CN101421392A - 茚满酰酰胺在刺激紫杉属次生代谢中的应用 - Google Patents

茚满酰酰胺在刺激紫杉属次生代谢中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及在包含茚满酰氨基酸的营养培养基中通过培养紫杉属悬浮细胞生产紫杉烷类的方法。茚满酰氨基酸可在培养的任何时刻以批量模式加入或在加料流中加入。特别地，已经发现合成化合物6－乙基－茚满酰－异亮氨酸、6－溴代茚满酰异亮氨酸和1－氧代－茚满－羧基－(L)－异亮氨酸－甲酯酰胺(1－OII)能增加紫杉属细胞培养物中的紫杉烷类生成。

Description

茚满酰酰胺在刺激紫杉属次生代谢中的应用
发明领域
[001]本发明涉及茚满酰(indanoyl)酰胺和茚满酰氨基酸辍合物例如coronolone的应用，以及在紫杉烷生成物种的植物细胞培养中聚积紫杉烷类用于生产药物组合物和治疗方法的方法。
相关技术综述
[002]紫杉醇及其类似物例如多西紫杉醇在癌症治疗中处于开发的前沿，在世界范围内对这些产品有不断增长的需求。由于紫杉醇的全化学合成很复杂且不经济，紫杉醇及其类似物目前在商业上通过半合成或生物合成法生产。半合成需要使用高级的、天然存在的紫杉烷前体(与紫杉醇结构密切相关)，并且要采用复杂的化学作用来实现这些前体向紫杉醇或相关紫杉烷类的结构转化。这些前体包括10-脱乙酰基浆果赤霉素III、浆果赤霉素III、N-酰化紫杉烷等。多种专利和文献公开了二萜类化合物母核的合成路线、生物合成基因、酶类或向想要的紫杉烷类的化学转化。对于这些公开的实例，参见例如美国专利第5,994,114号；美国专利第5,200,534号；美国专利第6,437,154号；美国专利第6,287,835号；美国专利第6,265,639号；＂SyntheticRoutes to the Diterpenoid Cores of Phorbol andResiniferatoxin，＂Eckelbarger，J.D.2001；＂Taxol biosyntheticgenes，＂Walker，K.等人，Phytochemistry，58(2001)1-7。
[003]通过使用紫杉属物种的植物细胞培养实现了紫杉醇的生物合成。生物合成路线的优点在于可以以相对纯的形式直接生产目标化合物或组合物，而不需要另外的化学作用。若干出版物公开了通过生物合成法生产紫杉烷类的方法。美国专利第5,019,504号(Christen等人，1991)描述了通过短叶红豆杉的细胞培养生产和回收紫杉醇和紫杉烷样化合物。WO 93/171121(Bringi等人，1993)和美国专利第5,407,816号(Bringi等人，1995)描述了通过紫杉属物种的细胞培养提高了紫杉醇和其它紫杉烷类的生产和回收。Bringi等人最早公开了经济可行的生产紫杉烷类的植物细胞培养过程。
[004]美国专利第6,248,572号(Choi等人，2001)描述了在紫杉属细胞的半连续培养过程中，通过向培养基中加入糖或糖与AgNO3生产紫杉醇的方法。其它相关专利包括例如美国专利第5,665,576号和美国专利第6,428,989号。
[005]EP 0 683 232 A1(Yukimune，1995)、EP 0 727 492 A2(Yukimune等人)和WO 97/44476(Bringi等人，1997)描述了在处理增强剂(process enhancement agent)例如重金属化合物、重金属络离子、重金属离子、胺或抗乙烯剂的存在下，并且在受控制的氧浓度下，通过培养组织或细胞生产紫杉烷类。这些专利申请还公开了茉莉酸和相关化合物在紫杉属细胞的细胞培养中提高紫杉烷类收率的有益效果。这些专利申请中的处理增强化合物都不含芳环。
[006]与茉莉酸相关的化合物和它们的应用描述在例如Haider等人，＂Structure-Activity Relationships of Synthetic Analogsof Jasmonic Acid and Coronatine on Induction ofBenzo[c]phenanthridine Alkaloid Accumulation in Eschscholziacalifornica Cell Cultures，＂Biol.Chem.，第381卷，第741-748页，2000年8月；Krumm等人，＂Leucine and Isoleucine Conjugatesof 1-Oxo-2，3-dihydro-indene-4-carboxylic Acid：Mimics ofJasmonate Type Signals and the Phytotoxin Coronatine，＂Molecules 1996，1，23-26；Miersch等人，＂Structure-activityRelations of Substituted，Deleted or StereospecificallyAltered Jasmonic Acid in Gene Expression of Barley Leaves，＂Phytochemistry 50(1999)353-361；Schuler等人，＂Coronalon：aPowerful Tool in Plant Stress Physiology＂；Yamada等人，＂Processfor Production of Oxime Derivatives，＂EP 86102811.6，公开号第0194554B1号；Boudier等人，＂Sereoselective Preparation andReactions of Configurationally Defined Dialkylzinc Compounds，＂Chem.Eur.J.2000，第6卷，第15期，2748-2761中。
[007]Haider等人教导了茉莉酸类似物，它们可引起力传导，常常并不同时引起次生代谢产物的生成。而且，Haider等人，Biol.Chem.，第381卷，第741-748页，2000年8月(第744页，第2栏，第1段)还报道了晕斑素(coronatine)的芳构化使它成为平面并且生物学无效。Haider等人指出：
防御基因的激活和力传导基因的激活似乎被沿着茉莉酸生物合成途径的不同化合物所调节。晕斑素——12-氧代-植物二烯酸结构相近的类似物，和十八烷类(octadecanoids)是卷须卷曲的强诱导物。另一方面，茉莉酸甲酯在激活苯并[c]菲啶生物碱聚积方面比十八烷类或晕斑素有效得多。这些结果进一步支持了如下假说：被十八烷类途径激活的各种生理学响应，例如对食草动物(herbivory)或病原体的生理学响应，和其中尤其是力传导，可以被诱导物分子的化学衍生化作用区分开来(Blechert等人，1997)。在此用Blechert等人(1999)相近类似物例如[茉莉酸酯的三个类似物](都是E.californica中的苯并[c]菲啶生物碱聚积的强诱导物)进行防御基因激活，而那些相同的化合物在诱导泻根力传导中却失败，通过所获得的这些不同结果强烈地证明了这一点。
[008]Boland等人描述了有关植物生理学的一些方面，这些植物已经暴露于茉莉酸和/或晕斑素。参见例如Boland等人，＂Jasmonicacid and Coronatine Induce Odor production in plants＂，Angewandte Chemie-International Edition，43：1600-1602(1995)；Krumm等人，＂Induction of volatile biosynthesis in the Lima bean(Phaseolus lunatus)by lucine-and isoleucine conjugate of1-oxo-and 1-hydroxyindan-4-carboxylic acid：Evidence for aminoacid conjugates of jasmonic acid as intermediates in theoctadecanoid signaling pathway＂，FEBS Lett.377：523-529(1995)；和Schuler等人，＂Synthesis of 6-azido-1-oxo-indan-4-oyl isoleucine；a photoaffinity approach to plant signaling＂，Tetrahedron，55：3897-3904(1999)，Lauchli等人，＂IndanoylAmino Acid Conjugates：Tunable Elicitors of Plant SecondaryMetabolism，＂The Chemical Record，Vol.2,000-000(2002)；和Schuler等人，＂6-Substituted Indanoyl Amino Acid Conjugates asMimics to the Biological Activity of Coronatine，＂WO 02/055480A3。
