DE69329154T2 - Erhöhte produktion von taxol und taxanen mittels -taxus-spezifische zellkulturen - Google Patents

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG A. GEBIET DER ERFINDUNG
• Diese Erfindung betrifft Verfahren für die verbesserte Produktion und Gewinnung von Taxol und Taxanen durch Zellkulturen einer Taxus-Art.
B. VERWANDTES FACHGEBIET Das Taxol-Versorgungsproblem und mögliche Lösungen
• Taxol ist ein Diterpenalkaloid, das ursprünglich aus der Rinde der Kurzblättrigen Eibe, Taxus brevifolia, isoliert wird (Wani et al. 1971).
• Das Interesse an Taxol wurde erweckt, als das National Cancer Institute (NCI) in einem groß angelegten Durchmusterungsverfahren feststellte, daß rohe Rindenextrakte antitumorige Wirkungen aufweisen. Seit damals haben klinische Versuche bestätigt, daß Taxol bei refraktärem Eierstockkrebs und bei Brust- und anderen Krebserkrankungen äußerst wirksam ist. Taxol wurde wegen seines grundlegend unterschiedlichen Zytotoxizitätsmechanismus, d. h., in dem es die Depolymerisation von Mikrotubuli hemmt (siehe Rowinsky et al. 1990), als Durchbruch in der Chemotherapie angesehen.
• Die bisher entmutigendste Variable in der Taxol-Gleichung ist die Versorgung. Es sind drei bis sechs 100 Jahre alte Kurzblättrige Eiben zur Behandlung eines einzigen Patienten notwendig, da die durchschnittlichen Taxol-Ausbeuten gering sind - ca. 0,01% der trockenen Rinde und Nadeln (Witherup et al. 1990). Zur Herstellung der Taxolmenge, die zur Behandlung und Testung notwendig ist, wäre die Zerstörung zehntausender Eiben notwendig. Bisher stammt die weltweite Versorgung aus der Ernte dieser kriechenden, langsam wachsenden Koniferen, die in den alten Wälder des Nordwestpazifik beheimatet sind. Leider wurde die Eibe durch Holzfällung nahezu ausgerottet. Naturschützer bekämpfen erfolgreich jede Massenfällung des Baumes, der in den alten Wäldern wächst, die eine Zufluchtstätte für die bedrohte nördliche gefleckte Eule und andere freilebende Tierarten sind. Da die Anzahl der Kurzblättrigen Eiben abnimmt, richtet die medizinische Forschung ihre Hoffnungen für zukünftiges Taxol auf neue, alternative Versorgungsquellen. Die drei Quellen, die in Betracht gezogen werden, sind chemische Synthese, Semi-Synthese und Pflanzenzellkultur.
• Taxol ist ein großes, strukturell komplexes, chemisches Molekül, das sich bisher einer vollständigen chemischen Synthese entzogen hat. Daher ist eine Massensynthese aus einfachen verfügbaren Chemikalien in den nächsten wenigen Jahren wahrscheinlich keine durchführbare Option.
• Eine mögliche Option für eine Massenproduktion ist die Semi-Synthese, d. h., die chemische Anlagerung einer Seitenkette an den landwirtschaftlich erzeugten Taxol- Prekursor Baccatin. In der Synthese der Seitenkette wurde ein wesentlicher Fortschritt erzielt (Denis et al. 1991). Es wurden auch Methoden entwickelt, um die Seitenkette an Baccatin zu koppeln (Denis et al. 1990, U. S. Patent 4,924,011; Holton 1991, U. S. Patent 5,015,744). Die landwirtschaftliche Versorgung mit Baccatin aus Nadeln von Taxus-Anpflanzungen ist jedoch keineswegs einfach; und sie wird gegenwärtig angesichts der Tatsache neu bewertet, daß frühere Berichte (Denis et al., 1988, 0.1 Gew.-%) optimistischer hinsichtlich des Baccatingehalts waren als jüngere (Witherup et al. 1990, 0,03% Trockengewicht).
• Zusammenfassend ist die Möglichkeit der chemischen Synthese und Semi-Synthese zur Bereitstellung von Taxol für eine weltweite chemotherapeutische Anwendung nicht gewährleistet. Es gibt gute Gründe zur Erforschung und Entwicklung alternativer Produktionsmittel.
• Diese Erfindung betrifft die Entwicklung eines auf einer Pflanzenzellkultur basierenden Verfahrens zur Bereitstellung von Taxol und anderen Taxanen.
Gewebekulturen als Quelle von pflanzlich abgeleiteten Chemikalien
• Die Fähigkeit von Pflanzenzellen, sich zu teilen, zu wachsen und sekundäre Metaboliten unter einer Vielzahl verschiedener Kultursysteme zu erzeugen, wurde von einer Reihe von Gruppen umfassend demonstriert. Gegenwärtig werden zwei Verbindungen, Shikonin (ein roter Farbstoff und entzündungshemmend) und Ginsengosid (ein Tonikum in der orientalischen Medizin) in Japan durch Gewebekulturverfahren erzeugt. Von vielen anderen Verfahren wird berichtet, daß sie kurz vor der kaufmännischen Nutzung stehen, einschließlich Vanillin, Berberin und Rosmarinsäure (siehe Payne et al. 1991).
• Die Vorteile für ein Pflanzenzellkulturverfahren für Taxol sind zahlreich: (i) Ein Zellkulturverfahren garantiert eine grenzenlose, kontinuierliche und gleichmäßige Produktversorgung, und unterliegt keinen Seuchen, Katastrophen und saisonalen Schwankungen, (ii) Zellkulturen können in großen Bioreaktoren kultiviert werden und können durch Manipulation der Umweltbedingungen zu einer Überproduktion von Taxol veranlaßt werden, (iii) Zellkulturen erzeugen ein einfacheres Spektrum von Verbindungen im Vergleich zu Rinde oder Nadeln, wodurch die Trennung und Reinigung deutlich vereinfacht wird, (iv) ein Zellkulturverfahren kann sich besser als Verfahren auf landwirtschaftlicher Basis schnell an rasche Änderungen im Bedarf anpassen, (v) neben der Versorgung mit Taxol kann ein Zellkulturverfahren auch Taxan-Vorläufer, wie Baccatin, erzeugen, die semi-synthetisch zu Taxol und andere aktive Derivate umgewandelt werden könnten.
• Da eine aseptische Pflanzenzellen-Massenkultivierung an sich teuer ist, wird ein Zellkulturverfahren kommerziell nur relevant, wenn diese Kosten durch ein rasches Zellwachstum und eine hohe Metabolitenproduktivität ausgeglichen werden. Jede Pflanzenart und jeder Zielmetabolit ist anders, und es sind unterschiedliche Vorgangsweisen für jedes bestimmte System notwendig. Diese Erfindung konzentriert sich auf kreative und geschickte Vorgangsweisen zum Erhalt rasch wachsender und hochproduktiver Pflanzenzellkulturen für die Taxol- und Taxanproduktion.
Probleme mit Gewebekulturen von Holzpflanzen und Koniferen
• Ein geschichtlicher Überblick der Literatur legt nahe, daß zwar Krautpflanzen in Kultur relativ leicht manipuliert werden, aber Kulturen von Holzpflanzen und Koniferen nur unter Schwierigkeiten zu erreichen sind.
• Das Wachstum von sekundäre Metaboliten erzeugenden Gymnospermen- und Koniferenkulturen ist allgemein gering. Zum Beispiel stellten Berlin und Witte (1988) fest, daß Kulturen der Thuja occidentalis ihre Biomasse nur um ca. 30% in 18 Tagen vergrößerten. Van Uden et al. (1990) berichtete von einer Zunahme der Biomasse um 20-50 % in 21 Tagen bei Suspensionen von Callitris drummondü. Westgate et al. (1991) gaben eine Verdopplungszeit von ca. 10 Tagen für Suspensionen der Gymnospermen, Cephalotaxus harringtonia, an. Wie von Bornman (1983) zusammengefaßt wurde, war das Bemühen enorm, ein Medium für Fichtensuspensionen (Picea abies) zu entwickeln. All diese Arbeiten zeigen, daß Gymnospermensuspensionen tatsächlich rasch wachsen können, aber keine Verallgemeinerungen angewendet werden können, und daß Medienformulierungen für verschiedene Zellinien unabhängig optimiert werden müssen.
• Ein Überblick über die sekundäre Metabolitenproduktivität unter Gymnospermenkulturen zeigt auch die Schwierigkeit auf, eine rasche Biosynthese im Vergleich zu Krautarten herbeizuführen. Zum Beispiel erzeugten Kulturen von Cephalotaxus harringtonia Terpenalkaloide nur in einem Ausmaß von 1% bis 3% von jenem, das in der Mutterpflanze vorhanden ist (Delfel und Rotrifus 1977). Selbst nach einer erfolgreichen Auslösung konnte Heinstein (1985) nur annähernd die Werte erreichen, die in der Mutterpflanze erzeugt werden (ca. 0,04% Trockengewicht Gesamtalkaloide). Van Uden et al. (1990) konnte Suspensionskulturen der Konifere Callitris drummondü veranlassen, Podophyllotoxin zu erzeugen, aber nur in einem Ausmaß von einem Zehntel der von den Nadeln erzeugten Menge. Die Fähigkeit von Thuja occidentalis, signifikante Mengen an Monoterpenen (10- 20 mg/l) und des Diterpenoids Dehydroferruginol (2-8 mg/l) zu erzeugen, wurde überzeugend von Berlin et al. (1988) demonstriert. Diese Ergebnisse wurden jedoch mit einer langsam wachsenden (30% Zunahme an Biomasse in 18 Tagen) Kultur mit geringer Zelldichte (5 bis 7 Gramm Trockengewicht pro Liter) erhalten.
Zellkultur für die Taxol-Produktion: Frühere Bemühungen
• Die Schwierigkeiten, ein rasches Wachstum und eine hohe Produktivität zu erreichen, die bei Gymnospermen-Suspensionen auftreten, wurden in den bisherigen drei Berichten über die Taxol-Produktion dargelegt. Jaziri et al. (1991) initiierten kürzlich Kallluskulturen von Taxus baccata, konnten aber kein Taxol unter Verwendung ihres Immunosorbens-Test nachweisen.
• Wickeramesinhe und Arteca (1991) berichteten von der Gegenwart von 0,009% Trockengewicht Taxol in Kalluskulturen von Taxus media (Kultivar hicksii), wobei aber keine Einzelheiten hinsichtlich der Verdopplungszeit, der Zelldichten und des Zeitmaßstabes, in dem das angegebene Taxol erzeugt wurde, angeführt wurden.
