ES2213328T3 - Produccion mejorada de taxol y taxanos mediante cultivos celulares de especies de taxus. - Google Patents
Produccion mejorada de taxol y taxanos mediante cultivos celulares de especies de taxus.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PRODUCCION DE TAXOL Y OTROS TAXANOS CON ELEVADOS RENDIMIENTOS, A PARTIR DE UN CULTIVO CELULAR DE TAXUS CHINENSIS, QUE CONSISTE EN: CULTIVAR, EN UN CULTIVO EN SUSPENSION EN UNO O MAS MEDIOS NUTRIENTES, CELULAS DERIVADAS DEL CALLO Y/O CULTIVOS EN SUSPENSION DE TAXUS CHINENSIS, Y EN RECUPERAR DICHO TAXOL Y OTROS TAXANOS A PARTIR DE DICHAS CELULAS Y/O DICHO MEDIO DE DICHO CULTIVO CELULAR.
Description
Producción mejorada de taxol y taxanos mediante
cultivos celulares de especies de Taxus.
Esta invención se dirige a métodos para la
producción y la recuperación mejoradas de taxol y taxanos mediante
cultivos celulares de Taxus chinensis.
El taxol es un alcaloide diterpenoide aislado
originalmente de la corteza del tejo del pacífico, Taxus
brevifolia (Wani y otros, 1971).
El interés en el taxol empezó cuando the National
Cancer Institute (NCI), en un programa de rastreo a gran escala,
encontró que los extractos de corteza en bruto exhibían actividades
antitumorales. Desde entonces, los experimentos clínicos han
confirmado que el taxol es extremadamente eficaz contra cánceres
ováricos refractarios y contra cánceres de mama y otros. El taxol ha
sido considerado como una ruptura en la quimioterapia debido a su
mecanismo de citotoxicidad fundamentalmente diferente, es decir, al
inhibir la despolimerización de los microtúbulos (véase Rowinsky y
otros, 1990).
La variable más desalentadora en la ecuación del
taxol es con mucho el suministro. Se emplean de tres a seis tejos
del pacífico de 100 años para tratar a un paciente debido a que los
rendimientos medios de taxol son bajos - alrededor de 0,01% de
corteza y hojas secas (Witherup y otros, 1990). Producir la
cantidad de taxol que se necesita para tratamiento y ensayo
requeriría la destrucción de decenas de miles de tejos. Hasta
ahora, todo el suministro mundial ha procedido de recoger estas
coníferas achaparradas de crecimiento lento que pueblan los
antiguos bosques del Noroeste del Pacífico. Desgraciadamente, el
tejo casi se ha extinguido debido a la tala. Los conservacionistas
se están oponiendo con éxito a cualquier sacrificio del árbol, que
crece en los bosques antiguos que son el refugio del búho moteado
septentrional en peligro de extinción y otras especies salvajes. A
medida que el número de tejos del pacífico desaparece, la
investigación médica está poniendo sus esperanzas de taxol futuro
en nuevas fuentes alternativas de suministro. Tres fuentes que se
han considerado son la síntesis química, la semisíntesis y el
cultivo de células de plantas.
El taxol es una molécula química grande
estructuralmente compleja que ha eludido así la síntesis química
total. Por lo tanto, no es probable que la síntesis a gran escala
de productos químicos disponibles simples sea una opción factible
para los próximos pocos años.
Una posible opción para la producción a gran
escala es la semisíntesis, es decir la unión química de una cadena
lateral al precursor de taxol agrícolamente producido bacatina. Se
ha hecho un progreso significativo en la síntesis de la cadena
lateral (Denis y otros, 1991). También se han desarrollado métodos
para acoplar la cadena lateral a bacatina (Denis y otros, 1990,
Patente de EE.UU. 4.924.011; Holton, 1991; Patente de EE.UU.
5.015.744). Sin embargo, el suministro agrícola de bacatina
procedente de hojas de plantaciones de Taxus no es de ningún
modo trivial; y actualmente se está reevaluando a la luz del hecho
de que los informes previos (Denis y otros, 1988; 0,1% en peso) eran
más optimistas acerca del contenido de bacatina que los recientes
(Witherup y otros, 1990, 0,03% en peso). En resumen, la capacidad
de la síntesis química y la semisíntesis para suministrar taxol
para uso terapéutico mundial no está asegurada. Existen fuertes
razones para explorar y desarrollar medios de producción
alternativos.
La invención se refiere al desarrollo de un
procedimiento basado en el cultivo en células de plantas para el
suministro de taxol y otros taxanos.
La capacidad de las células de plantas para
dividirse, crecer y producir metabolitos secundarios bajo una
variedad de diferentes regímenes de cultivo ha sido ampliamente
demostrada por un número de grupos. En la actualidad, dos
componentes, la ahikonina (un colorante rojo y antiinflamatorio) y
el ginsengósido (un tónico en la medicina oriental) se producen
mediante procedimientos de cultivo tisular en Japón. Muchos otros
procedimientos están según se informa cerca de la comercialización,
incluyendo la vainillina, la berberina y el ácido rosmarínico (véase
Payne y otros, 1991).
Las ventajas de un procedimiento de cultivo de
células de plantas para el taxol son muchas: (i) Un procedimiento
de cultivo celular asegura un suministro ilimitado, continuo y
uniforme de producto y no está sometido a plagas, desastres y
fluctuaciones estacionales, (ii) los cultivos celulares pueden
cultivarse en grandes biorreactores y pueden ser inducidos para
sobreproducir taxol manipulando condiciones ambientales, (iii) los
cultivos celulares producen un espectro de compuestos más simples
en comparación con la corteza o las hojas, simplificando
considerablemente la separación y la purificación, (iv) un
procedimiento de cultivo celular puede adaptarse velozmente a
cambios rápidos en la demanda mejor que los procedimientos basados
en la agricultura, (v) además de suministrar taxol, un
procedimiento de cultivo celular también podría producir
precursores de taxano tales como bacatina que podrían convertirse
semisintéticamente en taxol y otros derivados activos.
Puesto que el cultivo de células de plantas
aséptico a gran escala es inherentemente costoso, un procedimiento
de cultivo celular se hace comercialmente pertinente sólo cuando
estos costes son compensados por un crecimiento celular rápido y
una alta productividad de metabolitos. Cada especie de planta y
metabolito elegido es diferente, y son necesarios diferentes
procedimientos para cada sistema particular. Esta invención se
enfoca a procedimientos creativos y experimentados para obtener
cultivos de células de plantas que crecen rápidamente y altamente
productivos para la producción de taxol y taxano.
Un examen histórico de la literatura sugiere que
mientras que las plantas herbáceas se han manipulado de forma
relativamente fácil en el cultivo, los cultivos de plantas leñosas
y coníferas sólo se han alcanzado con dificultad.
El crecimiento de cultivos de gimnospermas y
coníferas que producen metabolitos secundarios ha sido generalmente
bajo. Por ejemplo, Berlin y Witte (1988) encontraron que los
cultivos de Thuja occidentalis incrementaban su biomasa en
solo alrededor de 30% en 30 días. Van Uden y otros (1990)
presentaron un incremento de biomasa de 20-50% en
21 días para suspensiones de Callitris drummondii. Westgate
y otros (1991) presentaron un tiempo de duplicación de alrededor de
10 días para suspensiones de la gimnosperma Cephalotaxus
harringtonia. Según es resumido por Bormman (1983), se ha
dirigido un esfuerzo ingente al desarrollo de medios para
suspensiones de abeto (Picea abies). Este trabajo colectivo
demuestra que las suspensiones de gimnospermas son en efecto
capaces de un crecimiento rápido, pero que no pueden aplicarse
generalidades, y que las formulaciones de medios para diferentes
líneas celulares deben optimizarse independientemente.
