KR100377545B1

KR100377545B1 - 인삼생육활성 미생물 슈도모나스 플로르센스 ｋｇｐｐ207및 그 대사물을 이용한 고품질인삼 생산증대 방법

Info

Publication number: KR100377545B1
Application number: KR10-1999-0066543A
Authority: KR
Inventors: 이미자; 윤종혁; 이미경; 레오니드텐; 이명구
Original assignee: 주식회사 케이티앤지
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2003-03-26
Also published as: KR20010061912A

Abstract

본 발명은 인삼근권으로부터 분리한 생육활성 미생물인 슈도모나스(Pseudomo nassp.) 속 플로르센스(fluorescens) KGPP207 균주(균주기탁번호 KCTC 0715BP) 및 이를 이용한 고품질 대편인삼 생산기술에 관한것이다.

본 발명의 균주를 배양한 배양여액은 인삼의 증식 세포에 생육촉진 효과가 있고 세근이 주로 근하부에 형성되며, 표식유전자로 Tn5gusA1을 도입한 바 뿌리 정착율이 높은 특성을 나타냈다. 본포재배시 묘삼을 균현탁액에 침지한 후 이식하고 재배기간 중 전엽기에 한차례씩 관주처리하였다. 재배기간중의 봄 출아율과 가을 지상부 생존율이 높았고 6년근을 채굴한 결과, 총수량이 23% 증가하였으며 개체중은 32% 크고 홍삼제조시 최고품질인 천지삼의 생출율이 44%로서 대조구 보다 2배 정도 높게 나타났다.

본 발명의 균주 KB 배양(6일)여액 및 균체를 수종의 용매로 분획하고 활성이 높게 나타난 초산에틸 분획을 감압건조한 후 실리카겔 60 컬럼으로 재분획하고 TLC , GC-MS 및 HPLC에 의한 분리정제 및 분석과정을 통하여 초산인돌(IAA) 외 9종의 인돌계 화합물과 5종의 초산페닐계 물질이 활성 본체임을 밝히고 그 생합성 경로가 병원성 미생물과 다르다는 것을 확인하였다.

본 발명의 균주는 숙근성 작물 및 근채류에 대한 생육활성 효과도 클것으로 기대된다.

Description

인삼생육활성 미생물 슈도모나스 플로르센스 ＫＧＰＰ207 및 그 대사물을 이용한 고품질인삼 생산증대 방법 {Method for Mass Production of High Quality Ginseng by use of Ginseng Growth Promoting Strain Pseudomonas fluorescens KGPP207 and Theirof Metabolites}

본 발명은 인삼근권으로부터 분리한 생육활성 미생물인 슈도모나스(Pseudomo nassp.) 속 플로르센스(fluorescens) KGPP207 균주(균주기탁번호 KCTC 0715BP)와 균주의 배양물 및 이를 이용한 고품질의 대편인삼 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 미생물을 이용하여 근중심속의 고(高)밀도, 대편인삼, 균형잡힌 형태의 품질좋은 고려인삼의 대량생산기술을 개발하는데 그 목적이 있다.

인삼은 유전적으로 안정적인 편이나 재배환경에 따라 개체중의 편차가 매우 커서 대편의 좋은 인삼이 생산되는 경작토양은 병원균의 분포가 낮은 반면 유용미생물의 출현빈도가 높은 점에 착안하였다.

종래의 미생물을 이용한 인삼재배 관련기술은 근부병원균에 대한 길항미생물을 이용하는 방법이 일부 개발되어 있으나, 본 발명은 병원균 방제효과 보다는 기주작물의 생육을 활성화시키므로서 병원균 감염을 최소화하고 생장을 극대화시켜 수량과 품질이 우수한 인삼의 생산방법에 관한 기술이다. 뿌리생육을 촉진시키는 미생물 탐색은 생물검정의 과정과 방법이 쉽지않고 더욱이 성장이 늦고 숙근성인 인삼은 생리적으로 특이한 대표적인 작물이기 때문에 인삼생육촉진성 미생물이나 화합물 탐색이 매우 어려운 분야로서 본 발명자들에 의해 선도적으로 이루어졌다. 인삼유묘검정은 약 5주 정도의 시간이 요구되고 인삼종자의 연중발아가 어려운 점이 있기 때문에 인삼생육과 상관성이 높은 간편한 생물검정 방법이 요구된다.