• U. S. Patent Nr. 5,019,504 (Christen et al. 1991) beschreibt die Produktion und Gewinnung von Taxan und taxanartigen Verbindungen durch Zellkulturen von Taxus brevifolia. Diese Wissenschafter berichteten von einer Taxol-Produktion in einem Maß von 1 bis 3 mg/l in einem zwei- bis vierwöchigen Zeitrahmen. Sie berichteten auch von einer Zunahme der Zellmasse um das "5-10-Fache in 3-4 Wochen", was einer Verdopplungszeit von ca. 7 bis 12 Tagen entspricht.
• Zunahmen in den Wachstumsraten, Taxol-Biosyntheseraten und den volumetrischen Produktivitäten sind eindeutig notwendig, bevor ein Gewebekulturverfahren für die Taxol- Produktion den vorgesehenen jährlichen Bedarf an einigen zehn bis hunderten Kilogramm Taxol pro Jahr decken kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Die Erfinder haben entdeckt, daß Taxol und taxolartige Verbindungen, oder Taxane, mit sehr hoher Ausbeute aus allen bekannten Taxus-Arten erzeugt werden können, d. h., brevifolia, canadensis, cuspidata, baccata, globosa, floridana, wallichiana, media und chinensis. Insbesondere stellten die Erfinder fest, daß die Art Taxus chinensis zu einem raschen Wachstum und zur Erzeugung extrem hoher Werte an Taxol und Taxanen innerhalb einer kurzen Zeitperiode imstande ist.
• Bei einer Verbesserung der Erfindung, die in Christen et al. (1991) beschrieben ist, haben die Erfinder hierin entdeckt, daß Zellkulturen von verschiedenen Taxus-Arten rasch und effizient initiiert und erfolgreich auf künstlichen Nährmedien gezüchtet werden können, und daß dieselben chemotherapeutisch aktiven Taxanalkaloide wie in der intakten Pflanze in der Zellkultur erzeugt werden.
• Des weiteren ist es durch die Verfahren dieser Erfindung möglich, Taxol in einem viel kürzeren Zeitrahmen als zuvor berichtet wurde zu erhalten. Mit der Art Taxis chinensis waren die Erfinder imstande, Zellen zu manipulieren, um Taxol in Mengen zu erhalten, die weit über den Mengen lagen, die von Gewebekulturen der anderen Taxus-Arten erhalten wurden. Des weiteren ist die Wachstumsrate der Taxus chinensis Zellkulturen deutlich höher, das 3- bis 6-Fache, als bei jenen von Taxus brevifolia, die in Christen et al. (1991) beschrieben sind.
• Die Aufgaben dieser Erfindung beinhalten die rasche und wirksame Initiierung von Zellkulturen verschiedener Taxus-Arten.
• Die Aufgaben dieser Erfindung beinhalten die Festlegung spezieller Umweltsbedingungen, um das rasche Wachstum, hohe Zelldichten und die hohe Lebensfähigkeit der Zellen zu fördern. Die Wachstumseigenschaften, die in dieser Studie berichtet werden, übersteigen frühere Ergebnisse um einen signifikanten Faktor.
• Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung von Taxol und anderen Taxanen mit hohen Ausbeuten aus Zellkulturen einer Taxus-Art bereit, umfassend: Kultivieren von Zellen einer Taxus-Art, die von Kallus- und/oder Suspensionskulturen abgeleitet ist, in einer Suspensionskultur in einem oder mehreren Nährstoffrnedien unter Wachstums- und Produktbildungsbedingungen, und Gewinnen des Taxols und anderer Taxane aus den Zellen und/oder dem Medium der Zellkultur, wobei die Bedingungen eine oder mehrere der Bedingungen sind, die eine kontinuierliche oder eine unterbrochene Beleuchtung mit Breitband- oder Schmalbandlicht oder Nährstoffmedien umfassen, die für die Wachstums- und Produktionsphasen der Kultur eine veränderte Medienzusammensetzung besitzen.
• Die Aufgaben dieser Erfindung beinhalten die Fähigkeit, hohe und anhaltende Raten der Taxol- und Taxan-Biosynthese und Sekretion durch: (a) sorgfältige Manipulation von Nährkonzentrationen ("Produktionsmediumformulierung"), (b) Verwendung von Licht, (c) Verwendung von periodischen Mediumaustauschprotokollen, (d) Verwendung von Auslösern, herbeizuführen.
• Die Aufgaben dieser Erfindung beinhalten die Fähigkeit, das Profil von erzeugten Taxanen durch Veränderung der Medienformulierungen und Umweltbedingungen zu manipulieren. Insbesondere wurden Zellen dazu gebracht, Taxol als vorherrschendes Taxan- Produkt zu erzeugen. Zusätzlich wurde die Produktion des Nebenproduktes Cephalomannin unterdrückt, wodurch eine elegante biologische Lösung für das Problem einer teuren und wichtigen stromabwärtigen Trennung und Reinigung bereitgestellt wurde.
• Die Aufgaben dieser Erfindung umfassen die Fähigkeit, verschiedene Taxane außer Taxol zu erzeugen, die selbst pharmakologische Aktivität aufweisen können, oder modifiziert und zu Verbindungen mit pharmakologischer Aktivität umgewandelt werden können. Zu den Aufgaben dieser Erfindung zählt die Fähigkeit, Zellkulturen von Taxis chinensis zu induzieren, um Taxol (0,32% Trockengewicht) in Werten zu erzeugen, die weit über jenen liegen, die in Wildpflanzen erzeugt werden (0,003 bis 0,03% Trockengewicht, Xu und Liu 1991).
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
• Fig. 1. Zunahme an Biomasse in einer Taxus chinensis Suspensionskulturlinie K-1 gegenüber einem typischen Chargen-Wachstumszyklus in Medium A. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung die aus doppelten Kolben gemessen wurde.
• Fig. 2. Wirkung eines Mediumaustausches an Tag 9 und 12 auf die Taxol- (A) und Gesamt-Taxan- (B) Produktivität in einem 15-tägigen Experiment. Die Zahlen in jedem Kasten zeigen das Zeitintervall (Tage), in dem das Produkt erzeugt wurde. Der dunkle Teil der Kästen innerhalb der Zellen zeigt das Taxol oder die Gesamt-Taxane, die in der Zellimpfkultur zu Beginn des Experiments vorhanden waren. Alle Behandlungen wurden doppelt ausgeführt. Die Taxus chinensis-Suspensionszellinie K-1 wurde mit Medium A verwendet, wie in Tabelle 2 dargelegt ist.
• Fig. 3. Spektralcharakteristika einer Standard Gro-Lux-Lampe (GTE Sylvania, Danvers, MA), die in Beispiel 7.3 verwendet wurde.
• Fig. 4. Taxan-Produktion in Taxus chinensis-Zellsuspension K-1. Der Teil des Chromatogramms von 10 bis 40 Minuten ist dargestellt. Diodenreihenabtastungen ausgewählter Taxan-Spitzen zeigen ein charakteristisches Taxan-UV-Absorptionsspektrum, mit einer Spitze bei 227 nm.
• Fig. 5. Taxol- und Taxan-Produktion nach anhaltender Kultivierung in Medium C durch Taxus chinensis-Zellinie K-1. Die obere Tabelle zeigt die Daten für die bekannten und unbekannten Taxane, während die untere Tafel die zunehmende Taxol- und Taxan-Produktion in der 25- bis 42-tägigen Zeitperiode zeigt.
• Fig. 6. MS/MS-Bestätigung von Taxol im Zellkulturüberstand. Tafel A zeigt das Ionenzerstäubungs-APCI-Massenspektrum von authentischem Taxol, und Tafel B zeigt das Tochter-Ionenspektrum der Mutterspitze (m/z 871 = Taxol + NH&sub4;&spplus;). Tafel C stellt das Ionenzerstäubungs-APCI-Spektrum von einem Rohzellkulturextrakt dar und zeigt für Taxol charakteristisches m/z 854 und 871. Tafel D zeigt das entsprechende Tochterspektrum von m/z 871 und liefert einen eindeutigen Beweis für die Gegenwart von Taxol im Zellkulturüberstand.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Seit langer Zeit stellen Pflanzen wichtige Quellen für Pharmazeutika und chemische Spezialitäten dar. Diese Produkte wurden für gewöhnlich durch Extraktion des geernteten Pflanzenmaterials oder durch chemische Synthese erhalten. Taxol ist eines der wichtigsten potentiellen krebsbekämpfenden Mittel geworden, das sich vor kurzem aus der Durchmusterung von natürlichen Produkten ergeben hat.
• Wie hierin verwendet, werden die Begriffe Taxol und taxolartige Verbindungen, oder Taxane, untereinander austauschbar verwendet, um eine Verbindung mit einem Taxan-Ring zu beschreiben. Diese Verbindungen können selbst antineoplastische Aktivität aufweisen, oder können modifiziert werden, um bioaktive Verbindungen zu erhalten.
• Wie hierin verwendet, wird der Begriff "Kallus" zur Beschreibung einer Masse kultivierter Pflanzenzellen verwendet, die strukturell undifferenziert ist, und auf einem verfestigten Medium kultiviert wird. Wie hierin verwendet, wird der Begriff "Suspensionskultur" zur Beschreibung strukturell undifferenzierter Zellen verwendet, die in einem flüssigen Nährmedium dispergiert sind. Es versteht sich, daß Suspensionskulturen Zellen in verschiedenen Aggregationsstufen umfassen. In den Suspensionen, die in dieser Erfindung beschrieben sind, ist ein Bereich von Aggregatgrößen vorhanden, wobei die Größen von einigen zehn Mikron im Durchmesser (einzelne Zellen oder wenige aggregierte Zellen) bis zu Aggregaten mit vielen Millimetern Durchmesser reichen, die aus vielen Tausenden von Zellen bestehen.
• Das Pflanzenmaterial, das in dieser Erfindung nützlich ist, wurde aus allen bekannten Taxus-Arten erhalten, d. h., brevifolia, canadensis, cuspidata, baccata, globosa, floridana, wallichiana, media und chinensis. Insbesondere haben die Erfinder festgestellt, daß die. Art Taxus chinensis imstande ist, signifikante Mengen an Taxol und Taxanen in einer kurzen Kulturzeitperiode zu erzeugen, wobei gewünschte Verbindungen kontinuierlich in das Medium sezerniert werden.