[009]WO 02/55480描述了6-取代的茚满酰氨基酸作为植物调节剂。Schuler等人(WO 02/55480)指出：＂6-乙基-1-氧代-茚满酰异亮氨酸甲酯是Bryonia diocia的触觉敏感性卷须的卷曲反应的有效引发剂＂。然而，WO 02/55480既没有公开细胞培养也没有公开用于紫杉属以提高紫杉烷类生产的用途。
[010]因此，由专利EP 727492(Yukimune等人)的教导看来，其中说明了晕斑素诱导紫杉醇和紫杉烷类生物合成，预期晕斑素的平面芳构化类似物对于该目的不会是生物学有效的。
发明概述
[011]有意义的是，这些以植物细胞培养为基础的过程中没有一个公开了使用例如6-乙基-茚满酰-异亮氨酸(6-EII)用于改善或改变悬浮培养细胞、尤其是紫杉属物种细胞的紫杉烷类生成。鉴于Schuler等人(WO 02/55480)观察到，茚满酰氨基酸辍合物是卷须卷曲(力传导)的有效引发剂，令人惊奇的是这些特定类似物将从紫杉属细胞培养中引起紫杉烷类次生代谢产物的生成。此外，Haider等人指出，使晕斑素类似物平面化的芳构化也会使它们生物学无活性。然而，6-EII(它包含芳环)既是平面的又是有活性的。因此加倍令人惊奇的是，平面的晕斑素类似物茚满酰氨基酸辍合物在紫杉属细胞培养中会是有效的紫杉烷类生成引发剂。
[012]本发明的一个实施方案涉及在包含茚满酰氨基酸的营养培养基中通过培养紫杉属悬浮细胞生产紫杉烷类的方法。本发明的另一个实施方案涉及包含茚满酰氨基酸的植物细胞营养培养基。茚满酰化合物可在培养过程中的任何时刻加到分批补料(fed batch)加料流(feed stream)中。在优选实施方案中，在补充的碳源被包括在加料流中以前，悬浮培养中的营养培养基中的碳源被部分消耗。
[013]在本发明的各个实施方案中，多种增强剂和/或抑制剂可加到营养培养基中。在优选实施方案中，茚满酰氨基酸以相对于不含它而言可有效改变培养生成的紫杉烷类谱(profile)的量加入。在另一个实施方案中，茚满酰氨基酸以相对于不含它而言可有效地选择性提高浆果赤霉素III的量提供。
[014]对于各个列举的实施方案，茚满酰氨基酸选自WO02/55480中所述的化合物。更优选地，茚满酰氨基酸是未取代的茚满酰氨基酸(1-氧代形式)或6-取代的茚满酰异亮氨酸及其衍生物。最优选地，茚满酰氨基酸选选自6-乙基茚满酰异亮氨酸(6-EII)、6-溴代茚满酰异亮氨酸(6-BII)、1-氧代-茚满-羧基-(L)-异亮氨酸-甲酯酰胺(1-OII)或其混合物。应该理解的是，任何一种茚满酰氨基酸化合物都可单独用于引发想要的紫杉烷类的生成。
[015]对于各个列举的实施方案，提高紫杉烷类生成的优选方法包括使用另外的增强剂，更优选自银化合物和络合物、茉莉酸甲酯相关的化合物和苯丙烷类(phenylpropanoid)抑制剂。同样地，可通过在适当阶段向培养基中提供那些紫杉烷类的不同生物合成前体而刺激优选的紫杉烷类产物的生成。另外，现有技术公认，快速生物量生长和产物的快速生成可被分开，并且不同的营养培养基配方和不同的培养条件可用于生长和生产阶段。
[016]在另一个实施方案中，营养培养基包含植物生长素(auxin)，具有植物生长素样生长调节剂活性的化合物，或其混合物。在另一个实施方案中，营养培养基包含银离子、银化合物、银络合物或其混合物。在另一个实施方案中，营养培养基包含苯丙烷类代谢的抑制剂。在优选的实施方案中，苯丙烷类代谢抑制剂是含亚甲二氧基的化合物，更优选地，苯丙烷类代谢抑制剂是MDCA(3，4-亚甲二氧基肉桂酸)或相关化合物，例如亚甲二氧基硝基肉桂酸、3，4-亚甲二氧基苯乙酸、亚甲二氧基苯丙酸等。在另一个实施方案中，营养培养基进一步包含氨基酸，更优选地，氨基酸是谷氨酰胺。
[017]在优选实施方案中，茚满酰氨基酸以相对于银毒性具有保护性的量提供。
发明详述
[018]本发明提供了在紫杉烷生成物种的植物细胞培养中增加紫杉烷类聚积的方法，以及分离和纯化它的方法。本发明涉及单独使用或与其它增强剂联用以改善紫杉烷类如紫杉醇、浆果赤霉素III和其它紫杉烷类似物的收率的特定增强剂(茚满酰酰胺)。
[019]在整篇说明书中引述的各篇文献都全文引入作为参考，至与本文公开不矛盾的程度。特别地，这些参考文献提供了优选方法来从愈伤组织培养中开发生长培养基和生产培养基，所述培养基导致紫杉烷类的高收率，包括添加和操纵培养条件来改善收率。
[020]紫杉烷类是也被称为taxoids或紫杉烷二萜类化合物的化合物家族成员。紫杉烷类以三环二萜紫杉烷环系为特征。目前有超过300种已知的紫杉烷类。术语＂紫杉醇样化合物＂或＂紫杉烷类＂可交换使用来描述具有紫杉烷环的二萜类化合物。紫杉烷类本身可具有抗肿瘤活性或能够修饰产生生物活性化合物。各种具体紫杉烷也列举在WO 97/44476(Bringi等人，1997)、EP 0 683 232 A1(Yukimune，1995)和EP 0 727 492 A2(Yukimune等人)中。
[021]术语＂紫杉烷生成细胞＂是指在至少一组培养条件下能够生成紫杉烷类分子的任何细胞。术语＂紫杉烷生成物种＂是指在至少一组培养条件下能够生成紫杉烷类分子的任何物种。术语＂紫杉烷生成细胞培养＂是指包含＂紫杉烷生成细胞＂的任何培养。生物合成组织(也就是紫杉烷生成细胞)可选自任何紫杉烷生成物种(或其组合)，这对于本领域技术人员来说是已知的。优选地，该组织选自的紫杉属物种是短叶红豆杉、加拿大红豆杉(Taxus canadensis)、东北红豆杉、欧洲红豆杉、墨西哥红豆杉、佛罗里达红豆杉(Taxus floridana)、西藏红豆杉、曼地亚红豆杉、红豆杉和Taxus gena。更优选地，紫杉属组织选自红豆杉。可选地，该组织可选自一种或多种榧树属的物种。榧树属物种优选为Torreya gradifolia或Torreya californica。该组织也可选自一种或多种榛属的物种。优选地，榛属物种是欧洲榛子。使用来自不同物种、变种、品系和/或属的细胞以任何方式的组合是本发明所关注的。例如，紫杉属物种细胞的一种或任何组合可与榧树属物种的一种或任何组合相联合，而不意欲限于此。也打算使用来自杂种和遗传改变等植物的组织。
[022]术语＂愈伤组织＂用于描述结构未分化的培养的植物细胞团块，它在固体化培养基上培养。术语＂悬浮培养＂用于描述分散在液体营养培养基中的结构未分化的细胞。可以理解的是，悬浮培养包含各个聚集阶段的细胞。悬浮液中聚集物的大小范围从直径数十微米(单细胞或少量聚集细胞)到直径数毫米的聚集物，后者由数千个细胞组成。
[023]术语＂营养培养基＂用于描述适合于植物细胞愈伤组织培养和悬浮培养的培养基。术语＂营养培养基＂是概括性的，包括＂生长培养基＂和＂生产培养基＂。术语＂生长培养基＂用于描述有利于培养细胞快速生长的营养培养基。术语＂生产培养基＂指的是有利于培养细胞中紫杉醇、浆果赤霉素III或总紫杉烷类生物合成的营养培养基。可以理解的是，生长可以发生在生产培养基中，生产也可以发生在生长培养基中，生长和生产都可以发生在单一的营养培养基中。优选地，紫杉烷生成细胞培养的生长阶段和生产阶段是可区别开的，具有独立优化的营养培养基。