본 발명에 이용한 슈도모나스(Pseudomonassp.) 속 플로르센스(fluorescens) KGPP207 균주는 대편인삼포 토양으로부터 분리한 형광성 세균이다. 밀자엽검정으로 1차 선발하고 인삼유묘검정으로 2차 선발하는 과정을 통하여 KGPP207 균주를 선발하였고 뿌리 정착성이 높고 오옥신류를 생산하는 우수한 생육촉진 미생물 임을 확인하였다. 토양중 근권미생물은 식물 생장과 분화에 영향을 미치며 그 가운데는 생육을 저해시키는 경우도 있는등 그 기전은 매우 다양하지만 주된 활성은 생육조절 물질 혹은 호르몬에 의한다.

생육촉진성 미생물로는 아조토박터(Azotobacter)바실러스(Bacillus),슈도모나스(Pseudomonas)속 등이 알려져 있고 최근 식물생장 조절물질 혹은 식물생장 촉진미생물을 종자에 접종하는 방법으로 식물생장을 촉진시키는 실용화 기술이 시도되고 있다(Frankenberger, W.T., 1995). 식물생장 촉진미생물 이용은 활성물질의 생산 분리 비용의 절감과 안정성등 식물생장 촉진물질 처리보다 효율이 높은 생물조절(biocontrol)의 장점을 최대로 살릴수 있는 잇점이 있다.

인돌초산(IAA; Indole Acetic Acid)을 생산하는 미생물로는 슈도모나스 시링게. 사바스타노이(Pseudomonas syringaepv.savastanoi;Kosuge, T., 1966),솔라나세럼(Psd. solanacearum;Phelps,R.H., 1967), 어위니아 허비콜라(Erwinia herbi cola;Brandle, M.,1996), 아조스피릴륨 브라실렌스(Azospirillium brasilense;Co stacurta, A.,1994) 등이 있고 병원성 미생물과 비병원성 미생물은 서로 다른 인돌초산(IAA) 생합성 과정을 가지기 때문에 이에 관한 보고가 주류를 이룬다. KGPP2 07 균주는 IAA생합성 중간산물인 인돌피루빈산(indole-3-pyruvic acid), 인돌젖산(indole-3-lactic acid), 인돌초산-3-알데히드(indole-3-acetaldehyde)가 존재하는 반면 식물병원성을 나타내는 IAA생산 세균에서 보고된 생합성 경로중의 트립타민(t ryptamine)은 발견되지 않아 비병원성균이 갖는 생합성 과정을 거치는 것을 확인하였다. 활성본체로 동정한 10종의 오옥신류 가운데 인돌부칠산(indole-3-butylic acid)과 인돌프로피온산(indole-3-propionic acid)은 식물에서는 보고된바 있으나 현재까지 미생물로부터 보고된 예는 드물고 슈도모나스속 가운데서는 본 발명의 균주로부터 최초로 분리동정되었다.

붸거(Weger, 1987) 등은 감자생육을 촉진하는 슈도모나스 플로라스센스(Pseu domonas fluorascens)의 뿌리 정착성이 편모에 의해 이루어진다고 보고하였고, 표지(marker)로서 발광유전자(luxgene, De Weger, 1991) 혹은 거스 유전자(gusA ge ne, Broek, 1993)을 도입시켜 밀, 감자, 잔디의 근면정착성을 조사하였다.