• Die Erfinder haben festgestellt, daß sich der spezifische Taxol-Gehalt je nach Pflanzenart, und unter den Pflanzenarten je nach Gewebequelle und spezifischen Bäumen unterscheidet. Die Wahl einer ausbeutereichen Quelle für die Taxol-Produktion ist ein wichtiger erster Schritt für die Bereitstellung ausreichender Taxol-Mengen für die therapeutische Verwendung.
Initiierung von Taxus-Zellinien
• Taxus-Pflanzenmaterial kann in ganz Nordamerika wie auch in anderen Kontinenten gesammelt werden. Die Kultur wird durch die Wahl des richtigen Taxus-Gewebes für das Wachstum initiiert. Gewebe von jedem Teil der Pflanze, einschließlich der Rinde, des Kambiums, der Nadeln, des Stamms, der Samen, Zapfen und Wurzeln, kann zum Induzieren des Kallus gewählt werden. Für eine optimale Taxol-Ausbeute sind jedoch Nadeln und die meristematischen Regionen von Pflanzenteilen bevorzugt. Besonders bevorzugt sind frisch gewachsene Nadeln (z. B. ein bis drei Monate alt), die im allgemeinen durch eine hellere grüne Farbe erkannt werden können. Der Begriff "frisch gewachsen" soll weitreichend die Pflanzennadelproduktion innerhalb der Wachstumssaison des Jahres bezeichnen.
• Zur Vermeidung einer Kontamination der Kultur sollte das Gewebe vor dem Einführen in das Kulturmedium oberflächensterilisiert werden. Jede herkömmliche Sterilisationstechnik, wie eine CLOROX-Behandlung (ein Warenzeichen, im Besitz der CLOROX- Company, für Bleiche), wäre wirksam. Zusätzlich können antimikrobielle Mittel, wie Cefoxitin, Benlat, Cloxacillin, Ampicillin, Gentamycinsulfat und Phosphomycin zur Oberflächensterilisation von Pflanzenmaterial verwendet werden.
Kalluswachstum
• Kulturen weisen für gewöhnlich eine Variabilität in der Wachstumsmorphologie, Produktivität, den Produktprofilen und anderen Eigenschaften auf. Da einzelne Zellinien sich in ihrer Bevorzugung von Wachstumsmediuminhaltsstoffen unterscheiden, können viele verschiedene Wachstumsmedien zur Induzierung und Proliferation des Kallus verwendet werden.
• Die richtige Mediumzusammensetzung unterscheidet sich je nach kultivierter Art.
• Die bevorzugten Medien für die verschiedenen Arten sind in Tabelle 3 angeführt. Zum Beispiel sind die beiden bevorzugten Wachstumsnährmedien für Taxus chinensis A und D, wobei aber auch andere verwendet werden können. Diese Medien enthalten vorzugsweise die Inhaltsstoffe, die in Tabelle 2 angeführt sind. Wenn zum Beispiel Medium A verwendet wird, sind Wachstumshormone oder Regulatoren in dem Medium in einer Menge zwischen 1 ppb bis 10 ppm, und vorzugsweise von 2 ppb bis 1 ppm, enthalten. Wenn Medium D verwendet wird, sind die Wachstumshormone oder Regulatoren in einer Menge zwischen 1 ppb bis 10 ppm, und vorzugsweise von 2 ppb bis 2 ppm, enthalten. Die Mengen anderer Mediuminhaltsstoffe können in einem Gehalt enthalten sein, der von 1/10 Konzentration bis zum Dreifachen der in Tabelle 2 angegebenen Konzentrationen reicht, sind aber vorzugsweise in den in Tabelle 2 angegebenen Mengen enthalten.
Suspensionswachstum
• Taxus-Suspensionskulturen ermöglichen rasche Wachstumsraten und hohe Zelldichten, wie andere Pflanzenzellkulturen. Optimale Bedingungen unterscheiden sich jedoch von einer Zellinie zur anderen, und daher müssen Methoden, die zu einer raschen Optimierung für eine bestimmte Zellinie führen, in Betracht gezogen werden.
• Die anfänglichen Kulturen verschiedener Taxus-Arten werden durch Übertragen in die Medien, die in Tabelle 3 angeführt sind, die Makro- und Mikronährstoffe, organische Salze und Wachstumshormone enthalten, subkultiviert. Die Mengen liegen im allgemeinen innerhalb der folgenden Bereiche: beginnend mit 1/10 Konzentration bis zum Dreifachen der Konzentration jedes Mediuminhaltsstoffs, der in Tabelle 2 dargestellt ist. Bevorzugte Werte sind jene, die in Tabelle 2 dargestellt sind.
• Die flüssigen Kulturen werden Luft ausgesetzt und vorzugsweise geschüttelt oder auf andere Weise sanft bewegt, um Luft in das Medium einzuführen, oder Luft kann durch Rohrleitungen in die Kulturgefäße eingeleitet werden. Die Kulturen werden unter geeigneten Wachstumsbedingungen bei einer Temperatur zwischen 20º bis 26ºC gehalten. Der pH kann etwa 3 bis 7 und vorzugsweise zwischen 4 bis 6 betragen. Die Kultur kann unter Lichtbedingungen gezüchtet werden, die von vollständiger Dunkelheit bis vollständigem Licht (Schmalband- und/oder Breitbandspektrum) über verschiedene Zeitperioden reichen. Da die Taxol-Gesamtproduktion in Kulturen, die Licht ausgesetzt werden, am höchsten ist, ist dies bevorzugt. Typische Lichtstärkenbedingungen reichen von etwa 100 bis etwa 3000 footcandle.
• Die Suspensionskulturen werden 1 bis 8 Wochen ab dem Zeitpunkt der Subkultivierung aufrechterhalten, wonach das Kulturwachstum abnimmt. Die Kulturen werden durch Entfernung des Wachstumsmediums, wie durch Filtration, geerntet. Die geerntete Kultur wird gewogen und getrocknet, wie durch Lyophilisation, zu einem feinen Pulver gemahlen, und das Taxol kann durch die Verwendung herkömmlicher Lösemittelextraktionstechniken extrahiert werden.
• Verdopplungszeiten wurden durch Aufzeichnung der zeitabhängigen Zunahme an Biomasse gemessen, wie auch durch einfache Aufzeichnung des Wachstumsindex während der Routine-Subkultur. Es wurden maximale Trockengewichtdichten von 15-24 Gramm pro Liter erreicht. Die Wachstumseigenschaften verschiedener Suspensionen von Taxus-Arten sind in Beispiel 4 ausführlich behandelt.
Analysemethoden
• Methoden zur Extraktion und Gewinnung von Taxol und Taxanen aus Zellen und dem Medium entsprechen herkömmlichen Techniken und sind ausführlich in Beispiel 5 beschrieben. Die Immunoassay- (ELISA) Technik folgte weitgehend den Protokollen, die von Hawai Biotechnology mit dem im Handel erhältlichen Kit bereitgestellt werden. Hochleistungs-Flüssigchromatographiemethoden wurden leicht gegenüber bestehenden Protokollen verändert, wie in Beispiel 5 ausführlich beschrieben ist. Unter den Bedingungen, die in dieser Erfindung verwendet werden, wurde eine klare Auflösung von Taxan-Spitzen erreicht, was einen exakten Nachweis und eine exakte quantitative Bestimmung zur Folge hatte. Wegen der Möglichkeit einer gleichzeitigen Elution von Nicht-Taxan-Komponenten wurde die spektrale Reinheit jeder mutmaßlichen Taxan-Spitze durch eine Diodenreihe vor der Integration von Spitzenflächen geprüft. Die Retentionszeiten von Taxan-Standards sind in Beispiel 5 angeführt, und ein Probenchromatogramm ist in Fig. 4 enthalten.
Produktionsmediumbedingungen
• Wie hierin verwendet, wird der Begriff "Nährmedium" zur Beschreibung eines Mediums verwendet, das für die Kultivierung von Pflanzenzellkallus- und Suspensionskulturen geeignet ist. Der Begriff "Nährmedium" ist allgemein und umfaßt sowohl "Wachstumsmedium" als auch "Produktionsmedium". Der Begriff "Wachstumsmedium" wird zur Beschreibung eines Nährmediums verwendet, das ein rasches Wachstum kultivierter Zellen begünstigt. Der Begriff "Produktionsmedium" bezeichnet ein Nährmedium, das die Taxol- und Taxan-Biosynthese in kultivierten Zellen begünstigt. Es ist offensichtlich, daß Wachstum in einem Produktionsmedium stattfinden kann, und daß Produktion in einem Wachstumsmedium erfolgen kann; und daß sowohl ein optimales Wachstum als auch eine optimale Produktion in einem einzigen Nährmedium stattfinden können.
• Bestimmte Klassen von Additiven in dem Nährmedium werden in dieser Erfindung mit speziellen Namen bezeichnet, und sind hier definiert. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Antibräunungsmittel" Komponenten, die dem Nährmedium zugegeben werden, um die Bildung von Pigmenten während der Zellkultivierung zu vermeiden. Zu diesen Pigmenten zählen Phenole und verwandte Verbindungen, bei welchen im allgemeinen eine schädliche Wirkung auf das Zellwachstum, die Lebensfähigkeit und Produktbildung beobachtet wird. Wie hierin verwendet, wird der Begriff "biosynthetische Prekursoren" zur Beschreibung von Verbindungen verwendet, die dem Nährmedium zugegeben werden, die metabolisiert und von den Zellen in Taxol und Taxane eingebaut werden. Wie hierin verwendet, wird der Begriff "metabolische Inhibitoren" zur Beschreibung von Verbindungen verwendet, die dem Nährmedium zugegeben werden, die bestimmte biosynthetische Pfade stören. Zum Beispiel kann ein metabolischer Inhibitor zur Verstärkung der Taxol-Biosynthese verwendet werden, indem er einen anderen Pfad blockiert, der mit Taxol um einen frühen biosynthetischen Prekursor konkurriert. Wie hierin verwendet, wird der Begriff Stimulator oder Aktivator zur Beschreibung von Verbindungen verwendet, die dem Nährmedium zugegeben werden, die bestimmte biosynthetische Pfade stimulieren oder aktivieren, zum Beispiel jene, die zur Taxol-Biosynthese führen. Es ist offensichtlich, daß der Wirkungsmechanismus der hierin beschriebenen Additive nicht restlos geklärt sein könnte.
