한, 세포 배양물은 냉동 보존된 세포 집단으로부터 임의로 유래될 수 있다.

2단계 방법을 통한 냉동 보존 ( cryopreservation )

하나의 실시양태에서, 본 발명은 냉동 조건에서 식물 세포 현탁 배양물의 동결 전에 탈수 및 동결방지 단계를 포함하는, 베라트룸 식물 세포 현탁 배양물에서 건조 내성의 유도를 위한 2단계 방법을 제공한다. 베라트룸 식물 세포의 세포 현탁액은 일반적으로 많은 큰 세포 응집물을 함유하고, 대안적 냉동 보존 방법, 예를 들어 유리화 (vitrification)는 세포 응집을 최소화하기 위한 조치를 취하지 않는 한, 식물 세포 현탁 배양물이 유의한 양의 고도로 응집된 식물 세포를 함유할 경우에 베라트룸 식물 세포 현탁액에 사용하기에 불리하다. 유리화 용액은 매우 높은 삼투질 농도 (osmolality)를 갖고, 이에 의해 응집물 외부의 세포가, 유리화 용액이 세포 응집물의 내부에 위치하는 세포를 관통하기 전에 유리화 용액에 의해 손상될 수 있다. 이러한 현상은 유리화 용액에 대한 노출 타이밍 결정을 매우 어렵게 만들고, 따라서 실질적인 응집물인 식물 세포와 함께 사용하기에 바람직하지 않게 된다. 그러나, 아래에서 논의되는 본 발명의 하나의 실시양태에서, 세포 응집물은 실질적으로 제거되고, 따라서 유리화 방법을 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 방법은 베라트룸 식물 세포 현탁액을 냉동 보존하는 효과적인 수단으로서 개발되었고, 이에 의하면 냉동 보존된 식물 세포의 해동 후에 세포 기능을 높은 수준으로 회복할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 방법은 본원에 제시된 냉동 보존 기술을 사용하여 냉동 보존된 베라트룸 식물 세포의 해동 후에 생존가능한 세포의 50% 초과의 회수율을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 방법은 본원에 제시된 냉동 보존 기술을 사용하여 냉동 보존된 베라트룸 식물 세포의 해동 후에 생존가능한 세포의 75% 초과의 회수율을 제공한다.

냉동 보존이 요구되는 경우에, 냉동 보존해야 할 베라트룸 식물 세포 현탁 배양물은 액체 GM (IND64) 배지에서 약 7 내지 약 10일 동안 사전-배양된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 식물 세포 현탁 배양물은 비분화된 세포를 포함하는 식물 세포 현탁 배양물이다. 세포 현탁액은 약 7 내지 약 10일마다 신선한 배지로 옮겨야 한다. 후속적으로, 식물 세포 현탁 배양물은 약 0.8% 아가로스 내지 약 1% 아가로스를 포함하는 고화 GM (IND64) 배지로 옮기고, 암소에서 약 7일 내지 약 10일 도안 25℃에서 배양한다.

상기 실시양태에서, 약 7 내지 약 10일 동안 고체 GM (IND64) 배지 상에서의 베라트룸 식물 세포의 사전-배양 후에 식물 세포는 본 발명의 2-단계 냉동 보존 방법을 사용하여 냉동 보존된다. 본 발명의 냉동 보존 방법은 베라트룸 식물 세포를 약 0.3M 내지 약 0.5M 소르비톨 또는 수크로스를 포함하는 액체 GM 배지 내에 옮기고, 베라트룸 식물 세포를 약 16시간 내지 약 48시간 동안 회전 진탕기 (120 rpm) 상에서 배양하는 것을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 옮겨진 베라트룸 현탁 식물 세포는 식물 세포의 작은 응집물이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 옮겨진 베라트룸 식물 세포는 예를 들어 벨코 (Bellco) 균질화기 및 벨코 셀렉터 (Cellector)™ 조직 체 (Tissue Sieve) (10 메쉬/1910 ㎛ 및 20 메쉬/860 ㎛) (벨코 바이오테크놀로지 (Bellco Biotechnology, 미국 뉴저지주 바인랜드))의 사용을 통해 실질적으로 작은 응집물이 된다.

액체 GM 배지를 제거하고, 베라트룸 식물 세포를 후속적으로 액체 냉동 보존 1 배지로 옮긴다. 표 4는 냉동 보존 1 배지의 성분을 제공한다.

^* 선택된 당은 중성 당, 알콜 당, 수크로스, 말토스, 트레할로스 또는 글리세롤을 의도한다. 중성 당은 글루코스, 아라비노스, 자일로스, 만노스, 갈락토스, 람노스 또는 글루쿠론산을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 알콜 당은 말티톨, 소르비톨, 자일리톨, 이소말트 (isomalt), 락티톨, 에리쓰리톨 또는 만니톨을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 냉동 보존 1 배지는 약 6% DMSO를 포함한다. 베라트룸 식물 세포는 약 2시간 이상 내지 약 4시간 이하까지 빙상에서 냉동 보존 1 배지 내에서 인큐베이팅한 후, 2 ml 부피의 식물 세포 현탁액을 냉동 보존 1 배지 내에서 냉동 바이알로 옮긴다. 옮겨진 식물 세포 현탁액 냉동 바이알을 이어서 0℃에서 -40℃로 분당 -0.33 내지 -1℃의 속도로 냉각한다. 냉각 후에, 냉동 바이알을 액체 질소 내에 침지하고, 액체 질소 탱크에서 보관한다. 도 5-7은 본원에서 제공되는 기술과 일치하는 냉동 보존 기술을 수행함으로써 얻을 수 있는 냉동 보존된 베라트룸 식물 세포 배양물의 회수를 보여준다.

유리화를 통한 냉동 보존

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 약 7 내지 약 10일 동안 고체 GM (IND64) 배지 상에서의 베라트룸 식물 세포의 사전 배양 후에 식물 세포는 유리화 기술을 사용하여 냉동 보존된다. 본 발명의 상기 실시양태에서, 베라트룸 식물 세포를 약 0.3M 내지 약 0.5M 소르비톨 또는 수크로스를 포함하는 액체 GM (IND64) 배지 내로 옮기고, 식물 세포를 약 16시간 내지 약 48시간 동안 회전 진탕기 (120 rpm) 상에서 배양한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 옮겨진 베라트룸 현탁 식물 세포는 벨코 균질화기 및 벨코 셀렉터™ 조직 체 (20 메쉬/860 ㎛) (벨코 바이오테크놀로지, 미국 뉴저지주 바인랜드)를 사용하여 생성된 작은 응집 식물 세포이다.

이어서, 액체 GM (IND64) 배지를 제거하고, 10-30% w/v의 신선한 베라트룸 식물 세포를 후속적으로 냉동 보존 2 배지 내로 옮긴다. 냉동 보존 2 배지의 조성물을 표 5에 제시한다. 필요한 경우, pH는 약 pH 5-7로 조정된다.

^* 선택된 당은 중성 당, 알콜 당, 수크로스, 말토스, 트레할로스 또는 글리세롤을 의도한다. 중성 당은 글루코스, 아라비노스, 자일로스, 만노스, 갈락토스, 람노스 또는 글루쿠론산을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 알콜 당은 말티톨, 소르비톨, 자일리톨, 이소말트, 락티톨, 에리쓰리톨 또는 만니톨을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

^** 선택된 트리사카라이드는 멜레지토스, 파노스, 라피노스, 케스토스 또는 락토수크로스를 의도한다.

바람직하게는, 베라트룸 식물 세포는 냉동 보존 2 배지 (세포 밀도 = 20%)에서 약 2시간 내지 약 4시간 동안 약 4℃에서 인큐베이팅한 후, 냉동 보존 2 배지를 제거한다. 약 1부의 냉동 보존 2 배지-처리 베라트룸 식물 세포를 칭량하고, 각각의 냉동 바이알에 첨가한다. 약 5 중량부의 차가운 동결방지제 용액을 각각의 냉동 바이알에 첨가하고, 세포를 0℃에서 (빙상에서) 냉각한 후, 액체 N₂에 침지시킨다. 차가운 동결방지제 용액의 조성을 표 6에 제시한다. 상기 인큐베이션 직후에, 냉동 바이알을 액체 질소에 침지시킨다.