인삼의 대편화 기술은 광, 수분, 재식밀도 등 주로 경종적인 방법에 의한 시도가 있었으나 큰 성과가 없었고 본 발명자들에 의해 근생육활성 미생물 이용에 의한 고품질 대편삼 생산기술이 최초로 확립되었다.

인삼근권 미생물을 이용한 고품질 대편인삼 생산의 기술적 과제는 인삼생육을 활성화하는 미생물의 효율적인 탐색기술의 활용을 통한 활성이 좋은 미생물의 확보가 선행되어야 하며 그 다음으로 선발균주 특성을 파악하고 활성본체를 구명하여 이용시 활성효과를 극대화하는 방법의 정립이 필요하다. 특히 미생물의 근권 친화성이 핵심인데 본 발명에 이용한 KGPP207은 표지유전자를 도입시켜 확인한 바뿌리 정착성이 매우 높은 특성이 있는 균주로서 식물조절 호르몬인 IAA를 비롯하여 오옥신계 호르몬의 생합성이 활발하여 10종의 인돌(indol)계 화합물과 5종의 페닐초산(phenyl acetic acid)계 물질을 생산하는 비병원성 균주로서 고품질의 대편인삼의 생산에 제공하고 자 한다.

밀자엽 검정에 의한 신속한 간이 검정법인 밀자엽검정과 인삼유묘검정, 포트시험, 포장시험을 통하여 처리시기와 처리방법을 해결하고 또한 효과를 확인하였다. 종래의 숙근성 작물인 인삼의 경우 크기가 커질수록 중심속 조직이 소질결여되는 경향이 가장 큰 문제점이었는 데 본 발명은 인삼동체 중심속의 조직밀도가 높고 홍삼제조시 천지삼의 생출율이 높은 결과를 얻어 품질 좋은 인삼 생산 기술로서 실용화가 기대된다.

도 1은 활성 분획의 분리를 나타낸 공정도

도 2는 F-19 분획내 화합물(a)과 실릴레이션(silylation)시킨 화합물(b)의 매스 스펙트라(Mass spectra)

도 3은 F-9 분획의 인돌초산 메칠에스터(IAA methyl ester)(a)와 F-14 분획의 인돌초산 에칠에스터의 매스 스펙트라

도 4는 인돌-3-알데히드(a)와 그의 mono-TMS 유도체(b)의 매스 스펙트라

도 5는 F-9 분획의 페닐초산(a)와 F-2 분획의 페닐초산 메칠에스터의 매스 스펙트라

도 6은 F-21 분획내의 IPA(a), ILAMe(b), ICA(c) 와 각 TMS 유도체 (a',b',c')의 매스 스펙트라

본 발명에 이용한 균주는 춘천지역 대편인삼근권에서 분리하였고 KB(King B) 배지에서 30℃ 로 2-6일 정도 진탕배양하였다. 배지조성은 펩톤(peptone) 20g, k₂HP O₄1.5g, MgSO_4˙7H₂O로서 1L의 증류수에 프로테오스 펩톤(proteose peptone) 20g을 가하고 121℃에서 20분간 살균하고 식힌후 30% K₂HPO₄, 30% MgSO₄각 5ml를 가하고 같은 조성으로 1-2일 된 전배양액을 1ml 정도 접종시켰다. 배양여액과 증식 세포 모두 생육촉진 효과가 있음을 인삼유묘 생물검정을 통하여 알 수 있었고 포트재배시 유의성 있는 근생육 촉진효과와 세근이 주로 근하부에 형성, 발달되는 형태를 나타냈으며 표시유전자(marker gene; Tn5gusA1)를 이용하여 뿌리정착율이 매우 높은 특성을 확인하였다. 본 발명은 인삼이 유전적으로 안정되어 있으나 재배환경에 따라 개체편차가 매우 큰 작물인 점에서 근권 미생물의 역할에 주목하고 이를 활용하고자 하였다. 일차 밀자엽검정에 의해 선발된 KGPP207 균주의 인삼근 생육활성은 인삼유묘검정, 포트시험, 포장시험에 의하여 확인되었고 그 과정을 통하여 처리조건을 확립하였다. 활성균주에 표시유전자를 도입시켜 인삼근에 대한 정착성이 우수한 균주임을 알 수 있었다. 활성본체를 분리동정하는 방법을 정립하였고 그에 따라 오옥신류를 생합성하는 활성이 높은 균주로서 생육촉진 활성의 근거를 증명하였으며 그 생합성 경로가 비병원성인 것을 밝혔다. 이식할 때 처리하고 매년 전엽기에 한차례씩 관주하고 채굴한 6년근 수삼은 수량이 많을 뿐만 아니고 동체 근비중이 높고 홍삼제조시 최고품질인 천지삼의 생산량이 높아 고수량 고품질의 인삼 생산기술임을 입증하였다. 본 발명의 형광세균 KGPP207 균주는 1999년 12월 16일 생명공학연구소 유전자은행에 수탁번호 KCTC 0715BP로 기탁되었다.