[024]当所有的营养素一开始就都提供，并且包含细胞和产物的培养内容物在培养阶段结尾采集的时候，这种操作模式被称为＂单阶段批处理＂。当批处理分成两个连续阶段——生长阶段和生产阶段，在这两个阶段之间要改变培养基时，这种操作模式称为＂两阶段批处理＂。在本发明关注的范围之内，从生长培养基到生产培养基的转换可通过不连贯的分步变换，或渐进地通过一系列步骤，或通过渐进的连续变换来实现。在一个极端中，渐进的变换是通过递增改变组成的培养基的渐进置换来实现的。在另一个可选择的方案中，渐进的变换是通过将生产培养基的一种或多种组分加料到生长期培养物中来实现的。这是分批补料法(fed-batch process)的一个实例。在＂分批补料＂操作中，特殊的培养基组分例如营养素和/或一种或多种增强剂在一阶段或两阶段培养的全部过程中或部分过程中定期地或连续地提供。营养素和增强剂的描述可在例如表A或WO 97/44476(Bringi等人，1997)的表1和2中找到。另外，也可采用不连贯变换和渐进变换的组合。在一个实例中，一部分营养培养基可不连贯地变换，而其它组分可缓慢加料。
[025]根据本发明的一个实施方案，当收获批培养内容物的相当大部分但不是全部，并且加入用于持续细胞生长和生成的新鲜培养基时，该过程类似于＂反复吸出和填充＂操作，被称为＂半连续过程＂。
[026]根据本发明的一个实施方案，当持续提供新鲜培养基，并且持续或重复除去废弃培养基时，该过程称为＂连续的＂。根据另一个实施方式，如果细胞保留在反应器中，该过程称为＂灌注模式＂。根据本发明的一个实施方式，如果细胞随着废弃培养基一起被持续移除，该连续过程被称为＂恒化培养＂。
茚满酰酰胺
[027]本发明关注的茚满酰酰胺作为特别有用的增强剂用于改进或改变紫杉烷类生成，描述如下。例如在WO 02/55480中描述了制造该化合物的化合物和方法，它已经被引入作为参考。
[028]晕斑素具有下式：
Figure A200580008687D00121
[029]如Boland等人所述，认为茚满酰酰胺是晕斑素类似物。在WO 02/55480中描述的化合物之中，优选化合物是茚满酰氨基酸辍合物(也称为茚满酰氨基酸)。优选地，本发明考虑使用如下化合物，该化合物可用例如复制如下的Boland等人(WO 02/55480)的通式表示：
Figure A200580008687D00131
虽然Boland描述了R基团的各种取代基，它们中的每一个都考虑用于本发明，然而优选的R基团包括：
R1＝双键键合的氧；
R2＝低级烷基，例如甲基或乙基，或卤素，优选溴；
R3＝甲基或氢；和
R4＝氨基酸侧链。优选地，氨基酸是非极性天然或合成氨基酸。更优选地，氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸。在特别优选的实施方案中，氨基酸是异亮氨酸。
[030]根据本发明，茚满酰酰胺用于代替或补充如下所述的引发剂。优选地，茚满酰衍生物和类似物在10-500μmol/l的范围内使用，更优选50-250μmol/l。
细胞培养方法和培养基：培养条件的操纵和增强剂
[031]可操纵培养条件以有利于所需紫杉烷类的生成。例如，可操纵反应条件，例如温度、pH、黑暗度、除去或添加营养素或其它试剂、改变营养素或试剂的浓度或其组合。
[032]组合物可进一步包含许多另外的组分中的任何一些，例如营养素和增强剂。优选地，组合物包含如下讨论的增强剂例如引发剂，茉莉酸酯相关的化合物，影响乙烯生物合成或作用的化合物，尤其是抑制剂，苯丙烷类代谢抑制剂，抗老化剂，前体和植物生长素相关的生长调节剂。
[033]在细胞培养启动之前，可根据其它参数选择组织，例如在特定条件下有利于形成特定紫杉烷或紫杉烷前体的能力，或处理(例如化学地、遗传上地或其它方面)组织以有利于形成特定紫杉烷或紫杉烷前体。
[034]次生代谢产物的生成是一个复杂的过程，需要很多不同的酶的协同作用来产生并顺序修饰最终转变成目标次生代谢产物的前体。与此同时，如果其它酶对所需代谢产物前体进行代谢，耗尽了构建次生代谢产物所需的前体库，那么次生代谢产物产生将会减少。
[035]紫杉烷类是通过一系列很多酶促步骤产生的次生代谢产物，已知数类增强剂可改善紫杉烷类的生物合成(参见例如表A，和WO97/44476(Bringi等人，1997)，EP 0 683 232 A1(Yukimune，1995)和EP 0 727 492 A2(Yukimune等人))。这些增强剂中的一种添加到紫杉烷生成细胞培养中将提高紫杉烷类的生产率。此外，增强剂的使用将在很多紫杉烷生成培养物中具有至少一些增强效果，这意味着总生产率不是由单个限速步骤决定，而是由众多限制因素之间的复杂相互作用决定。任何一个限制因素的解除将提高紫杉烷类的生成，尽管提高的强度将取决于特定培养条件，该条件决定了紫杉烷类生物合成中其它步骤(一旦特定限制被解除)的相对限制作用。
[036]影响各种限制因素之间的相互作用的培养条件包括细胞的遗传组成、培养基的组成和气体环境、温度、照明和操作方案。添加到特定培养中的增强剂将通常根据该培养中的限制因素而选择，可凭经验比较本文所列的各增强剂的效果来决定。如果培养中存在一种以上的增强剂，可提高紫杉烷类生成。增强剂种类有：抗褐变剂、抗老化剂、抗乙烯剂、植物生长调节剂、前体、抑制剂、引发剂和刺激剂。有代表性的增强剂和典型的需要量已经描述在例如上述背景部分中引用的参考文献中。在优选的实施方案中，培养基可特别适合于有利生长或紫杉烷类生成。根据本文提供的指导，和考虑到普遍理解的植物细胞生理学和新陈代谢原理，本领域技术人员可以很容易地独立开发出有利于生长或紫杉醇/紫杉烷类生成的培养基。
[037]紫杉烷生成组织的愈伤组织形成和愈伤组织繁殖的方法，连同改变生长形态学、生产能力、产物谱和其它特征的优选方法，都是现有技术已知的。在建立了愈伤组织培养以后，然后在生产和/或生长培养基中培养细胞。特别地，通过在悬浮培养中培养紫杉烷生成细胞促进大量紫杉烷类的生成。一般而言，可以使用成功培养愈伤组织的培养基来启动悬浮培养。然而，对悬浮培养的需求，尤其是对紫杉烷类高效生产的需求可通过修饰培养基来更好地满足。现已发现，当紫杉烷生成细胞在修饰培养基中培养并处理参数时，得自培养的一种或多种紫杉烷的收率相当大地提高了。当使用合适的营养素和反应条件时，生成紫杉烷类的悬浮培养能够实现快速生长速率和高细胞密度。对于本领域技术人员来说，根据本文提供的指导和已经全文引入本文作为参考的专利，掺入、修饰和操纵特定种类的组分和来自给定种类的组分，以达到最佳性能，这是一件常规的事情。
[038]本发明关注于使用经修饰产生想要的结果的生物合成过程。根据本发明的实施方案，紫杉烷生成细胞在可以产生紫杉烷类的条件下培养。这些条件包括有利于生物量累积和/或紫杉烷类生成的条件。紫杉烷生成细胞的培养详细描述在例如美国专利第5,407,816号(Bringi等人，1995)和WO 97/44476中，这些紫杉烷生成条件的修饰描述如下，并在下列实施例1到8中举例说明。然而，本发明并不旨在限制于此。本领域技术人员可以根据本文提供的指导结合已经引入作为参考的文献制备适当的紫杉烷生成细胞培养物。
[039]各种培养条件和增强作用是本领域已知的，例如在本申请各处描述的参考文献中；然而，优选条件描述如下。
优选的细胞培养实施方案
[040]细胞培养启动包括，例如，植物源材料的表面灭菌，如用洁净水彻底洗涤，使用消毒剂，如次氯酸盐，使用润湿剂，如吐温或Triton，使用抗生素，和任选使用抗真菌剂。然后，可完整使用植物部分，或可使用它的一部分，例如从种子剥离的胚芽。然后，培养条件使用现有技术已知的适合于紫杉属愈伤组织形成的典型营养培养基、温度范围和pH范围。类似地，使用胶凝剂、减少色素沉着、活性炭等，以及标准光照/黑暗循环。
[041]愈伤组织繁殖是附着于植物部分的基本上未分化细胞团的发育，它被小心地剥离，并作为未分化培养物进行繁殖。与优选培养基、pH范围、优选碳源、氮源、大量盐和微量盐、维生素和生长调节剂有关的培养条件都描述在例如WO 97/44476中。除了那其中所列的程序以外，优选的胶凝剂包括琼脂、水凝胶、明胶和gelrite。同样地，炭优选用于除去废料和不需要的有机化合物。接种物通常在约0.01-10g/25ml的范围内。另外，优选地，传代培养技术用于愈伤组织部分定期连续转移到新鲜营养素源中。