^* 선택된 당은 중성 당, 알콜 당, 수크로스, 말토스, 트레할로스 또는 글리세롤을 의도한다. 중성 당은 글루코스, 아라비노스, 자일로스, 만노스, 갈락토스, 람노스 또는 글루쿠론산을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 알콜 당은 말티톨, 소르비톨, 자일리톨, 이소말트, 락티톨, 에리쓰리톨 또는 만니톨을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

해동 및 회수

본 발명은 또한 냉동 보존된 베라트룸 식물 세포 현탁액의 해동 및 회수 방법을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 냉동 보존된 베라트룸 식물 세포 현탁액을 포함하는 냉동 바이알은 3 내지 5분 동안 또는 동결된 세포가 해동될 때까지 때때로 교반하거나 또는 부드럽게 진탕하면서 수조 또는 다른 지속되는 온도 환경에서 약 37℃ 내지 약 42℃의 온도 범위에서 해동시킨다.

냉동 바이알의 해동 및 멸균 후에 (일반적으로 에탄올 노출에 의해), 2-단계 방법이 사용되는 경우에, 냉동 바이알 내의 내용물은 냉동 보존 용액을 제거하기 위해 흡입 필터를 통과하고, 여과지 상의 세포는 고체 GM (IND64) 배지로 옮겨지고, 25℃에서 암소에서 약 16 내지 약 24시간 동안 인큐베이팅된다. 해동된 세포를 1-2 g의 생물량 (biomass)이 생산될 때까지 약 7일마다 신선한 배지에 옮긴다. 유리화 방법이 사용되는 경우에, 각각의 해동 및 멸균시킨 냉동 바이알의 내용물을 약 5-10 mM 2가 양이온 및 약 0.1 - 1.0 M의 선택된 당을 함유하는 10 ml의 배지에 10분 동안 붓고/희석한 후, 용액을 제거하기 위해 흡입 필터를 통과하고, 여과지 상의 세포는 고체 GM (IND64) 배지로 옮겨지고, 25℃에서 암소에서 약 16 내지 약 24시간 동안 인큐베이팅된다. 이어서, 세포가 있는 여과지는 신선한 고체 GM (IND64) 배지로 옮겨지고, 이어서 세포 기능의 회복을 위해 7일마다 25℃에서 암소에서 신선한 GM 배지로 옮겨진다.

세포 배양: 영양 배지

본 발명의 방법은 영양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 방법은 또한 영양 배지에서 세포를 배양하는 2 이상의 단계를 포함할 수 있다. 용어 "영양 배지"는 식물 세포 캘러스 및/또는 현탁 배양물의 배양에 적합한 배지를 의미한다. 용어 "영양 배지"는 일반적인 배지이고, "성장 배지" 및 "생산 배지"를 모두 포함한다. "성장 배지"는 배양된 세포의 성장에 유리한 영양 배지이다. 바람직한 실시양태에서, 성장 배지는 1주에 적어도 50%의 성장 증가를 제공한다. "생산 배지"는 하나 이상의 알칼로이드의 생산에 유리한 영양 배지이다. 성장은 생산 배지에서 이루어질 수 있지만, 생산은 성장 배지에서 이루어질 수 있고, 성장과 생산 둘 모두가 단일 영양 배지에서 이루어질 수 있고, 생산 배지는 성장 배지에 비해 표적 화합물의 생산에 유리하다. 본원에 기재된 방법은 성장 배지에서 세포를 배양하는 하나 이상의 단계 및/또는 생산 배지에서 세포를 배양하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.

비-성장-연관 2차 대사물질의 측면에서, 생산 배지는 바람직하게는 성장 배지에 비해 a) 증가된 수준의 수크로스 또는 다른 탄소원, 및/또는 b) 감소된 수준의 무기 성분, 예를 들어 니트레이트, 암모늄, 포스페이트, 및/또는 칼륨, 및/또는 c) 상이한 칼슘 수준을 갖는다. 미국 특허 4,717,664를 참조한다. 당업자는 일반적으로 탄소 대 무기 성분, 예를 들어 질소 및 포스페이트의 균형잡힌 또는 비교적 낮은 비율이 세포 성장에 도움이 되지만, 세포 성장은 탄소 대 무기 성분의 비교적 높은 비율에 의해 제함됨을 인식한다. 따라서, 생산 배지는 세포 성장과 반대로 알칼로이드 생산을 촉진하기 위해 성장 제한 조건, 예를 들어 탄소 대 무기 성분의 높은 비율을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sakuta M. & Komamine A., "Cell Growth and accumulation of Secondary Metabolites", Cell culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Chapter 5, Vol. 4, pp. 97-114 (1987)]; [Majerus F. & Pareilleux A., "Alkaloid accumulation in Ca-alginate entrapped cells of Catharanthus roseus: Using a limiting growth medium", Plant Cell Reports (1986) 5: 302-305]를 참조한다. 영양 배지는 무라시게 및 스쿡 기본 염 (Murashige and Skoog Basal Salts (MS)) 또는 쉔크 및 힐데브란트 기본 염 (Schenk and Hildebrandt Basal Salts (SH)) (Sigma-Aldrich)을 기초로 할 수 있다. 예시적인 생산 배지 (PM)는 염 염기 (예를 들어, MS 또는 SH) + 다량영양소, 미량영양소, 비타민, 5% 수크로스, 100 μM 메틸 자스모네이트 (MJS), 및 20 μM 디캄바를 함유하는 배지를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 예시적인 성장 배지는 염 염기 (예를 들어, MS 또는 SH) + 2% 수크로스, 및 10 μM 디캄바를 함유하는 배지를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

하나의 실시양태에서, 세포는 먼저 성장 배지에서 배양된 후, 세포는 성장 배지와 상이한 생산 배지에서 배양된다. 세포가 성장 배지로부터 생산 배지로 옮겨질 때, 생산 배지는 바람직하게는 보다 높은 수준의 탄소 공급원 및/또는 C:N 비, 예를 들어 보다 높은 농도의 사카라이드를 갖는다. 또한, 생산 배지는 바람직하게는 무기 또는 유기 질소, 예를 들어 아미노산의 공급원을 포함한다. 영양 배지의 다른 성분은 세포 및 배지가 처음 접촉한 후 배양물 내에 도입될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 이들 성분, 예를 들어 추가의 사카라이드는 필요한 바에 따라 간헐적으로 또는 연속적으로 공급 스트림에 공급된다. 물론, 알칼로이드 생성물은 질소를 함유하기 때문에, 목적하는 생성물의 축적을 유지하고 개선하기 위해 적당한 질소를 공급하는 것이 바람직하다.

요구되는 효과, 예를 들어, 성장 또는 생산은 온도, pH, 및 명/암을 포함하고 이로 제한되지 않는 다른 반응 조건을 조작함으로써; 하나 이상의 영양소 또는 다른 물질을 첨가하거나 제거하거나 농도를 변경하여 배지 조건을 조작함으로써; 또는 이들 조건의 임의의 조합을 조작함으로써 달성될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 요구되는 효과는 배지를 조작함으로써 달성된다. 특히, 알칼로이드를 생산하는 현탁 배양물은 적합한 영양소 및 반응 조건이 사용될 때 빠른 성장 속도 및 높은 세포 밀도를 제시할 수 있다. 당업자는 세포주 사이에서 상이할 것으로 예상될 수 있는, 최적 성능을 달성하기 위해 본원에서 제시되는 지침에 따라 배지 조건을 쉽게 조합, 변경 및 조작할 수 있다.

본 발명의 알칼로이드는 최종적으로 표적 2차 대사물질로 전환되는 전구체를 생산하고 순차적으로 변형하기 위해 많은 상이한 효소의 협동 작용을 필요로 하는 일련의 많은 효소 단계를 통해 생산되는 2차 대사물질이다. 이와 동시에, 2차 대사물질 생산은 다른 효소가 요구되는 대사물질의 전구체를 대사하여 2차 대사물질 형성에 필요한 전구체 풀 (pool)을 소모시킬 경우 저하될 것이다. 따라서, 특정 효소의 자극제 또는 다른 효소의 억제제는 특정 세포주의 배양에서 2차 대사물질의 속도 및/또는 최종 수율을 향상시킬 수 있다. 식물 세포 배양에서 일반적으로 사용되는 영양소 이외에, 다른 성분이 알칼로이드 생산을 개선하기 위해 포함될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 영양 배지는 증강제 (enhancement agent), 유인제 (elicitor), 자극제, 전구체, 억제제, 성장 조절인자, 중금속, 및 에틸렌 억제 화합물로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함한다.