< 실시예 1 >: 인삼 생육촉진 활성미생물의 분리, 활성검정 및 동정

본 발명에 이용한 KGPP207 균주는 춘천지역 인삼밭 토양으로부터 분리한 균주가운데 1차 밀자엽검정 및 2차 인삼유묘검정을 통하여 선발된 균주중의 하나이다. KGPP207 균주는 KB의 한천사면 배양이나 액체진탕배양 모두 24-48 시간내에 잘 증식되며 균체는 형광색을 띈다. 활성검정용 균체는 24시간 배양한 젊은 세포(young cell)를 사용하고, 대사물을 이용할 경우에는 6일정도 배양하여 여액을 멸균하지 않고 사용하였다.

KGPP207 균주의 배양여액으로 종자를 2시간 침지후 멸균된 버미큘라이트(ver miculite)에 심고 생장상(growth chamber)에서 5주간 자란 인삼유묘는 100배 혹은 10,000배 희석농도에서 곁근수, 근장, 근중 및 지상부 중량의 증가효과를 나타내었다(표1).

균주동정은 네델란드 레이덴대학의 슈도모나스연구실(PseudomonasLab.; Pro fessor Ben Lugtenberg)의 바이오로그시스템(Biolog system)에 의하여 수행한 바 본 KGPP207 균주는 슈도모나스 플로르센스(Pseudomonas fluorescens)로 동정되었다 (표 2).

표1. KGPP207 균주 배양여액에 의한 인삼유묘 생육검정(단위: %)

	경장	엽장	엽폭	근장	곁근수	근중	엽중	경중
배양원액	88.5	90.1	85.0	100.6	80.6	96.9	93.0	81.1
10^-2	96.2	100.8	95.4	113.7	102.8	132.3	108.8	105.4
10^-4	92.9	93.7	92.2	96.7	116.7	112.1	98.0	94.4
증류수	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0	100.0