Una revisión de la productividad de metabolitos
secundarios entre cultivos de gimnospermas también apunta a la
dificultad de inducir la biosíntesis rápida en comparación con
especies herbáceas. Por ejemplo, los cultivos de Cephalotaxus
harringtonia producían alcaloides terpénicos en un nivel de
solo 1% a 3% del encontrado en la planta originaria (Delfel y
Rothfus, 1977). Incluso con una estimulación satisfactoria,
Heinstein (1985) sólo fue capaz de aproximarse a los niveles
producidos en la planta originaria (alrededor de 0,04% en peso seco
de alcaloides totales). Van Uden y otros (1990) también fueron
capaces de inducir cultivos en suspensión de la conífera
Callitris drummondii para producir podofilotoxina, pero sólo
a niveles de un décimo de los producidos por las hojas. La
capacidad de Thuja occidentalis para producir niveles
significativos de monoterpenos (10-20 mg/l) y el
diterpenoide deshidroferruginol (2-8 mg/l) ha sido
demostrada convincentemente por Berlin y otros (1988). Sin embargo,
estos resultados se obtuvieron con un cultivo de crecimiento lento
(30% de incremento de biomasa en 18 días) y de baja densidad de
células (de 5 a 7 gramos de peso seco por litro).
Las dificultades para alcanzar el crecimiento
rápido y la alta productividad encontrados en suspensiones de
gimnospermas se han reflejado en los tres informes hasta ahora
sobre la producción de taxol. Jaziri y otros (1991) iniciaron
recientemente cultivos de callos de Taxus baccata, pero
fueron incapaces de detectar taxol usando su ensayo de
inmunoabsorción. Wickremesinhe y Arteca (1991) dieron cuenta de la
presencia de 0,009% en peso seco de taxol en cultivos de callos de
Taxus media (variedad de cultivo hicksii), pero no se
indicaron los detalles del tiempo de duplicación, las densidades
celulares y la escala temporal durante la que se producía el taxol
presentado.
La Patente de EE.UU. Nº 5.019.504 (Christen y
otros, 1991) describe la producción y la recuperación de taxano y
compuestos similares a taxano mediante cultivos celulares de
Taxus brevifolia. Estos investigadores presentaron la
producción de taxol a un nivel de 1 a 3 mg/l en un espacio de tiempo
de 2 a 4 semanas. También presentaron un incremento en la masa
celular de "5-10 veces en 3-4
semanas", que corresponde a tiempos de duplicación de alrededor
de 7 a 12 días.
Los incrementos en las velocidades de
crecimiento, las velocidades de biosíntesis de taxol y las
productividades volumétricas son claramente necesarios antes de que
un procedimiento de cultivo tisular para la producción de taxol
pueda suministrar la demanda anual proyectada de decenas a cientos
de kilogramos de taxol al año.
La presente invención se refiere al procedimiento
que se indica en las reivindicaciones.
Los inventores han descubierto que pueden
producirse taxol y compuestos similares a taxol, o taxanos, con un
rendimiento muy alto a partir de Taxus chinensis. En
particular, los inventores encontraron que la especie Taxus
chinensis es capaz de un crecimiento rápido y de producir
niveles extremadamente altos de taxol y taxanos en un corto período
de tiempo.
Mejorando la invención descrita en Christen y
otros (1991), los presentes inventores han descubierto que los
cultivos celulares de Taxus chinensis pueden iniciarse
rápidamente y eficazmente, y crecer satisfactoriamente sobre medios
nutrientes artificiales y que se producen los mismos alcaloides de
taxano quimioterapéuticamente activos en el cultivo celular que en
la planta intacta.
Además, mediante los métodos de esta invención,
es posible obtener taxol en un espacio de tiempo mucho más corto
que el presentado previamente. Con la Taxus chinensis, los
inventores han podido manipular células para dar taxol en
cantidades muy por encima de las cantidades obtenidas a partir de
cultivos tisulares de las otras especies de Taxus. Por otra
parte, la velocidad de crecimiento de los cultivos celulares de
Taxus chinensis es significativamente superior, de 3 a 6
veces, que para Taxus brevifolia descrita en Christen y
otros (1991).
Los objetivos de esta invención incluyen la
iniciación rápida y eficaz de cultivos celulares de Taxus
chinensis.
Los objetivos de esta invención incluyen la
formulación de condiciones ambientales especiales para fomentar el
crecimiento rápido, altas densidades celulares y altas viabilidades
celulares. Las características de crecimiento presentadas en este
estudio sobrepasan los resultados previos en un factor
significativo.
Los objetivos de esta invención incluyen la
capacidad para inducir velocidades altas y prolongadas de
biosíntesis y secreción de taxol y taxanos mediante: (a) la
manipulación cuidadosa de las concentraciones de nutrientes
("formulación del medio de producción"), (b) el uso de luz, (c)
el uso de procedimientos de intercambio periódico de medio, (d) el
uso de estimuladores.
Los objetivos de esta invención incluyen la
capacidad para manipular el perfil de taxanos producidos alterando
las formulaciones de los medios y las condiciones ambientales. En
particular, las células se estimularon para producir taxol como el
producto de taxano predominante. Además, la producción del
subproducto cefalomanina se suprimió, proporcionando de ese modo una
solución biológica elegante a un problema de separación y
purificación ulterior costoso e importante.
Los objetivos de esta invención incluyen la
capacidad para producir diversos taxanos distintos al taxol que
podrían mostrar ellos mismos actividad farmacológica, o pueden
modificarse y convertirse en compuestos con actividad
farmacológica.
Los objetivos de esta invención incluyen la
capacidad para inducir cultivos celulares de Taxus chinensis
para producir taxol (0,32% de peso seco) a niveles que superan
mucho los producidos en plantas silvestres (de 0,003 a 0,03% de
peso seco, Xu y Liu, 1991).
Figura 1. Incremento de biomasa en una línea
K-1 de cultivo en suspensión de Taxus
chinensis sobre un ciclo de crecimiento discontinuo típico en
Medio A. Las barras de errores representan la desviación estándar
medida a partir de matraces duplicados.
Figura 2. Efecto del intercambio de medio los
días 9 y 12 sobre la productividad de taxol (A) y taxanos totales
(B) en un experimento de 15 días. Los números en cada recuadro
representan el intervalo de tiempo (días) durante el que se
producía el producto. La porción oscurecida de los recuadros
intracelulares representa el taxol o los taxanos totales que
estaban presentes en el inóculo celular al comienzo del
experimento. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. La
línea celular K-1 de suspensión de Taxus
chinensis se usó con Medio A según se elabora en la Tabla 2.
Figura 3. Características espectrales de una
lámpara Standard Gro-Lux (GTE Sylvania, Danvers, MA)
usada en el Ejemplo 7.3.
Figura 4. Producción de taxano en suspensión
celular K-1 de Taxus chinensis. Se muestra
la porción del cromatograma de 10 a 40 minutos. Las exploraciones
con series de diodos de picos de taxano seleccionados muestran un
espectro de absorción UV de taxano característico, con un pico a
227 nm.
Figura 5. Producción de taxol y taxanos después
del cultivo prolongado en Medio C mediante la línea celular
K-1 de Taxus chinensis. El cuadro superior
tabula los datos para los taxanos conocidos y desconocidos, mientras
que el cuadro inferior muestra la producción incremental de taxol y
taxanos en el período de tiempo de 25 a 42 días.
Figura 6. Confirmación por MS/MS de taxol en
sobrenadante de cultivo celular. El cuadro A muestra el espectro de
masas APCI de pulverización iónica de taxol auténtico y el cuadro B
muestra el espectro iónico descendente del pico original (m/z 871 =
taxol+NH_{4}^{+}). El cuadro C representa el espectro de APCI de
pulverización iónica de un extracto de cultivo celular en bruto y
muestra m/z 854 y 871 característicos de taxol. El cuadro D muestra
el espectro descendente correspondiente de m/z 871 y proporciona
una evidencia inequívoca de la presencia de taxol en el
sobrenadante de cultivo celular.
Las plantas han proporcionado desde hace mucho
tiempo importantes fuentes de productos farmacéuticos y productos
químicos especiales. Estos productos se han obtenido típicamente a
través de la extracción de los materiales de plantas recogidos o
mediante síntesis química. El taxol se ha convertido en uno de los
agentes anticancerígenos potenciales más importantes en surgir
recientemente del rastreo de productos naturales. Según se usan
aquí, los términos taxol y compuestos similares a taxol, o taxanos,
se usan intercambiablemente para describir un compuesto con un
anillo de taxano. Estos compuestos pueden poseer ellos mismos
actividad antineoplástica, o pueden modificarse para dar compuestos
bioactivos.