하나 이상의 증강제를 세포 배양물에 첨가하면 알칼로이드 생산을 향상시킬 수 있다. 증강제는 항노화제, 에틸렌의 생합성 또는 작용에 영향을 주는 물질, 식물 성장 조절인자, 전구체, 전구체 또는 요구되는 생성물에 대한 경쟁 반응의 억제제, 유인제, 자스모네이트 및 12-옥소-파이토디엔산 경로의 관련 화합물, 옥신-유사 활성을 갖는 화합물 및 그의 전구체, 및 시토키닌-유사 활성을 갖는 화합물을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 콜레스테롤 및/또는 아세테이트 및/또는 그의 염 (이로 제한되지 않음)을 포함하는 전구체를 배양 배지 내로 첨가하면 생합성 속도 및/또는 최종 수율을 향상시킬 수 있다. 상기 전구체 공급은 요구되지 않는 생합성 경로의 억제제 및/또는 예를 들어 빛에 의한 요구되는 생합성 경로의 자극 (이로 제한되지 않음)과 같은 다른 인자와 조합될 수 있다.

카타란투스 로세우스 (Catharanthus roseus) 세포 배양물에서 인돌 알칼로이드의 생산은 첨가된 옥신-유사 화합물에 의해 억제되는 것으로 알려져 있고; 이와 유사하게, 알칼로이드 생산을 위한 배양 배지에 옥신-유사 물질을 배제하거나 함량을 저하시키면 생산이 향상되었다. 선택된 증강제(들)에 의한 알칼로이드 생산의 향상은 실험에 의해 확인될 수 있다.

알칼로이드 생산 속도는 단일 속도 제한 단계가 아니라 다수의 제한 인자 사이의 복잡한 상호작용에 의해 결정된다. 제한 인자 중의 임의의 하나의 완화가 알칼로이드 생산을 향상시킬 것이지만, 향상의 규모는 특정 제한이 완화된 후 알칼로이드 생산에서의 다른 단계의 상대적인 제한 효과를 결정하는 특정 배양 조건에 따라 결정될 것이다. 다양한 제한 인자 사이의 상호작용에 영향을 주는 배양 조건은 세포의 유전자 구성; 배양 배지의 조성; 및 기체상 환경, 온도, 조도, 및 공정 프로토콜을 포함한다. 특정 배양물에 첨가되는 증강제(들)은 대체로 본원에서 제시되는 개별적인 증강제의 효과를 비교함으로써 실험에 의해 결정될 수 있는, 배양물 내의 제한 인자에 비추어 선택될 것이다. 세포 배양을 위한 증강제의 일반적인 양은 당업계에 공지되어 있다.

유인제는 자스몬산, 메틸 자스모네이트, 천연 또는 합성 자스모네이트, 투버론산, 쿠쿠르브산, 코로나틴, 인다노일 아미드, 예를 들어 6-에틸-인다노일 이소류신, 알칸산, 12-옥소-파이토디엔산, 시스테민, 볼리시틴, 및 임의의 이들 예시적인 유인제에 관련된 화합물을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 유인제는 또한 올리고사카라이드, 예를 들어 식물, 진균, 또는 미생물로부터의 올리고당; 키토산; 키틴; 글루칸; 시클릭 폴리사카라이드; 세균, 진균, 효모, 식물, 또는 곤충으로부터의 세포 물질을 함유하는 제제; 곤충 타액 또는 분비물에 함유된 물질; 식물에서 에틸렌 생합성 또는 작용의 억제제, 특히 은-함유 화합물 또는 복합체, 코발트, 및 아미노에톡시비닐글라이신을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

베라트룸 알칼로이드의 생산을 위해 특히 유용한 유인제는 자스몬산-관련 화합물, 예를 들어 자스모네이트, 쿠쿠르베이트 및 투베로네이트를 포함한다. 또한, 인다노일 아미드도 유용한 유인제이다. 중금속, 예를 들어 카드뮴, 바나듐 및 은은 염 또는 복합체 형태에 유용하다. 키틴, 키토산 (특히, 키토산 글루타메이트), N-아세틸 올리고사카라이드, 펙트산 폴리사카라이드, 진균 글리칸 (5개 이상의 당 함유), 진균 글리코프로테오갈락탄, 스핑고지질 유인제, 펙트산 폴리사카라이드, 및 아라키돈산도 유용한 유인제이다.

예시적인 성장 조절인자 및 억제제는 WO 97/44476 (Bringi)에 개시된 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 또는 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 식물 성장 조절인자는 일반적인 식물 문헌에서 쉽게 알 수 있는 매우 다양한 물질을 포함한다. 이들 중에서, 베라트룸 배양에 특히 적합한 성장 조절인자는 옥신 및/또는 시토키닌-유사 화합물, 예를 들어, 인돌아세트산, 인돌부티르산, 나프탈렌 아세트산 (NAA), 페녹시아세트산 및 할로겐 치환된 페녹시아세트산, 피클로람, 디캄바, 벤질 아미노푸린, 키네틴, 제아틴, 티디아주론, 및 인돌 아세트산을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 아미노산은 세포에 의해 이용되는 임의의 천연 또는 합성 아미노산, 예를 들어 글루타민, 글루탐산, 및 아스파르트산을 포함한다.

알파 아미노 이소부티르산 (rol C-유도를 자극하는) 및/또는 알파 DL-디-플루오르메틸오르니틴 (RI-T-DNA에 의해 유도되는 것과 유사한 표현형/생화학적 상황을 유도할 수 있는)을 포함하고 이로 제한되지 않는 다른 화합물이 비관련 화합물을 감소시키고/시키거나 생성물 수율을 개선하기 위해 배양 배지에 첨가될 수 있다.

또한, 세포 배양에서 산화 갈변을 감소시키거나 방지하는 것이 바람직하다. 따라서, 항갈변제는 페놀계 삼출액의 산화를 억제하기 위해 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 배양물 내의 세포는 배아 세포보다 갈변에 덜 민감한 비분화된 세포이다.

이들 배지 성분에 대해 제안된 농도 범위를 아래에 제시하지만, 통상적인 최적화는 특정 세포주 및/또는 특정 배양 조건에 대한 이들 범위 외의 바람직한 조건을 입증할 수 있다. 모든 농도는 첨가 후에 세포외 배지 내의 초기 값의 평균을 의미한다. 공급 용액 내의 농도 및 따라서 국소적으로 세포와 접촉하는 농도는 표시된 것보다 높을 수 있다. 유인제, 예를 들어 자스몬산-관련 화합물은 약 0.01 μmol/L 내지 약 1 mmol/L, 바람직하게는 약 1 μmol/L 내지 약 500 μmol/L의 용량으로 사용될 수 있다. 세포 물질을 함유하는 제제는 제제의 특정 성분의 농도를 기초로 하여 또는 배양물 부피의 수분의 1로서 첨가될 수 있다. 중금속 및 에틸렌 억제제, 예를 들어 은 염 또는 복합체는 약 1 mmol/L 이하, 바람직하게는 약 0.01 μmol/L 내지 약 500 μmol/L의 농도에서 사용될 수 있다. 대사 경로의 다른 억제제는 약 1 μmol/L 내지 약 5 mmol/L의 농도로 사용될 수 있다. 메틸렌디옥시 관능기를 포함하는 방향족 화합물은 약 0.1 μmol/L 내지 약 5 mmol/L, 바람직하게는 약 1 μmol/L 내지 약 2 mraol/L의 농도로 포함될 수 있다. 성장 조절인자, 예를 들어 옥신-유사 활성을 갖는 화합물; 시토키닌-유사 활성을 갖는 화합물; 지베렐린산-, 아브시스산-, 또는 브라시노스테로이드-유사 활성을 갖는 화합물은 약 0.001 μmol/L 내지 약 2 mmol/L, 바람직하게는 약 0.01 μmol/L 내지 약 1 mmol/L의 농도로 사용될 수 있다. 전구체, 예를 들어 아미노산 또는 테르페노이드 전구체는 약 1 μmol/L 내지 약 20 mmol/L, 바람직하게는 약 10 μmol/L 내지 약 10 mmol/L의 농도로 사용될 수 있다. 지표로서 이들 제안된 농도를 사용하여, 통상적인 최적화를 통해 어떤 성분, 또는 성분의 조합, 및 상기 제안된 범위를 벗어난 농도를 포함하여 어떤 농도가 알칼로이드 생산의 최대화를 위해 유용할 것인지 파악할 수 있다.