< 실시예 2 >: 형광세균 KGPP207 균주의 인삼뿌리 정착성

인삼에 대한 미생물을 이용할 경우 근권생존율이 높아야 그 효과를 기대할수 있으므로 근면정착성을 검토하기 위하여 표시유전자를 도입시켰다. 먼저 항생제 내성을 조사한 결과 클로람페니콜(chloramphenicol) 20㎍, 스펙트로마이신(spectromycin) 200㎍와 날리딕신산(nalidixic acid) 15㎍ 농도에서 내성을 보였다. 내성이 있는 항생제를 적용하여 표시유전자인 Tn5gusA1(Wilson et al., 1991)를 가진 E. coli인 PBS387과 KGPP207균주를 가교시켜 표시유전자가 도입된 변이주 3주를 얻는데 성공하였고 이 변이주를 이용한 인삼유묘검정과 포트시험을 통하여 인삼뿌리에 대한 정착성이 우수한 균주임을 확인할 수 있었다(표3, 4). 배양액의 흡광도(620n m)가 0.2되게 하룻밤 배양하고 여기에 약 3mm 정도로 발아된 종자를 20분간 침지하여 접종시키고 노토바이오틱 어세이시스템(Gnotobiotic assay system)에 의하여 자란 유묘뿌리를 부위별로 자르고 공시미생물을 침출시켜 배양한 후 생존 군락수를 조사하므로서 인삼뿌리에 대한 정착도를 조사하였다. 이때 슈도모나스 (Pseudomona sWCS365)를 비교균주로 사용하였고 표 3과 같이 공시한 두 균주 모두 인삼뿌리에 이행 정착하여 10⁶CFU/cm 이상의 높은 군락을 이루었고 선발균주는 비교균주보다 인삼근에 대하여 더 높은 친화성을 보였다. 포트시험에 의하여 표시유전자가 도입된 변이주 KGPP207AB1의 뿌리정착성을 조사한 결과(표 4), 지상부의 생육이 활발한 5월 17일 까지는 공시균이 주로 근표면에 분포하였으며 6월 10일 경에는 근표면과 근내부에 정착된 것을 알 수 있었고 시간경과에 따라 군락수는 점차 감소되는 경향을 보였다.

표 3. KGPP207 균주의 인삼유모의 뿌리부위별 정착분포 양상

	대조균주Psu. WCS365	Psu. fluorescensKGPP207
근상단부	10⁶CFU/cm	10⁷CFU/cm
근중단부	10⁶CFU/cm	10⁷CFU/cm
근말단부	10⁵CFU/cm	10⁶CFU/cm

표 4. 2년생 인삼에 대한 KGPP207AB1의 근정착 밀도(포트시험)

	5월 17일	6월 10일	8월 24일
근표면	2.7 x 10⁵	6.1 x 10³	5.5 x 10²
근내부	-	3.1 x 10³	2.5 x 10²

*10⁶CFU 농도의 균 현탁액에 침지하고 이식(4월 1일) 하고 9월 4일 채굴함.

사용배지 : LC + Sm⁵⁰⁰+ X-glc

< 실시예 3 >: KGPP207 균주의 처리방법과 시기 및 인삼생육반응

본 발명에 이용한 균주의 실용화를 위하여 포장에 대한 처리조건을 검토하였던 바 6년근에 대해 매우 바람직한 포장성적을 얻었다.

[시험 1]: 처리방법과 시기

배양여액에 종자를 침지하거나 지상부가 나온후 개체별 관주 혹은 전엽후 엽면살포 하여 각 방법에 따른 인삼생육 반응( 5주 생장)을 조사하여 효과적인 처리방법을 수립했다. 표 5와 같이 본 균주는 침지법이 관주법이나 살포법 보다 높은 생육활성을 나타내었다. 본 균주가 오옥신류 생산균주인 점에서 처리시기는 포트시험과 포장시험으로 수행한 IAA의 처리시기(4월 하순 - 5월 초순)와 미생물 활성시기를 감안하여 5월 초순경으로 실시했다.

표 5. KGPP207 균주 배양여액의 처리방법에 따른 인삼유묘의 생육활성

	경장	엽장	엽폭	근장	곁근수	근중	엽중	경중
침지법	96.2	100.8	95.4	113.7	102.8	132.3	108.8	105.4
관주법	100.0	99.5	82.5	92.0	94.1	86.2	94.8	95.3
살포법	102.2	106.4	103.4	100.3	100.0	87.4	90.6	91.7

활성표시 : 대조구(증류수로 각각 처리)에 대한 백분율로 표시함.