• Wenn eine sekundäre Metabolitenbildung in einer Suspensionskultur gleichzeitig mit dem Wachstum stattfindet, wird der Metabolit als wachstumsassoziiert bezeichnet, und eine einzige Mediumformulierung kann ausreichend sein, um ein gutes Wachstum und eine hochwertige Produkte zu erreichen. In vielen anderen Systemen hat sich gezeigt, daß ein rasches Wachstum und eine hohe Produktbildung nicht gleichzeitig stattfinden. In solchen Fällen sind die Wachstums- und Produktionsphasen getrennt und es wird für jede Phase unabhängig ein Medium entwickelt (Überblick in Payne et al. 1991). Im Falle der Taxol- und Taxan-Produktion in Taxus chinensis, waren Wachstum und rasche Produktbildung getrennt, und für jedes wurden unabhängige Medien gebildet. Es ist jedoch offensichtlich, daß ein einziges Wachstums/Produktionsmedium für diese Kultur formuliert werden kann. Die hier entwickelten Produktionsmedien erhöhen nicht nur die gesamte Taxol- und Taxanbildung, sondern lenken auch die zelluläre Biosynthese auf die Taxol-Produktion. Zusätzlich ist die Produktion störender Nebenprodukte, wie Cephalomannin, im Vergleich zu Rindegewebe minimal. Die hier entwickelten Produktionsmedien fördern auch eine verlängerte Lebensfähigkeit der Zelle und Biosynthese, und bewirken zusätzlich, daß wesentliche Produktmengen in das extrazelluläre Medium sezerniert werden. Diese Eigenschaften sind in der Durchführung eines effizienten Verfahrens zur Taxol-Produktion im kommerziellen Maßstab besonders wichtig.
• Die bevorzugten Produktionsmedien für die verschiedenen Arten sind in Tabelle 5 angeführt, obwohl andere verwendet werden können. Zum Beispiel sind die bevorzugten Produktionsmedien für Taxus chinensis B und C, obwohl andere verwendet werden können. Diese Medien enthalten vorzugsweise die in Tabelle 2 angeführten Inhaltsstoffe. Diese Medien enthalten vorzugsweise anorganische Haupt- und Nebensalze, organische Verbindungen und Wachstumshormone oder Wachstumsregulatoren. Die Mengen liegen im allgemeinen in den folgenden Bereichen, beginnend mit der 1/10 bis dreifachen Konzentration jedes Mediuminhaltsstoffs, der in Tabelle 2 angegeben ist. Die bevorzugten Werte sind jedoch jene, die in Tabelle 2 angeführt sind.
• Wenn Medium B verwendet wird, sind die Wachstumsregulatoren in dem Medium in einer Menge zwischen 0,1 ppm bis 20 ppm enthalten, und vorzugsweise zwischen 1 ppm und 10 ppm. Wenn Medium C verwendet wird, sind die Wachstumsregulatoren in dem Medium vorzugsweise in Mengen im Bereich von 0,1 ppm bis 5 ppm enthalten.
• Es ist offensichtlich, daß in diesem Medium Modifikationen vorgenommen werden können, wie die Substitution anderer herkömmlicher Salzzusammensetzungen (wie organischer Verbindungen, Vitamine, Aminosäuren, Prekursoren, Aktivatoren und Inhibitoren), die Zugabe oder Entfernung verschiedener Komponenten, Wachstumsregulatoren oder eine Veränderung der Anteile.
• Zusätzlich zu nichtflüchtigen, gelösten Nährstoffen, spielen gasförmige Komponenten, vorwiegend Sauerstoff, Kohlendioxid und Ethylen (ein Pflanzenhormon), eine entscheidende Rolle beim Wachstum und der Produktbildung. Zwei Parameter sind wichtig. Die Konzentrationen an gelöstem Gas, die das Wachstum und die Taxol-Bildung fördern, sind offensichtlich von Bedeutung, da sie die Reaktorbetriebsbedingungen bestimmen. Zusätzlich müssen die Verbrauchs- oder Produktionsraten beim Reaktoraufbau berücksichtigt werden, so daß die optimalen spezifizierten Konzentrationen aufrechterhalten werden können. Neben seiner Bedeutung für die Respiration kann Sauerstoff auch die Rate der sekundären Biosynthese dramatisch beeinflussen. Eine hohe Sättigungskonstante für einen Sauerstoff benötigenden Schritt auf einem sekundären Biosynthese-Pfad kann erfordern, daß Zellen hohen Sauerstoffwerten in dem Reaktor ausgesetzt werden. Die Bedeutung der CO&sub2;- Anreicherung in der Aufrechterhaltung hoher Wachstumsraten wurde dokumentiert. Ethylen, ein Pflanzenhormon, spielt pleiotrope Rollen in allen Aspekten des Pflanzenwachstums und der Entwicklung, einschließlich des sekundären Metabolismus (siehe z. B. Payne et al., 1991).
Auslöser
• Zur Verbesserung der Ausbeute von Taxol und anderen verwandten Taxanen in Zellkulturen haben die Erfinder eine Reihe von Vorgangsweisen verfolgt. Eine der Methoden, die zur Erhöhung der Produktivität angewandt wurde, ist die Verwendung sogenannter Auslöser. Wie hierin verwendet, wird der Begriff Auslöser für Verbindungen biologischen und nichtbiologischen Ursprungs verwendet, die eine Erhöhung in der sekundären Metabolitproduktion verursachen, wenn sie bei Pflanzen oder Pflanzenzellkulturen angewendet werden (Eilert 1987; Ebel 1984; und Darvill et al. 1982). Viele verschiedene Verbindungen können als Auslöser dienen, abhängig von der Art ihres Ursprungs und ihres Wirkungsmodus beim Zellmetabolismus. In diesen Studien haben die Erfinder zwei Hauptarten von Auslöser verwendet: 1) Biotische Auslöser, die für gewöhnlich Zellwandextrakte oder Filtrate von einer ausgewählten Gruppe von Pilzen, Bakterien und Hefen umfassen, und auch deren gereinigte Fraktionen. 2) Abiotische Auslöser, die chemische Streßmittel wie auch einige Verbindungen biologischen Ursprungs enthalten (siehe Auslöser, die in Tabelle 1 angeführt sind).
• Christen et al. (1991) berichten die Verwendung von Pilz-Auslösern und ausgewählten Verbindungen zur Produktion von Taxol durch Suspensionen von Taxus brevifolia; die Erhöhungen in der Menge der Taxol-Ansammlung aufgrund von Auslöserbehandlungen wurden jedoch nicht spezifiziert.
• Im allgemeinen waren beide Arten von Auslösern wirksam, obwohl das Ausmaß, in dem die Auslösung (Taxan-Ansammlung in Zellkulturen, wie auch deren Sekretion in das Medium) auftrat, sich von Auslöser zu Auslöser und von Art zu Art unterschied. Der höchste Produktionsanstieg wurde mit Chitosanglutamat, Lichenan, Ferulasäure und Benzoesäure erreicht. Chitosan und Lichenan sind komplexe Polysaccharide, die von mikrobiellen Zellwänden abgeleitet werden. Wenn Chitosan alleine verwendet wird, ist es in Medium unlöslich und ist toxisch und verursacht einen dauerhaften Zellschaden. Chitosanglutamat ist andererseits in Medium leicht löslich und beeinträchtigt die Lebensfähigkeit der Zelle nicht. Ferula- und Benzoesäure sind synthetisierte Chemikalien biologischen Ursprungs und werden im allgemeinen als Antioxidanzien in biologischen Systemen verwendet.
• Auslöser interagieren mit gelösten Gasen in vielfachen Weisen. Der Sauerstoffbedarf kann sich bei der Auslösung ändern. Anstiege in Respirationsraten als Wundreaktion werden allgemein in Pflanzenzellkulturen beobachtet. Auslöser können, was von Bedeutung ist, ihre Wirkung über Ethylen vermitteln. In solchen Fällen kann es wünschenswert sein, eine mikrobielle Auslöserzubereitung durch Ethylen zu ersetzen, und vielleicht die Toxizität zu verhindern, die mit anderen mikrobiellen Komponenten in der Auslöserzubereitung zusammenhängt.
• Auslöser und metabolische Streßmittel können gemäß dieser Erfindung zur Maximierung der Taxol-Produktion und Sekretion in Gewebekultur verwendet werden, indem die Auslöserspezifität und -konzentration, die zeitliche Steuerung und Dauer als Funktion des Kulturalters und der Medienzusammensetzung bestimmt wird.
Rascher Mediumaustausch zur Erhöhung der Produktivität
• Wie in Beispiel 7.3 dargelegt, trug die Entfernung von verbrauchtem Medium und das Nachfüllen von frischem Medium alle 3 Tage zu einer deutlichen Verbesserung der Gesamt-Taxan- und Taxol-Produktion bei, wie auch zu einer Erhöhung der Mengen an extrazellulärem Produkt.
• Die stimulierenden Wirkungen des Mediumaustausches könnten auf die Entfernung des Produkts in situ zurückzuführen sein, wodurch eine rekurrente Hemmung und Produktverschlechterung verhindert wird. Solche positiven Wirkungen der in situ Produktentfernung auf die sekundäre Metabolitenproduktion und Sekretion in Suspensionskulturen wurde unter anderem von Robins und Rhodes (1986) und Asada und Shuler (1989) dokumentiert. Die periodische Entfernung von verbrauchtem Medium bringt die obengenannten Vorteile mit sich, und kann zusätzlich zur Dereprimation einer sekundären Biosynthese durch Entfernung anderer hemmenden Nicht-Taxan-Komponenten (wie Phenolverbindungen) aus dem Medium dienen.
• Das Nachfüllen von frischem Medium zu den Zellen, die eine aktive Biosynthese erfahren, kann auch die Produktion steigern, indem wesentliche Nährstoffe, die verarmt sind, bereitgestellt werden. Zum Beispiel waren Miyasaka et al. (1986) imstande, die Zellen von Salvia miltiorhiza in der stationären Phase zu stimulieren, um Diterpenmetaboliten, Cryptotanshinon und Ferruginol zu erzeugen, indem einfach Sucrose dem Medium zugegeben wurde. Vermutlich hat die Biosynthese aufgrund der Kohlenstoffbegrenzung in der stationären Phase geendet. Das periodische Mediumaustausch-Protokoll, das in der vorliegenden Arbeit verwendet wird, könnte infolge eines der obengenannten Faktoren günstig gewesen sein.
• Es ist offensichtlich, daß die Menge an ausgetauschtem Medium, die Häufigkeit des Austausches, und die Zusammensetzung des nachgefüllten Mediums verändert werden können.