세포 배양: 다른 반응 조건

상기 설명된 바와 같이, 세포는 생산 및/또는 성장에 유리한 조건 하에서 배양될 수 있다. 배지 성분의 변경 이외에, 다른 반응 조건도 요구되는 결과를 얻기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, 온도 범위가 조정될 수 있다. 바람직한 온도는 약 0℃ 내지 약 35℃, 보다 바람직하게는 약 15℃ 내지 약 35℃, 훨씬 더 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 30℃를 포함한다. 이와 유사하게, 명/암 주기의 기간을 변경할 수 있거나, 또는 생산 주기 내에 암소에서의 제1 기간 (24시간 초과), 이어서 밝은 상태 (바람직하게는 약 10 μmol 광자 m^-2s^-1 내지 약 250 μmol 광자 m^-2s^-1)에서의 제2 기간 (24시간 초과)을 적용할 수 있다. 상기 절차는 1회 또는 2회 적용될 수 있거나, 또는 반복적인 방식으로 수회 적용될 수 있다.

산소, 이산화탄소, 및 에틸렌과 같은 기체의 수준은 알칼로이드 생산에 유리하도록 또는 생물량 축적에 유리하도록 제어될 수 있다. 시트, 플러그 또는 뚜껑과 같은 일반적인 닫는 수단이 있는, 공기 분위기에서 유지되는 실험 규모 배양 용기에서의 통상적인 배양은 공기 포화 미만의 용존 산소 수준 및 대기 공기에 존재하는 것보다 높은 이산화탄소 및 에틸렌 수준을 생성한다. 따라서, 통상적으로, 배양물의 상부 공간 (head-space) 내의 이산화탄소 수준은 일반적으로 약 0.03% v/v 초과이다. 그러나, 이산화탄소 및/또는 에틸렌의 농도는 알칼로이드 생산에 유리하도록 또는 세포 증식에 유리하도록 조정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 알칼로이드 생산은 작동 온도에서 액체와 평형을 이루는 상부 공간 또는 폭기 스트림 내의 이산화탄소 수준을 약 0.1% (대략 대기의 3배) 내지 약 10%, 바람직하게는 약 0.3% 내지 약 7%로 조정함으로써 유리해진다. 또 다른 실시양태에서, 에틸렌은 작동 온도에서 액체상과 평형을 이루는 기체상에서 측정될 때 약 500 ppm 미만, 바람직하게는 200 ppm 미만이다. 기체는 또한 독립적으로 제공될 수 있고, 예를 들어 산소 및 이산화탄소의 공급원은 상이할 수 있다.

용해된 기체는 교반 속도, 폭기 기체의 조성, 폭기 기체의 공급 속도, 폭기 기체의 환기 속도, 및 배양 용기 내의 총 압력 중의 하나 이상을 변경함으로써 제어될 수 있다. 교반 속도는 분당 약 1 내지 약 500회 (교반기의 회전 또는 진동 또는 유체의 순환)에서 제어될 수 있다. 기체의 공급 속도는 세포 생물량 축적 또는 유지 또는 생성물 형성에 적당하거나 최적인 용존 기체 농도의 달성에 적절한 임의의 속도일 수 있다. 바람직하게는, 상기 속도는 분당 배양조의 부피당 약 0.01 내지 약 10 부피의 기체이고, 직접 배양 액체 내로 또는 후에 배양물의 나머지와 혼합되는 액체의 별개의 부분 내로, 또는 배양물의 상부 공간 내로, 또는 기체 종을 배양 배지와 접촉시키기 위한 장치 내로 공급될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 용존 산소 농도는 작동 온도에서 공기 포화의 약 10% 내지 약 200%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 150%로 제어된다. 물론, 다양한 작동상의 이유, 예를 들어 일시적인 폭기 감소 때문에, 용존 산소 수준이 수분 내지 수시간 동안 0만큼 낮을 수 있는 것도 가능하다. 상기 범위 이외의 산소, 이산화탄소, 및 에틸렌의 구체적인 유용한 조합이 통상적인 실험을 통해 발견될 수 있고, 본 발명의 범위 내에 해당하는 것으로 간주된다.

세포 배양: 공정 작동

식물 세포 배양 공정을 위한 작동 방식은 영양소, 세포, 및 생성물이 시간에 따라 첨가되거나 제거되는 방식을 의미한다 (Payne et al. 1991). 세포에 제공되는 성분은 많은 상이한 방식으로 제공될 수 있다. 성분은 유도기, 대수기, 또는 정지기와 같은 특정 성장 단계에서 첨가될 수 있다. 모든 성분은 한번에 제공될 수 있고, 적합한 기간 후에 생성물을 회수할 수 있다. 별법으로, 모든 성분이 동시에 제공될 수 있는 것은 아니다. 오히려, 성분 중의 하나 이상이 배양 동안 상이한 시간에 제공될 수 있다. 또한, 첨가는 불연속적이거나 초기 접촉 시간에 대해 시차를 두고 이루어질 수 있고, 이러한 제공 기간은 상이한 성분에 대해 다를 수 있다. 성분들은 다수의 부분으로 제공될 수 있다. 하나 이상의 성분은 세포 배양물 또는 그의 부분과 별개로 접촉하는 용액의 일부로서 공급될 수 있다. 배양물의 일부는 임의의 시점에 또는 주기적으로 제거하여 냉동 보존, 추가의 세포 증식, 생산, 및/또는 회수를 위해 사용될 수 있다. 그러한 세포-함유 부분은 영양소 또는 요구되는 다른 성분에 추가로 노출될 수 있다. 예시적인 계대배양 절차가 본원에 기재된다.

하나의 실시양태에서, 제거된 부피의 일부 또는 전부를 보충하기 위해서 영양소 또는 다른 성분을 함유하는 배지를 첨가할 수 있다. 보충 (희석) 속도 (용기 내의 액체 부피로 나눈 첨가 부피 속도)는 세포의 특이적 성장 속도의 0.1배 내지 10배로 다를 수 있다. 상기 제거된 물질의 일부는 본래의 배양물 내로 다시 첨가될 수 있고, 예를 들어, 세포 및 배지가 제거되고, 세포 또는 배지의 일부는 생성물 회수를 위해 사용될 수 있고, 나머지 세포 또는 배지는 재사용될 수 있다. 성분의 배양물로의 공급 속도 또는 배양물 내의 다양한 성분의 수준은 생성물을 유리하게 생산하고 회수하도록 제어될 수 있다. 배양물의 별개의 부분이 상기 임의의 방식에서 성분에 노출된 후, 생산에 유리한 것으로 결정된 비율로 조합될 수 있다. 또한, 배양물의 세포 함량은 유리하게 생성물을 생산하거나 세포를 증식시키도록 조정될 수 있다. 세포 함량의 조정은 영양소 또는 다른 성분과 접촉시키기 위한 전략과 유리하게 조합될 수 있다.

배양 방법은 배지 교환을 포함할 수 있다. 예를 들어, WO 97/44476 (Bringi)에 기재된 바와 같이, 주기적으로, 예를 들어 수일마다 소비된 배지를 제거하고 신선한 배지를 보충하면 총 생산을 유의하게 향상시킬 뿐만 아니라 세포외 생성물의 양을 증가시킬 수 있다. 배지 교환의 자극 효과는 피드백 억제 및 생성물 분해를 방지하는 계내 생성물의 제거에 의한 것일 수 있다. 비관련 식물의 현탁 배양물에서 2차 대사물질 생산 및 분비에 대한 상기 계내 생성물 제거의 긍정적인 효과는 문헌 [Robins et al., "The Stimulation of Anthraquinone Production by Cinchona ledgeriana Cultures with Polymeric Adsorbents," Appl. Microbiol. Biotechnol. 24: 35-41 (1986)] 및 [Asada et al., "Stimulation of Ajmalicine Production and Excretion from Catharanthus roseus: Effects of Adsorption in situ, Elicitors and Alginate Immobilization," Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:475-81 (1989)]에 기재되어 있다. 소비된 배지의 주기적인 제거는 상기 잇점을 제공하고, 배지로부터 다른 억제 성분을 제거함으로써 2차 생합성을 탈억제 (de-repression)하는 기능을 수행할 수 있다. 계내 생성물 제거는 또한 배지 교환 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 생성물은 추가의 생산을 자극하기 위해 수지 흡착에 의해 제거될 수 있다.

또한, 활발한 생합성이 일어나는 세포에 신선한 배지를 보충하면, 고갈된 필수 영양소를 제공함으로써 생산을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 미야사까 (Miyasaka) 등은 간단히 수크로스를 배지에 첨가함으로써 디테르펜 대사물질인 크립토탄시논 및 페루기놀을 생산하기 위해 살비아 밀티오리자 (Salvia miltiorhiza)의 정지기 세포를 자극할 수 있었다 [Miyasaka et al., "Regulation of Ferruginol and Cryptotanshinone Biosynthesis in Cell Suspension Cultures of Salvia Miltiorrhiza," Phylochemistry 25: 637-640 (1986)]. 생합성은 정지기에서 탄소 제한에 의해 중지된 것으로 추정되었다. 본 배양 방법을 위한 주기적인 배지 교환 프로토콜은 유사한 잇점을 제공할 수 있다.