[042]悬浮培养条件描述在例如WO 97/44476中。除了那其中所列的程序以外，一旦启动，可如下进一步进行悬浮培养，或者通过从培养基中大体分离细胞(通常通过过滤)，然后再次导入一部分到含营养素的培养基中，或者通过转移一定体积的培养肉汤(细胞和培养基)到含营养素的培养基中，或者通过使细胞沉降，接着除去已经存在的任何部分培养基并再次导入含营养素的培养基。当细胞被分离和转移到不同的含营养素的培养基中时，转移的量可为以新鲜重量为基础的0.3％到30％，尽管优选1％-25％的新鲜重量。注意，当细胞适应新环境和/或生长时，这个分数可改变。当细胞和培养基按体积转移时，转移体积相对于最终体积的比可从1％到基本上所有体积。在这种情况下，为了只导致小量体积增加，新鲜营养素可以浓缩形式提供。因此，培养可分成数个部分。每个部分可任选用于紫杉烷生成。不同部分的包含营养素的培养基的组成不需要相同。可加入不包含在原始培养基中的其它成分，或可省略或在强度方面改变原始培养基中的项目。培养持续时间通常至少2天。另外，可通过补充加入了营养素的部分消耗的培养基延长生长的持续时间。
[043]所有浓度都指的是细胞外培养基中的平均最初值。加料溶液中的浓度和因此局部与细胞接触的浓度可高于所指出的浓度。除了在植物细胞培养中通常采用的营养素以外，其它成分可包括在内，以协助紫杉烷类生产。特别适合于紫杉烷类生产的成分包括选自以下的一种或多种：引发剂、刺激剂、前体、抑制剂、生长调节剂、重金属和/或乙烯抑制化合物。引发剂包括茉莉酸和相关化合物，tuberonicacid和相关化合物，cucurbic acid和相关化合物，晕斑素和相关化合物，6-乙基-茚满酰异亮氨酸和相关化合物，12-氧代-植物二烯酸和相关化合物，系统素和相关化合物，volicitin和相关化合物，寡糖，壳聚糖，甲壳质，葡聚糖，环状多糖，包含来自细菌、真菌、酵母、植物、昆虫的细胞物质的制剂，或包含在昆虫唾液或分泌物中的物质等，植物中乙烯生物合成或作用的抑制剂，特别是包含银的化合物或络合物，钴，氨基乙氧基乙烯基甘氨酸等，苯丙烷类代谢抑制剂例如已知抑制苯丙氨酸氨裂解酶、肉桂酸羟化酶、香豆酸CoA连接酶的化合物，亚甲二氧基肉桂酸，亚甲二氧基硝基肉桂酸，亚甲二氧基苯丙酸，一般而言，包括亚甲二氧基官能团的其它化合物例如亚甲二氧基苯乙酸，亚甲二氧基苯甲酸等。生长调节剂和/或抑制剂及其组合的非限制性实例包括在表A和WO 97/44476(Bringi等人，1997)中公开的表格中，这并不是旨在对其进行限制。氨基酸包括用于细胞培养的任何普通氨基酸，例如谷氨酰胺、谷氨酸、门冬氨酸、α-或β-苯丙氨酸等。
[044]引发剂例如茉莉酸相关化合物等通常可以0.01μmol/l到1mmol/l的剂量使用。该值优选为1到500μmol/l。可根据制剂的特定组分的浓度，或作为培养体积的一部分，添加包含细胞物质的制剂。重金属和乙烯抑制剂例如银盐或络合物可以至多1mmol/l的浓度使用；然而，范围为0.01到500μmol/l。可以1μmol/l到5mmol/l的浓度使用其它抑制剂。包括亚甲二氧基官能团的芳香化合物可以0.1μmol/l到5mmol/l的浓度包括在内，但更通常是1μmol/l到2mmol/l。生长调节剂可以0.001μmol/l到2mmol/l的值使用，但更通常地，它们可以0.01μmol/l到1mmol/l的浓度范围使用。前体例如氨基酸或萜类前体可以1μmol/l到20mmol/l的浓度范围使用；然而更通常地，它们以10μmol/l到10mmol/l的浓度使用。按照本文提供的指导，对于本领域技术人员来说，通过常规实验方法来发现在所建议的有用范围之外单独使用物质或联合使用物质的特别益处，这是可能的。这些发现也认为在本发明的范围之内。
[045]可以很多不同方式提供供给细胞的成分。可在生长的特定阶段加入成分，例如滞后期、指数期或稳定期。所有成分都可一次提供，然后在适当的时间阶段之后，可回收紫杉烷类。可选择地，不是所有成分都一次全部提供，而是在培养过程的不同时间提供它们中的一种或多种。此外，添加在初始接触时间方面可能是不连续的或交错开的，并且该供给的持续时间对于不同成分可有所不同。成分可分多个部分提供。然后可以回收紫杉烷类。一种或多种成分可作为分别与细胞培养或其部分接触的溶液的一部分进行提供。可从全部培养物或培养物的一部分(只有培养基，只有细胞，或一定量的细胞和培养基一起)中回收紫杉烷类。可在培养期间的任何时间或在培养阶段完成以后回收紫杉烷类。可在任何时间或定期性地取出部分培养物，并用于紫杉烷类生产和/或回收或进一步繁殖细胞。这种包含细胞的部分可进一步与营养素或希望的其它成分接触。
[046]在一个实施方案中，包含营养素或其它成分的培养基可加入以补充移除体积的一部分或全部。补充(稀释)速率(由器皿中液体体积划分的添加容积率)可为细胞特定生长速率的0.1倍到10倍。部分这种移除物质可加回到原始培养中，例如，可移除细胞和培养基，培养基或细胞可用于紫杉烷类回收，剩余的细胞或培养基可返还。提供到培养中的成分的提供速率或培养中各种成分的水平可控制以有利于生产和回收紫杉烷类。培养的单独分开部分可以任何前述方式与成分接触，然后以经测定有利于紫杉烷类生产的比例合并。培养的细胞含量也可调节至有利于生产紫杉烷类或繁殖细胞的程度。细胞含量的调节可有利地和与营养素或其它成分接触的策略相结合。
[047]气体例如氧、二氧化碳和乙烯的水平可控制以有利于生产一种或多种紫杉烷，或有利于生物量累积。实验室规模培养器皿中的常规培养保持在空气氛中，通常用例如板、塞子或盖子封闭，导致溶解的氧水平低于空气饱和度，而CO2和乙烯水平高于大气中存在的CO2和乙烯水平。因此常规地，培养物顶部空间中的二氧化碳水平通常大于约0.03％。然而，二氧化碳和/或乙烯浓度可调节至有利于生成紫杉烷类或繁殖细胞的程度。因此，发明人已经发现，为了让紫杉烷类更好地生成，优选该水平高于0.1％(大约是大气的3倍)到10％，优选为0.3％到7％的CO2。乙烯可优选低于100ppm，这是在那个温度下，在与液相平衡的气相中测定的，优选低于20ppm。可以使用一种或多种方法控制溶解的气体，包括改变搅动速率、通气气体的组成、通气气体的补给速率或排气速率，或通过调节培养器皿中的总压力。
[048]气体也可独立提供，例如，氧和CO2源可不同。搅动速率可控制在1次到500次每分钟之间(搅拌器或液体循环的旋转或振动)。气体的补给速率可介于0.01到10体积气体每体积培养肉汤每分钟，并且可直接提供到培养液体中，或提供到液体的分离部分中，该液体分离部分随后与培养的剩余部分混合，或提供到培养的顶部空间中。典型地，对紫杉烷类生成和紫杉属细胞生长有利的溶解氧浓度可在操作温度下控制在10％到200％气体饱和度之间，优选为气体饱和度的20％到150％。当然，由于各种操作方面的原因，例如通气临时减少，溶解的氧水平可能低至零，并持续数分钟到数小时，这是有可能的。在这些范围之外的氧、二氧化碳和乙烯的特别有用的组合可通过常规实验发现，认为这在本发明的范围之内。
[049]在一个实施方案中，培养基可特别适合有利于生长或紫杉烷类生成。根据以上给出的指导和根据对植物细胞生理学和新陈代谢的一般理解的原理，本领域技术人员能够设计出有利于生长或紫杉醇/紫杉烷类生成的培养基。例如，人们可改变温度范围(如0℃-35℃，优选15℃-35℃，更优选20℃-30℃)。同样地，人们可改变光照/黑暗循环的周期。
[050]在优选的实施方案中，紫杉烷生成细胞从生长培养基转移到具有更高基本碳源浓度的生产培养基中。生产培养基还包含含银化合物或络合物，和含亚甲二氧基的化合物。另外，在细胞和生产培养基首次接触后0-3天，将茚满酰氨基酸化合物(如6-EII)、谷氨酰胺和NAA(萘乙酸)引入培养中。甚至更优选地，这些成分在加料流中提供。补充的葡萄糖或麦芽糖优选当需要时加到培养物中。
[051]从细胞培养物、植物组织或包含不同紫杉烷的混合物中纯化、重结晶、分离、提取紫杉烷类的方法描述在例如美国专利第6,452,024号；美国专利第6,215,000号；美国专利第6,136,989号；美国专利第6,124,482号；美国专利第5,281,727号；美国专利第5,380,916号；美国专利第5,969,165号；美国专利第5,900,367号；美国专利第5,393,896号；美国专利第5,393,895号；美国专利第5,549,830号；美国专利第5,654,448号；美国专利第5,723,635号；美国专利第5,736,366号；美国专利第5,744,333号；美国专利第5,756,098号和美国专利第6,008,385号中。