Según se usa aquí, el término "callo" se uso
para describir una masa de células de planta cultivadas que está
estructuralmente no diferenciada, y se cultiva sobre medio sólido.
Según se usa aquí, el término "suspensión en cultivo" se usa
para describir células estructuralmente no diferenciadas que están
dispersadas en un medio nutriente líquido. Se entiende que los
cultivos en suspensión comprenden células en diversas fases de
agregación. Un intervalo de tamaños de agregados se encuentran en
las suspensiones descritas en esta invención, con tamaños que
varían desde decenas de micras de diámetro (células simples o pocas
células agregadas) hasta agregados de muchos milímetros de
diámetro, que consisten en muchos miles de células.
El material de plantas útiles en esta invención
se obtuvo de Taxus chinensis. En particular, los inventores
han identificado la especie Taxus chinensis como capaz de
producir cantidades significativas de taxol y taxanos en un corto
período de tiempo de cultivo secretándose los compuestos deseados
continuamente al medio.
Ha sido encontrado por los inventores que el
contenido específico de taxol varía con la especie de planta y
dentro de la especie de planta con la fuente de tejido y los
árboles específicos. Seleccionar una fuente de alto rendimiento
para la producción de taxol es una primera etapa importante para
proporcionar cantidades suficientes de taxol para uso
terapéutico.
El material de planta de Taxus puede
recogerse de toda Norteamérica así como de otros continentes. El
cultivo se inicia seleccionando el tejido de Taxus apropiado
para el crecimiento. Tejido de cualquier parte de la planta,
incluyendo la corteza, el cámbium, las hojas, los tallos, las
semillas, las piñas y las raíces, puede seleccionarse para inducir
el callo. Sin embargo, para el rendimiento óptimo de taxol, se
prefieren las hojas y regiones meristemáticas de partes de plantas.
Las más preferidas son agujas recientemente desarrolladas (por
ejemplo, de uno a tres meses) que pueden identificarse generalmente
por un color verde más claro. El término "nuevo crecimiento"
pretende significar ampliamente producción de hojas de la planta
dentro de esa estación de crecimiento del año.
Para evitar la contaminación del cultivo, el
tejido debe esterilizarse superficialmente antes de introducirlo en
el medio de cultivo. Podría ser eficaz cualquier técnica de
esterilización convencional tal como el tratamiento con CLOROX (una
marca comercial poseída por CLOROX Company para lejía). Además,
pueden usarse agentes antimicrobianos tales como cefoxitina,
benlato, cloxacilina, ampicilina, sulfato de gentamicina y
fosfomicina para la esterilización superficial de material de
plantas.
Los cultivos exhibirán típicamente variabilidad
en la morfología del crecimiento, la productividad, los perfiles de
los productos y otras características.
Puesto que las líneas celulares individuales
varían en sus preferencias para los constituyentes del medio de
crecimiento, pueden usarse muchos medios de crecimiento diferentes
para la inducción y la proliferación del callo.
La composición apropiada del medio varía con la
especie que se cultiva. Los medios preferidos para las diferentes
especies se listan en la Tabla 3. Por ejemplo, aunque pueden usarse
otros, los dos medios nutrientes de crecimiento preferidos para
Taxus chinensis son A y D. Estos medios contienen
preferiblemente los ingredientes listados en la Tabla 2. Por
ejemplo, cuando se usa medio A, se incorporan hormonas o
reguladores del crecimiento en el medio en una cantidad entre 1 ppb
y 10 ppm, y preferiblemente en de 2 ppb a 1 ppm. Cuando se usa
medio D, las hormonas o reguladores de crecimiento se incorporan en
niveles que varían de 1 ppb a 10 ppm, y preferiblemente en de 2 ppb
a 2 ppm. Las cantidades de otros ingredientes del medio pueden
incorporarse a niveles que varían de 1/10º de la concentración
hasta tres veces las concentraciones indicadas en la Tabla 2, pero
se incorporan preferiblemente en los niveles mostrados en la Tabla
2.
Los cultivos en suspensión de Taxus son
capaces de velocidades de crecimiento rápidas y densidades
celulares altas como otros cultivos de células de plantas. Sin
embargo, las condiciones óptimas varían de una línea celular a otra
y, de acuerdo con esto, deben considerarse métodos que conducen a la
optimización rápida para cualquier línea celular dada.
Los cultivos iniciales de diversas especies de
Taxus se subcultivan mediante transferencia en los medios
listados en la Tabla 3, que contienen macro- y
micro-nutrientes, sales orgánicas y hormonas de
crecimiento. Las cantidades están generalmente en los siguientes
intervalos: partiendo de 1/10º de concentración a tres veces la
concentración de cada ingrediente del medio mostrado en la Tabla 2.
Los niveles preferidos son los listados en la Tabla 2.
Los cultivos líquidos se exponen a aire y
preferiblemente se agitan o se mueven suavemente de otro modo para
introducir aire en el medio, o puede introducirse aire a través de
un tubo en los recipientes de cultivo. Los cultivos se mantienen
bajo condiciones de crecimiento apropiadas a una temperatura entre
20ºC y 26ºC. El pH puede ser de aproximadamente 3 a 7 y
preferiblemente entre 4 y 6. El cultivo puede hacerse crecer bajo
condiciones de luz que varían desde oscuridad total hasta luz total
(espectro de banda estrecha y/o ancho) durante diversos períodos de
tiempo. Debido a que la producción de taxol total es la más alta en
cultivos expuestos a la luz, esto se prefiere. Las condiciones de
intensidad de luz típicas varían entre una potencia de
aproximadamente 100 y aproximadamente 3000
pies-bujía.
Los cultivos en suspensión se mantienen durante
de 1 a 8 semanas desde el momento del subcultivo, después del cual
el crecimiento de cultivo declina. Los cultivos se recogen mediante
la retirada del medio de crecimiento, tal como mediante filtración.
El cultivo recogido se pesa y se seca, tal como mediante
liofilización, se tritura hasta un polvo fino y el taxol puede
extraerse mediante el uso de técnicas de extracción con disolvente
convencionales.
Los tiempos de duplicación se han medido
controlando el incremento de biomasa dependiente del tiempo, así
como controlando simplemente el índice de crecimiento durante un
subcultivo habitual. También se han alcanzado densidades en peso
seco máximas de 15-24 gramos por litro. Las
características de crecimiento de diversas suspensiones de especies
de Taxus se elaboran en el Ejemplo 4.
Los métodos para la extracción y la recuperación
de taxol y taxanos de células y el medio siguen técnicas
convencionales y se describen con detalle en el Ejemplo 5. La
técnica de inmunoensayo (ELISA) seguía en gran parte los
procedimientos suministrados por Hawaii Biotechnology en el estuche
disponible comercialmente. Los métodos de cromatografía líquida de
alta resolución se modificaron ligeramente desde los procedimientos
existentes según se elabora en el Ejemplo 5. Bajo las condiciones
usadas en esta invención, se alcanzó una resolución clara de picos
de taxano, dando como resultado una detección y una cuantificación
exactas. Debido a la posibilidad de co-eluir
componentes diferentes a taxanos, la pureza espectral de cada pico
de taxano putativo se controló mediante una serie de diodos antes
de la integración de las áreas de los picos. Los tiempos de
retención de patrones de taxano se listan en el Ejemplo 5 y un
cromatograma de la muestra se incluye en la figura 4.
Según se usa aquí, el término "medio
nutriente" se usa para describir un medio que es adecuado para
el cultivo de callos y cultivos en suspensión de células de planta.
El término "medio nutriente" es general y abarca tanto "medio
de crecimiento" como "medio de producción". El término
"medio de crecimiento" se usa para describir un medio
nutriente que favorece el crecimiento rápido de células cultivadas.