교환되는 배지의 양, 교환 빈도, 및 보충되는 배지의 조성은 본 발명의 다양한 실시양태에 따라 상이할 수 있음이 고려된다. 배지 교환에 의해 생합성 및 분비를 자극하는 능력은 연속식, 반연속식, 또는 유가식 (fed-batch)에서 효율적인 상업적인 공정의 설계 및 작동을 위해 중요한 의미를 갖는다.

모든 영양소가 초기에 공급되고, 세포 및 생성물을 포함하는 배양 내용물이 배양 기간 종료시에 수거될 때, 이 작동 방식은 "1단계 배치 (batch) 공정"으로 불린다. 실제로, 예를 들어 상이한 성분에 대한 별도의 처리 요건 때문에 일부 성분은 먼저 첨가되고, 다른 성분은 얼마 후에 첨가될 수 있다. 배치 공정이 2개의 기 사이에서 배지를 교환하는 2개의 순차적인 기, 즉 성장기 및 생산기로 나뉠 때, 작동 방식은 "2단계 성장/생산 배치 공정"으로 불린다. 이 방법은 갑작스런 단계적인 변경에 의한, 또는 일련의 단계에 의해 점진적인 변경에 의한, 또는 점진적인 연속적인 변경에 의한, 성장 배지로부터 생산 배지로의 과도기를 포함할 수 있다. 한 예에서, 점진적인 변경은 조성이 증가하는 배지에 의한 점진적인 대체에 의해 달성된다. 또 다른 예에서, 점진적인 변경은 생산 배지의 하나 이상의 성분을 성장기 배양물에 공급함으로써 달성된다. 이것은 유가식 공정의 일례이다. "유가식" 작동에서, 특정 배지 성분, 예를 들어 영양소 및/또는 하나 이상의 증강제는 1단계 또는 2단계 배양 과정의 전부 또는 일부 동안 주기적으로 또는 연속적으로 공급된다. 영양소 및 증강제에 대한 설명은 예를 들어 WO 97/44476의 표 A 또는 표 1 및 2에서 볼 수 있다. 추가로, 갑작스런 변경 및 점진적인 변경의 조합도 사용될 때. 한 예에서, 영양 배지의 몇몇 부분은 다른 성분이 서서히 공급되는 동안 갑작스럽게 변경될 수 있다.

유가식을 사용할 때, 세포는 연장된 기간 동안 생산성 상태에서 유지될 수 있고, 세포의 생산성이 향상될 수 있음이 밝혀졌다. 공급물의 조성은 요구되는 결과, 예를 들어 생산 수율을 증가시키기 위한 생산기의 연장, 또는 보다 높은 생물량 밀도를 달성하기 위한 성장기의 연장을 달성하기 위해 변경될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 최적 생산성 및 성능을 달성하기 위한 적합한 조건은 본원에 기재된 교시내용에 비추어 통상적인 기술자의 기술 범위 내에서 용이하게 선택할 수 있다. 유사하게, 다른 작동 파라미터, 예를 들어 요구되는 결과를 달성하기 위한 첨가 타이밍 및 기간 및 유가식 성분의 첨가 속도의 변경은 본원에 기재된 교시내용에 비추어 당업자의 능력 내에서 수행될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 배치 배양물의 내용물의 전부는 아니지만 실질적인 부분을 계속된 세포 성장 및 생산을 위해 신선한 배지로 교체하고; 상기 공정 방식은 "반복적인 배출 및 충전 (repeated draw and fill)" 작동과 유사하고, "반연속식 공정"으로 불린다. 또 다른 실시양태에서, 공정은 "연속식"이다. 즉, 신선한 배지가 연속적으로 공급되고, 유출 배지는 연속적으로 또는 반복적으로 제거된다.

하나의 실시양태에서, 작동 방식은 "관류 방식"이다. 즉, 세포는 반응기 내에 실질적으로 유지된다. 또 다른 실시양태에서, 공정은 "항성분 배양 (chemostat) 방식"이다. 즉, 세포는 유출 배지와 함께 연속적으로 제거된다.

일단 개시되면, 현탁 배양물은 세포를 배지로부터 실질적으로 분리한 후 (일반적으로 여과에 의해), 일부를 영양소를 함유하는 배지에 재도입함으로써, 또는 일정 부피의 배양 브로쓰 (broth)를 영양소를 함유하는 배지에 옮김으로써, 또는 세포를 침강시킨 후 이미 존재하는 배지의 임의의 부분을 제거하고 영양소-함유 배지를 재도입함으로써 추가로 배양될 수 있다. 세포를 분리하고 상이한 영양소-함유 배지에 옮긴 경우, 옮겨지는 양은 신선한 중량 기준으로 약 0.3% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 25%일 수 있다. 세포가 순응하고/하거나 성장할 때, 상기 비율은 변할 수 있음을 유의한다. 세포 및 배지가 부피 기준으로 옮겨질 때, 옮겨지는 부피 대 최종 부피의 비율은 약 1% 내지 실질적으로 모든 부피일 수 있다. 이 경우, 신선한 영양분은 농축된 형태로 공급될 수 있고, 단지 작은 부피 증가만을 야기할 수 있다. 따라서, 배양물은 여러 부분으로 나뉠 수 있다. 하나의 실시양태에서, 각각의 부분은 임의로 알칼로이드 생산을 위해 사용된다. 각각의 부분은 서로와 또는 본래 배양물과 동일한 조건 하에서 배양될 수 있지만, 꼭 그럴 필요는 없다. 배양 기간은 바람직하게는 2-50일, 2-15일, 5-10일, 또는 약 7일이다. 성장 기간은 부분적으로 고갈된 배지를 영양소로 보충함으로써 연장될 수 있다.

알칼로이드 회수

알칼로이드는 전체 배양물 또는 배양물의 임의의 부분 (배지 단독, 세포 단독, 또는 일정량의 세포와 배지 둘 모두)으로부터 회수할 수 있다. 세포 물질은 추출 절차에 앞서 동결건조될 수 있다. 세포 물질 및/또는 적절한 추출 방법을 위한 배지를 제조하기 위해 당업계에 공지된 다른 방법을 사용할 수 있다. 알칼로이드는 비수성 극성 용매를 사용하는 추출, 산성 배지를 사용하는 추출, 염기성 배지를 사용하는 추출, 수지 흡수에 의한 회수 (여기서, 수지는 배양 용기의 내부 또는 외부에 존재함)를 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 회수할 수 있다. 알칼로이드는 배양 동안 임의의 시점에 또는 배양 기간의 완료 후에 회수할 수 있다.

특정 특징이 특정 실시양태에 관하여 설명될 수 있지만, 각각의 특징은 독립적으로 또는 백합과의 배양물에서 베라트룸 알칼로이드의 생산을 증가시키기 위해 본원에 기재된 임의의 다른 특징과 조합으로 사용될 수 있다. 본원에 기재된 본 발명을 더욱 명백히 설명하기 위해, 다음의 비-제한적인 실시예를 제공한다.

실시예

실시예 1: 베라트룸 세포의 배양

베라트룸 세포 배양은 인정되는 식물 세포 배양 기술을 이용하여 베라트룸 식물의 임의의 적합한 부위로부터 개시하였다. 실질적으로 비분화된 세포를 고화 배지 상에서 배양된 세포가 교반을 요구하지 않는 것을 제외하고는 다음 조건 하에서 고화 또는 액체 영양 배지 상에서 증식시켰다. 배양물을 혼합하기 위해 교반을 이용하고 산소 및 다른 기체를 제공하고 산소-함유 기체를 세포 현탁액과 접촉시킴으로써 통기시킴으로써 20-30℃에서 pH A-7에서 암소에서 베라트룸 세포를 배양하였다. 산소는 작동 온도에서 10%-150%의 공기 포화에서 유지하고, 이산화탄소는 0.05%보다 더 높게 유지하였다. 산소 및 다른 기체의 수준은 교반, 압력, 기체의 조성, 통기 속도, 및/또는 기체의 공급 속도를 조정함으로써 제어하였다.