• Die Fähigkeit, die Biosynthese und Sekretion durch periodischen Mediumaustausch zu stimulieren, hat wichtige Auswirkungen auf den Aufbau und die Durchführung eines effizienten kommerziellen Verfahrens im kontinuierlichen, semi-kontinuierlichen oder Nachführ-Beschickungsmodus.
Licht
• Für höhere Pflanzen ist Licht ein wirksamer Faktor im sekundären Metabolismus, sowohl bei der intakten Pflanze als auch in Zellkulturen. Sowohl die Stärke als auch die Wellenlänge von Licht sind wichtig (Seibert und Kadkade 1980). Zum Beispiel werden die Flavanoid- und Anthocyanin-Biosynthese für gewöhnlich durch kontinuierliches Licht hoher Stärke begünstigt, während im Dunkeln kultivierte Kulturen für andere Metaboliten bevorzugt sein können. Ein Anstieg in der Ergrünung oder photosynthetischen Kapazität kultivierter Zellen kann auch die Produktbildung oder das Produktspektrum verbessern. Die Studien der Erfinder beinhalteten die Verwendung sowohl von Breitband- als auch spezifscher Schmalband-Lichtquellen. Wie in Beispiel 7.3 dargestellt ist, kann die Lichtbestrahlung eine erhöhte Taxol-Ansammlung wie auch Sekretion in das Medium herbeiführen. Die stimulierende Wirkung von Licht auf die Taxol-Produktion läßt auf das Vorhandensein einzigartiger Steuermechanismen für die Biosynthese von Taxanen schließen. Die Art des Photorezeptors und die biochemischen Eigenschaften der durch Licht herbeigeführten Stimulierung sind noch nicht geklärt.
Verfahrensdurchführungsmoden
• Der Durchführungsmodus für ein Pflanzenzellkulturverfahren bezieht sich auf die Art und Weise, in der Nährstoffe, Zellen und Produkte in bezug auf die Zeit zugegeben oder entfernt werden (Payne et al. 1991). Wenn alle Nährstoffe zu Beginn bereitgestellt werden, und die Kulturinhaltsstoffe, umfassend die Zellen und das Produkt, am Ende der Kulturperiode geerntet werden, wird der Betriebsmodus als "einstufiges Beschickungsverfahren" bezeichnet. Wenn ein Beschickungsverfahren in zwei aufeinanderfolgende Phasen, eine Wachstums- und eine Produktionsphase, geteilt ist, wobei das Medium zwischen den beiden Phasen getauscht wird, wird der Durchführungsmodus als "zweistufiges Beschickungsverfahren" bezeichnet.
• In einem "Nachführ-Beschickungsverfahren" werden bestimmte Mediumadditive und Nährstoffe entweder periodisch oder kontinuierlich im Verlauf einer einstufigen oder zweistufigen Beschickungskultur zugegeben.
• Wenn ein wesentlicher Teil, aber nicht alle, der Inhaltsstoffe einer Beschickungskultur geerntet wird, während frisches Medium für ein anhaltendes Zellwachstum und eine anhaltende Produktion zugegeben wird, ist das Verfahren einem "wiederholten Abzugs- und Nachfüllvorgang" ähnlich und wird als "semi-kontinuierliches Verfahren" bezeichnet. Wenn frisches Medium kontinuierlich zugegeben wird und überschüssiges Medium kontinuierlich entfernt wird, wird das Verfahren als "kontinuierlich" bezeichnet. Wenn Zellen in dem Reaktor gehalten werden, wird das Verfahren als "Durchströmungsmodus" bezeichnet. Wenn Zellen kontinuierlich mit dem überschüssigen Medium entfernt werden, wird das kontinuierliche Verfahren als "Chemostat" bezeichnet.
• Es ist offensichtlich, daß diese verschiedenen Verfahrensdurchführungsmoden mit dem hierin beschriebenen Taxol-Produktionssystem kompatibel sind.
BEISPIELE
• Die folgenden Beispiele beschreiben die Materialien und Methoden näher, die bei der Durchführung der Erfindung verwendet werden. Die Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1 Kallusinitiierung
• Proben von Taxus-Pflanzenmaterial wurden aus einer Reihe von wilden und kultivierten Pflanzen gesammelt. Die Proben wurden bei der Ankunft im Labor verarbeitet oder bis zur Verwendung bei 4ºC gelagert.
• Das Material wurde zunächst in einer verdünnten Seifenlösung gewaschen, in Wasser gespült, und die Oberfläche in einer CLOROX-Lösung (1% Hypochlorit, pH 7) 10 Minuten sterilisiert. Das Material wurde dann unter sterilen Bedingungen dreimal mit sterilem Wasser gespült. Die Nadeln wurden dann in einer 1% Polyvinylpyrrolidon- (PVP) Lösung mit 100 mg/l Ascorbinsäure geschnitten. Die Nadeln wurden mit dem geschnittenen Ende in Medium E (siehe Tabelle 2) eingebracht. 30 bis 40 Explantate wurden pro Platte Medium kultiviert. Die Platten, welche die Explantate enthielten, wurden bei 24 ± 1ºC im Dunkeln inkubiert. Die Platten wurden täglich auf das Auftreten kontaminierender Mikroorganismen überwacht, und wenn diese vorhanden waren, wurden unkontaminierte Nadeln entfernt und in eine frische Platte Medium E eingebracht. Eine wesentliche Kallusbildung wurde beobachtet und der Kallus wurde von dem Explantat spätestens nach 20 Tagen getrennt und auf die verschiedenen Kallus-Proliferationsmedien aufgebracht, die in Tabelle 3 angeführt sind. Zum Beispiel wurden Kalli von Taxus chinensis auf Medium D überführt (siehe Tabelle 2). Diese Initiationsprozedur war sehr effizient und führte zu einer geringen Kontaminationsrate und einer hohen Frequenz der Kallusinduktion mit mehr als 90% initiierten Explantaten. Dieselbe Prozedur wurde erfolgreich zum Initiieren von Kulturen von Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus cuspidata, Taxus baccata, Taxus globosa, Taxus floridana, Taxus wallichiana, Taxus media und Taxus chinensis verwendet.
Beispiel 2: Kallusproliferation
• Sobald Kalli aus dem Explantat entfernt waren, wurden sie bei 24 ± 1ºC im Dunkeln kultiviert. Gesunde Teile des Kallus wurden alle 10 Tage in frisches Medium überführt, und diese Häufigkeit der Überführung erwies sich als äußerst wichtig in der Verhinderung einer Bräunung für eine längere Kalluserhaltung. Die bevorzugten Wachstums- und Erhaltungsmedien für Kalli verschiedener Arten sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Beispiel 3: Suspensionsinitüerung
• 1 g Frischgewicht von Kallusmaterial wurde aseptisch in einen 125 ml Erlenmeyer Kolben geimpft, der 25 ml flüssiges Medium enthielt, das für jede Art das geeignete war (siehe Tabelle 3). Zum Beispiel wurde Medium D für Taxus chinensis verwendet. Der Kolben wurde mit einem Silikonschaumkappe (Bellco, NJ) bedeckt und auf einen Kreiselschüttler bei 120 U/min bei 24 ± 1ºC im Dunkeln aufgebracht. Suspensionskulturen bildeten sich in etwa 3 bis 10 Tagen. Zu Beginn wurde Medium durch Saugfiltration des Kolbeninhalts durch einen Büchner-Trichter, der einen Miracloth-Filter (Calbiochem) enthielt, und Resuspendieren der gesamten Biomasse in frischem Medium getauscht. Nach dem Zellwachstum wurden 1-2 g (Frischgewicht) Zellen allgemein in einen neuen 125 ml Kolben überführt, der 25 ml frisches Medium enthielt, und wurden danach wöchentlich subkultiviert.
Beispiel 4: Wachstum suspendierter Zellen
• Die typischen Wachstumsraten und Zelldichten, die in Suspensionskulturen repräsentativer Arten erreicht wurden, sind in Tabelle 4 angeführt.
• Als ausführliches Beispiel ist die Zunahme an Biomasse (Frisch- und Trockengewicht) im Laufe der Zeit für die Taxus chinensis Linie K-1 in Fig. 1 dargestellt. Die maximale Wachstumsrate wurde anhand der Steigung an Punkten mit der schnellsten Zunahme an Biomasse auf den Wachstumskurven gemessen. Zellkulturen von Taxus chinensis wuchsen mit einer maximalen Verdopplungszeit von 2,5 Tagen. Diese Wachstumsrate ist signifikant höher als zuvor für Suspensionskulturen der Taxus-Art angegeben wurde. Zum Beispiel berichteten Christen et al. (1991) eine fünf bis zehnfache Zunahme an Biomasse nach 3 bis 4 Wochen Kultur, was eine durchschnittliche Verdopplungszeit für Taxus brevifolia Suspensionen von 7 bis 12 Tagen bedeutet.
• Die Möglichkeit, Zellen bei hoher Dichte zu kultivieren, ist für die Maximierung der volumetrischen Produktivität eines Zellkulturverfahrens wichtig. Während Kulturen von Taxus brevifolia eine Zelldichte von weniger als 1 g Trockengewicht pro Liter (berechnet aus den Daten, die in Christen et al. (1991) angegeben sind) erreichten, konnten Suspensionen von Taxus chinensis Dichten bis zu 8 bis 20 g Trockengewicht pro Liter nach 18 Tagen Wachstum erreichen. Die Lebensfähigkeit von Zellen wurde durch Färben der Zellen mit einer 0,05% Lösung aus Fluoresceindiacetat in Aceton (Widholm, 1972) und Zählen der Anzahl von grün fluoreszierenden Zellen bei Erregung mit blauem Licht in einem invertierten Fluoreszenzmikroskop (Olympus IMT-2, Japan) bestimmt. Die Lebensfähigkeit von Zellen war während der gesamten Wachstumsphase höher als 90%.
• Die Möglichkeit, Zellen unter raschen Wachstumsbedingungen zu hohen Zelldichten zu kultivieren, während eine hohe Lebensfähigkeit erhalten bleibt, ist eine wichtige Voraussetzung für das wirtschaftlichen Betreiben eines Pflanzenzellkulturprozesses zur Bereitstellung von Taxol und Taxol-artigen Verbindungen.