El término "medio de producción" se refiere a un medio
nutriente que favorece la biosíntesis de taxol y taxanos en células
cultivadas. Se entiende que el crecimiento puede producirse en un
medio de producción y que la producción puede tener lugar en un
medio de crecimiento, y que tanto el crecimiento como la producción
óptimos pueden tener lugar en un medio de crecimiento y que tanto
el crecimiento como la producción óptimos pueden tener lugar en un
solo medio nutriente.
Ciertas clases de aditivos en el medio nutriente
se denominan mediante nombres especiales en esta invención, y se
definen aquí. Según se usa aquí, el término "agentes
antipardeamiento" se refiere a componentes que se añaden al
medio nutriente para evitar la formación de pigmentos durante el
cultivo celular. Estos pigmentos incluyen compuestos fenólicos y
compuestos afines que se observa generalmente que tienen un efecto
perjudicial sobre el crecimiento celular, la viabilidad y la
formación de productos. Según se usa aquí, el término
"precursores biosintéticos" se usa para describir compuestos
añadidos al medio nutriente que son metabolizados e incorporados
por las células como taxol y taxanos.
Según se usa aquí, el término "inhibidores
metabólicos" se usa para describir compuestos añadidos al medio
nutriente que interfieren con rutas biosintéticas específicas. Por
ejemplo, un inhibidor metabólico puede usarse para mejorar la
biosíntesis de taxol bloqueando una ruta diferente que compite con
el taxol para un precursor biosintético primario. Según se usa aquí,
el término estimulador o activador se usa para describir compuestos
añadidos al medio nutriente que estimulan o activan rutas
biosintéticas específicas, por ejemplo las que conducen a la
biosíntesis de taxol. Se entiende que el mecanismo de acción de
estos aditivos descritos aquí puede no entenderse completamente.
Si la formación de metabolitos secundarios en un
cultivo en suspensión tiene lugar simultáneamente con el
crecimiento, el metabolito se denomina asociado al crecimiento, y
una formulación de un solo medio puede ser suficiente para alcanzar
buen crecimiento y producción de alto nivel. En muchos otros
sistemas, se ha encontrado que el crecimiento rápido y la formación
alta de productos no tienen lugar simultáneamente. En tales casos,
las fases de crecimiento y producción están separadas y se
desarrolla un medio para cada fase independientemente (revisado en
Payne y otros, 1991). En el caso de la producción de taxol y
taxanos en Taxus chinensis, el crecimiento y la formación
rápida de productos se han separado, y se han desarrollado medios
independientes para cada uno. Sin embargo, se entiende que puede
formularse un solo medio de crecimiento/producción para este
cultivo. Los medios de producción desarrollados aquí no sólo
incrementan la formación total de taxol y taxanos, sino que también
dirigen la biosíntesis celular hacia la producción de taxol. Además,
la producción de subproductos interferentes, tales como
cefalomanina, es mínima en comparación con tejido de corteza. Los
medios de producción desarrollados aquí también promueven la
viabilidad y la biosíntesis celular prolongadas, y además hacen que
se secreten niveles significativos de producto en el medio
extracelular. Estas características son extremadamente importantes
en el funcionamiento de un procedimiento a escala comercial eficaz
para la producción de taxol.
Aunque pueden usarse otros, los medios de
producción preferidos para las diversas especies se listan en la
Tabla 5. Por ejemplo, aunque pueden usarse otros, los medios de
producción preferidos para Taxus chinensis son B y C. Estos
medios contienen preferiblemente los ingredientes listados en la
Tabla 2. Estos medios contienen preferiblemente sales inorgánicas
principales y secundarias, materiales orgánicos y hormonas del
crecimiento o reguladores del crecimiento. Las cantidades están
generalmente con los siguientes intervalos partiendo desde 1/10º
hasta tres veces la concentración de cada ingrediente del medio
indicado en la Tabla 2. Sin embargo, los niveles preferidos son los
listados en la Tabla 2.
Cuando se usa medio B, los reguladores del
crecimiento se incorporan en el medio en una cantidad entre 0,1 ppm
y 20 ppm, y preferiblemente entre 1 ppm y 10 ppm. Cuando se usa
Medio C, los reguladores del crecimiento se incorporan
preferiblemente en niveles que varían de 0,1 ppm a 5 ppm.
Se entiende que pueden hacerse modificaciones en
este medio, tales como la substitución de otras composiciones
salinas convencionales (tales como materiales orgánicos, vitaminas,
aminoácidos, precursores, activadores e inhibidores), la adición o
la supresión de diversos componentes, reguladores del crecimiento o
la alteración de las proporciones.
Además de los nutrientes disueltos no volátiles,
los componentes gaseosos, principalmente oxígeno, dióxido de carbono
y etileno (una hormona de plantas), juegan papeles críticos en el
crecimiento y la formación de productos. Son importantes dos
parámetros. Las concentraciones de gas disuelto que favorecen el
crecimiento y la formación de taxol son obviamente importantes ya
que dictan las condiciones de funcionamiento del reactor. Además,
las velocidades de consumo o producción necesitan incorporarse al
diseño del reactor, de modo que puedan mantenerse las
concentraciones especificadas óptimas.
Además de su importancia en la respiración, el
oxígeno también puede afectar drásticamente a la velocidad de
biosíntesis secundaria. Una alta constante de saturación para una
etapa que requiere oxígeno en una ruta biosintética secundaria
puede requerir que las células se sometan a altos niveles de
oxígeno en el reactor. La importancia de la complementación con
CO_{2} para mantener altas velocidades de crecimiento se ha
documentado. El etileno, una hormona de plantas, juega papeles
pleiotrópicos en todos los aspectos del crecimiento y el desarrollo
de las plantas, incluyendo el metabolismo secundario (por ejemplo,
véase Payne y otros, 1991).
Para mejorar el rendimiento de taxol y otros
taxanos relacionados en cultivos celulares, los inventores han
realizado un número de procedimientos. Uno de los procedimientos
que se ha usado para mejorar la productividad es el uso de los
llamados elicitores. Según se usa aquí, el término elicitores se usa
para compuestos de origen biológico y no biológico que provocan un
incremento en la producción de metabolitos secundarios cuando se
aplican a plantas o cultivos de células de plantas. (Eilert 1987;
Ebel 1984 y Darvill y otros, 1984). Muchos compuestos diferentes
pueden actuar como elicitores, dependiendo de su naturaleza de
origen y su modo de acción con el metabolismo celular. En estos
estudios, los inventores han usado dos tipos principales de
elicitores: 1) Elicitores bióticos que comprenden habitualmente
extractos de la pared celular o filtrados de un grupo seleccionado
de hongos, bacterias y levaduras, y también sus fracciones
purificadas. 2) Elicitores abióticos que han incluido agentes de
estrés químico así como algunos compuestos de origen biológico
(véanse los elicitores listados en la Tabla 1).
Christen y otros (1991) presentan el uso de
elicitores fúngicos y compuestos seleccionados para la producción
de taxol por suspensiones de Taxus brevifolia; sin embargo,
los incrementos en el nivel de la acumulación de taxol debidos al
tratamiento con elicitores no se han especificado.
En general, eran eficaces ambos tipos de
elicitores, aunque la extensión hasta la que se producía la
elicitación (acumulación de taxanos en cultivos celulares así como
su secreción al medio) difería de elicitor a elicitor y de especie
a especie. El incremento de producción más alto se alcanzaba con
glutamato de quitosano, liquenano, ácido ferúlico y ácido benzoico.
El quitosano y el liquenano son polisacáridos complejos derivados
de paredes celulares microbianas. El quitosano, cuando se usa solo,
es insoluble en medio y es tóxico y provoca daño celular
permanente. El glutamato de quitosano, por otra parte, es fácilmente
soluble en el medio y no afecta a la viabilidad celular. Los ácidos
ferúlico y benzoico son productos químicos sintetizados de origen
biológico, y se usan generalmente como antioxidantes en sistemas
biológicos.