[052]在使用分批补料的过程中，已经发现细胞可以保持在生产状态持续延长的时间，事实上，细胞的生产能力是能够增强的。对于技术人员来说显然的是，可改变进料组成，以获得所需的结果，例如延长生产阶段以提高紫杉烷类收率，或延长生长阶段以获得较高的生物量密度。选择适当的条件来达到最佳的生产能力和性能，这在本领域普通技术人员考虑到本文所述的教导是很容易的。类似地，其它操作参数例如添加的定时和持续时间和分批补料组分的添加速率的变化，来达到所需的结果，这也是技术人员考虑到本文所述的教导能够达到的。
[053]如所引证的，例如在Bringi的WO 97/44476中，用过的培养基的周期性去除和新鲜培养基的周期性补充，例如每隔数日，促成了总紫杉烷类和紫杉醇生产的显著增加，以及细胞外产物的量的提高。
[054]培养基交换的刺激作用可能是由于就地移除了产物，这能防止反馈抑制和产物降解。就地产物移除对于不相关植物悬浮培养中次生代谢产物生成和分泌的这种正面影响除了别人以外已经由Robins和Rhodes(1986)以及Asada和Shuler(1989)证明了。周期性的除去用过的培养基也有以上优点，另外，通过从培养基中移除其它的非紫杉烷类抑制性组分(例如酚类化合物)可用于使继发生物合成去抑制。
[055]通过提供已经耗尽的基本营养素，新鲜培养基补充到正在进行活跃生物合成的细胞中也可增强生产。例如，Miyasaka等人(1986)只是通过添加蔗糖到培养基中就能够刺激丹参的稳定期细胞生成二萜类代谢产物隐丹参酮和弥罗松酚。也许，由于稳定期中碳的限制，生物合成已经停止了。作为任何以上因素的结果，本发明所用的周期性培养基交换方案可能是有益的。消耗的培养基组分的补充也可以通过包含所述组分的加料流(分批补料)来完成。
[056]可以预期的是，交换的培养基的量、交换频率、补充的培养基的组成是可根据本发明的不同实施方案改变的。
[057]通过培养基交换刺激生物合成和分泌的能力对于连续、半连续或分批补料模式的有效商业工艺过程的设计和操作具有重要含义。
[058]尽管可单独使用以上描述的在培养中生产紫杉烷类的任何实施方案，然而所述技术也可彼此组合使用。
实施例
[059]下列实施例是非限制性实施例。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，可以对它们作出很多改变和修饰，而不背离本文所述的本发明的精神或范围。
实施例1-紫杉属细胞的培养
[060]使用植物细胞培养的公认技术从紫杉属植物任何合适的部分开始紫杉属细胞培养。除了在固体化培养基上培养的细胞不需要搅动以外，基本上未分化的细胞在下述条件下在固体化或液体营养培养基上繁殖。紫杉属细胞在温度22-28摄氏度下培养，pH4-7，暗处，使用搅动来混合培养物并提供氧和其它气体，将含氧气体与细胞悬浮液接触来换气。在操作温度下将氧保持在10％到150％空气饱和度，二氧化碳保持在高于0.05％。通过调节搅动、压力、气体组成、气体的换气速率或补料速率的方式控制氧和其它气体的水平。培养基包含能够支持紫杉属细胞生长的组分，例如1-100g/l的糖，1-100mmol/l的累积量氮源，并且可包括生长调节剂，例如植物生长素和/或细胞分裂素样化合物，例如萘乙酸(NAA)、苯氧乙酸和卤素取代的苯氧乙酸、毒莠定、二氯甲氧苯酸、苯甲酸嘌呤、激动素、玉米素、苯基噻二唑脲、吲哚乙酸等。培养基可任选包含紫杉烷类物质，例如浆果赤霉素III或10-脱乙酰基浆果赤霉素III，氨基酸例如谷氨酰胺、α-或β-苯丙氨酸或其它，亚甲二氧基肉桂酸(MDCA)，或亚甲二氧基硝基肉桂酸或亚甲二氧基苯乙酸或α-氨基苯乙酸或相关化合物，银离子源，例如以硝酸银或硫代硫酸银的形式，或其它能够影响乙烯生物合成或作用的成分。紫杉属细胞的接种浓度可为10g新鲜细胞重量/l到300g新鲜细胞重量/l。
[061]培养基还包含本申请所述的茚满酰酰胺，任选与一种或多种茉莉酸相关物质联合，这些物质可在培养开始加入，在指数生长期以后加入，或在整个培养过程中间歇加入。培养基的其它成分可在培养过程中的一个时间全部加入，或在不同时间加入，可连续进料或间歇进料。可在培养肉汤中包括植物细胞之前或之后加入这些成分。此外，如果认为有用的话，可在培养过程中另外加入营养素或其它成分。任选地，可在培养适当阶段之后变更培养基，借此将细胞新鲜暴露于包含上述类似成分的培养基中。这种变更可以包括改变糖例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等的量，改变氮源例如硝酸盐、铵的量，或改变氨基酸或水解酪蛋白氨基酸等的量。经过一段时间的培养之后，收获培养物，并用HPLC对紫杉烷类水平进行定量，使用LC/MS/MS鉴定特定的紫杉烷。可以从这些培养物中通过适当的提取和纯化过程回收紫杉烷类。
[062]对于实验2-8来说，紫杉属细胞在固体培养基上作为愈伤组织培养物培养，然后进一步在液体培养基中培养成细胞团块悬浮液。尽管可以在固体培养基上通过培养生成紫杉烷类，但优选使用液体培养基。培养温度控制在20到30摄氏度之间。
实施例2-6-EII的分批补料添加
[063]根据下列参数进行本实验。12天分批补料处理的结果描述在表1中，证明了6-EII和茉莉酸甲酯具有相当的活性。根据上述方法，将红豆杉细胞作为愈伤组织培养，然后作为悬浮细胞培养在包含1％麦芽糖和B5盐的生长培养基(表B中所示的培养基A)中。在该培养基中培养了7天以后，从该培养基中大体分离出悬浮细胞，并以约20％(w/v)新鲜细胞置于生产培养基中，生产培养基由约20％(v/v)用过的生长培养基和80％(v/v)基础生产培养基(表B中所示的培养基B，但浓缩1.25倍)组成，最初pH为5.8，包含20μmol/l MDCA和50μmol/lSLTS(硫代硫酸银)。NAA(萘乙酸)、GLN(谷氨酰胺)和MJS(茉莉酸甲酯)或6-EII(6-乙基-茚满酰-异亮氨酸)作为加料流的一部分以下列速率进行补料：1.66μmol/l/d(NAA)，0.84mmol/l/d(GLN)，和MJS(2.51μmol/l/d)或6-EII(0.832、1.665、4.17或6.25μmol/l/天)。气相控制在25％氧和4.5％ CO2(平衡氮)，温度控制在25±2摄氏度。在暗处培养细胞，在实验过程中以100-150rpm搅动。在生产培养基中培养了12天以后，在培养物中收获紫杉烷类。
[064]下列结果证明了在补充了6-EII(即20-100μmol/l的累积剂量)增量或茉莉酸甲酯(MJS)的培养基中，紫杉烷类生成以类似于茉莉酸甲酯的方式响应6-EII。
表1：6-EII的分批补料添加对紫杉烷类生成的作用
 
引发剂 累积12天的分批补料剂量(μmol/l) 浆果赤霉素IIImg/L 紫杉醇mg/L 总共mg/L
MJS 30 273 490 1410
6-EII 20 159 443 694
6-EII 50 358 495 1301
6-EII 75 605 556 1693
6-EII 100 616 557 1702
实施例3-6-EII与其它培养基组分联合的批量添加
[065]用类似于实施例2的过程培养紫杉属细胞。培养基由6-EII(或茉莉酸甲酯-MJS)、NAA、SLTS、MDCA和谷氨酰胺的不同组合组成。以一批的方式，即一次全部，加入所有成分。
[066]数据显示，6-EII和MJS在提高紫杉烷类生成方面具有相当的活性。因此，当它本身使用时，6-EII无疑是有效的。然而，数据还指出培养基的组分之间有若干正相互作用。数据显示，6-EII与银协同作用增加紫杉烷类的总产量。特别地，结果证明了6-EII改善浆果赤霉素-III生产而不降低所生产的紫杉醇的量的能力。6-EII和植物生长素型生长调节剂NAA也能积极相互作用改进紫杉烷类的生产。6-EII和植物生长素型生长调节剂的组合令人意想不到地优于单独各组分的使用。数据证明了6-EII和氨基酸谷氨酰胺有利地相互作用改进紫杉烷类生成。数据还令人惊奇地证明了6-EII、银(以SLTS提供)和植物生长素型生长调节剂NAA相互作用改进了紫杉烷类的生成。因此，6-EII与其它增强剂的联用，例如NAA——植物生长素型生长调节剂、SLTS——含银化合物/络合物的实例(乙烯作用的抑制剂)、含亚甲二氧基的化合物(苯丙烷类代谢抑制剂)和谷氨酰胺(氨基酸的实例)，连同适当配方的培养基(例如表B的培养基B)一起，导致了紫杉烷类生成的改进。