Beispiel 5 Analyse von Taxol und Taxanen 5.1 ELISA-Methoden
• Die ELISA-Analyse für Taxol (Hawaii Biotech) wurde zur Massendurchmusterung von Zellinien verwendet. Diese Methode bietet eine hohe Empfindlichkeit (0,1 ng/ml), da aber ein polyklonaler Antikörper verwendet wird, wird eine Kreuzreaktivität mit anderen Taxanen beobachtet. Präparative (analytischer Maßstab) HPLC mit Fraktionssammlung zeigte eine Kreuzreaktivität mit 10-Deacetyltaxol, 7-Xylosyl-10-deacetyltaxol, Cephalomannin, 10-Deacetyl-7-epitaxol, 7-Epitaxol, wie auch mit anderen nicht identifizierten Taxanen. Trotz dieser Kreuzreaktivität erwies sich diese Methode als äußerst nützlich für den Nachweis der Taxan-Produktion und ermöglichte eine rasche Durchmusterung einer großen Anzahl von Zellinien. Zellextrakte, die eine signifikante Produktion von Taxanen zeigten, wurden dann ausführlich unter Verwendung des in der Folge beschriebenen HPLC- Verfahrens analysiert.
5.2 Extraktion von Taxol und verwandten Taxanen
• Die Extraktion von Taxanen aus Überständen wurde nach zwei Methoden ausgeführt, abhängig von den in den Medien vorhandenen Konzentrationen. Wenn ausreichende Mengen an Taxanen in flüssigen Medien vorhanden waren, wurden Proben sehr rasch und effizient hergestellt. Medien (2 ml) wurden vollständig (in Vakuum) getrocknet und eine abgemessene Menge an Methanol (0,5-2,0 ml) wurde zugefügt. Diese Mischung wurde ultraschallgerührt, bis eine vollständige Auflösung oder Dispersion der Probe erreicht war. Feststoffe wurden durch Zentrifugation vor der HPLC-Analyse entfernt. Quantitative Ausbeuten wurden bei Werten von 1 mg/l mit Nachweiswerten deutlich unter 0,1 mg/l erhalten. Wenn die Konzentration von Taxanen in den Kulturüberständen gering war, wurde das Medium dreimal mit einem gleichen Volumen einer Mischung aus Methylenchlorid und Isopropylalkohol (IPA) (9 : 1 auf das Volumen bezogen) extrahiert. Die organische Schicht wurde bis zur Trockenheit verringert und in einem abgemessenen Volumen Methanol (50 - 250 ml) rekonstituiert. Eine Mehrfachextraktion ergab für gewöhnlich 90-95% Taxol, Cephalomannin, und Baccatin III bei 0,6 mg/l Werten.
• Zellmaterialien wurden durch Einfrieren frisch geernteter Zellen (-5ºC), wonach eine Vakuumtrocknung folgte, und Methanol Soxhlet-Extraktion über 50 Zyklen extrahiert. 70 bis 80% der Taxane wurden im allgemeinen gewonnen, mit 10-15% meßbarer Zersetzung. Die Extraktion von festen Medien und Kallus wurde identisch zu jener der Zellen durchgeführt, wobei aber immer eine Verteilung von Methylenchlorid/IPA gegenüber Wasser des letzten Methanolextrakts durchgeführt wurde.
5.3. Hochleistungs-Flüssigchromatographiemethoden
• Eine analytische Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) wurde auf einer kohlenstoffreich beladenen Diphenylsäule (Supelco, 5 mM, 4,6 mm · 25 cm) mit einem LDC analytischen Zweikomponenten-Hochdruckmischsystem durchgeführt, das aus CM3500/CM3200 Pumpen, einem CM4100 automatischen Probengebersystem mit variablem Volumen, und einem SMS000 Photodiodenarraydetektor bestand, der an einen Total Peripherals 486 Personal-Computer angeschlossen war. Die Säulentemperatur wurde mit einem Eldex CH150 Säulenofen bei 35ºC reguliert. Die quantitative HPLC-Analyse von Taxanen wurde unter Verwendung eines Zweikomponentenelutionsschemas wie folgt ausgeführt:
• Die verwendeten chromatographischen Methoden sind mehreren veröffentlichten Methoden (Witherup et al. 1989) ähnlich, mit der Ausnahme, daß ein Phosphatpuffer, der Trifluoressigsäure enthielt, verwendet wurde und daß ein längerer Gradient benutzt wurde. Diese Unterschiede verbessern die Auflösung von Taxol und anderen Taxanen aus der Mischung deutlich. Die relativen Retentionszeiten, die für Taxane beobachtet wurden, sind in der Folge angeführt. Taxol eluiert zwischen 31 und 33 Minuten, abhängig von der Säule und Gerätschaft, die verwendet wurden.
• Verbindung Relative Retentionszeit
• 10-Deacetylbaccatin III 0,38
• Baccatin III 0,56
• 7-Xylosyl-10-deacetyltaxol C 0,80
• 10-Deacetyltaxol C 0,87
• Cephalomannin 0,94
• 10-Deacetyl-7-epitaxol C 0,98
• Taxol C 1,00
• 7-Epitaxol 1,12
• Die Retentionszeiten von Taxol, Cephalomannin und Baccatin III wurden unter Verwendung authentischer Proben bestimmt, die vom National Cancer Institute erhalten worden waren. Die Retentionszeiten der anderen, oben angeführten Taxane wurden mit analytischen Standards verglichen, die von Hauser Chemical (Boulder CO) bereitgestellt wurden. Die Identifizierung bekannter Taxane beruhte auf der Retentionszeit und Ultraviolett-Spektralvergleichen. Die Quantifizierung von Taxol, Cephalomannin und Baccatin III beruhte auf Ansprechfaktoren, die von authentischen Materialien bestimmt wurden. Die Quantifizierung von 10-Deacetylbaccatin III wurde unter Verwendung des Ansprechfaktors durchgeführt, der für Baccatin III bestimmt wurde. Die Quantifizierung der übrigen Taxol- Derivate beruhte konservativ auf dem Ansprechfaktor, der für Taxol gemessen wurde. Jeder der Standards (10 ml) wurde für gewöhnlich eingespritzt (zu Beginn, dann nach 3 oder 4 Proben) und die Flächen für jede der drei Komponenten wurden integriert. Die Ansprechfaktoren für jede der Komponenten wurden durch lineare Analyse kleinster Quadrate der Daten erhalten. 10 ml jeder Probe wurden eingespritzt und die Menge pro Injektion wurde beruhend auf der Standarddatenregression berechnet. Diese Ergebnisse wurden in Menge pro Liter oder Prozent Trockengewicht umgewandelt. Fig. 4 zeigt ein typisches Chromatogramm einer Überstandprobe.
5.4 MS/MS-Bestätigung von Taxol
• Die Identität von Taxol im Zellkulturüberstand wurde unter Verwendung einer MS/MS-Methode (wie in Fig. 6 dargestellt) bestätigt, die Fließinjektion mit einer Ionenzerstäubungs-Atmosphärendruck-Chemüonisation koppelt. Einzelheiten der Prozeduren, die zur Gewinnung der in Fig. 6 dargestellten Daten verwendet wurden, sind wie folgt: Massenspektrometer: Sciex API 3 Tripel-Quadrupol mit einer Atmosphärendruck- Ionisationsquelle. Stickstoff wurde als Vorhanggas verwendet und Argon wurde als Kollisionsgas für die CID-Spektren verwendet. Interface: eine Ionenzerstäubungs-Interface wurde zur Erzeugung von Ionen durch Ionenverdampfungsionisierung (Electrospray) verwendet. Null-Luft wurde als Zerstäubungsgas verwendet. LC-Pumne: ABI 140B Doppelspritzenpumpe, die bei 5 ul/Minute betrieben wird. Lösemittel: 50/50 Acetonitril/H&sub2;O 2 mM NH&sub4;OAc + 0,1% Ameisensäure. Einspritzvolumen: 5 ul, alle Spektren wurden durch Fließinjektionsanalyse ermittelt. Diese Methode lieferte eine eindeutige Bestätigung für die Gegenwart von Taxol in Zellkulturproben, und lieferte auch eine Quantifizierung mit ausgezeichneter Übereinstimmung mit HPLC-Ergebnissen.
Beispiel 6: Taxol-Produktion durch verschiedene Arten
• Das Taxol, das durch Zellkulturen verschiedener Taxus-Arten erzeugt wurde, ist in Tabelle 5 zusammengefaßt. Der Kallus wurde 20 Tage im Dunkeln auf dem angegebenen, verfestigten Medium für jede Art kultiviert. Die Zellen und das Medium wurden getrocknet und gemeinsam methanolextrahiert, und entweder durch ELISA oder HPLC, wie angegeben, analysiert. Die mit Taxus chinensis-Kulturen erhaltenen Ergebnisse sind in den Beispielen 7 und 8 ausführlich dargestellt.
Beispiel 7: 7.1 Produktion in Wachstumsmedium
• Die Produktion von Taxol und verwandten Taxanen begann innerhalb der ersten 2 Tage nach der Übertragung in Wachstumsmedium A. Das Maximum an Taxol wurde am Tag 15 mit 8,81 ul/Kolben beobachtet, was 0,44 mg/Liter Taxol entsprach. Davon waren 46,1% im extrazellulären Medium vorhanden. Am Tag 15 betrug die Taxan-Gesamtkonzentration 72,87 ug/Kolben, oder 3,6 mg/Liter, wovon 58,6% im exirazellulären Medium vorhanden waren. Die Lebensfähigkeit der Zellen war immer höher als 90%, wie durch Fluoreszenzfärbung (Beispiel 4) gemessen wurde, was darauf schließen läßt, daß die Gegenwart von extrazellulärem Taxol und Taxanen auf Sekretion und nicht auf Zellyse zurückzuführen war. Die Fähigkeit von Zellen, Taxol und Taxane zu sezernieren, ist ein wichtiger Aspekt einer kontinuierlichen Durchführung.
7.2 Mediumaustausch zur Erhöhung der Produktivität
• Deutliche Verbesserungen in der Taxol- und Gesamt-Taxan-Produktivität wurden durch aseptisches Absaugen des Wachstumsmediums A am Tag 9, Auffüllen mit frischem Medium und Wiederholen der Prozedur am Tag 12 erhalten. Das Experiment wurde am Tag 15 beendet und die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Die wichtigen Anstiege in der Produktivität aufgrund des Mediumaustausches sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Im Vergleich zu Kontrollen ohne Behandlung waren die mit einem Mediumaustausch erzeugten Gesamtmengen von Taxol und Taxanen ca. 4,6-mal höher. Von Bedeutung ist, daß im Vergleich zu Kontrollen ohne Mediumaustauschbehandlung ca. 4,9-mal mehr Taxol und ca. 5,9- mal mehr Gesamt-Taxane im extrazellulären Medium gewonnen werden konnten.