Los elicitores interactúan con gases disueltos de
muchos modos. Los requerimientos de oxígeno pueden cambiar durante
la elicitación. Incrementos en las velocidades de respiración así
como en la respuesta a lesiones se observan comúnmente en cultivos
de células de plantas. De forma importante, los elicitores pueden
mediar su acción a través de etileno. En tales casos, puede ser
deseable substituir una preparación de elicitor microbiano por
etileno, y quizá evitar la toxicidad asociada con otros componentes
microbianos en la preparación del elicitor.
Los elicitores y los agentes de estrés metabólico
pueden utilizarse de acuerdo con esta invención para maximizar la
producción y la secreción de taxol en cultivo tisular determinando
la especificidad y la concentración del elicitor, el tiempo y la
duración, como una función de la edad del cultivo y la composición
del medio.
Según se documenta en el Ejemplo 7.3, la retirada
de medio agotado y la reposición de medio reciente cada 3 días
contribuía a una mejora significativa de la producción de taxanos
totales y taxol, así como a un incremento en las cantidades de
producto extracelular.
Los efectos estimuladores del intercambio de
medio pueden haberse debido a la retirada de producto in
situ, que evitaría la inhibición de la retroalimentación y la
degradación del producto. Tales efectos positivos de la retirada de
producto in situ sobre la producción y la secreción de
metabolitos secundarios en cultivos en suspensión han sido
documentados por, entre otros, Robins y Rhodes (1986) y Asada y
Shuler (1989). La retirada periódica de medio gastado incorpora las
ventajas previas y, adicionalmente, puede servir para desreprimir
la biosíntesis secundaria retirando otros componentes inhibidores
distintos a taxanos (tale como compuestos fenólicos) del medio.
La reposición de medio reciente a células que
sufren biosíntesis activa también puede mejorar la producción
proporcionando nutrientes esenciales que se han agotado. Por
ejemplo, Miyasaka y otros (1986) pudieron estimular células en fase
estacionaria de Salvia miltiorhiza para producir los
metabolitos diterpénicos criptotanashinona y ferruginol simplemente
añadiendo sacarosa al medio. Presumiblemente, la biosíntesis había
cesado debido a la limitación de carbono en la fase estacionaria.
El procedimiento de intercambio de medio periódico usado en el
presente trabajo podría haber sido beneficioso como resultado de
cualquiera de los factores previos.
Se entiende que la cantidad de medio
intercambiado, la frecuencia del intercambio y la composición del
medio que se repone pueden variarse.
La capacidad para estimular la biosíntesis y la
secreción mediante intercambio periódico de medio tiene
implicaciones importantes para el diseño y la operación de un
procedimiento comercial eficaz en el modo continuo, semicontinuo o
de lotes alimentados.
Para plantas superiores, la luz es un factor
potencial en el metabolismo secundario tanto en plantas intactas
como en cultivos celulares. Son importantes tanto la intensidad
como la longitud de onda de la luz (Seibert y Kadkade, 1980). Por
ejemplo, la biosíntesis de flavanoides y antocianinas está
habitualmente favorecida por luz continua de alta intensidad,
mientras que los cultivos cultivados en la oscuridad pueden ser
preferibles para otros metabolitos. Un incremento en el
enverdecimiento o la capacidad fotosintética de células cultivadas
también puede incrementar la formación de producto o el espectro de
productos. Los estudios de los inventores implicaban el uso de
fuentes de luz de banda ancha así como banda estrecha específica.
Según se muestra en el Ejemplo 7.3, la exposición a la luz puede
producir una acumulación de taxol incrementada así como secreción
al medio. El efecto estimulante de la luz sobre la producción de
taxol sugiere la existencia de mecanismos de control únicos para la
biosíntesis de taxanos. La naturaleza del fotorreceptor y las
características bioquímicas de la estimulación inducida por luz no
están todavía claras.
El modo de operación para un procedimiento de
cultivo de células de plantas se refiere a la manera en la que los
nutrientes, las células y los productos se añaden o se retiran con
respecto al tiempo (Payne y otros, 1991). Cuando todos los
nutrientes se suministran inicialmente y los contenidos del cultivo
que comprende células y productos se recogen al final del período de
cultivo, el modo de operación se denomina un "procedimiento
discontinuo en una etapa". Cuando un procedimiento discontinuo
se divide en dos etapas secuenciales, una etapa de crecimiento y una
de producción, intercambiándose el medio entre las dos etapas, el
modo de operación se denomina un "procedimiento discontinuo en
dos etapas".
En una operación de "lotes alimentados",
aditivos y nutrientes particulares del medio se suministran
periódicamente o continuamente a lo largo del transcurso del
cultivo discontinuo en una etapa o en dos etapas.
Cuando una porción substancial, pero no la
totalidad, de los contenidos de un cultivo discontinuo se recoge,
con adición de medio reciente para el crecimiento celular y la
producción continuados, el procedimiento se asemeja a una operación
de "extracción y relleno repetidos" y se denomina un
"procedimiento semicontinuo".
Cuando se suministra continuamente medio reciente
y se retira continuamente medio efluente, el procedimiento se
denomina "continuo". Si las células se retienen dentro del
reactor, el procedimiento se denomina un "modo de perfusión".
Si las células se retiran continuamente con el medio efluente, el
procedimiento continuo se denomina un "quimioestato".
Se entiende que estos diversos modos de operación
del procedimiento son compatibles con el sistema de producción de
taxol descrito aquí.
Los siguientes ejemplos describen adicionalmente
los Materiales y Métodos usados para llevar a cabo la invención.
Los ejemplos pretenden ser ilustrativos y no pretenden limitar la
invención de ningún modo.
Muestras de material de plantas de Taxus
se recogieron de un número de plantas silvestres y cultivadas. Las
muestras se procesaron al llegar al laboratorio o se almacenaron a
4ºC hasta que podían usarse.
El material se lavó en primer lugar en solución
jabonosa diluida, se enjuagó en agua y la superficie se esterilizó
en una solución de CLORAX (hipoclorito al 1%, pH 7) durante 10
minutos. Bajo condiciones estériles, el material se enjuagó a
continuación 3 veces con agua estéril. Las hojas se cortaron a
continuación en una solución de polivinilpirrolidona (PVP) al 1% con
100 mg/l de ácido ascórbico. Las agujas se pusieron con el extremo
cortado en Medio E (véase la Tabla 2). Se cultivaron de treinta a
cuarenta explantes por placa de medio. Las placas que contenían
explantes se incubaron a 24\pm1ºC en la oscuridad. Las placas se
controlaron diariamente con respecto a la aparición de
microorganismos contaminantes y, cuando estaban presentes, las hojas
no contaminadas se recogieron y se pusieron en una placa reciente
de Medio E. La formación substancial del callo se observó y el
callo se separó del explante 20 días y se puso sobre los diversos
medios de proliferación del callo listados en la Tabla 3. Por
ejemplo, los callos de Taxus chinensis se transfirieron a
Medio D (véase la Tabla 2). Este procedimiento de iniciación era muy
eficaz, dando como resultado un bajo grado de contaminación y una
alta frecuencia de inducción del callo de más de 90% de los
explantes iniciales. El mismo procedimiento se usó
satisfactoriamente para iniciar cultivos de Taxus brevifolia,
Taxus canadensis, Taxus cuspidata, Taxus baccata, Taxus
globosa, Taxus floridana, Taxus wallichiana, Taxus media
y Taxus chinensis.
Una vez que los callos se retiraban del explante,
se cultivaban a 24\pm1ºC en la oscuridad. Las partes sanas del
callo se transfirieron a medio reciente cada 10 días y se encontró
que esta frecuencia de transferencia era extremadamente importante
para la prevención del pardeamiento y para el mantenimiento
prolongado del callo. Los medios de crecimiento y mantenimiento
preferidos para callos de diversas especies se resumen en la Tabla
3.
Se inoculó asépticamente 1 g de peso fresco de
material de callo a un matraz Erlenmeyer de 125 ml que contenía 25
ml de medio líquido apropiado para cada especie (véase la Tabla 3).