[시험 2]: KGPP207 균체 처리에 의한 2년근 인삼의 생육(포트시험)

유묘검정에 의해 KGPP207 배양여액에 의한 인삼생육 촉진활성과 효과적인 처리방법이 구명되었으므로 KGPP207 균체의 활성확인을 포트시험을 통하여 실시하였다. 증식시킨 KGPP207 균체를 A620=0.2(620nm에서 흡광도 0.2) 농도로 현탁시킨 액에 본당 0.9g 내외의 1년 자란 묘삼을 20 분간 침지시킨 후 1/5000a 와그너포트에 4월에 이식하였다. 이때 사용한 포트상토는 멸균후 알긴산나트륨(Na-alginate)으로 시험예 3과 같이 고정화시킨 공시균주를 0.25%(w/w) 씩 미리 섞어 사용하였다. 생육기간중 지상부 생육도 대조구 보다 양호하였고 약 5개월 후인 8월 하순에 채취한 2년근의 생육결과는 표 6과 같다. 근중은 대조구보다 50% 증대되었고 36.2%의 근비대 효과가 유의성있게 나타났다. 근장은 13.2% 정도 신장되었으나 유의성이 없었다. 공시균주 처리구는 병삼발생이 없었으며 질소환원효소(NRA;nitrate reductase)의 활성과 수용성 단백질의 함량이 높게 나타난 결과로부터 KGPP207 균주 처리에의하여 특히 질소대사가 활성화되는 것을 시사한다.

표 6. KGPP207 균주를 처리한 2년근 인삼의 생육(포트시험)

	근 중(g,fw)	근 장(cm)	근직경(cm)	엽면적(cm²)	병삼율(%)	NRA(nmole/g/hr)	단백질(mg/g)
KGPP 207	4.38a	8.53ab	0.94a	20.11a	0	8.43	21.00
대조구	2.92b	7.53b	0.69b	14.07b	10.0	5.42	15.19

* 유의성 검정 : Duncan's multiple range test

[시험 3]: KGPP207 균체의 고정화

1% 알긴산나트륨 188ml, 카올린(kaolin) 14.1g, 젖은균체(wet cell) 15g, 멸균수 60ml의 조성비율로 혼합한 균체용액을 0.25몰 CaCl₂용액에 수중펌프를 이용하여 방울로 떨어지게 하면 그대로 굳어져 펠렛(pellet)이 형성된다. 균체가 고정된 펠렛을 건져 내어 맑은 물로 수세하고 풍건시킨 후 사용하였다.

[실시 4]: KGPP207 균주를 처리한 6년근 인삼의 수량과 품질

KB 배지에서 30^oC로 6일간 진탕배양한 KGPP207 균주의 배양액 농도를 A₆₂₀=0.2되게 멸균수로 희석하고 카올린을 5% 되도록 가하여 고루 섞은 균체액에 묘삼을 침지한 후 꺼내어 본포에 이식하였다. 3,4,5년시 5월 상중순(전엽기)에 상술한 것과 같이 만든 균현탁액을 각각 5ml, 5ml, 8ml 씩 관주하고 수확기에 채굴한 6년근 수삼의 총수량은 대조구보다 23.3% 증대된 결과를 보였다(표 7). 병삼이나 적변삼을 제외한 원삼수량으로는 38%, 평균 개체중도 94.8g으로 대조구보다 32% 정도 증대되었으며 동직경대비 동체장이 길어 대조구보다 양호한 체형을 나타내었다.

고려홍삼은 한국을 대표하는 이미지 상품가운데 하나로서 품질이 좋을수록 가격의 상승률이 매우 높다. 홍삼의 품질 저해 요인가운데 가장 치명적인 것은 내공내백을 들수있는데 내공내백의 발생은 생육기간중에 일어나는 소질적인 요인과 홍삼제조 과정중에 생기는 가공요인에 의하여 일어난다. 일반적으로 대편일수록 가공시 내공의 발생율이 높고 소질적으로도 동체 중심속의 밀도가 낯은 경향이어서 내백발생이 되기 쉽다. KGPP207 균주 처리구는 생밀도와 건밀도가 각각 1.122와 0.323으로서 대조구보다 높았으며(표 8) 실제로 홍삼을 제조했을 때 대조구보다 내공내백율이 낮게 나타났다(표 9). 홍삼은 충남 부여 소재의 한국담배인삼공사 홍삼창에서 관행의 방법에 의해 제조되었고 품질판정도 일반 상품과 동일한 방법 및 기준에 의해 실시하였다. 최고 품질을 나타내는 천삼과 다음 등급인 지삼율이 대조구 보다 약 2배정도 많은 결과로부터 본 균주의 이용은 고품질 백삼은 물론 부가가치가 더 높은 홍삼 원료삼 생산을 위해 매우 유망한 기술이라고 판단된다.