• Die Fähigkeit die Taxol- und Gesamt-Taxan-Produktivität deutlich zu verbessern und des weiteren eine extrazelluläre Produktansammlung zu verursachen, ist für die Durchführung eines effizienten, kontinuierlichen Verfahrens mit einer Wiederverwendung der Biomasse und einer vereinfachten stromabwärtigen Reinigung wesentlich.
7.3 Wirkung von Licht auf die Taxan-Produktion in Wachstumsmedium
• Es ist bekannt, daß Licht eine wichtige Rolle nicht nur in der Photosynthese, sondern auch in verschiedenen Aspekten des sekundären Metabolismus in Pflanzenzellkulturen spielt (Seibert und Kadkade 1980). Während die Experimente, die in Beispiel 4, 7.1 und 7.2 beschrieben sind, im Dunkeln ausgeführt wurden, wird hier die Reaktion von Taxus chinensis Kulturen auf Licht beschrieben.
• Ein Gramm Frischgewicht von 7 Tage alten Zellen der Taxus chinensis Linie K1 wurde in 25 ml Wachstumsmedium A (siehe Tabelle 2) in 125 ml Erlenmeyer Kolben geimpft und bei 24 ± 1ºC auf einem Kreiselschüttler bei 120 U/min inkubiert. Doppelkolben wurden im Dunkeln und unter einer Standard GroLux Lampe in einem Abstand von 3 Fuß aufgestellt. Spektralcharakteristika der Lampe sind in Fig. 3 dargestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angeführt.
• Die Bestrahlung der Kulturen mit Licht beeinträchtigte die Taxan-Werte oder das Ausmaß der extrazellulären Ansammlung nicht. Die Taxan-Profile waren jedoch in den beiden Behandlungen wesentlich verändert. Zum Beispiel erzeugten Zellen, die im Licht kultiviert worden waren, 2,8-mal mehr Taxol als Zellen im Dunkeln. Der Anteil des extrazellulären Taxols war auch signifikant höher als in der Behandlung im Dunkeln (76% gegenüber 56%). Die Anwendung der Lichtbehandlung, insbesondere von bestimmter spektraler Qualität, wäre somit in einem Zellkulturverfahren für die Taxol-Produktion äußerst nützlich.
Beispiel 8 Auslöser
• Der Begriff Auslöser wird für Verbindungen biologischen (oder biotischen) und nichtbiologischen (oder ablotischen Ursprungs verwendet, die einen Anstieg im sekundären Metabolismus verursachen, wenn sie Pflanzenzellkulturen zugegeben werden.
• Während sich eine Reihe von Auslösern als nützlich erwiesen hat, ist ein repräsentatives, veranschaulichendes Beispiel hier ausführlich beschrieben, nämlich die Verwendung von Chitosanglutamat. Obwohl Chitosan zuvor als Auslöser in einigen Pflanzenzellkultursystemen versucht wurde, haben die begleitenden toxischen Reaktionen, wie die Bräunung und der Verlust an Lebensfähigkeit, es zur Verwendung unbrauchbar gemacht (Beaumont und Knorr 1987). Tatsächlich sind solche toxischen Nebenwirkungen ein allgemeiner Nachteil vieler Auslöser, die in der Literatur angeführt sind. Die Verwendung von chemisch modifizierten Chitosanen, wie Chitosanglutamat, zur spezifischen Induzierung der Taxol- und Taxan-Biosynthese unter Umgehung toxischer Nebenwirkungen ist ein neuer Weg.
• Suspensionen der Taxus chinensis Linie K-1, die in Medium D 7 bis 8 Tage gezüchtet wurden, wurden unter Verwendung eines sterilen Büchner-Trichters aseptisch saugfiltriert, der mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) ausgestattet war. Zellen mit 2 g Frischgewicht wurden aseptisch in 25 ml Medium C (siehe Tabelle 2) in einem 125 ml Erlenmeyer Kolben überführt. Eine Lösung von 0,05% Chitosanglutamat wurde frisch hergestellt und durch einen 0,22 Mikron Patronenfilter filtersterilisiert. 825 ul dieser Lösung wurden dem Kolben zu Beginn des Experiments zugegeben, entsprechend einem Wert von 165 mg Auslöser pro Gramm Trockengewicht der Zellen. Die Kolben wurden bei 24 ± 1ºC auf einem Kreiselschüttler bei 110 U/min im Dunkeln inkubiert. Von den Kolben wurden am Tag 15 destruktiv Proben genommen und Beobachtungen hinsichtlich Wachstum, Farbe der Zellen und des Mediums und der Lebensfähigkeit der Zellen wurden aufgezeichnet. Gefriergetrocknete Proben wurden für Taxol und Taxane, wie in Beispiel 5 beschrieben, methanolextrahiert und durch HPLC analysiert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 8 dargestellt.
• Die Auslöserbehandlung führt zu einer mäßigen Verbesserung in der Gesamt-Taxan- Produktion pro Zelle (0,53% gegenüber 0,42% Trockengewicht Taxane) im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollen. Die nicht-toxische Eigenschaft des Auslösers geht aus der hohen Lebensfähigkeit (75-80%) hervor, die in beiden Behandlungen beobachtet wurde. Tatsächlich wurde wiederholt ein erhöhtes Trockengewicht in der Auslöserbehandlung im Vergleich zu Kontrollen beobachtet (14,2 g/l gegenüber 10,1 g/l Trockengewicht). Die höheren Zelldichten führten zu einem 1,8-mal höheren Titer an Gesamt-Taxanen in der Auslöserbehandlung, d. h., 75,8 mg/l gegenüber 42,4 mg/l für die Kontrolle.
• Die Auslöserbehandlung führte zu einer erhöhten Taxol-Biosynthese, sowohl auf einer Basis pro Zelle (0,098% gegenüber 0,054% Trockengewicht Taxol, ein 1,8-facher Anstieg) als auch in einem Titervergleich (13,9 mg/l gegenüber 5,4 mg/l, ein 2,6-facher Anstieg). Das Ausmaß der Sekretion war für die Auslöserbehandlung im Vergleich zu der Kontrolle höher (85% gegenüber 72% extrazelluläres Produkt).
• Die hierin beschriebene Auslöserbehandlung führt zu einer erhöhten Taxol-Produktion, einem besseren Produktprofil, einer verstärkten Produktsekretion und Erhaltung einer höheren Lebensfähigkeit der Zelle. Diese Produkteigenschaften stellen eine wesentliche Verbesserung für ein Zellkulturverfahren zur Taxol-Produktion dar.
Beispiel 8: Produktionsmediumentwicklung
• In dem Bemühen, die Taxol-Produktivitäten über die Werte zu erhöhen, die in Beispiel 6 beschrieben sind, wurden die Nährstoffwerte manipuliert, um spezielle "Produktionsmedien" zu erzeugen. 7 bis 8 Tage alte Suspensionen der Taxus chinensis Linie Kl, die in Medium D gezüchtet wurden, wurden unter Verwendung eines sterilen Büchner- Trichters aseptisch saugfiltriert, der mit einem Miracloth-Filter (Calbiochem) ausgestattet war. Zellen mit 500 mg Frischgewicht wurden aseptisch in 5 ml Produktionsmedium B und C (siehe Tabelle 2) überführt. Die Gefäße wurden über unterschiedliche Zeitperioden von 18, 25 und 42 Tagen bei 24 ± 1ºC auf einem Kreiselschüttler bei 110 U/min im Dunkeln inkubiert. Von den Behandlungen wurden destruktiv Proben genommen und Beobachtungen hinsichtlich Wachstum, Farbe der Zellen und des Mediums und der Lebensfähigkeit der Zellen wurden aufgezeichnet. Gefriergetrocknete Proben wurden für Taxol und Taxane, wie in Beispiel 5 beschrieben, methanolextrahiert und durch HPLC analysiert.
9.1. Ergebnisse der 18-tägigen Kultivierung
• Taxus chinensis Zellkulturen sprachen auf die geänderten Mediumzusammensetzungen an, indem sie wesentliche Taxan- und Taxol-Werte erzeugten. Diese Daten sind in Tabelle 9 zusammengefaßt und ein Probenchromatogramm ist in Fig. 4 dargestellt. In Medium B wurden 99,8 mg/Liter Gesamt-Taxane erzeugt, mit 24,1 mg/Liter reinem Taxol. In Medium C wurden 110 mg/Liter Gesamt-Taxane erzeugt, mit 21,3 mg/Liter reinem Taxol. Auf einer Trockengewichtsbasis erzeugten die Zellen 0,18% Trockengewicht Taxol auf Medium B und 0,065% Trockengewicht Taxol auf Medium C.
9.2. Verlängerte Kultivierung
• Die Taxol- und Taxan-Produktion nach verlängerter Kultivierung von Taxus chinensis Zellen (Linie K-1) über 25 und 42 Tage wurde in Medium C untersucht, und die Ergebnisse sind in Fig. 5 zusammengefaßt. Die folgenden signifikanten Beobachtungen können zusammengefaßt werden:
• (i) Taxus-Suspensionskulturen sind imstande, signifikante Werte von Taxol und anderen Taxanen zu erzeugen. Die höchste Ansammlung fand nach 42 Tagen statt, mit 0,32% Trockengewicht Taxol und 0,62% Trockengewicht Gesamt-Taxanen; entsprechend einem Titer von 153 mg/l Taxol und 295 mg/l Gesamt-Taxane, basierend auf dem Endmediumvolumen. Die Analyse dieser Probe durch Tandern-Massenspektrometrie bestätigte die Gegenwart von Taxol, wie in Fig. 6 dargestellt ist. Die Quantifizierung durch MS/MS zeigte eine ausgezeichnete Übereinstimmung mit HPLC.
• (ii) Die Rate der Taxol-Biosynthese zwischen Tag 25 und 42 betrug ca. 7,6 mg Taxol pro Liter pro Tag, unter der Annahme einer linearen Produktion in der 17-tägigen Periode.
• Diese Rate ist signifikant höher als die Produktionsrate in den ersten 25 Tagen. Die Rate der Gesamt-Taxan-Biosynthese zwischen Tag 25 und 42 betrug 12,3 mg pro Liter pro Tag.
• (iii) Produktionsmediumzubereitungen können bis zu 45-fache Anstiege im spezifischen Taxol-Gehalt im Vergleich zu schnellen Wachstumsbedingungen herbeiführen, wie jenen, die in Beispiel 7 beschrieben sind.