Por ejemplo, el Medio D se usó para Taxus chinensis. El
matraz se cubrió con una capa de espuma de silicona (Bellco, NJ) y
se puso en un agitador giratorio a 120 rpm a 24\pm1ºC en la
oscuridad. Los cultivos en suspensión se formaron en de
aproximadamente 3 a 10 días. Inicialmente, el medio se intercambió
mediante succión filtrando el contenido del matraz a través de un
embudo Buchner que contenía un filtro Miracloth (Calbiochem) y
resuspendiendo toda la biomasa en medio reciente. Durante el
crecimiento celular, 1-2 g (peso fresco) de células
se transfirieron generalmente a un nuevo matraz de 125 ml que
contenía 25 ml de medio reciente y a continuación se subcultivaron
semanalmente.
Las velocidades de crecimiento y las densidades
celulares típicas alcanzada en cultivos en suspensión de especies
representativas se listan en la Tabla 4.
Como un ejemplo detallado, el incremento en la
biomasa (peso fresco y seco) con el tiempo para la línea
K-1 de Taxus chinensis se muestra en la
figura 1. La velocidad de crecimiento máxima se midió tomando la
pendiente en puntos del incremento de biomasa más rápido sobre las
curvas de crecimiento. Los cultivos celulares de Taxus
chinensis crecían en un tiempo de duplicación máximo de 2,5
días. Esta velocidad de crecimiento es significativamente superior
que la presentada previamente para cultivos en suspensión de
especies de Taxus. Por ejemplo, Christen y otros (1991)
presentaron un incremento de 5 a 10 veces en la biomasa después de
3 a 4 semanas de cultivo, que se traduce en un tiempo de
duplicación medio para suspensiones de Taxus brevifolia de 7
a 12 días.
La capacidad para cultivar células a una densidad
alta es importante para maximizar la productividad volumétrica de
un procedimiento de cultivo celular. Mientras que los cultivos de
Taxus brevifolia alcanzaban una densidad celular de menos de
1 g de peso seco por litro (calculado a partir de los datos
presentados en Christen y otros (1991)), las suspensiones de
Taxus chinensis podían alcanzar densidades de hasta 8 a 20 g
de peso seco por litro después de 18 días de crecimiento. La
viabilidad de las células se determinó midiendo células con una
solución al 0,05% de diacetato de fluoresceína en acetona (Widholm,
1972) y contando el número de células fluorescentes verdes durante
la excitación con luz azul en un microscopio de fluorescencia
invertido (Olympus IMT-2, Japón). La viabilidad de
las células era superior a 90% a lo largo de la fase de
crecimiento.
La capacidad para cultivar células bajo
condiciones de crecimiento rápido hasta altas densidades celulares
mientras se retiene una alta viabilidad es un requisito previo
importante para la operación económica de un procedimiento de
cultivo de células de plantas para producir taxol y compuestos
similares a taxol.
El análisis de ELISA para taxol (Hawaii Biotech)
se usó para el rastreo a gran escala de líneas celulares. Este
método proporciona alta sensibilidad (0,1 mg/ml), sin embargo,
debido a que se usa un anticuerpo policlonal, se observa
reactividad cruzada con otros taxanos. La HPLC preparativa (escala
analítica) con recogida de fracciones mostraba reactividad cruzada
con 10-desacetiltaxol,
7-xilosil-10-desacetiltaxol,
cefalomanina,
10-desacetil-7-epitaxol,
7-epitaxol, así como otros taxanos no
identificados. A pesar de tal reactividad cruzada, se encontró que
este método era extremadamente útil para la detección de la
producción de taxanos y permitía que se rastrearan rápidamente
grandes números de líneas celulares. Los extractos celulares que
mostraban una producción significativa de taxanos se analizaron a
continuación con detalle usando el procedimiento de HPLC esbozado
más adelante.
La extracción de taxanos de sobrenadantes se
realizó mediante dos métodos, dependiendo de las concentraciones
presentes en los medios. Cuando están presentes cantidades
suficientes de taxanos en medios líquidos, las muestras se preparan
muy rápidamente y eficazmente. Los medios (2 ml) se secaron
completamente (a vacío) y se añadió una cantidad medida de metanol
(0,5-2,0 ml). Esta mezcla se agitó ultrasónicamente
hasta que se efectuaba la disolución o dispersión completa de la
muestra. Los sólidos se retiraron mediante centrifugación antes del
análisis por HPLC. Se han obtenido recuperaciones cuantitativas a
niveles de 1 mg/ml con niveles de detección muy por debajo de 0,1
mg/l.
Cuando la concentración de taxanos en los
sobrenadantes de cultivo era baja, el medio se extrajo tres veces
con un volumen igual de una mezcla de cloruro de metileno y alcohol
isopropílico (IPA) (9:1 en volumen). La capa orgánica se redujo
hasta sequedad y se reconstituyó en un volumen medido de metanol
(50-250 ml). La extracción múltiple recuperaba
típicamente 90-95% del taxol, cefalomanina y
bacatina III en niveles de 0,6 mg/l.
Los materiales celulares se extrajeron congelando
células recientemente recogidas (-5ºC), seguido por secado a vacío
y extracción Soxhlet con metanol durante 50 ciclos. Se recuperó
generalmente de 70 a 80% de los taxanos con 10-15%
de descomposición medible. La extracción de medio sólido y callo se
efectuó idénticamente a la de las células, sin embargo, siempre se
realizó el reparto de cloruro de metileno/IPA frente a agua del
extracto de metanol final.
Se realizó cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) sobre una columna difenílica cargada con alto
contenido de carbono (Supelco, 5 mM, 4,6 mM x 25 cm) con un
gradiente binario LDC Analytical con un sistema de mezcladura a
alta presión que consistía en bombas CM3500/CM3200, un
automuestreador volumétrico variable CM4100 y un detector de serie
de fotodiodos SM5000 interconectado a un ordenador personal Total
Peripherals 486. La temperatura de la columna se reguló a 35ºC con
una estufa para columnas Eldex CH150. El análisis cuantitativo por
HPLC de los taxanos se efectuó usando un esquema de elución en
gradiente binario como sigue:
| Tiempo | % de Eluyente A | % de Eluyente B | Flujo |
| 0 | 75 | 25 | 1 ml/min |
| 40 | 35 | 65 | '' |
| 42 | 25 | 75 | '' |
| 47 | 25 | 75 | '' |
| 50 | 75 | 25 | '' |
| Eluyente A = 0,015 mM KH_{2}PO_{4} llevado hasta pH 3,5 con ácido trifluoroacético | |||
| Eluyente B = acetonitrilo |
Los métodos cromatográficos usados se asemejan a
varios métodos publicados (Witherup y otros, 1989) con las
excepciones de que se ha usado un tampón de fosfato que contiene
ácido trifluoroacético y que se emplea un gradiente más prolongado.
Estas diferencias mejoran significativamente la resolución de taxol
y otros taxanos a partir de la mezcla. Los tiempos de retención
relativos observados para los taxanos se muestran más adelante. El
taxol se eluye entre 31 y 33 minutos dependiendo de la columna y el
hardware usado.
| Compuesto | Tiempo de retención relativo |
| 10-desacetilbacatina III | 0,38 |
| bacatina III | 0,56 |
| 7-xilosil-10-desacetiltaxol C | 0,80 |
| 10-desacetiltaxol C | 0,87 |
| cefalomanina | 0,94 |
| 10-desacetil-7-epitaxol C | 0,98 |
| taxol C | 1,00 |
| 7-epitaxol | 1,12 |
Los tiempos de retención de taxol, cefalomanina y
bacatina III se determinaron usando muestras auténticas obtenidas
de the National Cancer Institute. Los tiempos de retención de los
otros taxanos listados previamente se compararon con patrones
analíticos proporcionados por Hauser Chemical (Boulder CO). La
identificación de taxanos conocidos se basaba en el tiempo de
retención y comparaciones espectrales ultravioleta. La
cuantificación de taxol, cefalomanina y bacatina III se basaba en
factores de respuesta determinados a partir de materiales
auténticos. La cuantificación de
10-desacetilbacatina III se realizó usando el factor
de respuesta determinado para bacatina III. La cuantificación de
los restantes derivados de taxol se basaba conservativamente en el
factor de respuesta medido para el taxol.