实施例4-6-EII和其它培养基成分联用的效果
[067]根据下列参数进行本实验。根据上述方法，将红豆杉细胞培养成愈伤组织，然后作为悬浮细胞培养在生长培养基A(表B)中。在该培养基中培养了7天以后，从该培养基中大体分离出悬浮细胞，并以约20％(w/v)新鲜细胞置于最初pH为5.8的基础生产培养基(表B的培养基B)中。除了培养基B中所列的成分以外，培养基还另外包含5mmol/l谷氨酰胺。气相控制在氧为空气中值的90-97％，和2.5-6％CO2；温度保持在25±2摄氏度。在暗处培养细胞，在实验过程中以150-200rpm搅动。在生产培养基中培养了14天以后，在培养物中收获紫杉烷类。
[068]测试响应培养基的特定组分组合的紫杉烷类收率，并与在缺乏特定组分或缺乏组分的特定联合的情况下获得的收率相比较。
[069]发现5-500μmol/l的6-EII本身的掺入导致了紫杉烷类收率的提高。然而，当与20μmol/l NAA(一种植物生长素型生长调节剂)联用时，收率提高量显著更高。当50μmol/l银(一种乙烯作用的抑制剂，以硫代硫酸盐络合物提供)加到6-EII和NAA的联合中时，收率进一步提高了。并且，当20μmol/l MDCA(3，4-亚甲二氧基肉桂酸，已知是苯丙烷类代谢抑制剂)加到该联合中时，收率甚至更进一步提高了。这些令人惊讶的活性从单独组分的活性中是无法预测的。在特定条件下，通过滴定使组分浓度最优化，例如使用50-200μmol/l茚满酰氨基酸如6-EII，与20μmol/l NAA联用或与20μmol/l NAA和50μmol/l SLTS联用，或与20μmol/l NAA、50μmol/l SLTS和20μmol/l MDCA联用，以使想要的结果最大化，这也是可能的。
实施例5-硝酸银和6-EII对紫杉烷类生成的影响
[070]根据以上实施例1和2中所述的方法，将红豆杉细胞培养成愈伤组织，然后作为悬浮细胞悬浮在生长培养基(表B的培养基A)中。在该培养基中培养了7天以后，从该培养基中大体分离出悬浮细胞，并以约20％(w/v)新鲜细胞置于最初pH为5.8的培养基B(表B)中。除了表B中所列的成分以外，将20μmol/l NAA、20μmol/l MDCA、5mmol/l GLN、MJS或6-EII，和作为硝酸盐或硫代硫酸盐络合物的银以多种水平加到培养基中。气相控制在氧为空气中水平的90-97％，和CO2为2.5-6％；温度保持在25±2摄氏度。在暗处培养细胞，在实验过程中以150-200rpm搅动。在生产培养基中培养了14天以后，在培养物中收获紫杉烷类。
[071]数据证明了6-EII和银协同作用。因此，单独使用的6-EII或银都不能产生当细胞暴露于这些试剂联合存在时所观察到的作用的强度。在该实施例中，硝酸银和硫代硫酸银被用作含银化合物或络合物的说明性的实例。发明人已经发现了也可使用数种其它的含银化合物或络合物。其它适当的银络合物的实例可在例如背景部分中讨论的公开内容中找到，例如WO97/44476和美国专利第6,428,989号。
实施例6-6-溴代茚满酰异亮氨酸(6-BII)对紫杉烷类生成的影 响
[072]根据下列参数进行本实验。根据上述方法，将红豆杉细胞培养成愈伤组织，然后作为悬浮细胞悬浮在生长培养基(表B的培养基A)中。在该培养基中培养了7天以后，从该培养基中大体分离出悬浮细胞，并以约20％(w/v)新鲜细胞置于最初pH为5.8的基础生产培养基(表B的培养基B)中。除了表B中所列的成分以外，培养基还包含20μmol/l NAA、20μmol/l MDCA、5mmol/l GLN，和50μmol/l作为硫代硫酸盐络合物的银。将6-BII以下表2中标明的水平加到生产培养基中。气相控制在氧为空气中水平的90-97％，和CO2为2.5-6％；温度保持在25±2摄氏度。在暗处培养细胞，在实验过程中以150-200rpm搅动。在生产培养基中培养了14天以后，在培养物中收获紫杉烷类。
[073]数据显示，像6-EII一样，6-BII(卤素取代的衍生物)也是红豆杉细胞培养物生成紫杉烷类的有效诱导剂。数据还举例说明了最佳6-BII水平的确定，它同样可通过在紫杉烷生成细胞培养物中滴定其它茚满酰酰胺来确定。
表2：6-溴代茚满酰异亮氨酸(6-BII)对紫杉烷类生成的影响
 
添加的化合物 剂量(μmol/l) 浆果赤霉素III(mg/l) 紫杉醇(mg/l) 总紫杉烷类(mg/l)
无 0 66 229 364
MJS 45 154 574 912
6-BII 5 92 235 423
6-BII 20 114 230 441
6-BII 50 174 254 580
6-BII 100 313 360 962
6-BII 200 307 375 1060
6-BII 500 1 0 105
实施例7-1-氧代-茚满-羧基-(L)-异亮氨酸-甲酯酰胺(1-OII) 对紫杉属细胞悬浮培养物总紫杉烷类蓄积的影响
[074]根据下列参数进行本实验。根据上述方法，将红豆杉细胞培养成愈伤组织，然后作为悬浮细胞悬浮在生长培养基(表B的培养基A)中。在该培养基中培养了7天以后，从该培养基中大体分离出悬浮细胞，并以约20％(w/v)新鲜细胞置于最初pH为5.8的基础生产培养基(表B的培养基B)中。除了表B中所列的成分以外，培养基还包含20μmol/l NAA、20μmol/l MDCA、5mmol/l GLN，和50μmol/l作为硫代硫酸盐络合物的银。将1-OII以下表中标明的水平加到基础生产培养基中。气相控制在氧为空气中值的90-97％，和CO2为2.5-6％；温度保持在25±2摄氏度。在暗处培养细胞，在实验过程中以150-200rpm搅动。在生产培养基中培养了14天以后，在培养物中收获紫杉烷类。
[075]数据显示，像6-取代的衍生物——以上讨论的6-EII和6-BII一样，6-未取代的茚满酰异亮氨酸在紫杉属悬浮培养中也是紫杉烷类生成的有效诱导剂。
表3：1-氧代-茚满-羧基-(L)-异亮氨酸-甲酯酰胺(1-OII)对紫杉属细胞悬浮培养总紫杉烷类蓄积的影响
 
化合物 剂量(μmol/l) 浆果赤霉素III(mg/l) 紫杉醇(mg/l) 总紫杉烷类(mg/l)
无 0 49 170 277
MJS 45 226 432 854
1-OII 5 50 192 300
1-OII 20 72 248 400
1-OII 50 112 349 580
1-OII 100 242 409 822
1-OII 200 375 407 1055
1-OII 500 45 67 368
实施例8-6-EII的分批补料供应的效果和与向培养物中补充另 外的糖相联合的效果
[076]根据上述方法，将红豆杉细胞培养成愈伤组织，然后作为悬浮细胞悬浮在生长培养基A(表B)中。在该培养基中培养了7天以后，从该培养基中大体分离出悬浮细胞，并以约20％(w/v)新鲜细胞置于最初pH为5.8的浓缩了1.25倍的培养基B(表B)中，向其中加入20％(v/v)培养基A培养结束时用过的培养基。另外还加入20μmol/l MDCA和50μmol/l作为硫代硫酸盐络合物的银。以下列速率作为加料流一部分补充NAA、GLN和6-EII：1.66μmol/l/d(NAA)、0.84mmol/l/d(GLN)和4μmol/l/天(6-EII)。气相控制在25％氧和4.5％ CO2(平衡氮)，温度保持在25±2摄氏度。在暗处培养细胞，在实验过程中以100-150rpm搅动。在这些条件下培养了一段时间以后(在该案例中是12天)，培养物部分耗尽了主要的碳源。这时，向包含NAA、GLN和6-EII的加料流以400g/l补充葡萄糖，以向细胞提供充足的碳源补给，使得紫杉烷类生成的持续时间可得以延长。因此，额外持续培养16天。这时收获培养物中的紫杉烷类，用建立的分析方法确定紫杉烷类的量。