• (iv) Das Produktspektrum kann so manipuliert werden, daß die Biosynthese auf das gewünschte Endprodukt Taxol ausgerichtet wird, während die Produktion unerwünschter Taxane minimiert wird. Zum Beispiel bildete am Tag 25 Taxol 28% der Gesamt-Taxane und am Tag 42 stellte Taxol 52% der Gesamt-Taxane dar, im Gegensatz zu dem Wachstumsmedium (siehe Beispiel 7.1), in dem Taxol nur 12,2% der Gesamt-Taxane darstellte. Diese Fähigkeit, die Produktprofile zu manipulieren, hat wichtige Rückwirkungen auf die stromabwärtige Reinigung und für regulierende Schritte, die mit der Produktreinheit in Zusammenhang stehen. Zum Beispiel könnte die Fähigkeit, die Produktion des Taxan-Nebenprodukts Cephalomannin zu unterdrücken, die stromabwärtige Reinigung im Vergleich zur Reinigung von Taxol von Rindengewebe deutlich vereinfachen.
• (v) Taxus-Zellkulturen wurden veranlaßt, signifikante Mengen von Taxol (87% am Tag 42) und anderen Taxanen zu sezernieren. Daß die Gegenwart von extrazellulärem Taxol und Taxanen eher auf die Sekretion als auf die Zellyse zurückzuführen ist, wird durch mehrere unabhängige Beobachtungen bekräftigt: (a) eine fortgesetzte Biosynthese fand zwischen Tag 25 und 42 statt, was darauf schließen läßt, daß die Zellen lebensfähig und aktiv waren. Unabhängige Beobachtungen haben gezeigt, daß eine Lebensfähigkeit > 70% nach 18 Tagen im Produktionsmedium beobachtet wurde, (b) verschiedene Prozentsätze unterschiedlicher Taxane wurden sezerniert. Hätten Zellen eine Lyse erfahren, wäre ein ähnlicher Prozentsatz in dem Medium für die unterschiedlichen Taxane zu erwarten.
• (vi) Die Fähigkeit dieser Taxus-Zellinie, Taxol in hohen Raten in einer extrazellulären Umgebung so produktreich gedeihen zu lassen und zu erzeugen, ist besonders erwähnenswert.
• (vii) Die Taxus-Zellinie, mit welcher diese Ergebnisse erhalten wurden, ist auch zu einem raschen Wachstum zu hohen Zelldichten imstande, und wies die angegebenen Produktivitäten nach 20 Generation unter schnellen Wachstumsbedingungen auf, was ein Beweis für ihre Stabilität und ihr kommerzielles Potential ist.
• Die Taxol- und Taxan-Werte, die von Zellinien von Taxus chinensis unter den hierin beschriebenen Bedingungen erzeugt wurden, sind um einen 35- bis 150-fachen Faktor höher als zuvor berichtete Ergebnisse. Zum Beispiel berichteten Christen et al. (1991) die Produktion von 1 bis 3 mg/Liter Taxol durch Suspensionskulturen von Taxus brevifolia nach 2 bis 4 Wochen Kultivierung. Wickeramesinhe und Arteca (1991) berichteten von der Produktion von Taxol mit 0,009% Trockengewicht in Zellkulturen von Taxus media.
• Zusammenfassend zeigen unsere Daten, daß mit einer sorgfältigen Initiierung und Auswahl von Taxus chinensis Kulturen, und mit speziell festgelegten Wachstumsmediumbedingungen Zellen veranlaßt werden können, rasch zu hohen Zelldichten zu wachsen. Wenn diese Zellen in Produktionsmediumbedingungen überführt werden, sind die Zellen zur Biosynthese imstande und sezernieren signifikante Werte an Taxol und anderen Taxanen über anhaltende Perioden, während sie eine hohe Lebensfähigkeit bewahren. Die Einbeziehung eines periodischen Mediumaustausches, von Licht und Auslösern in das Produktionsmedium führt zu weiteren synergistischen Produktivitätssteigerungen. Diese Eigenschaften sind kritische Voraussetzungen für ein effizientes kommerzielles Verfahren für die Taxol- und Taxan-Produktion unter Verwendung der Gewebekulturtechnologie.
Referenzliteratur
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Tabelle 1.a. Liste von Auslösern, die in der Auslösung von Taxus spp. Zellkulturen verwendet werden.
• 1. Biotische Auslöser (Mikroorganismen)
• Botrytis cinerea
• - Phytophthora meaasperma
• Pinellas stripticum
• - Oligosporus sp.
• - Phytium mamillatum
• - Phytium svlvaticum
• - Verticillium dahliae
• - Verticillium sp.
• - Penicillium minioluteum
• - Phytophtora lateralis
• - Cytospora cincta
• - Cospora leucostoma
• - Alternaria brassicicola
• - Alternaria solani
• - Alternatia cucumerina
• - Botrytis squamosa
• - Cochliobolus heterostrophus
• - Colletotrichum trifolii
• - Colletotrichum orbiculare
• - Colletotrichum graminicola
• - Colletotrichum gloeosporioides
• - Cylindrocladium floridanum
• - Fusarium crookwellense
• - Fusarium heterosporium
• - Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans
• - Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
• - Fusarium oxysporum f. sp. pisi
• - Gibberella zeae
• - Gaeumannomyces graminis var. tritici
• - Geotrichum sp.
• - Leptosphaeria korroae
• - Nectria haematococca MPVI
• - Mycosphaerella pinodes
• - Ophiostoma ulmi
• - Phoma lingam
• - Phoma pinodella
• - Phytophthora infestans
• - Phytium aristosporum
• - Phytium graminicola
• - Phytium ultimum
• - Rhizoctonia solani
• - Sclerotinia sp.
• - S. nodorum D-45
• - Trametes versicolor
• - Ustilago maydis
• Venturia inaegualis II Biotische Auslöser (mikrobielle Fraktionen oder Produkte) III. Abiotische Auslöser (Chemische Streßmittel wie auch einige natürlich vor­kommende Biochemikalien) Tabelle 1.b. Liste von Prekursoren, Inhibitoren oder Aktivatoren, die in der Regu­lierung der Biosynthese von Taxol & Taxanen in T. spp. Zellkulturen verwendet werden. Prekursoren Inhibitoren Stimulanzien oder Aktivatoren Tabelle 2: Komponenten (mg/l) von katalytischen Phyton-Medien, die zur Kulti­vierung von Taxus-Kulturen verwendet werden
• * filtersterilisiert in autoklaviertes Medium Tabelle 3. Bevorzugte Bedingungen für die Kallusproliferation für verschiedene Taxus-Arten. Die Bestandteile in den Grundmedien sind in Tabelle 2 angeführt.
• * Abkürzungen: Picloram (P), Naphthalenessigsäure (N), Benzyladenin (BA), Dimethylallylaminopurin (2iP), Kinetin (K) Tabelle 4. Typische Wachstumseigenschaften von Taxus sp. Suspensions­kulturen.
• * noch nicht bestimmt Tabelle 5. Taxol-Produktion in verschiedenen Taxus-Arten. Tabelle 6. Verbesserungen in der Produktivität aufgrund der Mediumaustausch­behandlung. Die Zahlen sind als x-fache Verbesserung gegenüber Werten angegeben, die in einem 15-tägigen Chargenintervall erreicht wurden. Die Taxus chinensis Zellinie K-1 wurde in Medium A im Dunkeln kultiviert.
• *Gesamtwerte, kombiniert in Zellen und Medium Tabelle 7. Wirkung der Standard GroLux Lichtbehandlung auf den Taxol- und Taxan-Gehalt in 10 Tage alten Kulturen der Taxus chinensis Linie K1, die in Medium A kultiviert wurde. Die dargestellten Mengen sind in ug angegeben, die aus 20 ml Suspension extrahiert wurden. Das Zellwachstum war in beiden Behandlungen identisch (164 mg Trockengewicht pro Kolben). Tabelle 8. Vergleich von mit Chitosan-Glutamat behandelten mit nicht ausge­lösten Suspensionen der Taxus chinensis-Suspensionslinie K-1 nach 15 Tagen Kultivierung in Medium C. Die angegebenen Taxan-Werte sind eine Kombination aus Zellen und Medium. % extra bezeichnet den Prozentsatz an extrazellulärem Produkt. Tabelle 9. Nährmediummanipulation zur verstärkten Taxan- und Taxol-Biosyn­these in der Taxus chinensis-Suspensionslinie K-1. Zellen mit einem Frischgewicht von 500 mg wurden pro 5 ml Medium eingeimpft und im Dunkeln 18 Tage inkubiert. Angegeben sind die produzierten Gesamt-Taxane (kombiniert in den Zellen und im Medium). Die In­haltsstoffe in Medium B und C sind in Tabelle 2 angeführt.

Claims (9)

1. Verfahren zur Gewinnung von Taxol und anderen Taxanen mit hohen Ausbeuten aus Zellkulturen einer Taxus-Art, das ein Kultivieren von Zellen einer Taxus-Art, die von Kallus- und/oder Suspensionskulturen abgeleitet ist, in einer Suspensionskultur in einem oder mehreren Nährstoffmedien unter Wachstums und Produktbildungsbedingungen und ein Gewinnen des Taxols und anderer Taxane aus den Zellen und/oder dem Medium der Zellkultur umfaßt, wobei die Bedingungen eine oder mehrere der Bedingungen sind, die eine kontinuierliche oder eine unterbrochene Beleuchtung mit Breitband- oder Schmalbandlicht oder Nährstoffmedien umfassen, die für die Wachstumsund Produktionsphasen der Kultur eine veränderte Medienzusammensetzung besitzen.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Taxus-Arten T. canadenis, T. chinensis, T. cuspidara, T. baccata, T. globosa, T. floridana, T, wallichiana oder T. media sind.

3. Verfahren gemäß 1 oder 2, bei dem die Nährstoffmedien Picloram enthalten.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem in der Produktionsphase der Kultur als ein Auslöser Chitosanglutamat gegeben ist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Nährstoffmedien einen Stimulanzstoff enthalten.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem in der Produktionsphase der Kultur als ein Prekursor Phenylalanin gegeben ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das ferner einen periodischen Wechsel des Nährstoffmediums umfaßt.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, das ferner eine periodische Entfernung von Taxol oder anderen Taxanen umfaßt.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Wachstums- und Produktbildung unter Verwendung eines Einstufen- oder Zweistufen-Beschickungsverfahrens oder eines Nachführ-Beachickungsverfahrens oder eines semikontinuierlichen Verfahrens oder Modifizierungen voll diesen erzielt werden.