배지는 베라트룸 세포 성장을 지지할 수 있는 성분을 함유한다. 예를 들어, 배지는 당 (약 1-100 g/L) 및 하나 이상의 공급원으로부터의 누적 질소 (약 1-100 mmol/L)를 함유할 수 있다. 배지는 또한 성장 조절인자, 예를 들어 옥신 및/또는 시토키닌-유사 화합물, 예를 들어, 나프탈렌 아세트산 (NAA), 페녹시아세트산 및 할로겐 치환된 페녹시아세트산, 피클로람, 디캄바, 벤질아미노푸린, 키네틴. 제아틴, 티디아주론, 및/또는 인돌 아세트산을 함유할 수 있다. 배지는 임의로 다른 베라트룸 알칼로이드, 아미노산, 예를 들어 글루타민, 은 이온의 공급원, 예를 들어, 질산은 또는 티오황산은, 또는 에틸렌 생합성 또는 작용에 영향을 미칠 수 있는 다른 성분을 함유할 수 있다. 베라트룸 세포의 접종물 농도는 약 10 g의 신선한 세포 중량/L 내지 약 300 g의 신선한 세포 중량/L일 수 있다. 배지는 또한 하나 이상의 유인제, 예를 들어 인다노일 아미드, 자스몬산-관련 물질, 또는 또 다른 유인제를 함유할 수 있다.

이들 배지 성분은 배양 개시시에, 대수 성장기 후에, 또는 배양 기간 전체에 걸쳐서 간헐적으로 첨가될 수 있다. 배지 성분은 한번에 또는 배양 동안 상이한 시간에 첨가될 수 있고, 연속적으로 또는 간헐적으로 공급될 수 있다. 성분은 배양 브로쓰에 식물 세포를 도입하기 전 또는 후에 첨가될 수 있다. 또한, 영양소 또는 다른 성분은 배양 동안 첨가될 수 있다. 임의로, 배지를 적합한 배양 기간 후에 교환할 수 있고, 이에 의해 세포는 상기한 바와 유사한 성분을 함유하는 배지에 새로이 노출된다. 이러한 변경은 하나 이상의 당, 예를 들어 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 및 말토스의 양 변경, 및/또는 하나 이상의 질소 공급원, 예를 들어 니트레이트, 암모늄, 아미노산, 카사미노산의 양 변경을 포함한다.

배양 기간 후에, 배양물을 수거하고, 베라트룸 알칼로이드의 수준을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 정량하고, 구체적인 베라트룸 알칼로이드는 액체 크로마토그래피-포토다이오드 어레이-질량분광계 (LC- PDA-MS)를 사용하여 확인한다. 베라트룸 알칼로이드는 적절한 추출 및 정제 절차에 의해 상기 배양물로부터 회수될 수 있다.

실시예 2: 베라트룸 알칼로이드의 검출 및 정량

본 실시예는 베라트룸 종 배양물에서 시클로파민, 제르빈, 및 관련 스테로이드성 알칼로이드를 정량하기 위한 적절한 분석 방법을 제공한다. 초기 스크리닝을 액체 크로마토그래피-포토다이오드 어레이-질량분광계 (LC-PDA-MS)에 의해 수행하였다. 이 기술은 특히 다중 반응 모니터링 (MRM) 및 단일 이온 모니터 (SIM)처럼 몇몇의 특수 질량 분광 시험을 사용할 때 복합적인 혼합물에서 화합물의 확인시에 특히 유용하다. 상기 표적화 방법은 세포 배양물에서 하나 이상의 표적 화합물의 생산을 조사하기 위해 적합하다.

MRM 실험에서, 분석물의 Q1 스캔 (풀 (full) 스캔, 제1 사중극자) 및 MSMS 스캔 (단편 및 생성물이 얻어짐)을 수행하였다. 이어서, 양성자화된 유사 분자 이온 (M+H⁺)의 특정 단편화 생성물을 그의 초기 스캔을 기초로 하여 선택하였다. 이어서, 선택된 이온쌍을 기초로 하여 보다 민감한 검출을 달성하기 위해 기기 최적화를 수행하였다. 선택 방법은 ㎍/L 수준에서 정확하고 정밀하고 민감한 것으로 입증되었다.

삼중 사중극자 기기를 사용한 MRM 실험은 표적 화합물에 대한 최대 검출 감도를 얻도록 설계되었다. 상기 종류의 질량분광 실험은 제약 산업에서 약물 및 약물 대사물질의 검출 및 정량을 위해 널리 사용된다.

상기 기술을 이용하여, 약물 분자의 구조 및 분자량이 알려진 경우 약물 분자의 많은 공통적인 대사물질에 대한 전구체 m/z 및 단편 m/z (MRM 전이 (transition))를 예측할 수 있다. 이들 MRM 실험은 특정 대사물질의 스크리닝을 위해 사용될 수 있고, 대사물질 구조를 확인하기 위한 의존적 생성물 이온 스캔을 유발할 수 있다. 표적 분자의 분자량 및 구조가 알려진 경우 세포 배양에서 표적 분자의 생산 및 최적화를 연구하기 위해 동일한 원칙이 적용될 수 있다. 상기 고감도 MRM 시험은 생성물 이온 스캔 (MS/MS)의 의존적 획득을 유발하기 위해 사용되었다. 시클로파민 및 제르빈이 상기 방법을 사용하여 베라트룸 종 식물 세포 배양물에서 검출되었다.

일반적인 방법: 특히 언급된 경우를 제외하고, 각각의 실시예에서 다음 방법을 이용하였다.

장비 및 물질:

시약: 아세토니트릴 (HPLC 등급), 메탄올 (HPLC 등급), CHCl₃, 및 빙초산 (모두 VWR에서 구입함)

표준물: 시클로파민, 제르빈, 및/또는 토마티딘 (칼바이오켐 (Calbiochem)).

장비: 콰트로 프리미어 (Quattro Premier) 삼중 사중극자 질량분광계 (마이크로매스 엘티디. (Micromass Ltd.)), 어퀴티 (Acquity) UPLC 시스템 (워터스 (Waters)), BEH C₁₈ 컬럼 (1,7 ㎛, 2.1x50 mm, 워터스)

표준물 제조

1 mg 알칼로이드 (예를 들어, 제르빈, 시클로파민, 토마티딘)를 최종 부피 10 mL로 산성 메탄올 (0.1% 아세트산 v/v)에 개별적으로 용해시켰다. 표준물 용액을 1 min 동안 초음파 처리하였다.

샘플 제조: 각각의 베라트룸 샘플을 유리 바이알 내에서 눌러 부수고, 산성 메탄올 (20 mL, 1% 포름산)을 첨가하였다. 샘플을 2 hr 동안 초음파 처리한 후, 암소에서 철야 정치하였다. 바이알을 원심분리하고, 그의 상등액을 제거하였다. 상등액을 회전 증발기에서 농축하고, 생성되는 추출물을 산성 메탄올 (1% 포름산 v/v) 내에 재구성하였다.

액체 크로마토그래피 분리: 분리는 BEH C₁₈ 컬럼 (1.7 ㎛, 2.1x50 mm)가 장치된 워터스 어퀴티 UPLC 시스템에서 수행하였다. 20 마이크로리터 (20 μL) 분취액을 자동 샘플러를 사용하여 주입하였다. 용매 A는 탈이온수 내의 0.05% 포름산이었고, 용매 B는 0.05% 포름산이 존재하는 HPLC 등급 아세토니트릴이었다.

분리는 1분 동안 77% A에서의 초기 유지, 4.5분 동안 77% A로부터 100% B로의 선형 구배, 이어서 0.1분 동안 100% B에서의 유지에 의해 달성되었다. 분석 동안, 유속은 350 μL/min이었고, 컬럼은 35℃에서 유지되었다.

질량 분광법: 모든 질량 데이터는 콰트로 프리미어 삼중 사중극자 질량분광계 (마이크로매스 엘티디.)에서 얻었다. 질량분광계는 MassLynx V4.0 소프트웨어 제어 하에 작동되었다. 조사된 샘플에 대해, 기기는 모세관 전압 3.50 kV, 탈용매 (desolvation) 온도 120℃, 공급원 온도 120℃, 및 샘플 콘 (cone) 전압 45 V에서 양이온 방식 전기분무화로 작동되었다 (시클로파민 및 제르빈의 예시적인 검출에 대해서는, 실시예 4, 도 3을 참조한다).