Cada uno de los patrones (10 ml) se inyectó
típicamente (inicialmente y a continuación después de 3 ó 4
muestras) y se integraron las áreas para cada uno de los tres
componentes. Los factores de respuesta para cada uno de los
componentes se obtuvieron mediante análisis lineal por mínimos
cuadrados de los datos. Se inyectaron 10 ml de cada muestra y la
cantidad por inyección se calculó basándose en la regresión de
datos estándar. Estos resultados se convirtieron en cantidad por
litro o porcentaje en peso seco. La figura 4 ilustra un cromatograma
típico y una muestra de sobrenadante.
La identidad del taxol en sobrenadante de cultivo
celular se ha confirmado usando un método MS/MS (según se muestra
en la figura 6) que acopla inyección de flujo con ionización
química a presión atmosférica con pulverización iónica. Los
detalles de los procedimientos usados para adquirir los datos
presentados en la figura 6 eran como sigue: Espectrómetro de
Masas: Cuadrupolo triple Sciex API 3 con una fuerte ionización
a presión atmosférica. Se usó nitrógeno como el gas de cortina y se
usó argón como el gas de colisión para los espectros de CID.
Interfase: Interfase de pulverización iónica que produce
iones mediante ionización por evaporación iónica
(electropulverización). Se usó aire cero como el gas nebulizador.
Bomba LC: Bomba de jeringa doble ABI 140B que funciona a 5
\mul/minuto. Disolventes: Acetonitrilo/NH_{4}OAc 2 mM
H_{2}O 50/50 + ácido fórmico al 0,1%. Volumen de
Inyección: 5 \mul, todos los espectros se tomaron mediante
análisis de inyección de flujo. Este método proporcionaba una
confirmación inequívoca de la presencia de taxol en muestras de
cultivo celular y también proporcionaba una cuantificación con
excelente conformidad con los resultados de HPLC.
El taxol producido por cultivos celulares de
diversas especies de Taxus se resume en la Tabla 5. El callo
se cultivó durante 20 días en la oscuridad sobre el medio
solidificado indicado para cada especie. Las células y el medio se
secaron y se extrajeron con metanol juntos, y se ensayaron mediante
ELISA o HPLC según se indica. Los resultados obtenidos con cultivos
de Taxus chinensis se elaboran adicionalmente en los
Ejemplos 7 y 8.
La producción de taxol y taxanos relacionados
comenzó en los dos primeros días de transferencia en Medio A de
crecimiento. El taxol máximo observado era el día 15, con 8,81
\mug/matraz, que corresponde a 0,44 mg/litro de taxol. De estos,
46,1% estaba presente en el medio extracelular. El día 15, la
concentración de taxanos totales era 72,87 \mug/matraz, o 3,6
mg/litro, de los cuales 5,86% estaba presente en el medio
extracelular. La viabilidad de las células era siempre mayor que
90% según se medía mediante tinción con fluorescencia (Ejemplo 4),
sugiriendo que la presencia de taxol y taxanos extracelulares se
debía a la secreción en vez de deberse a lisis celular. La
capacidad de las células para secretar taxol y taxanos será un
aspecto importante de la operación continua.
Se obtuvieron mejoras significativas en la
productividad de taxol y taxanos totales separando por succión
asépticamente Medio A de crecimiento el día 9, reemplazando con
medio reciente y repitiendo el procedimiento el día 12. El
experimento se terminó el día 15 y los resultados se muestran en la
figura 2. Los importantes incrementos en la productividad debidos
al intercambio de medio se resumen en la Tabla 6. Las cantidades
totales de taxol y taxanos producidas eran alrededor de 4,6 veces
superiores con intercambio de medio en comparación con controles
sin tratamiento. De forma importante, alrededor de 4,9 veces más de
taxol y alrededor de 5,9 veces más taxanos totales se recuperaban en
el medio extracelular en comparación con controles sin tratamiento
de intercambio de medio.
La capacidad para mejorar notablemente las
productividades de taxol y taxanos totales y, además, para provocar
la acumulación extracelular de productos es importante para la
operación de un procedimiento continuo eficaz con reutilización de
biomasa y simplificaba la purificación aguas abajo.
Se sabe que la luz juega un papel importante no
solo en la fotosíntesis sino también en diversos aspectos del
metabolismo secundario en cultivos de células de plantas (Seibert y
Kadkade, 1980). Aunque los experimentos descritos en los Ejemplos
4, 7.1 y 7.2 se efectuaron en la oscuridad, la respuesta de
cultivos de Taxus chinensis a la luz se describe aquí.
Se inoculó 1 gramo de peso fresco de células de 7
días de edad de línea K-1 de Taxus chinensis
en 25 ml de Medio A de crecimiento (véase la Tabla 2) en matraces
Erlenmeyer de 125 ml y se incubó a 24 \pm 1ºC en un agitador
giratorio a 120 rpm. Matraces duplicados se pusieron en la oscuridad
y bajo una lámpara Standard GroLux a una distancia de 3 pies. Las
características espectrales de la lámpara se muestran en la figura
3. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
La exposición de los cultivos a la luz no
afectaba a los niveles de taxanos totales o la extensión de la
acumulación extracelular. Sin embargo, los perfiles de taxano
estaban alterados significativamente en los dos tratamientos. Por
ejemplo, las células cultivadas a la luz producían 2,8 veces más
taxol que las células en la oscuridad. La proporción de taxol
extracelular también era significativamente superior que en el
tratamiento en la oscuridad (76% frente a 56%). El uso de
tratamiento con luz, especialmente de una calidad espectral
específica, sería así extremadamente útil en un procedimiento de
cultivo celular para la producción de taxol.
El término elicitores se usa para compuestos de
origen biológico (o biótico) y no biológico (o abiótico) que
provocan un incremento en el metabolismo secundario cuando se
añaden a cultivos de células de plantas.
Aunque se ha encontrado útil un número de
elicitores, un ejemplo ilustrativo representativo se describe aquí
con detalle, a saber el uso de glutamato de quitosano. Aunque el
quitosano se ha probado previamente como un elicitor en algunos
sistemas de cultivo en células de plantas, las reacciones tóxicas
adjuntas, tales como pardeamiento y pérdida de viabilidad, han hecho
su uso poco práctico (Beaumont y Knorr, 1987). En efecto, tales
reacciones secundarias tóxicas son una desventaja común de muchos
elicitores presentados en la literatura. El uso de quitosanos
químicamente modificados, tales como glutamato de quitosano, para
inducir específicamente la biosíntesis de taxol y taxanos mientras
se evitan efectos secundarios tóxicos, es un procedimiento
nuevo.
Suspensiones de línea K-1 de
Taxus chinensis que crecían en Medio D durante de 7 a 8 días
se filtraron por succión asépticamente usando un embudo Buchner
estéril con un filtro Miracloth (Calbiochem). Se transfirieron
asépticamente 2 g de peso fresco de células a 25 ml de Medio C
(véase la Tabla 2) en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Se preparó
una solución de glutamato de quitosano al 0,05% recientemente y se
esterilizó por filtración a través de un filtro de cartucho de 0,22
micras. Se añadieron 825 \mul de esta solución al matraz al
principio del experimento, correspondiendo a un nivel de 165 mg de
elicitor por gramo de peso seco de células. Los matraces se
incubaron a 24 \pm 1ºC en un agitador giratorio a 110 rpm en la
oscuridad. Los matraces se muestrearon destructivamente el día 15 y
se registraron observaciones del crecimiento, el color de las
células y el medio y la viabilidad de las células. Las muestras
liofilizadas se extrajeron con metanol para taxol y taxanos según
se describe en el Ejemplo 5 y se analizaron mediante HPLC. Los
resultados de este experimento se muestran en la Tabla 8.