표 7. KGPP207 균주를 처리한 6년근 수삼수량

	대 조 구	KGPP207 처리구
총 수 량, kg/칸	3.0 ±1.2	3.7 ± 0.6
원 삼 율, wt%	2.1	2.9
개 체 중, g/본	71.8	94.8

표 8. KGPP207 균주를 처리한 6년근 수삼의 소질

	대 조 구	KGPP207 처리구
생 밀 도	1.027 ±0.042	1.122 ±0.030
건 밀 도	0.218 ±0.014	0.323 ±0.033
장 경 비(동체장/동직경)	2.33	2.50

표 9. KGPP207 균주를 처리한 6년근 홍삼의 품질

	대 조 구	KGPP207 처리구
천지삼율(%)	23.1	44.1
내공율(%)	46.2	32.4
내백율(%)	69.2	44.1
균열율(%)	7.69	0

< 실시예 5 > KGPP207 균주의 인삼생육활성 촉진물질의 동정

[시험 1]: KGPP207 균주의 인삼생육 활성물질의 분리정제 및 화학구조

본 발명에 이용한 KGPP207 균주의 활성본체를 구명하기 위해 여러 가지 용매로 도1의 과정과 같이 분획하고 단계에 따라 각 분획에 대한 밀자엽검정에 의하여 활성을 확인하면서 추적하였다. 활성이 높은 초산에칠(Ethylacetate) 분획을 실리카겔 컬럼(silicagel column)으로 재정제 분획하여 활성이 높은 F2, F9, F14, F19, F21 분획을 얻었고 이들 분획을 GC-MS로 분석하여 다음과 같은 인돌계 화합물 인돌-3-초산 메칠에스터(IAAME; Indole-3-acetic acid methyl ester), 인돌-3-초산 에칠에스터(IAAEt; Indole-3-acetic acid ethyl ester), 인돌-3-알데히드(IAID; Indole-3-aldehyde), 인돌-3-초산(IAA; Indole-3-acetic acid), 인돌-3-프로피오닌산(IPA; Indole-3-propionic acid), 인돌-3-젖산 메칠에스터(ILAME; Indole-3- lactic acid methyl ester), 인돌-3-카복실린산(ica; Indole-3-carboxylic acid),인돌-3-부치린산(IBA; Indole-3-butyric acid), 인돌-3-젖산(ILA; Indole-3-lactic acid), 인돌-3-피루빈산(IPyA; Indole-3-pyruvic acid) 및 페닐산(Phenyl acid)계 화합물인 페닐초산 메칠에스터(PAAME; Phenyl acetic acid methyl ester), 페닐초산(PAA; Phenyl acetic acid), 하이드록시페닐 초산 메칠에스터(HPAAME; p-Hydroxy phenyl acetic acid methyl ester), 하이드록시페닐초산 에칠에스터(HPAAEt ; p-Hy droxyphenyl acetic acid ethyl ester), 하이드록시페닐 초산(HPAA; p-Hydro xyphenyl acetic acid)을 동정하고 메틸레이션(methylation)과 실릴레이션(silylat ion)으로 구조를 확인하였다(도 2).