실시예 3: 캘러스 배양물로부터 시클로파민의 생산

베라트룸 칼리포르니쿰의 종자를 표준 기술을 사용하여 표면 멸균하고, 아가-고화 성장 배지 상에서 배양하였다. 몇몇 예에서, 종자를 물을 빨아들인 필터 상에 1 내지 3개월 동안 위치시킨 후, 2 내지 4주 동안 물/아가 (0.5-1% 아가 w/v) 조합물에 옮겼다. 성장 배지는 다음을 포함하였다:

MS 염, 2% w/v 수크로스, 및 10 마이크로몰/L 피클로람;

MS 염, 2% w/v 수크로스, 및 10 마이크로몰/L 디캄바;

MS 염, 2% w/v 수크로스, 및 10 마이크로몰/L 알파-나프탈렌 아세트산 (NAA).

현탁 배양의 개시 (실시예 4에 설명됨) 전에, MS 염, 2% 수크로스, 및 10 μM 디캄바를 함유하는 고화 배지 상에서 캘러스를 형성시키고 배양하였다. 캘러스 이송은 캘러스 성장에 따라 약 1-8주마다 주기적으로 수행하였다.

대략 50 mg의 캘러스 샘플을 유리 바이알 내에서 눌러 부수고, 초음파 처리조에서 60분 동안 각각 2 ml 산성 메탄올 및 CHCl₃ 혼합물 (1:1 v/v)로 3회 추출하였다. 매번, 바이알을 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 상등액을 합하여 원심분리 증발기 (게나박 (Genavac))에서 농축하였다. 생성된 추출물을 최종 부피 0.4 mL로 클로로포름 (CHCl₃) 및 메탄올 (MeOH) 혼합물에 재구성하였다.

크로마토그래피 분리는 1분 동안 95% A에서의 초기 유지, 10분 동안 95% A로부터 100% B로의 선형 구배, 이어서 1분 동안 100% B에서의 유지를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 바와 같이 달성하였다. 유속은 0.3 mL/min이었다.

질량 분광법 분석을 위해, 각각의 액체 스트림의 샘플은 150 내지 1000 Da에서 얻은 질량 스펙트럼을 사용하여 0.1 s 동안 채취하였다. 기기는 모세관 전압 3.00 kV, 탈용매 온도 120℃, 공급원 온도 100℃, 및 샘플 콘 전압 45 V에서 양이온 방식 전기분무화로 작동되었다.

시클로파민은 두 캘러스 모두에서 검출되었다. 도 1 및 도 2를 참조한다.

실시예 4: 현탁 배양물로부터 알칼로이드 생산

현탁 배양은 약 1 g의 캘러스 물질을 MS 염, 2% 수크로스, 및 10 μM 디캄바를 함유하는 25 ml의 액체 성장 배지가 담긴 125 ml 에를렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크에 옮김으로써 개시하였다. 상기 현탁 배양물을 1'-쓰로우 진탕기 (throw shaker)에서 120 rpm에서 진탕함으로써 암소에서 유지하였다. 기체 이동이 가능하도록 개방 셀 실리콘 포움 마개 (open cell silicone foam closure)로 플라스크를 막았다. 플라스크를 공기 분위기에서 유지하였다. 캘러스로부터의 현탁 세포를 총 45일 동안 적절한 이동 간격으로 액체 성장 배지에 5회 옮겼고; 마지막 싸이클 시간은 11일이었다.

4개의 베라트룸 칼리포르니쿰 배양물로부터의 현탁 세포를 MS-PM (MS 염, 다량영양소, 미량영양소, 비타민, 5% 수크로스, 100 μM 메틸 자스모네이트 (MJS), 및 20 μM 디캄바를 함유하는 무라시게 및 스쿡 기본 염-기반 생산 배지) 내로 20% w/v의 신선한 중량 접종물 농도에서 접종하였다. 배양물을 공기 분위기에서 암소에서 25℃에서 180 rpm에서 진탕하면서 14일 동안 인큐베이팅하였다.

현탁 세포는 일반적인 방법에 따른 분석을 위해 제조하고 (실시예 2 참조), 각각의 재구성된 추출물의 2 mL 바이알로부터의 용매를 질소 스트림에 의해 제거하였다. 샘플 추출물을 분석 전에 200 μL의 산성 메탄올 (1% 포름산)에 재용해시켰다.

데이터 획득은 양성자화된 유사 분자 이온의 선택된 단편화 생성물의 풀 스캔 및 다중 반응 모니터링 (MRM)으로 수행하였다 (시클로파민 m/z에 대해, M+H⁺, 412.69 -> 321.65 및 제르빈에 대해 426.58 -> 313.54). 기지량의 시클로파민 및 제르빈을 함유하는 20 μL의 산성 MeOH (1% 포름산) 용액을 주입함으로써 관심있는 각각의 표적 화합물에 대한 적절한 4점 교정 곡선을 작성하였다.

관심있는 2가지 알칼로이드, 즉 제르빈 및 시클로파민의 확인은 그의 체류 시간, PDA UV 스펙트럼, MS 스펙트럼, 및 MS/MS 스펙트럼을 공지의 표준물과 비교함으로써 수행하였다. 제르빈 및 시클로파민은 하나의 세포 배양물에서 검출되었다 (도 3 및 도 4 참조). 추출물 내의 시클로파민의 농도는 정량 한계 미만이었지만, 검출 한계 이상이었다 (3:1, 신호 대 노이즈 비). 시클로파민은 ㎍/L 수준에서 검출되었다.

실시예 5: 현탁 배양물로부터 알칼로이드 생산

베라트룸 칼리포르니쿰의 종자를 표면 멸균하고, 배아를 추출하고, 실시예 3에 설명된 바와 같이 다양한 고체 배지 상에 두었다. 표면 멸균 후에, 상기 배아는 SH 염, 2% w/v 수크로스, 및 10 μM 디캄바를 함유하는 고체 배지 상에 직접 두었다. 비분화된 세포의 캘러스가 생산될 때까지 고체 배지 상에서 배양을 계속하였다.

세포 밀도 5% (w/v)의 캘러스 부분을 현탁 배양물을 형성하기 위해 SH 염, 2% 수크로스, 및 10 μM 디캄바를 함유하는 액체 성장 배지에 두었다. 상기 현탁 배양물에 대한 성장 지수는 7일 성장 기간에 걸쳐 약 2이었다 (성장 지수는 배양 지속 기간에 걸쳐 최종 신선 또는 건조 중량 대 대응하는 초기 신선 또는 건조 중량의 비이다). 세포를 여과에 의해 분리한 후, 20% w/v의 출발 접종 밀도에서 MS-PM 또는 SH-PM에 접종하였다. 샘플을 공기 분위기에서 85% 습도 및 180 rpm에서 암소에서 25℃의 온도에서 인큐베이팅하였다. 배양물을 8, 9, 및 10일의 인큐베이션 후에 샘플링하고 분석하였다. 베라트룸 칼리포르니쿰의 하나의 현탁 세포 배양물에 대해, 베라트룸 알칼로이드 생산은 MS-PM 및 SH-PM 모두에서 제9일에 가장 높았다. 도 5a 및 도 5b를 참조한다. 도 6 및 도 7은 동일한 세포 배양을 사용한 반복 시험으로부터의 데이터를 보여준다. 베라트룸 칼리포르니쿰의 또 다른 현탁 세포 배양물에 대한 결과를 도 8 및 도 9에 제시한다.

시클로파민 및 제르빈이 각각의 샘플에서 검출되었다. 알칼로이드 생산은 제8일부터 게속 증가한 후, 이후 제14경에는 감소하였다.

실시예 6: 2단계 방법을 사용한 베라트룸 세포의 냉동 보존

베라트룸 칼리포르니쿰 세포주 VEACCSP-94 비분화된 세포를 액체 GM (IND64) 배지에서 약 7일 동안 사전-배양하였다. 사전-배양 후에, 비분화된 세포를 약 0.8% 또는 약 1.0% 아가로스를 포함하는 고체 GM (IND-64) 배지 플레이트에 옮겼다.

사전-배양 후에, 베라트룸 세포를 0.3-0.5 M 소르비톨을 함유하는 액체 GM (IND-64) 배지에 옮기고, 약 25℃에서 약 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후에, 베라트룸 세포를 액체 냉동 보존 1 배지에 옮기고, 약 2-4시간 동안 약 0℃ 내지 4℃에서 인큐베이팅하였다.

이어서, 베라트룸 세포를 세포가 약 -40℃로 냉각될 때까지 약 -0.33 ℃/분의 속도로 냉각하였다. 냉각된 세포를 즉시 액체 질소 내에 넣고, 냉동 보존하였다.