[077]结果表明，与其中培养基成分的利用度可限制紫杉烷类生成的持续时间的批量模式培养相比，以分批补料模式补充额外的糖能够延长该持续时间。此外，通过以分批补料模式少量添加补充糖，而不是一次突然性的加入全量，可以实现高紫杉烷类产量。
[078]以上描述了本发明的优选实施方案，连同许多可能的供选方案。然而这些实施方案只是作为举例，本发明不受其限制。因此，实施例的结果可以适用于总体的紫杉属物种，而不只限于红豆杉。另外，实施例的条件，例如添加组分的浓度，不受限制。
                         表A
(1-氨基-2-苯乙基)膦酸(APEP)          2-氟-6-碘苯甲酸
(1-氨基-2-苯乙基)亚膦酸(APEPi)       2-氟苯甲酸
(3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸          2-氟-β-丙氨酸
(E)-2-氨基甲基-3-苯丙烯酸            2-羟基-4，6-二甲氧基苯甲酸
(S)-2-氨基氧-3-苯丙酸                2-羟苯基氨基亚磺酰乙酸
(S)-4-硝基-苯丙氨酸                  1，1-二甲酯(OH-PAS)
(S)-α-氨基氧-β-苯丙酸                2-碘苯甲酸
1-氨基-3′，4′-二氯苄基膦酸         2-甲氧基肉桂酸
1-氨基-3-苯丙基膦酸                  2-萘甲酸
1-氨基苯并三唑                       2-硝基肉桂酸
1-氨基苄基膦酸                       3-(2-羟苯基)丙酸
2，3，4，5-四氟苯甲酸                3-(3，4-亚甲二氧基苯基)丙酸
2，3，5-三氯苯甲酸                   3-(3-氟-4-甲氧基苯甲酰基)丙酸
2，3，5-三碘苯甲酸                   3-(3-甲氧基苯基)-β-丙氨酸
2，3，6-三氟苯甲酸                   3-(4-溴苯甲酰基)丙酸
2，3-二氯苯甲酸                      3-(4-氯苯甲酰基)丙酸
2，3-二氟苯甲酸                      3，4-(亚甲二氧基)-6-硝基-肉桂酸
2，4，6-三氯苯甲酸                   3，4-(亚甲二氧基)肉桂酸
2，4-羰基二苯甲酸                    3，4-二氯苯甲酸
2，4-二氯苯氧乙酸                    3，4-二甲氧基-6-硝基肉桂酸
2，4-二氯苯甲酸                      3，4-二甲氧基苯乙酸
2，4-二氟苯甲酸                      3，4-亚甲二氧基苯甲酸
2，4-二甲氧基苯甲酸                  3，4-亚甲二氧基苯乙酸
2，5-二氯苯甲酸                      3，4-反式-二甲氧基肉桂酸
2，5-二氟苯甲酸                3，5-二氨基苯甲酸
2，5-二甲氧基苯甲酸            3-亚硝基苯甲酸
2，6-二氯苯甲酸                4-亚硝基苯甲酸
2，6-二甲氧基-3-硝基苯甲酸     亚硝基苯甲酸
2，6-二甲氧基苯甲酸            3，5-二溴苯甲酸
2-氨基-2，5-二氯苯甲酸         3，5-二氯-4-羟基苯甲酸
2-氨基茚满-2-膦酸(AIP)         3，5-二氟苯甲酸
2-氨基-茚-2-膦酸               3，5-二甲氧基-4-羟基苄基酰肼
2-溴-5-甲氧基苯甲酸            3，5-二甲氧基苯甲酸
2-氯苯甲酸                     3-氨基苯甲酰胺
3-氯苯甲酸                     3-苯甲酰基丙酸
3-氟苯甲酸                     3-氯-4-羟基苯甲酸
3-碘苯甲酸                     +/--2-氨基甲基-3-苯丙酸
3-硝基苯甲酸                   溴苯甲酸
3-硝基肉桂酸                   咖啡酸
4-氨基苯甲酸                   苄氧羰基-β-丙氨酸
4-(二甲氨基)肉桂酸             氯原酸
4-(羟苯基)丙酮酸               肉桂酸
4-氨基-DL-苯丙氨酸             肉桂腈
4-氟-(1-氨基-2-苯乙基)膦酸     肉桂醇
4-氟-2-(三氟甲基)苯甲酸        Cinnamyledeneacetophenone
4-氟苯甲酸                     肉桂叉丙二酸
可选择的苯甲酰基：CoA底物      Co2+(钴)盐
4-氟肉桂酸                     香豆酸
4-氟-D-苯丙氨酸                Cu2+(铜)盐
4-氟-L-苯丙氨酸                二乙基二硫代氨基甲酸(Na)
4-羟基苯甲酸                   二氢咖啡酸
4-羟基肉桂酸                   二硫苏糖醇
4-碘苯甲酸                     DL-3，4-二羟基苯丙氨酸
4-碘苯氧乙酸                   DL-3-氨基丁酸
4-甲氧基苯甲酸                 DL-3-氟苯丙氨酸
4-甲氧基肉桂酸                 DL-门冬氨酸
4-硝基肉桂醛                                DL-邻氯苯丙氨酸
4-硝基肉桂酸                                DL-对氯苯丙氨酸
5-氟-2-甲基苯甲酸                           苯甲酸乙酯
5-硝基-2-(3-苯丙氨基)-苯甲酸                3-硝基肉桂酸乙酯
6-氟-2-羟基苯甲酸                           乙基-4-硝基肉桂酸
6-甲氧基-2-苯并噁唑啉                       阿魏酸
含Ag的化合物或络合物                        烟曲霉毒素
α-氨基氧乙酸(AOA)                           没食子酸
草酸铵                                      甘氨酰-β-丙氨酸
苯甲酸                                      甘氨酰-L-苯丙氨酸
苯甲酰氯                                    草甘膦
肉桂酸苄酯                                  含Hg2+(汞)的盐或化合物
β-(2-羟基-3-甲苯基)丙氨酸                   羟胺
β-(2-羟基-5-甲苯基)丙氨酸                   异烟酸酯
β-氯乙基三甲铵                              茉莉酸和衍生物
β-苯基-DL-丝氨酸                            山柰酚
β-苯乙基丙氨酸                              D(+)-1-氨基-2-苯乙基膦酸
L-β-高-苯丙氨酸                             L-3，4-二羟基苯丙氨酸
LiCl(氯化锂)                                 L-α-氨基氧-β-苯丙酸(AOPP)*
L-苯丙氨酸-2-萘酰胺                          L-α-氨基氧苯丙酸
L-苯丙氨酸-对硝基苯胺                        镧
L-酪氨酸苄酯                                 邻二氮菲