[시험 2]: KGPP207 균주의 IAA 생합성 경로와 비병원성

대사물의 GC-MS 분석을 통하여 IAA 생합성 과정을 분석한 결과 병원성세균 (Psu. syringae pv. savastanoi)은 인돌-3-초산 메칠에스터(Indole-3-acetic acid methyl ester)를 경유해서 IAA가 합성되는 반면 KGPP207 균주는 고등식물과 몇종의 유용미생물과 같이 인돌-3-피루빈산(indole-3-pyruvic acid)을 경유하는 경로를 나타내었다. 또한 대사물로부터 인돌-3-피루빈산과 인돌-3-부티린산이 동정되었는데 이것은 고등식물에서 발견되었을뿐 현재까지 슈도모나스속으로부터 보고고된바 없었고 슈도모나스속으로는 본 균주로부터 처음 동정되었다.

또한 배지조건을 달리해서 오옥신 및 오옥신 계열 화합물의 생합성 특성을 조사하였다. KB 배지에 트립토판(tryptophan) 1g/L를 가하여 다량의 인돌화합물 합성을 유도한 결과 IAA, IPyA, ILA, IAAMe의 생산량이 1.5-2배 정도 증가되었고 PhAA와 같은 오옥신 계열 화합물의 함량은 변화가 없는 결과로부터 인돌-3-피루빈산을 거치는 경로를 거쳐 합성되는 것을 확인하였다. 또한 배지의 pH를 5.5로 낮추어 그 산물을 분석한 결과 IAA의 합성량은 변함이 없으나 다른 인돌 화합물의 생성 비율이 변화되는 경향을 보였다.

본 발명의 균주 KGPP207는 인삼생육활성 물질인 인돌계화합물, 오옥신류 및 그 계열화합물을 생산하므로 좋은 품질의 대편백삼 및 홍삼 원료삼의 대량 생산방법을 제공할 수 있는 기술이다. 또한 다른 근채류나 숙근성 작물에 대한 생육활성도에도 큰 영향을 미칠 것으로 전망되어 활용이 기대된다.

Claims

높은 인삼근의 생육촉진 및 뿌리 정착율을 나타내는 슈도모나스 플로르센스 KGPP207(KCTC 0715BP)
슈도모나스 플로르센스 KGPP207(KCTC 0715BP)를 24∼48시간 동안 26∼28℃에서 호기적으로 펩톤 20g, K₂HPO₄1.5g, MgSO₄ㆍ7H₂O/L의 KB한천사면 또는 액체 진탕배양하여 배양액중에 생리활성호르몬을 축적시키는 것을 특징으로 하는 인삼생육활성 미생물을 배양하는 방법
제 2항에 있어서, 배양액중의 생리활성호르몬은 인돌초산(Indole Acetic Acid), 오옥신계 호르몬의 생합성이 활발한 인돌(indol)계 화합물 및 페닐초산(phe nyl acetic acid)계 물질인 것을 특징으로하는 인삼생육활성 미생물을 배양하는 방법
슈도모나스 플로르센스 KGPP207(기탁번호 KCTC 0715BP) 균주와 이 균주를 배양하여 얻은 배양액이나 균체를 인삼 종자에 침지, 개체별 관주 또는 전엽후 전면에 살포하는 것을 특징으로 하는 인삼생육활성 미생물과 그 배양물을 이용한 고품질인삼 생산증대 방법
제 4항에 있어서, 인삼의 생육기간중 오옥신 및 오옥신류를 인삼에 사용하는 경우에 있어서는 4월 하순 내지 5월 초순 관주를 통하여 인삼에 사용하는 것을 특징으로 하는 인삼생육활성 미생물과 그 배양물을 이용한 고품질인삼 생산증대 방법
제 4항에 있어서, 균체를 고정화하여 사용할 경우에 있어서는 1% 알긴산나트륨 188ml, 카올린 14.1g, 습윤세포 15g, 멸균수 60ml의 조성비율로 혼합한 균체용액을 0.25몰 CaCl₂용액에 수중펌프를 이용하여 형성시켜 균체를 펠렛에 고정한 후 수세하고 풍건시켜 사용하는 것을 특징으로 하는 인삼생육활성 미생물과 그 배양물을 이용한 고품질인삼 생산증대 방법