실시예 7: 해동된 베라트룸 세포의 회수

실시예 6의 냉동 보존된 베라트룸 세포를 세포가 더이상 동결되지 않을 때까지 때때로 교반하면서 42℃ 수조에서 동결 상태로부터 해동시켰다. 해동된 세포의 세포 생활력을 결정하기 위해서 TTC 세포 생활력 시험을 해동된 세포에 대해 수행하였다. TTC 세포 생활력 시험은 당업자에게 공지되어 있다. TTC 시험은 50% 초과의 해동된 세포가 생존가능함을 보여준다.

실시예 8: 유리화를 통한 냉동 보존

본원에서 상기 제시된 바와 같이 비분화된 베라트룸 식물 세포를 고체 GM (IND64) 배지 상에서 약 7일 동안 사전-배양한 후, 식물 세포를 유리화 기술을 사용하여 냉동 보존하였다. 배양된 베라트룸 식물 세포를 약 0.5 M 소르비톨을 포함하는 액체 GM (IND64) 배지 내로 옮기고, 식물 세포를 약 32시간 동안 회전 진탕기 (120 rpm) 상에서 배양하였다. 옮겨진 베라트룸 현탁 식물 세포는 벨코 균질화기 및 벨코 셀렉터™ 조직 체 (20 메쉬/860 ㎛) (벨코 바이오테크놀로지, 미국 뉴저지주 바인랜드)를 사용하여 생성된 작은 응집된 식물 세포이다.

이어서, 액체 GM (IND64) 배지를 제거하고, 베라트룸 식물 세포를 후속적으로 냉동 보존 2 배지 내에 옮겼다. 냉동 보존 2 배지의 조성을 표 7에 제시한다.

^* 선택된 당은 중성 당, 알콜 당, 수크로스, 말토스, 트레할로스 또는 글리세롤을 의도한다. 중성 당은 글루코스, 아라비노스, 자일로스, 만노스, 갈락토스, 람노스 또는 글루쿠론산을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 알콜 당은 말티톨, 소르비톨, 자일리톨, 이소말트, 락티톨, 에리쓰리톨 또는 만니톨을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

^** 선택된 트리사카라이드는 멜레지토스, 파노스, 라피노스, 케스토스 또는 락토수크로스를 의도한다.

베라트룸 식물 세포를 냉동 보존 2 배지 (세포 밀도 = 20%) 내에서 약 3시간 동안 약 4℃에서 인큐베이팅한 후, 냉동 보존 2 배지를 제거하였다. 약 1부의 냉동 보존 2 배지-처리된 베라트룸 식물 세포를 칭량하고, 각각의 냉동 바이알 내에 첨가하였다. 약 5부의 차가운 동결방지제 용액을 각각의 냉동 바이알에 첨가하고, 세포를 0℃에서 (얼음 상에서) 단기간 동안 인큐베이팅하였다. 차가운 동결방지제 용액의 조성을 표 8에 제공한다. 상기 인큐베이션 직후에, 냉동 바이알을 액체 질소에 침지시켰다.

^* 선택된 당은 중성 당, 알콜 당, 수크로스, 말토스, 트레할로스 또는 글리세롤을 의도한다. 중성 당은 글루코스, 아라비노스, 자일로스, 만노스, 갈락토스, 람노스 또는 글루쿠론산을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 알콜 당은 말티톨, 소르비톨, 자일리톨, 이소말트, 락티톨, 에리쓰리톨 또는 만니톨을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

냉동 보존된 베라트룸 식물 세포를 포함하는 냉동 바이알은 냉동 보존 후에 약 4분 동안 또는 동결된 세포가 해동될 때까지 때때로 교반하거나 또는 부드럽게 진탕하면서 수조 또는 다른 지속되는 온도 환경에서 약 40℃의 온도에서 해동시켰다.

냉동 바이알의 해동 및 멸균 후에 (일반적으로 에탄올 노출에 의해), 각각의 해동 및 멸균시킨 냉동 바이알의 내용물을 약 5-10 mM 2가 양이온 및 약 0.1 - 1.0 M소르비톨을 함유하는 10 ml의 액체 배지에 10분 동안 붓고/희석한 후, 용액을 제거하기 위해 흡입 필터를 통과시키고, 여과지 상의 세포는 고체 GM (IND64) 배지로 옮기고, 25℃에서 암소에서 16-24시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포가 있는 여과지는 신선한 고체 GM (IND64) 배지로 옮기고, 이어서 세포 기능의 회복을 위해 7일마다 25℃에서 암소에서 신선한 GM 배지로 옮겼다.

Claims (28)

1. a. 비분화된 베라트룸(Veratrum) 세포를 영양 배지에서 배양하여 하나 이상의 알칼로이드를 생산하는 세포 배양물을 형성하고,
   b. 상기 단계 a에서 생산된 상기 하나 이상의 알칼로이드를 회수하는 것
   을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 베라트룸 세포가 베라트룸 칼리포르니쿰(Veratrum californicum) 세포인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 알칼로이드가 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리를 함유하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 알칼로이드가 시클로파민을 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 알칼로이드가 제르빈(jervine)을 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 배양 단계 a가 상기 베라트룸 세포를 성장 배지 내에서 배양하는 것을 포함하고, 여기서 성장 배지는 1주에 적어도 50%의 성장 증가를 유도할 수 있는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 배양 단계 a가 상기 베라트룸 세포를 생산 배지 내에서 배양하는 것을 포함하고, 여기서 생산 배지 내에서의 세포 배양이 적어도 0.1 mg/L의 상기 하나 이상의 알칼로이드를 생성하는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 생산 배지 내에서의 세포 배양이 적어도 0.3 mg/L의 상기 하나 이상의 알칼로이드를 생성하는 것인 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 생산 배지 내에서의 세포 배양이 적어도 0.5 mg/L의 상기 하나 이상의 알칼로이드를 생성하는 것인 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 생산 배지 내에서의 세포 배양이 적어도 0.75 mg/L의 상기 하나 이상의 알칼로이드를 생성하는 것인 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 생산 배지 내에서의 세포 배양이 적어도 1 mg/L의 상기 하나 이상의 알칼로이드를 생성하는 것인 방법.
12. 제7항에 있어서, 상기 생산 배지 내에서의 세포 배양이 적어도 1.5 mg/L의 상기 하나 이상의 알칼로이드를 생성하는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 배양 단계 a가
    a-1. 상기 베라트룸 세포를 성장 배지 내에서 배양하고; 후속적으로
    a-2. 상기 베라트룸 세포를 상기 성장 배지와 상이한 생산 배지 내에서 배양하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
14. a. 베라트룸 속의 비분화된 식물 세포를 1주에 적어도 50%의 성장 증가를 유도할 수 있는 성장 배지에서 배양하고;
    b. 상기 비분화된 식물 세포를 상기 성장 배지와 상이한 생산 배지에서 배양하고, 여기서 상기 생산 배지 내의 세포는 적어도 0.1 mg/L의 하나 이상의 알칼로이드를 생성하고;
    c. 상기 단계 b에서 생성된 적어도 하나의 알칼로이드를 회수하는 것
    을 포함하는 방법.
15. 적어도 0.1 mg/L의 하나 이상의 알칼로이드를 생산할 수 있는 비분화된 베라트룸 세포의 배양물.
16. 비분화된 베라트룸 세포 및 적어도 0.1 mg/L 양의 하나 이상의 알칼로이드를 포함하는 현탁 배양물로서, 상기 하나 이상의 알칼로이드가 배양된 비분화 베라트룸 세포에 의해 생산된 것인, 현탁 배양물.
17. 삭제
18. C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드의 생합성을 촉진하는 하나 이상의 자극제의 존재 하에 배양 용기에서 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드 화합물을 생산하는 비분화된 베라트룸 세포를 배양하고, 여기서 상기 배양 용기 내의 산소 농도가 배양 초기 단계의 대기(atmosphere) 내의 산소 농도보다 낮도록 상기 배양 용기 내의 기체상이 제어되거나, 또는 세포와 접촉하는 유체 배지 내의 용존 산소 농도가 배양 초기 단계의 온도에서의 포화 용존 산소 농도보다 낮도록 상기 세포와 접촉하는 유체 배지 내의 용존 산소 농도가 제어되고,
    생성되는 배양물로부터 C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드 화합물을 회수하는 것
    을 포함하는, C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드 화합물의 생산 방법.
19. 제18항에 있어서, C-노르-D-호모-[14(13->12)-아베오] 고리 함유 알칼로이드 화합물을 생산하는 상기 비분화된 베라트룸 세포가 0.03% 내지 10%의 이산화탄소를 함유하는 산소 기체를 상기 배양 용기 내로 도입함으로써 배양되는 것인 방법.
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제

Images