丙二酸衍生物                                 邻磺基苯甲酸
MDCA(3，4-亚甲二氧基肉桂酸)                  对-氨基苯甲酸
苯甲酸甲酯                                   对-氨基-L-苯丙氨酸
Mg2+(镁)                                     对-氯苯甲酸汞
间甲基肉桂酸                                 对-香豆酸
茉莉酸甲酯                                   喷司他丁
N-(2-羟基-3-甲氧基-5-硝基苯亚甲基)β-丙氨酸   对-氟-DL-苯丙氨酸
N-(2-羟乙基)-β-丙氨酸                        对-氟-D-苯丙氨酸
N-(3，4，5，6-四氢-2H-氮杂
Figure A200580008687D0031145139QIETU
-7-基)-β-丙氨酸  苯乙酸和类似物
n-(4-氯苯基)-N-甲苯磺酰基-β-丙氨酸           苯肼
N-(γ-L-谷氨酰基)苯                  丙氨酸苯乳酸
N，N-二环己基碳二亚胺               苯丙炔酸
N，N-二甲基-L-苯丙氨酸              苯丙酸
N-乙酰基-咪唑                       苯基丙酮酸
n-乙酰基-1-门冬氨酸                 对-羟基苯甲酸
n-乙酰基-L-苯丙氨酸                 对-羟基苯甲酸汞
N′-苯甲酰基-β-丙氨酸甲酯           邻吡啶甲酸酯
N-肉桂酰基哌嗪                      对-碘-苯丙氨酸
N-环己基-β-丙氨酸                   对-苯甲酸汞
含Ni2+(镍)的盐或化合物               对-氨磺酰基苯甲酸
烟酸盐                              对位-取代的苯甲酸
硝基肉桂酰醇                        水杨酸
N-马来酰基-β-丙氨酸                 氨基脲
N-丙基-4-penenoic acid(VPA(丙戊酸)的代谢产物)硝酸银或其它银盐
O-苄基羟胺(OB-HA)                  硫代硫酸银
邻-氯肉桂酸                        亚精胺(Spd3+)
邻-羟基肉桂酸                      精胺(Spm4+)
邻-甲基肉桂酸                      苯甲酰磺胺
                                   t-肉桂酸盐
                                   tetcyclacis
                                   硫代苯甲酸
                                   反式-2，4-二甲氧基肉桂酸
                                   反式-3，4-二氟肉桂酸
                                   反式-香豆酸
                                   反式-肉桂酸甲酯
                                   香草酸
                                   Zn2+(锌)
表B：培养基A和培养基B的组成
 
培养基 培养基A 培养基B
组分 mg/L mg/L
硫酸铵 134 33.5
抗坏血酸 100 ---
门冬氨酸 1330 ---
硼酸 3 0.75
无水氯化钙 113.24 28.3
二水合氯化钙 50
六水合氯化钴 0.025 0.00625
二水合氯化铜 --- 0.01
五水合硫酸铜 0.025 0.00625
二水合EDTA二钠 37.3 9.31
七水合硫酸亚铁 27.8 6.96
叶酸 10
谷氨酰胺 292 ---
甘氨酸 50
无水硫酸镁 122.09 30.52
麦芽糖 10,000 70,000
一水合硫酸锰 10 27.5
肌醇 100 25
烟酸(游离酸) 1 .025
毒莠定 2.415 ---
碘化钾 0.75 0.188
硝酸钾 2500 625
盐酸吡哆醇 1 10.25
L-丝氨酸 --- 50
二水合钼酸钠 0.25 0.0625
无水磷酸二氢钠 130.5 32.63
苯基噻二唑脲 0.022 --
盐酸硫胺素 1 2.5
七水合硫酸锌 2 0.5

Claims (29)

1.通过在营养培养基中悬浮培养紫杉属细胞生成紫杉烷类的方法，改进在于其中将茚满酰氨基酸加到营养培养基中。
2.权利要求1的方法，其中，茚满酰氨基酸在分批补料加料流中提供。
3.权利要求2的方法，其中，在补充的碳源包括在加料流中之前，悬浮培养基中的碳源被部分消耗。
4.权利要求1的方法，其中，茚满酰氨基酸以相对于不存在茚满酰氨基酸时生成的比率有效改变通过培养生成的紫杉烷类之间的比率的量加到营养培养基中。
5.权利要求1的方法，其中，茚满酰氨基酸以相对于不存在茚满酰氨基酸时生成的量有效地选择性增加浆果赤霉素III的量加到营养培养基中。
6.权利要求1的方法，其中，茚满酰氨基酸是6-取代的茚满酰氨基酸。
7.权利要求1的方法，其中，茚满酰氨基酸选自6-乙基茚满酰异亮氨酸(6-EII)、6-溴代茚满酰异亮氨酸(6-BII)和1-氧代-茚满-羧基-(L)-异亮氨酸-甲酯酰胺(1-0II)。
8.权利要求1的方法，其中，营养培养基包含至少一种增强剂和/或抑制剂。
9.权利要求1的方法，其中，营养培养基包含植物生长素，有植物生长素样生长调节活性的化合物，或这两者。
10.权利要求1的方法，其中，营养培养基包含银离子、银化合物、银络合物或其混合物。
11.权利要求1的方法，其中，茚满酰氨基酸以相对于银毒性具有保护性的量提供。
12.根据权利要求1的方法，其中，营养培养基包含苯丙烷类代谢的抑制剂。
13.根据权利要求12的方法，其中，抑制剂是含亚甲二氧基基团的化合物。
14.根据权利要求13的方法，其中，化合物是3，4-亚甲二氧基肉桂酸、亚甲二氧基硝基肉桂酸、亚甲二氧基苯丙酸或3，4-亚甲二氧基苯乙酸。
15.权利要求1的方法，其中，营养培养基进一步包含氨基酸。
16.根据权利要求15的方法，其中，氨基酸是谷氨酰胺。
17.包含茚满酰氨基酸的植物细胞培养营养培养基。
18.权利要求17的培养基，其中，茚满酰氨基酸以相对于不存在茚满酰氨基酸时生成的比率有效改变培养基中培养的细胞生成的紫杉烷类之间的比率的量加到培养基中。
19.权利要求17的培养基，其中，茚满酰氨基酸以相对于不存在茚满酰氨基酸时生成的量有效地选择性增加浆果赤霉素III的量加到培养基中。
20.权利要求17的培养基，其中，茚满酰氨基酸选自6-乙基茚满酰异亮氨酸(6-EII)、6-溴代茚满酰异亮氨酸(6-BII)和1-氧代-茚满-羧基-(L)-异亮氨酸-甲酯酰胺(1-0II)。
21.权利要求17的培养基，其中，培养基包含至少一种增强剂和/或抑制剂。
22.权利要求17的培养基，其中，培养基包含植物生长素，有植物生长素样生长调节活性的化合物，或这两者。
23.权利要求17的培养基，其中，培养基包含银离子、银化合物、银络合物或其混合物。
24.权利要求17的培养基，其中，茚满酰氨基酸以相对于银毒性具有保护性的量提供。
25.权利要求17的培养基，其中，培养基包含苯丙烷类代谢的抑制剂。
26.权利要求25的培养基，其中，抑制剂是含亚甲二氧基基团的化合物。
27.权利要求26的培养基，其中，化合物是3，4-亚甲二氧基肉桂酸、亚甲二氧基硝基肉桂酸、亚甲二氧基苯丙酸或3，4-亚甲二氧基苯乙酸。
28.权利要求17的培养基，其中，培养基进一步包含氨基酸。
29.权利要求28的培养基，其中，氨基酸是谷氨酰胺。
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