El tratamiento con elicitor daba como resultado
una mejora modesta en la producción de taxanos totales por célula
(0,53% frente a 0,42% de peso de taxanos) sobre los controles no
tratados. La naturaleza atóxica del elicitor es evidente a partir
de las altas viabilidades (75-80%) observadas en
ambos tratamientos. De hecho, se ha observado reproduciblemente un
peso seco incrementado en el tratamiento con elicitor en
comparación con los controles (14,2 g/l frente a 10,1 g/l de peso
seco). Las densidades celulares superiores daban como resultado una
concentración 1,8 veces mayor de taxanos totales en el tratamiento
con elicitor, es decir 75,8 mg/l frente a 42,4 mg/l para el
control.
El tratamiento con elicitor daba como resultado
un incremento en la biosíntesis de taxol, tanto sobre una base por
célula (0,098% frente a 0,054% de peso seco de taxol, un incremento
de 1,8 veces) como en una comparación de concentraciones (13,9 mg/l
frente a 5,4 mg/l, un incremento de 2,6 veces). La extensión de la
secreción era superior para el tratamiento con elicitor en
comparación con el control (85% frente a 72% de producto
extracelular).
El tratamiento con elicitor descrito aquí da como
resultado una producción de taxol incrementada, un perfil de
producto más favorable, una secreción de productos mejorada y
retención de alta viabilidad celular. Estas características de
producción representan una mejora significativa para el
procedimiento de cultivo celular para la producción de taxol.
En un esfuerzo para incrementar las
productividades de taxol sobre los niveles descritos en el Ejemplo
6, se manipularon los niveles de nutrientes para formular "medios
de producción" especiales. Suspensiones de 7 a 8 días de edad de
línea K-1 de Taxus chinensis que crecían en
Medio D se filtraron por succión asépticamente usando un embudo
Buchner estéril equipado con un filtro Miracloth (Calbiochem). Se
transfirieron asépticamente 500 mg de peso fresco de células a 5 ml
de Medios B y C de producción (véase la Tabla 2). Los recipientes
se incubaron durante períodos de tiempo variables de 18, 25 y 42
días a 24 \pm 1ºC en un agitador giratorio a 110 rpm en la
oscuridad. Los tratamientos se muestrearon destructivamente y se
registraron observaciones del crecimiento, el color de las células
y el medio y la viabilidad celular. Las muestras liofilizadas se
extrajeron con metanol para taxol y taxanos según se describe en el
Ejemplo 5 y se analizaron mediante HPLC.
Los cultivos celulares de Taxus chinensis
respondían a las composiciones de medio alteradas produciendo
niveles significativos de taxanos y taxol. Estos datos se resumen
en la Tabla 9 y un cromatograma de la muestra se observa en la
figura 4. En el medio B, se producían 99,8 mg/litro de taxanos
totales, con 24,1 mg/litro de taxol puro. En el Medio C, se
producían 110 mg/litro de taxanos totales, con 21,3 mg/litro de
taxol. Sobre un base en peso seco, las células producían 0,18% de
peso seco de taxol en Medio B y 0,065% de peso seco de taxol en
Medio C.
La producción de taxol y taxanos después del
cultivo prolongado de células (línea K-1) de
Taxus chinensis durante 25 y 42 días se estudió en Medio C,
cuyos resultados se resumen en la figura 5. Pueden resumirse las
siguientes observaciones significativas:
(i) Los cultivos en suspensión de Taxus
son capaces de producir niveles significativos de taxol y otros
taxanos. La acumulación más alta se producía a los 42 días, con
0,32% en peso seco de taxol y 0,62% en peso seco de taxanos totales;
correspondientes a valoraciones de 135 mg/l de taxol y 295 mg/l de
taxanos totales basadas en el volumen de medio final. El análisis de
la muestra mediante espectrometría de masas en tándem confirmaba la
presencia de taxol según se muestra en la figura 6. La
cuantificación mediante MS/MS mostraba una excelente coincidencia
con HPLC.
(ii) La velocidad de biosíntesis de taxol entre
los días 25 y 42 estaba alrededor de 7,6 mg de taxol por litro por
día suponiendo una producción lineal en el período de 17 días. Esta
velocidad es significativamente superior que la velocidad de
producción en los primeros 25 días. La velocidad de biosíntesis de
taxanos totales entre los días 25 y 42 era 12,3 mg por litro por
día.
(iii) Las formulaciones de medios de producción
pueden inducir incrementos de hasta 45 veces en el contenido de
taxol específico en comparación con condiciones de crecimiento
rápidas tales como las descritas en el Ejemplo 7.
(iv) El espectro de productos puede manipularse a
fin de encauzar la biosíntesis hacia el taxol obtenido como
producto final deseado, mientras se minimiza la producción de
taxanos no deseables. Por ejemplo, el día 25, el taxol constituía
28% de los taxanos totales y el día 42 el taxol constituía 52% de
los taxanos totales en contraste con el medio de crecimiento (véase
el Ejemplo 7.1), en el que el taxol constituía sólo 12,2% de los
taxanos totales. Esta capacidad para manipular los perfiles de
productos tendrá repercusiones importantes para la purificación
aguas abajo y para elementos reguladores relacionados con la pureza
del producto. Por ejemplo, la capacidad para suprimir la producción
del subproducto de taxano cefalomanina podría simplificar mucho la
purificación aguas abajo en comparación con la purificación de
taxol de tejido de corteza.
(v) Los cultivos de células de Taxus han
sido inducidos para secretar cantidades significativas de taxol
(87% el día 42) y otros taxanos. Que la presencia de taxol y
taxanos extracelulares se debe a la secreción en vez de deberse a
la lisis celular es corroborado por varias observaciones
independientes: (a) se producía biosíntesis continuada entre los
días 25 y 42, sugiriendo que las células eran viables y activas.
Observaciones independientes han mostrado que se ha observado una
viabilidad de >70% después de 18 días en medio de producción;
(b) se secretaban diferentes porcentajes de diferentes taxanos. Si
las células habían sufrido lisis, podría haberse esperado que el
porcentaje del medio fuera similar para los diferentes taxanos.
\newpage
(vi) La capacidad de esta línea celular de
Taxus para crecer y producir taxol en altos grados en un
ambiente extracelular tan rico en producto merece una mención
particular.
(vii) La línea celular de Taxus con la que
se obtenían estas células también es capaz de un crecimiento rápido
hasta altas densidades celulares, y expresaba las productividades
presentadas después de 20 generaciones bajo condiciones de
crecimiento rápido, atestiguando su estabilidad y potencial
comercial.
Los niveles de taxol y taxanos producidos por
líneas celulares de Taxus chinensis bajo las condiciones
descritas aquí son superiores que los resultados presentados
previamente en un factor de 35 a 150 veces. Por ejemplo Christen y
otros (1991) presentaron la producción de 1 a 3 mg/litro de taxol
mediante cultivos en suspensión de Taxus brevifolia después
de 2 y 4 semanas de cultivo. Wickeramesinhe y Arteca (1991)
presentaron la producción de taxol en 0,009% en peso seco en
cultivos celulares de Taxus media.
En resumen, los presentes datos muestran que con
una iniciación y una selección cuidadosas de cultivos de Taxus
chinensis, y condiciones de medio de crecimiento especialmente
formulado, las células pueden inducirse a crecer rápidamente hasta
altas densidades celulares. Cuando estas células se transfieren a
condiciones de medio de producción, las células pueden
biosintetizar y secretar niveles significativos de taxol y otros
taxanos durante períodos prolongados mientras que mantienen altas
viabilidades. La incorporación de un intercambio periódico de medio
y elicitores con el medio de producción da como resultado mejoras
de productividad sinérgicas adicionales. Estas propiedades son
requisitos previos críticos para un procedimiento comercial eficaz
para la producción de taxol y taxano usando tecnología de cultivo
tisular.
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\newpage
Claims (4)
1. Un procedimiento para producir taxol y otros
taxanos con altos rendimientos a partir del cultivo celular de
Taxus chinensis, que comprende cultivar, en cultivo en
suspensión en uno o más medios nutrientes, células derivadas de
callo y/o cultivos en suspensión de Taxus chinensis y
recuperar dichos taxol y otros taxanos de dichas células y/o dicho
medio de dicho cultivo celular.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el medio nutriente comprende jasmonato
de metilo.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el medio nutriente comprende nitrato de
plata.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el medio nutriente comprende
fenilalanina.
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